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VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON

Année 2014 - Thèse n°

ÉLABORATION D’UNE MOLECULE DE CHIMIO-THERAPIE

POUR LE TRAITEMENT DES TUMEURS MAMMAIRES :

LES QUINOLEINES SUBSTITUEES

(STIMULANT DES JONCTIONS GAP)

THESE

Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I

(Médecine - Pharmacie)

et soutenue publiquement le 18 décembre 2014

pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire

par Delahaye Adélaïde

Né (e) le : 15 septembre 1988

à Evreux (27)

5

Remerciements

A monsieur le professeur Michel Rivoire de la faculté de médecine de Lyon, pour

avoir aimablement accepté la présidence de cette thèse,

Hommages respectueux,

Au professeur Thierry Marchal, pour m’avoir aidé dans la realisation de ce travail

alors meme que je me trouvais sur un autre continent,

Un immense merci,

Au professeur Philippe Berny, pour avoir accepté de faire partie de ce jury de

thèse et pour son soutien tout au long de ma scolarite a Vetagro Sup,

Remerciements,

6

A mes parents et ma famille sans qui je n’en serais pas la aujourdh’hui

A Dave qui m’apporte son soutien au quotidien

A Annelise, qui ma accepte dans son laboratoire et m’a tant aide dans mes

travaux de recherche

A mon groupe de Clinique, Benedicte, Chloe, Kelly, sans qui les rotations

n’auraient pas été les memes

A ma simili ancienne qui m’a été precieuse au cours de ces annees a Marcy

A mes bruns qui sont a l’origine de tant de bons souvenirs

A tous mes autres amis a Vetagro Sup, Philippe, Bernadette, Tatiana, Aurelie,

Maelys, Adeline, Justine, Celia, Helene, Thomas, Yorick, Anais

Aux amis d’avant qui restent malgre la distance

A tous ceux que j’oublie

Merci a tous

7

Sommaire

Liste des enseignants de VetAgro Sup ................................................................... 3

Remerciements ....................................................................................................... 5

Sommaire ................................................................................................................ 7

Table des illustrations ............................................................................................ 17

Table des tableaux ................................................................................................ 21

Introduction ......................................................................................................... 23

Première partie : Tissu mammaire et cancérisation ......................................... 25

I/ Formation du tissu mammaire ............................................................................ 27

A/ Embryogenèse mammaire ................................................................................ 27

i/ La glande mammaire .......................................................................................... 27

a/ L'épithélium mammaire .................................................................................. 27

b/ Le mésenchyme mammaire ........................................................................... 28

1/ Le mésenchyme dense ............................................................................... 29

2/ Le tissu précurseur du coussinet adipeux ................................................... 30

c/ Le développement des mamelons .................................................................. 31

ii/ Interactions épithélium-mésenchyme au cours de l'embryogenèse ................... 31

a/ Interactions entre épithélium mammaire et fibroblastes ................................. 31

b/ Interactions entre épithélium mammaire et tissu précurseur du coussinet adi-

peux ................................................................................................................... 32

iii/ Les protéines de matrice extracellulaire ............................................................ 33

B/ Développement post-natal de la glande mammaire chez la souris ................... 33

i/ Développement de la ramification ductale .......................................................... 34

a/ Le nouveau-né ............................................................................................... 34

b/ Le jeune : bourgeons terminaux et canaux .................................................... 35

ii/ Régulation de la croissance ............................................................................... 37

a/ Régulateurs de croissance systémiques ........................................................ 37

b/ Œstrogènes .................................................................................................... 37

c/ Hormones de croissance et prolactine ........................................................... 38

d/ Facteur de croissance épidermiques ............................................................. 38

iii/ Interactions épithélium-stroma .......................................................................... 39

8

a/ Croissance organotypique et stroma .............................................................. 39

b/ L'épithélium subadulte conserve un potentiel embryogénique ....................... 39

c/ Réorganisation du stroma .............................................................................. 40

d/ Synthèse d'ADN du stroma ............................................................................ 40

e/ Induction des récepteurs ................................................................................ 40

iv/ Vieillissement des cellules mammaires ............................................................ 41

II/ Carcinogenèse .................................................................................................. 43

A/ Principes de base ............................................................................................. 43

i/ Evolution clonale ................................................................................................ 43

ii/ Cycle cellulaire, senescence et apoptose .......................................................... 43

B/ Les gènes impliqués dans la carcinogenèse..................................................... 47

i/ Oncogènes ......................................................................................................... 47

a/ L'oncogène myc ............................................................................................. 48

b/ L'oncogène ras ............................................................................................... 49

c/ Le récepteur tyrosine kinase ErbB2 ............................................................... 51

d/ Les microARNs comme oncogènes ............................................................... 51

e/ Les oncogènes dans la recherche contre le cancer ....................................... 52

ii/ Gènes tumeur-suppresseurs (TSGs) ................................................................. 52

a/ Génétique des TSGs dans le cancer ............................................................. 53

1/ Hypothèse de Knudson sur l'inactivation des TSGs ................................... 53

2/ Analyse de la perte d'hétérozygotie ............................................................ 54

3/ Haploinsuffisance ....................................................................................... 57

b/ Rôle et propriétés de certains TSGs .............................................................. 57

1/ Rb ............................................................................................................... 57

2/ p53 .............................................................................................................. 58

3/ Famille CIP/KIP (p21Waf1/Cip1 et p27Kip1) ...................................................... 60

iii/ Instabilité génomique ........................................................................................ 61

a/ Présentation des mécanismes de préservation de l'intégrité du génome ....... 61

b/ Tumeurs présentant une instabilité des microsatellites .................................. 62

c/ Tumeurs caractérisées par une instabilité chromosomique (CIN) .................. 63

d/ Recombinaison mitotique et cancer : l'hélicase BLM ..................................... 63

e/ Réarrangements chromosomiques dus à un dysfonctionnement des télo-

mères ................................................................................................................. 64

9

f/ Valeur clinique de l'instabilité génomique ........................................................ 64

iv/ Epigénétique ..................................................................................................... 65

a/ Méthylation de l'ADN ...................................................................................... 65

b/ Régulation de la méthylation de l'ADN et de son maintien ............................. 66

c/ Cancer et méthylation aberrante .................................................................... 66

d/ Perte d'empreinte dans le cancer ................................................................... 67

e/ Remodelage du nucléosome .......................................................................... 68

f/ Variants des histones ...................................................................................... 68

g/ Interaction dynamique entre les différents mécanismes épigénétiques ......... 68

h/ Détection du cancer ....................................................................................... 69

i/ Résistance à la thérapie .................................................................................. 69

j/ Thérapie liée à la méthylation .......................................................................... 69

v/ Importance du stroma ........................................................................................ 70

a/ La morphologie du stroma tumorale est modifiée .......................................... 71

b/ Changement du profil d'expression des fibroblastes ...................................... 72

c/ Les fibroblastes associés aux tumeurs ne sont pas toujours génétiquement

normaux ............................................................................................................. 72

d/ « Modelage » du stroma tumoral .................................................................... 73

vi/ Télomérase ....................................................................................................... 73

a/ Les télomères, des structures spécialisés ...................................................... 74

b/ Structure et activité des télomérases ............................................................. 74

c/ Régulation de l'activité des télomérases ........................................................ 75

d/ Implication thérapeutique des télomérases .................................................... 75

e/ Mécanismes alternatifs pour la maintenance des télomères .......................... 76

vii/ Angiogenèse .................................................................................................... 76

a/ L'organisation des vaisseaux tumoraux est différente de celle des vaisseaux

normaux ............................................................................................................. 76

b/ Régulation de l'angiogenèse .......................................................................... 77

c/ Déclenchement de l'angiogenèse par hypoxie ............................................... 77

d/ Autres stimuli déclenchant l'angiogenèse ...................................................... 78

e/ Vascularisation des tumeurs .......................................................................... 79

f/ Cooptation ....................................................................................................... 80

g/ Mimétisme vasculaire ..................................................................................... 80

10

h/ Vaisseaux mosaïques .................................................................................... 80

i/ Thérapie anti-angiogénique ............................................................................. 80

viii/ Métastase ........................................................................................................ 81

a/ Les étapes de la métastase ........................................................................... 82

b/ Bases moléculaires ........................................................................................ 83

1/ Interactions cellule-cellule ........................................................................... 83

2/ Protéolyse de la matrice extracellulaire ...................................................... 84

3/ Gènes suppresseurs de métastases .......................................................... 85

4/ Migration et motilité des cellules cancéreuses ............................................ 85

5/ Implantation ................................................................................................ 86

c/ Implications clinique ....................................................................................... 86

C/ Aspects spécifiques .......................................................................................... 87

i/ Contexte tissulaire comme déterminant de la fonction tumeur-suppressive ou

oncogène............................................................................................................... 87

a/ Les gènes RUNX ........................................................................................... 87

b/ Les gènes Notch ............................................................................................ 89

ii/ Cellules souches cancéreuses .......................................................................... 91

iii/ Pharmacogénomique – Détermination de l'efficacité thérapeutique ................. 94

a/ Lien entre chimiothérapie / radiothérapie et apoptose ................................... 95

b/ Le gène tumeur suppresseur p53, un régulateur majeur de l'efficacité de la

thérapeutique anticancéreuse ............................................................................ 95

c/ La résistance à la thérapie est intrinsèque aux tumeurs ................................ 96

d/ Pharmacogénétique ....................................................................................... 97

1/ Les mécanismes en amont ......................................................................... 97

2/ Interaction médicament-cible ...................................................................... 98

3/ Les mécanismes en aval ............................................................................ 99

4/ Vers la thérapie individuelle ........................................................................ 99

iv/ Carcinogenèse chimique .................................................................................. 99

a/ Carcinogènes génotoxiques ......................................................................... 100

b/ Les hydrocarbones aromatiques polycycliques (PAHs) ............................... 100

c/ Les aflatoxines ............................................................................................. 100

d/ Les carcinogènes non génotoxiques ............................................................ 101

v/ Hormones et cancer ........................................................................................ 101

11

a/ Androgènes et cancer de la prostate ........................................................... 102

b/ Stéroïdes sexuels et cancer du sein ............................................................ 104

c/ GNRH (Growth Hormone Releasing Hormone) et carcinogenèse ............... 106

vi/ Oncogenèse virale .......................................................................................... 108

a/ Papillomavirus humain (HPV) ...................................................................... 109

b/ Epstein-Barr Virus (EBV).............................................................................. 111

c/ Virus de l'hépatite B (HBV) ........................................................................... 112

d/ Virus BK (BKV) ............................................................................................. 112

e/ Virus de leucémie à lymphocytes T humain (HTLV) .................................... 113

f/ Virus de tumeur mammaire murin (MMTV) ................................................... 114

Deuxième partie : Développement des quinoléines substituées et test

fonctionnel sur des xénogreffes ...................................................................... 117

I/ Synthèse et activité anti-cancer du sein des quinoléines substituées .............. 119

II/ Bioactivité et cibles moléculaires de nouvelles quinoléines substituées dans des

lignées de cellules tumorales murines et humaines in vitro ................................. 127

A/ Résumé........................................................................................................... 127

B/ Introduction ..................................................................................................... 128

C/ Matériels et méthodes .................................................................................... 130

i/ Traitements médicamenteux, culture cellulaire et essai de prolifération ........... 130

ii/ Immunofluorescence et microscopie confocale ............................................... 132

iii/ Synthèse de macromolécules et transport de nucléosides ............................. 132

iv/ Liaison à l'ADN et tests de fragmentation ....................................................... 133

v/ Index mitotique et anomalies ........................................................................... 135

vi/ Test fluorogénic de l'activité des caspases ..................................................... 136

vii/ Analyse par Western blot du clivage de la poly (ADP-ribose) polymérase-1

(PARP-1) ............................................................................................................. 137

viii/ Immunodétection du niveau protéique et de l'autophosphorylation de HER1 et

HER2 ................................................................................................................... 138

D/ Résultats ......................................................................................................... 141

i/ Inhibition de la prolifération des cellules tumorales .......................................... 141

ii/ Inhibition de l'expression de la protéine Ki-67 .................................................. 143

iii/ Inhibition de la synthèse de macromolécules et transport de nucléosides ...... 145

iv/ Liaison et fragmentation de l'ADN ................................................................... 147

12

v/ Index mitotique et anomalies ........................................................................... 149

vi/ Induction du clivage de PARP-1 et de l'activation des caspases effectrices et

initiatrices ............................................................................................................ 150

vii/ Niveaux protéiques et autophosphorylation de HER1 et HER2 ..................... 152

E/ Discussion ....................................................................................................... 154

III/ Les quinoléines substituées de seconde génération comme médicament anti-

cancéreux contre le cancer du sein ..................................................................... 165

A/ Résumé........................................................................................................... 165

B/ Introduction ..................................................................................................... 165


i/ Matériaux .......................................................................................................... 168

ii/ Lignée cellulaire et culture ............................................................................... 168

iii/ Analyse par Western blot ................................................................................ 168

iv/ Activité des jonctions GAP .............................................................................. 169

v/ Croissance des colonies sur gélose molle ....................................................... 169

vi/ Exclusion au bleu Trypan................................................................................ 169

vii/ Tumeurs de xénogreffes de cellules T47D chez les souris nu/nu .................. 170

viii/ Analyse statistique ........................................................................................ 170

D/ Résultats ......................................................................................................... 170

E/ Discussion et conclusion ................................................................................. 174

IV/ Les activateurs des jonctions GAP augmentent l'efficacité du cisplatine dans la

réduction des tumeurs mammaires ..................................................................... 177

A/ Résumé........................................................................................................... 177

B/ Introduction ..................................................................................................... 178


i/ Déclaration éthique ........................................................................................... 180

ii/ Composés ........................................................................................................ 180

iii/ Lignées cellulaires et culture cellulaire ............................................................ 180

iv/ Xénogreffe de cellules tumorales T47D chez la souris nude .......................... 181

v/ Analyse Western blot ....................................................................................... 181

vi/ Immunohistochimie ......................................................................................... 182

vii/ Analyse statistique ......................................................................................... 182

D/ Résultats ......................................................................................................... 183

13

i/ Croissance de xénogreffes de cellules tumorales T47D chez la souris nude ... 183

ii/ Expression de protéines des xénogreffes ........................................................ 184

iii/ Etude histologique des organes métaboliques ................................................ 188

E/ Discussion ....................................................................................................... 191

V/ Traitement combinatoire avec l'activateur des jonctions GAP et le tamoxifène

dans des cellules de cancer du sein .................................................................... 197

A/ Résumé........................................................................................................... 197

B/ Introduction ..................................................................................................... 198


i/ Lignées cellulaires et culture ............................................................................ 201

ii/ Morphologie cellulaire ...................................................................................... 201

iii/ Croissance des colonies en utilisant de l'agar mou......................................... 201

iv/ Test MTT ........................................................................................................ 201


vi/ Immunofluorescence et microscopie confocale .............................................. 203

vii/ Dosage de l'apoptose par cytométrie de flux ................................................. 203

viii/ Analyse statistique ........................................................................................ 203

D/ Résultats et discussion ................................................................................... 170

i/ Effet des PQ1 et du tamoxifène sur des protéines apoptotiques ...................... 201

ii/ Mesure de l'apoptose par la morphologie nucléaire et cytométrie de flux ........ 201

iii/ Effet de l'inhibiteur des jonctions GAP, CBX, sur les protéines Cx43, BAX,

caspase 3 et cycline D1 ...................................................................................... 201

iv/ Effet du CBX sur le test MTT, l'expression de la protéine Ki-67 et le dosage de

l'apoptose par cytométrie de flux ......................................................................... 201

E/ Conclusion ...................................................................................................... 170

F/ Importance ...................................................................................................... 170

Troisième partie : tests thérapeutiques sur un modèle de tumeurs

spontanées chez la souris MMTV-PyVT .......................................................... 219

I/ La souris transgénique MMTV-PyVT comme modèle de carcinome mammaire à

plusieurs stades et efficacité du traitement antinéoplasique ............................... 221

A/ Résumé........................................................................................................... 221

B/ Introduction ..................................................................................................... 221


i/ Animaux............................................................................................................ 224

14

ii/ Composés ........................................................................................................ 225

iii/ Anticorps ......................................................................................................... 225

iv/ Analyse Western blot ...................................................................................... 226

v/ Immunohistochimie (IHC) ................................................................................ 226

vi/ Analyse statistique .......................................................................................... 227

D/ Résultats ......................................................................................................... 227

E/ Discussion ....................................................................................................... 234

II/ Effet anticancéreux de la molécule PQ1 sur le modèle de souris MMTV-PyVT241

A/ Résumé........................................................................................................... 241

B/ Introduction ..................................................................................................... 242


i/ Composés ........................................................................................................ 244

ii/ Animaux ........................................................................................................... 244

iii/ Anticorps ......................................................................................................... 245

iv/ Analyse Western blot ...................................................................................... 245

v/ Immunohistochimie (IHC) ................................................................................ 245


D/ Résultats ......................................................................................................... 246

E/ Discussion ....................................................................................................... 253

III/ Biodisponibilité et efficacité d'un stimulant des jonctions GAP (PQ7) dans un

modèle de tumeur mammaire murin .................................................................... 261

A/ Résumé........................................................................................................... 261

B/ Introduction ..................................................................................................... 262



ii/ Composés ........................................................................................................ 264

iii/ Animaux .......................................................................................................... 264

iv/ Études de distribution des PQ7 chez la souris (HPLC et spectrométrie de

masse) ................................................................................................................ 265

a/ Extraction des PQ7 des organes et du plasma ............................................ 265

b/ Quantification de PQ7 par HPLC ................................................................. 266

v/ Spectroscopie de masse ................................................................................. 267

vi/ Anticorps ......................................................................................................... 267

15

vii/ Analyse Western blot ..................................................................................... 267

viii/ Immunohistochimie (IHC) .............................................................................. 268

ix/ Analyse statistique .......................................................................................... 268

D/ Résultats ......................................................................................................... 269

i/ Distribution des PQ7 ......................................................................................... 269

ii/ Analyse des organes vitaux après exposition aux PQ7 ................................... 271

iii/ Effet des PQ7 sur la croissance tumorale dans un modèle de formation

spontanée de tumeurs mammaires ..................................................................... 272

iv/ Analyse pathologique des tumeurs PyVT après traitement aux PQ7 ............. 275

v/ Effet de PQ7 sur l'expression de la connexine dans le tissu néoplasique ....... 277

E/ Discussion ....................................................................................................... 279

IV/ Effet de molécules antinéoplasique sur un modèle de tumeur spontanée chez

le mâle ................................................................................................................. 285

A/ Résumé........................................................................................................... 285

B/ Introduction ..................................................................................................... 285



ii/ Modèle de souris ............................................................................................. 290

iii/ Anticorps ......................................................................................................... 290

iv/ Immunohistochimie ......................................................................................... 291



D/ Résultats ......................................................................................................... 292

i/ Caractérisation du modèle de souris PyVT et effets du traitement sur

l'expression des récepteurs hormonaux .............................................................. 292

ii/ Effet du cisplatine sur le développement précoce des souris PyVT ................. 293

iii/ Effet du paclitaxel sur le développement précoce de PyVT souris .................. 295

iv/ Effet du tamoxifène sur le développement précoce des souris PyVT ............. 296

v/ Expression protéique dans les tumeurs isolées de souris PyVT ..................... 297

vi/ Examen pathologique des tumeurs mammaires chez le mâle ........................ 299

E/ Discussion ....................................................................................................... 300

Conclusion ......................................................................................................... 305

Références bibliographiques ........................................................................... 307

17

Table des illustrations

Fig. 1 : Ramifications et bourgeons terminaux chez une souris femelle de 5

semaines ............................................................................................................... 36

Fig. 2 : Marquage de la glande mammaire ............................................................ 37

Fig. 3 : Reponse a l’EGF chez la souris ovariectomisee ....................................... 38

Fig. 4 : Transplantations successives de tissu mammaire .................................... 42

Fig. 5 : Diminution du taux de croissance de 15% a chaque generation ............... 42

Fig. 6 : Cycle cellulaire .......................................................................................... 44

Fig. 7 Voie majeure d’induction de la senescence ................................................ 45

Fig. 8 : Deux voies principales d’induction de l’apoptose ...................................... 46

Fig. 9 : Formation de foci ....................................................................................... 47

Fig. 10 : L’oncogene Myc et la proteine Max ......................................................... 49

Fig. 11 : Régulation de la protéine p21 par GEF et GAP ....................................... 50

Fig. 12 : Hypothese de Knudson ........................................................................... 54

Fig. 13 : Perte d’heterozygotie ............................................................................... 55

Fig. 14 : Analyse de la perte d’heterozygotie......................................................... 56

Fig. 15 : Region minimale de deletion ................................................................... 56

Fig. 16 : Régulation de la protéine Rb ................................................................... 58

Fig. 17 : Régulation des TSGs Rb et p53 par Ink4a/Arf ........................................ 59

Fig. 18 : Test de tumorigénicité ............................................................................. 92

Fig. 19 : Structure du récepteur aux androgènes ................................................ 103

Fig. 20 : Surexpression des récepteurs aux androgènes en réponse à la thérapie

............................................................................................................................ 104

Fig. 21 : Structure et formules des quinoléines substituées ................................ 120

Fig. 22 : Préparation du 4-amino-5-nitro-2-(3-trifluoromethylphenyloxy) anisole

(compose 13) ...................................................................................................... 121

Fig. 23 : Préparation de la quinoléine 14 ............................................................. 122

Fig. 24 : Synthèse des quinoléines substituées 1 à 4 .......................................... 123

Fig. 25 : Synthèse des quinoléines substituées 5, 6 et 7 ..................................... 124

Fig. 26 : Structures des differentes quinoleines substituees ............................... 143

Fig. 27 : Inhibition de la croissance des cellules L1210 par differentes PQ à 2 et 4

jours .................................................................................................................... 143

18

Fig. 28 : Inhibition de la croissance des cellules tumorales Pan02, A-431, BT-474

et SK-BR-3 par PQ1 à 2 et 4 jours ...................................................................... 143

Fig. 29 : Inhibition de l’expression de la proteine Ki-67 par PQ1 ......................... 144

Fig. 30 : Inhibition de l’incorporation de [3H]-thymidine par differentes

concentrations de PQ1 ........................................................................................ 146

Fig. 31 : Inhibition du transport cellulaire des bases puriques et pyrimidiques dans

des cellules L1210 ............................................................................................... 146

Fig. 32 : Inhibition de l’incorporation de [3H]-uridine dans l’ARN et de [3H]-leucine

dans les proteines par differentes concentrations de PQ1 .................................. 146

Fig. 33 : Inhibition de la liaison du bromure d’ethidium a l’ADN........................... 147

Fig. 34 : Induction de la fragmentation de l’ADN ................................................. 148

Fig. 35 : Gel de fragmentation de l’ADN .............................................................. 149

Fig. 36 : Clivage de la protéine PARP-1 dans des cellules L1210 ....................... 151

Fig. 37 : Test fluorogenic de l’activation des caspases initiatrices et effectrices

dans des cellules L1210 ...................................................................................... 152

Fig. 38 : Immunodetection du niveau des recepteurs HER1 et HER2 ................. 153

Fig. 39 : Inhibition de la phosphorylation des récepteurs HER1 et HER2 dans des

cellules A-431 et SK-BR-3 ................................................................................... 154

Fig. 40 : Activité des jonctions GAP .................................................................... 171

Fig. 41 : Formation de colonies sur gélose molle ................................................ 172

Fig. 42 : Effet des PQ7 sur la viabilité cellulaire .................................................. 172

Fig. 43 : Effet des PQ7 sur l’expression de Cx43 dans des cellules T47D .......... 173

Fig. 44 : Effet des PQ7 sur les caspases 9 activées ........................................... 173

Fig. 45 : Croissance de xénogreffes de cellules T47D chez des souris nu/nu

préalablement traitées au 17β-œstradiol ............................................................. 174

Fig. 46 : Croissance de xénogreffes chez la souris nude .................................... 183

Fig. 47 : Immunohistochimie sur des tumeurs de xénogreffes de cellules T47D . 184

Fig. 48 : Expression protéique dans des tumeurs de xénogreffes de cellules T47D

............................................................................................................................ 186

Fig. 49 : Immunohistochimie des organes métaboliques ..................................... 190

Fig. 50 : Expression de la Cx43 dans des organes prélevés sur des souris nude191

Fig. 51 : Effet des PQ1 sur la morphologie des cellules T47D ............................ 206

Fig. 52 : Réduction de croissance des colonies de cellules T47D ....................... 207

Fig. 53 : Évaluation de la prolifération des cellules T47D au moyen du test MTT207

19

Fig. 54 : Expression du marqueur de division cellulaire Ki-67 ............................. 208

Fig. 55 : Expression des protéines impliquées dans les voies de l'apoptose ...... 210

Fig. 56 : Expression des protéines survivine et BAX observée par

immunofluorescence ........................................................................................... 212

Fig. 57 : Analyse des cellules apoptotiques par marquage APO-BrdU et flow

cytométrie ............................................................................................................ 213

Fig. 58 : Etude de l'inhibition des jonctions GAP en utilisant le CBX ................... 215

Fig. 59 : Immunohistochimie de tumeurs de souris PyVT aux stades de pré-

développement, développement précoce et développement tardif ..................... 229

Fig. 60 : Immunohistochimie de tumeurs de souris PyVT ................................... 229

Fig. 61 : Expression de marqueurs moléculaires aux trois stades de

développement .................................................................................................... 231

Fig. 62 : Evaluation histo-pathologique de tumeurs mammaires de souris PyVT

colorées à l’hemalun-éosine ................................................................................ 232

Fig. 63 : Métastases de tumeurs mammaires dans les poumons, colorées à

l’hemalun-éosine ................................................................................................. 232

Fig. 64 : Croissance tumorale chez les souris PyVT femelles ............................. 234

Fig. 65 : Croissance tumorale (en mm3) chez la femelle PyVT femelle .............. 248

Fig. 66 : Nombre de tumeurs développées chez la souris PyVT femelle ............ 249

Fig. 67 : Expression des protéines x46, Cx43, PKC-α et survivine dans les

tumeurs PyVT aux trois stades de développement ............................................. 251

Fig. 68 : Immunohistochimie de tumeurs issues de souris PyVT femelles .......... 253

Fig. 69 : Métastases de tumeurs mammaires dans l’épithélium pulmonaires ..... 254

Fig. 70 : Evaluation de tissus normaux issus de souris PyVT ............................. 256

Fig. 71 : Distribution du compose PQ7 ................................................................ 270

Fig. 72 : Effet du compose PQ7 sur l’expression des Cx43 dans les tissus

normaux .............................................................................................................. 271

Fig. 73 : Croissance tumorale (en mm3) chez la souris PyVT femelle ................ 273

Fig. 74 : Nombre de tumeurs développées chez la souris PyVT femelle ............ 275

Fig. 75 : Analyse de tumeurs isolées de souris PyVT femelles 48h après la

dernière injection ................................................................................................. 276

Fig. 76 : Immunohistochimie de tumeurs issues de souris PyVT femelles .......... 278

Fig. 77 : Phénotype des souris PyVT males au cours du stade précoce de

développement .................................................................................................... 294

20

Fig. 78 : Croissance tumorale (en mm3) chez la souris PyVT male traitée au

cisplatine ............................................................................................................. 295


paclitaxel ............................................................................................................. 296


tamoxifène ........................................................................................................... 297

Fig. 81 : Expression des marqueurs moléculaires Bcl-2, caspase 3, cycline D1 et

survivine .............................................................................................................. 299

21

Table des tableaux

Table 1 : Les quatre méthyltransférases majeures identifiées chez l'Homme et

leurs propriétés

Table 2 : Effets des quinoléines substituées sur l’index mitotique et la fréquence

de cellules binucléés ou avec des micronoyaux dans des cellules tumorales L1210

23

Introduction

Le cancer du sein est le cancer de plus grande incidence chez la femme.

L'American Cancer Society estime à plus de 230 000 le nombre de nouveaux cas

en 2014 pour les Etats-Unis seulement, soit environ 30 % de l'ensemble des

cancers chez la femme. Grâce aux progrès réalisés en terme de diagnostic, 60 %

des cancers du sein sont maintenant diagnostiqués à un stade précoce, ce qui,

conjointement avec les progrès en matière de traitement a permis d'atteindre un

taux de survie à cinq ans de 90 % dans la population caucasienne et 79 % dans la

population afro-américaine. Pour autant, le cancer du sein est la deuxième cause

de mortalité par cancer après le cancer des poumons. On estime à 40 000 le

nombre de décès par cancer du sein chez les femmes américaines en 2014, soit

15 % des décès suite à un cancer chez la femme. (1)

Les cellules cancéreuses se caractérisent par la présence d'anomalies

génétiques à l'origine d'une instabilité génomique qui permet l'accumulation de

nouvelles mutations. Parmi les anomalies observées dans les cellules de cancer

de sein, on rencontre la perte de communication intercellulaire au travers des

jonctions GAP (GJIC) en raison de la diminution d'expression ou l'absence de

jonctions GAP (2). Les jonctions GAP sont les seules jonctions des cellules

animales permettant le passage de petites molécules, jusqu'à 1,2 kDa (3). La

restauration de jonctions GAP fonctionnelles pourrait ainsi être une option

thérapeutique dans le traitement du cancer. L'association d'un activateur des

jonctions GAP avec d'autres molécules de chimiothérapies est également une

option intéressante dans la mesure où elle permettrait d'augmenter la propagation

de la molécule cytotoxique et ainsi potentiellement améliorer son efficacité.

Ce travail présente dans un premier temps la mise en place de la glande

mammaire au cours du développement et les connaissances acquises au cours

des dernières décennies sur les mécanismes de la carcinogenèse. Ensuite, nous

présenterons la partie expérimentale de cette thèse avec, dans un premier temps,

l'élaboration de l'inhibiteur des jonctions GAP et son utilisation dans un modèle de

24

xénogreffe et, dans un deuxième temps, son utilisation dans un modèle de tumeur

spontanée chez la souris PyVT-MMTV.

25

Première partie

Tissue mammaire et

cancérisation

27

I/ Formation du tissu mammaire

A/ Embryogenèse mammaire

La glande mammaire est un organe spécifique des mammifères. Comme

d'autres organes reproducteurs, la glande mammaire croit lentement au cours de

l'embryogenèse et de la vie du jeune mais n'est pas mature avant que le système

reproducteur devienne fonctionnel à la puberté. (4)

i/ La glande mammaire

a/ L'épithélium mammaire

La formation de la glande mammaire commence chez l'embryon de 10 à 11

jours avec l'élargissement d'une monocouche d'ectoderme du bourgeon du

membre antérieur au bourgeon du membre postérieur d'un côté puis des deux

côtés. C'est ce qu'on appelle la crête mammaire primitive. Elle a également été

décrite chez le rat et chez l'Homme. (5, 6, 7)

À 12 jours, l'embryon possède cinq pairs de bourgeons mammaires : trois

thoraciques et deux inguinales. Ils sont formés de plusieurs couches de cellules

épidermiques, légèrement élevées par rapport à la surface de l'épiderme. Il a été

proposé que le bourgeon se forme par division asymétrique des cellules à

intervalle régulier le long de la crête mammaire primitive avec disparition de la

crête entre ces foyers de proliférations. Cependant, l'index mitotique des cellules

du bourgeon est inférieur à celui des cellules épidermiques adjacentes, suggérant

que les bourgeons se forment par migration de cellules épidermiques, ce qui a été

montré par la suite. (4, 8, 9)

Chez les souris, la différenciation des gonades s'effectue à la fin du 13ème

jour de gestation, moment à partir duquel les testicules commencent à produire

des androgènes chez le mâle. Chez les femelles, la croissance de la glande

mammaire est très lente entre les 11ème et 16ème jours de gestation, sans

différenciation cellulaire, correspondant à une phase de repos. À la fin du 16ème

28

jour, le bourgeon mammaire s'allonge et pénètre le tissu précurseur du tissu

adipeux au 17ème jour. Durant les derniers jours de gestation l'épithélium croit et

se ramifie jusqu'à atteindre 15 à 20 canaux. Chez les mâles, le développement de

la glande mammaire est inhibé par les androgènes fœtaux. Au 14ème jour, le

volume de l'épithélium diminue. Au 15ème jour, la connexion entre les rudiments

mammaires et l'épiderme s'affine puis se rompt. Les rudiments mammaires sont

isolés au sein du coussinet adipeux et ne connaissent qu'une faible croissance

quand ils ne dégénèrent pas.

Lorsque les rudiments mammaires s'allongent chez la femelle à la fin du

16ème jour, ils prennent la forme d'un entonnoir dont l'embouchure est dirigée

vers l'épiderme et est en partie remplie de cellules cornées. Au même moment,

des vacuoles intercellulaires se forment en région proximale et fusionnent pour

former un canal qui se connecte ensuite au canal lactifère principal. À ce stade de

développement, la glande développe des ramifications secondaires et tertiaires. (4)

En raison de la difficulté à retirer complètement les différentes hormones de

l'embryon à un stade précoce, il n'a pas été possible d'étudier les besoins en une

hormone particulière au cours de la morphogenèse mammaire in vivo. Cependant,

des études in vitro ont montré que la glande mammaire de rat au 17ème jour

répondait aux hormones induisant la différenciation chez l'adulte parmi lesquelles

on trouve l'insuline, l'aldostérone, la prolactine, la progestérone et les œstrogènes.

En particulier, l'insuline entraine la croissance et la pénétration du mésenchyme

par l'épithélium mammaire ; la prolactine stimule la prolifération et la ramification

des canaux dans le coussinet adipeux et toutes les hormones en association

induit la production de caséine. Ainsi, l'épithélium est déjà déterminé comme

épithélium mammaire dès le 17ème jour de gestation. (10)

b/ Le mésenchyme mammaire

De nombreux organes sont composés d'une part de tissu épithélial et

d'autre part de tissu mésenchymateux. Ces deux tissus interagissent, ce qui

s'avère essentiel pour la croissance, la détermination, la morphogenèse ou encore

la différenciation. Dans le cadre du développement de la glande mammaire, on

distingue deux types de mésenchymes : un, dense, est composé de plusieurs

29

couches de fibroblastes en contact direct avec l'épithélium tandis que le second

est précurseur du coussinet adipeux. L'importance du mésenchyme dans

l'induction de la glande mammaire a été montrée par Propper. Celui-ci a retiré le

tissu mésodermique de régions mammaires et non mammaires chez des

embryons de rat de 12 jours et l'a mis en culture avec de l'épiderme de futures

régions mammaires et non mammaires. Il a constaté que l'épiderme de la future

région mammaire mis en culture avec du mésoderme non mammaire ne

développait pas de bourgeon mammaire alors qu'inversement, l'épiderme issu de

région non mammaire mis en culture avec du mésoderme mammaire développait

des bourgeons mammaires. (11-15)

1. Le mésenchyme dense

Avant 10 à 12 jours de gestation, il est difficile de le distinguer du

mésenchyme précurseur du coussinet adipeux sans utiliser de marqueurs

spécifiques. À 13 jours, ce mésenchyme est constitué de deux à trois couches de

fibroblastes autour de l'épithélium mammaire. La différenciation phénotypique

entre mâles et femelles s'opère entre le 13ème et le 15ème jour de gestation.

Chez le mâle, le mésenchyme se condense autour du bourgeon mammaire sous

l'influence des androgènes, ayant pour conséquence la régression du tissu. Chez

la femelle, le mésenchyme persiste autour de l'épithélium mais sans condensation.

Lors d'expériences avec de la testostérone radio marquée (3H-testostérone ou 3H-

5-dihydrotestostérone), il a été montré que le mésenchyme était la seule cible et

que de 12 à 14 jours de gestation on passait de quelques cellules à environ 3000

possédant des récepteurs. La réponse aux androgènes ne se manifeste pas avant

la fin du 13ème jour. (16-20)

Au cours du développement, ce mésenchyme présente deux fonctions

majeures : il permet l'interaction entre l'épithélium mammaire et le stroma adipeux

et il intervient dans le dimorphisme sexuel. (15, 21)

30

2. Le tissu précurseur du coussinet adipeux

Au 14ème jour de gestation, il apparaît comme un tissu dense sous les

rudiments mammaires. Si on l'isole et le transplante sous la capsule rénale, il se

différencie en tissu adipeux en environ deux semaines. Aux jours 15-16, il évolue

vers un tissu lâche qui, aux jours 16-17 contient des pré-adipocytes qui forment

des structures lobulaires, observables au rouge Soudan. Les îlots de pré-

adipocytes augmentent en taille puis fusionnent entre eux au fur et à mesure de la

différenciation. Deux à trois jours après la naissance, l'ensemble du tissu

précurseur est converti en tissu adipeux blanc.

La différenciation du tissu adipeux mammaire s'opère avant les autres

tissus adipeux. En effet, elle s'observe avant la naissance alors que les autres

tissus adipeux, présents au niveau de l'épididyme, du mésentère ou du

mésomètre par exemple, ne se différencient que 1 à 3 jours après la naissance.

Selon la classification de Hausman et Thomas, il existe trois stades de

différenciation : le stade I au cours duquel le tissu est histologiquement distinct du

tissu conjonctif adjacent mais ne possède pas d'enzyme de la lipogenèse ; le

stade II au cours duquel les adipocytes ne sont pas morphologiquement

différenciés mais sont réactifs pour certaines enzymes et stade III au cours duquel

sont morphologiquement différenciés et réactifs pour de nombreuses enzymes. Le

tissu précurseur du coussinet adipeux est au stade I à 14 jours de gestation, au

stade II à 17 et au stade III deux à trois jours après la naissance. (22, 23)

Le tissu précurseur du coussinet adipeux est essentiel au bon

développement de la glande mammaire. En effet, si l'on sépare l'épithélium

mammaire du tissu environnant et qu'on le met en culture avec du mésenchyme

de différents organes, une glande mammaire avec canaux allongés et bourgeons

terminaux ne se développe qu'en présence du tissu précurseur du coussinet

adipeux. Le tissu mésenchymateux fibroblastique dense permet la prolifération

nodulaire de l'épithélium avec de nombreuses ramifications des canaux. (14)

31

c/ Le développement des mamelons

Les mamelons sont classés en trois grands types : le type prolifératif, le

type épithélial et le type éversif. Le type prolifératif est rencontré chez l'Homme et

de nombreux mammifères domestiques. Les cellules du mésenchyme prolifèrent

autour du cordon mammaire entrainant une élévation de l'épiderme suivie par la

formation des mamelons. Chez les rongeurs, on rencontre le type épithélial qui se

caractérise par une invagination circulaire de l'épiderme autour du cordon

mammaire au 18ème jour de gestation chez la souris et au 20ème chez le rat. Au

même moment, la croissance de l'anneau épidermique forme une zone circulaire

surélevée qui sera plus tard le mamelon. (4, 10)

ii/ Interactions épithélium-mésenchyme au cours de l'embryogenèse

Les interactions entre l'épithélium et le mésenchyme sont primordiales au

cours de l'organogenèse chez l'embryon mais aussi chez l'adulte. Le meilleur

exemple est représenté par le développement des dents : le mésenchyme affecte

l'épithélium qui à son tour affecte le mésenchyme et finalement, l'épithélium

synthétise l'énamel tandis que le mésenchyme synthétise la dentine. On observe

le même schéma au cours du développement mammaire avec le mésenchyme qui

entraine la détermination de l'épithélium et rend l'épithélium capable d'interagir

avec le stroma adipeux. Ensuite l'épithélium mammaire induit l'expression de

récepteurs aux androgènes par le mésenchyme mammaire permettant la réponse

de ce dernier aux androgènes. (12)

a/ Interactions entre épithélium mammaire et fibroblastes

L'importance de l'épithélium dans l'expression de récepteurs aux

androgènes a été montrée par co-culture de mésenchyme de jeune embryon

n'exprimant pas encore de récepteurs et d'épithélium mammaire ou non

mammaire tel que de l'épithélium pancréatique ou épidermique. Le halo de

testostérone radio-marquée (3H-testostérone) couplé aux cellules

mésenchymateuses n'a été observé qu'avec de l'épithélium mammaire suggérant

32

que les récepteurs aux androgènes étaient induit chez les cellules

mésenchymateuses par l'épithélium mammaire adjacent. (19)

En plus des études mentionnées précédemment, des études ont été

menées avec des souris mutées insensibles aux androgènes Xtfm. L'épithélium et

le mésenchyme mammaires ont été isolés d'animaux Tfm et sauvages puis les

différentes combinaisons de ces deux tissus ont été mises en culture en présence

d'androgène. Seules les cultures dont le mésenchyme provenait d'un animal

sauvage ont entrainé un phénotype mâle (régression du tissu mammaire),

suggérant que le mésenchyme est la cible des androgènes. (17, 24)

D'autres études similaires ont montré que la condensation des cellules

mésenchymateuses responsable de la destruction des rudiments mammaire

n'avaient lieu que lorsque le mésenchyme sauvage était attaché à la surface

épithéliale, et ce même si le mésenchyme était extrait de jeunes embryons deux

jours avant l'expression de récepteurs aux androgènes. Ceci indique que les

cellules requises pour la réponse aux androgènes sont déjà sur place et ne

migrent pas depuis une région éloignée. Par ailleurs, cette réponse est organe

spécifique mais non espèce spécifique. En effet, lorsque de l'épithélium mammaire

de souris est mis en culture avec du mésenchyme en présence de testostérone,

on n'observe une condensation du mésenchyme que lorsque ce dernier est

d'origine mammaire, et non lorsqu'il est d'origine pancréatique, pulmonaire ou

encore salivaire. En revanche, la condensation s'opère que le mésenchyme

provienne de souris, de rat ou de lapin. (18)

b/ Interactions entre épithélium mammaire et tissu précurseur du coussinet

adipeux

Au début du développement de la glande mammaire, l'épithélium est

entouré de mésenchyme mammaire dense. Ensuite, lorsque la différenciation des

cellules adipeuses commence (à 16-17 jours chez la souris et 19-20 jours chez le

rat), l'épithélium mammaire traverse la gaine de mésenchyme dense et pénètre le

tissu précurseur du coussinet adipeux. L'interaction de l'épithélium mammaire

avec ce dernier est indispensable pour la détermination des caractéristiques de

structure de la glande mammaire. En effet, si l'épithélium mammaire est

33

transplanté avec du mésenchyme dense sous la capsule rénale, il développe une

hyperplasie des canaux avec de nombreuses ramifications mais sans élongation.

En revanche, si l'épithélium est transplanté avec du tissu précurseur du coussinet

mammaire, il se développe normalement. (4, 14)

iii/ Les protéines de matrice extracellulaire

Les interactions entre deux tissus, comme épithélium et mésenchyme,

peuvent être médiées par des signaux diffusibles ou non, incluant des hormones,

des hormones de croissance ou encore des protéines de matrice extracellulaire

(MEC). Les principaux constituants de la MEC sont : les collagènes,

glycoprotéines et protéoglycanes. Parmi ceux-ci, l'épithélium synthétise de la

laminine, du sulfate de protéohéparane et du collagène de type IV tandis que le

mésenchyme produit de la fibronectine. (25-30)

La fibronectine est produite par le mésenchyme mammaire et les

fibroblastes dermiques tout au long de l'embryongenèse mammaire. La laminine et

le sulfate de protéohéparane, en revanche, n'est présente que dans la membrane

basale située entre l'épithélium et le mésenchyme au 14ème jour de gestation

chez la souris. À la fin du 16ème jour, les cellules précurseurs du coussinet

adipeux commencent à déposer de la matière grasse et synthétisent de la

laminine et du sulfate de protéohéparane, habituellement produits par l'épithélium,

tandis que l'épithélium croit et pénètre le tissu précurseur du coussinet adipeux. La

membrane basale est dégradée à la pointe des canaux en développement. (4, 30,

31)

B/ Développement post-natal de la glande mammaire chez la souris

À la différence de la plupart des organes, la glande mammaire subit une

grande partie de sa morphogenèse au cours de la puberté et chez l'adulte. À partir

de la puberté, les glandes mammaires se développent au sein des coussinets

adipeux. Cette caractéristique est importante dans la mesure où, contrairement

aux autres organes, l'étude du développement est rendue plus aisée, le sujet

34

n'étant plus dans l'utérus de la mère. Il est ainsi possible d'étudier le

développement des canaux, les régulations qui s'opèrent sur le tissu ou encore les

interactions entre épithélium et stroma. (4)

i/ Développement de la ramification ductale

a/ Le nouveau-né

Chez la souris nouveau-née femelle, le parenchyme mammaire consiste en

un unique canal primaire relié à la tétine auquel sont reliés des cordons de cellules

épithéliales. Les canaux sont formés d'au maximum deux ou trois couches de

cellules épithéliales et présentent de nombreuses lumières qui fusionnent

progressivement pour former de réels canaux. Les canaux se terminent en

bourgeons terminaux riches en cellules en division (32).

Au cours des trois premières semaines de vie, les canaux s'allongent et se

ramifient. Avec l'élimination des hormones maternelles par le nouveau-né, les

bourgeons terminaux présents à la naissance régressent. La croissance qui a lieu

à cette période est abolie par stérilisation, ce qui suggère que celle -ci est due aux

hormones ovariennes, bien que la maturité sexuelle ne soit pas atteinte avant

l'âge de quatre à six semaines chez les souris et les rats. (33, 34)

Il est intéressant de noter que les cellules épithéliales du fœtus à terme

semblent déjà engagées dans leur voie de différenciation. En effet, la culture de

ces cellules en présence d'hormones permet la différenciation qui se traduit par la

production de caséine. Chez le rat, cette production de caséine peut être obtenue

dès 16 jours en présence d'insuline, de glucocorticoïdes et de prolactine. (35)

Cependant ces cellules ne sont pas complètement déterminées. Greffées

au sein du mésenchyme salivaire, elles se ramifient à la manière de cellules

épithéliales salivaires et forment parfois des adénomères : l'unité sécrétrice des

glandes salivaires. Des expériences similaires ont été menées au sein de la

capsule rénale aboutissant aux mêmes résultats. Chez l'individu en lactation en

revanche, ces tissus ectopiques expriment des lactose synthétases et sécrètent

une substance similaire au lait. Ainsi, il semble que la fonction de l'épithélium

35

mammaire soit déterminée avant la naissance mais que celui-ci conserve une

certaine pluripotence. (36, 37)

La différenciation du stroma mammaire autour de la naissance est

extrêmement importante pour la différenciation de l'épithélium mammaire. La

région mammaire du fœtus présente un mésenchyme dense qui se différencie en

fin de gestation formant le coussinet adipeux. Ce coussinet adipeux est

indispensable à la morphogenèse mammaire et déterminera par la suite les limites

de l'élargissement de la glande. (38, 32)

b/ Le jeune : bourgeons terminaux et canaux

Dès l'âge de trois à quatre semaines chez la souris, un plus tard chez le rat,

les bourgeons terminaux se forment de nouveau à l’extrémité des canaux et le

taux de croissance ainsi que la ramification augmentent. Bien qu'ayant lieu avant

la puberté, ce processus est sous contrôle d'hormones ovariennes puisqu'une

ovariectomie entraine la régression des bourgeons terminaux et l'arrêt de la

croissance en quelques jours. (39, 40)

Le bourgeon terminal permet la croissance mais aussi détermine le profil de

ramification en réponse aux hormones systémiques pour la croissance et aux

signaux locaux pour la ramification. Lorsque les limites du coussinet adipeux sont

atteintes, le stroma envoie un signal entrainant la régression des bourgeons

terminaux. (41) (Fig. 1)

Les bourgeons terminaux ont un diamètre de 0,1 à 0,5 mm et consistent en

quatre à six couches d'épithélium cubique. La lumière est bordée de cellules en

continuité avec les canaux matures qui présentent des microvillosités sur leur face

luminale. (42)

En région basale du bourgeon terminal, les cellules de la couche

superficielle sont très différentes des cellules situées plus en profondeur. Ces

cellules de surface ne sont pas différentiées : elles ne présentent pas de polarité

cytoplasmique, ne possède pas un cytosquelette hautement organisé et ne

forment pas de jonctions avec les cellules voisines ou les cellules de la couche

inférieure. En effet, la destruction de la lame basale avec de la hyaluronidase a

pour conséquence le détachement de ces cellules de surface. (4, 42)

36

Ces cellules se différencient progressivement avec l'éloignement, en latéral,

de l'extrémité du bourgeon, en cellules myoépithéliales. En revanche, il semblerait

que certaines d'entre elles infiltrent les cellules sous-jacentes pour rejoindre les

cellules canalaires. Par ailleurs, des expériences de transplantation ont montré

que des transplants étaient capables de se régénérer dans un coussinet adipeux

dépourvu de glande mammaire. Il semblerait donc que les cellules de surface du

bourgeon soient des cellules souches pluripotentes. (42, 43, 44, 45)

Fig. 1 : Ramifications et bourgeons

terminaux chez une souris femelle de 5

semaines. Extrait de Williams et Daniel

(42)

Les canaux sont composés de deux types cellulaires : des cellules

canalaires en région centrale et des cellules myoépithéliales avec leur membrane

basale en périphérie. Il a été proposé que les cellules myoépithéliales fussent

capables de se dédifférencier et donner des cellules souches de surface au cours

de la formation de ramifications ou d'alvéoles. (32, 42)

La lame basale est synthétisée par les cellules de surface au niveau des

bourgeons terminaux et par les cellules myoépithéliales au niveau des canaux. (42,

27). Au niveau du bourgeon terminal, elle est riche en acide hyaluronique qui

pourrait servir à réduire l'adhésion afin que le bourgeon terminal puisse envahir le

coussinet adipeux. (27)

Un marquage à la 14C-thymidine montre que la réplication a lieu

essentiellement au niveau des bourgeons terminaux. (Fig. 2). Lorsque la glande

atteint les limites du coussinet adipeux, les bourgeons régressent et la glande

reste inactive jusqu'à la gestation.

37

Fig. 2 : Gauche : Marquage de la glande mammaire à la 14C-thymidine chez une souris de cinq semaines. Droite : Coloration à l'hémalun. D'après Daniel et al. (71)

ii/ Régulation de la croissance

a/ Régulateurs de croissance systémiques

Pour étudier le rôle des hormones dans la croissance de la glande

mammaire, des animaux ont été ovariectomisés, hypophysectomysés et

adrénalectomisés, conduisant à une complète régression du tissu glandulaire

mammaire. Par la suite, ils ont été traités avec des hormones stéroïdiennes et

peptidiques, seules ou en association sur une période de 30 jours.

Chez la souris jusqu'à 12 semaines, la croissance ductale est maximale

avec une association d'oestrogènes et d'hormones de croissance. Les hormones

de croissance seules stimulent fortement la croissance avant 12 semaines mais

faiblement par la suite, ce qui pourrait s'expliquer par le fait que les bourgeons

terminaux ont alors atteints les limites du coussinet adipeux. Les oestrogènes

seuls ne stimulent pas la croissance, quelque soit l'âge de l'animal. (46, 47, 48)

b/ Oestrogènes

Des animaux ovariectomisés avec un implant de 17β-oestradiol dans la

glande mammaire présentent une stimulation de la prolifération locale des

bourgeons terminaux sans affecter la glande controlatérale ce qui semble indiquer

une action paracrine de l'hormone. Par ailleurs, cet effet de l'oestradiol n'est

observé que si les cellules épithéliales sont accompagnées de cellules du stroma

ce qui souligne l'importance du micro-environnement cellulaire dans le

38

développement. Nous verrons par la suite que ce micro-environnement joue

également un rôle majeur au cours de la carcinogenèse. (49, 50, 51, 52).

c/ Hormones de croissance et prolactine

De la même manière que pour les oestrogènes, des implants d'hormones

de croissance et de prolactine sont capables de stimuler la prolifération de

l'épithélium mammaire et ce, que les animaux soient ovariectomisés ou non. (46,

47, 49, 53, 54, 55)

d/ Facteur de croissance épidermiques

Il a été montré sur culture en gel de collagène dans un milieu supplémenté

en sérum que le facteur de croissance épidermique EGF ainsi que les facteurs

permettant la production d'AMPc stimulaient la prolifération de l'épithélium

mammaire. Le même type d'expérience dans un milieu non supplémenté en

sérum a montré que l'association d'insuline, EGF, transferrine, sérum albumine

bovin et choléra toxine pouvait accroitre la prolifération cellulaire d'un facteur 10

en l'espace de 10 jours. Inversement, en l'absence d'EGF et d'insuline, la

croissance est inhibée. Enfin, EGF agit en synergie avec la prolactine et la

progestérone pour stimuler la croissance. (56, 57, 58)

Des expériences d'implants d'EGF chez des souris ovariectomisées ont

montré que l'action du facteur de croissance était dose dépendante. (Fig. 3)

Fig. 3 : Réponse à l'EGF dose-dépendante chez la souris ovariectomisée. Extrait de Coleman et al. (49)

39

iii/ Interactions épithélium-stroma

a/ Croissance organotypique et stroma

Les cellules épithéliales mammaires sont incapables de former des canaux

et des bourgeons terminaux in vitro, même si elles sont mises en culture dans un

gel de collagène, ce qui suggère que la présence du stroma est indispensable au

développement de la glande mammaire. Les cellules sont cependant toujours

capables de subir la morphogenèse normale. En effet, des cellules épithéliales

mammaires issues de cultures cellulaires sont capables de former des

ramifications de nouveau lorsqu'elles sont placées dans un coussinet adipeux

dépourvu de parenchyme. (53, 54, 59)

Il est intéressant de constater que si l'on injecte dans le coussinet adipeux

de souris du collagène de type I que l'on laisse polymériser puis que l'on introduit

un fragment de canal mammaire, en trois à six jours, ce dernier prend un aspect

cranté en raison de la formation de cul-de-sacs épithéliaux semblables à ceux

formés in vitro en gel de collagène. Lorsque les cellules atteignent le coussinet

adipeux, des bourgeons terminaux normaux se forment, ce qui souligne

l'importance du tissu adipeux pour le développement de l'épithélium mammaire.

(60)

b/ L'épithélium subadulte conserve un potentiel embryonique

Chez le jeune, l'épithélium mammaire est encore sensible au mésenchyme

embryonnaire. Ainsi, des cellules épithéliales mammaires de l'animal subadulte

transplantées dans du mésenchyme salivaire développent une morphologie de

glande salivaire. En revanche, le même transplant dans du mésenchyme

pulmonaire, pancréatique ou méta-néphrogénique n'a pas d'effet, ce qui montre

que la plasticité est réduite. La gestation rend ces cellules unipotentes, avec

absence de réponse à une transplantation dans du mésenchyme salivaire. (61)

40

c/ Réorganisation du stroma

La région comprise entre le bourgeon terminal et le canal mammaire est

une zone de forte activité morphogénique où, en l'espace de 200 à 300 μm, le

diamètre du bourgeon terminal est réduit d'un facteur dix pour atteindre le

diamètre du canal. De façon concomitante, le stroma s'enrichit en fibrocytes qui

s'orientent le long des flancs du bourgeon terminal et du canal mammaire et

produisent du collagène. (42)

Au cours de la formation des fibrocytes, du glycosaminoglycane est

synthétisé, en particulier de la chondroïtine sulfate. (27, 62)

d/ Synthèse d'ADN du stroma

Des expériences de radio marquage chez la souris et le rat ont montré de

la synthèse d'ADN au sein du stroma jusqu'à 250 μm de distance du bourgeon

terminal, avec une réplication décroissante au fur et à mesure de l'éloignement du

bourgeon terminal. En revanche, les canaux en régression et l'épithélium

mammaire sénescents ne sont pas associés à de la synthèse d'ADN dans le

stroma, ce qui suggère que l'épithélium en prolifération induit la synthèse d'ADN

dans le stroma. (63, 64)

Cette réponse du stroma sert à produire des fibrocytes comme expliqué

précédemment. Par ailleurs, une partie des cellules en réplication sont des

cellules endothéliales en division en raison de l'angiogenèse qui se produit dans la

glande mammaire au cours du développement.

e/ Induction des récepteurs

Des expériences d'autoradiographie des récepteurs aux EGF révèlent que

le nombre de récepteur par cellule dans le stroma est augmenté d'un facteur 5

entre le stroma adjacent aux flancs du bourgeon terminal et le stroma éloigné du

bourgeon ; ce qui suggère que l'épithélium en croissance induit une activité des

récepteurs aux EGF de façon locale. Chez l'embryon mâle, l'épithélium mammaire

entraîne l'expression de récepteurs aux androgènes dans les cellules du

41

mésenchyme adjacentes. Plus tard, ces cellules participent à la destruction des

rudiments mammaires induite par les androgènes. (49, 65, 66)

iv/ Vieillissement des cellules mammaires

Les cellules, non immortalisées ou transformées, en culture présentent un

potentiel de croissance limité, proportionnel à l'espérance de vie de l'espèce du

donneur et qui ne peut pas être significativement accru par des modifications du

milieu de culture. (19, 68, 69)

Les milieux de culture n'étant pas un bon reflet du micro-environnement des

cellules in vivo, des expériences de transplantations séquentielles au cours

desquelles l'épithélium mammaire est transplanté de façon successive dans de

nouveaux coussinets mammaires dépourvus de glande mammaire chez des

animaux jeunes permet de reproduire des interactions normales épithélium-stroma

dans des conditions physiologiques. Ces expériences ont permis de mieux

comprendre le vieillissement des cellules mammaires :

1. Les cellules mammaires ont une espérance de vie limitée, même dans des

conditions jugées optimales (Fig. 4). La croissance décroit de 15 % en moyenne à

chaque génération (Fig. 5). Cette baisse de croissance reflète la sénescence

cellulaire.

2. La sénescence est liée au nombre de divisions cellulaire et non au temps

écoulé.

3. Les nodules alvéolaires hyperplasiés (lésions pré-cancéreuses) sont formés de

cellules immortalisées qui n'entrent pas en sénescence.

4. La sénescence des cellules mammaires résulte d'une perte progressive de

capacité à répondre aux facteurs mitogènes. Le tissu sénescent, qui a perdu sa

capacité de prolifération chez la souris vierge peut cependant être stimulé et

proliférer de nouveau en réponse à des signaux hormonaux différents comme lors

d'une gestation. Cependant, dans le cas d'une gestation, la prolifération va donner

naissance à des alvéoles et non à des bourgeons terminaux.

5. Les cellules mammaires sénescentes peuvent entrer en division en réponse à

la choléra-toxine, un stimulant de la production d'AMPc ; ce qui est en accord avec

l'hypothèse selon laquelle, suite à une exposition répétée à un facteur mitogène, la

42

cellule cesse de répondre et entre en sénescence. (43, 45, 71, 72, 73, 74, 75, 76,

77, 78)

Fig. 4 : Transplantations successives de tissu mammaire (3 mois entre chaque transplantation). A. Première génération : tout le coussinet adipeux est occupé B. Quatrième génération : tissu de 16 mois, seuls 25 % du coussinet adipeux sont occupés. Issu de Daniel et al. (71)

Fig. 5 : Diminution du taux de croissance de 15 % à chaque génération. Issu de Daniel et al. (71)

43

II/ Carcinogenèse

A/ Principes de base

i/ Evolution clonale

Le cancer est une maladie qui a une base génétique. Que la tumeur soit

due à un virus ou à un autre carcinogène, l'ADN des cellules tumorales est

toujours affecté. Il s'agit également d'une maladie présentant une progression

clonale. En effet, la tumeur a pour origine une seule cellule qui se divise et donne

naissance à un grand nombre de clones. Au fur et à mesure que les cellules

accumulent des mutations, les cellules présentant les caractéristiques les plus

agressifs, tels que croissance rapide ou résistance à certaines molécules de

chimiothérapies deviennent prédominantes. Certaines tumeurs sont dites

polyclonales car provenant de plusieurs cellules, porteuses de mutations

différentes, chacune progressant de façon clonale. Ces tumeurs sont encore plus

difficiles à traiter en raison de leur polymorphisme.

ii/ Cycle cellulaire, senescence et apoptose

L'une des caractéristiques majeures des tumeurs malignes est la

dérégulation de l'équilibre entre division et mort cellulaires. Dans des conditions

normales, l'équilibre peut être rompu, en faveur de la division cellulaire au cours

du développement par exemple ou en faveur de la mort cellulaire au cours de

l'involution du tissu mammaire post lactation par exemple. Ceci étant, ce

déséquilibre est toujours hautement contrôlé, ce qui n’est pas le cas dans les

cellules cancéreuses. En effet, ces dernières échappent aux signaux contrôlant la

division et la mort cellulaires et les détournent à leur avantage afin de se

développer aux dépends des cellules avoisinantes.

Le cycle cellulaire se divise en quatre phases majeures nommées G1, S, G2

et M (Fig. 6). La réplication de l'ADN a lieu au cours de la phase S, alors que la

mitose et la cytokinèse ont lieu au cours de la phase M. Les phases G1 et G2 sont

44

des phases de préparation aux phases S et M, respectivement. Ce sont les

phases sujettes aux plus importantes régulations. Les cyclines et kinases

dépendantes des cyclines (CdK) sont des protéines clefs de cette régulation. En

cas de signal de croissance, on observe une augmentation du nombre de cyclines

qui se lient et ainsi activent les CdK qui à leur tour phosphorylent des facteurs en

aval, principalement oncogènes ou tumeurs suppresseurs tels que les protéines

p53 et Rb, levant ainsi l'arrêt du cycle cellulaire. La protéine CDK1 est

responsable de la sortie de la phase G1 tandis que la protéine CDK2 est

responsable de la transition G2/M. (79)

Fig. 6 : Cycle cellulaire

La présence d'inhibiteurs de croissance ou l'absence de facteurs de

croissance induisent l'arrêt du cycle cellulaire. Dans certaines conditions, comme

par exemple en présence de dommages de l'ADN ou en cas de raccourcissement

des télomères, cet arrêt est irréversible. Les cellules sont alors dites sénescentes.

Dans le cadre du cancer, ces cellules sont importantes car elles ont la capacité de

sécréter des facteurs de croissance et ainsi former un micro-environnement pro-

oncogène, comme c'est le cas pour les fibroblastes sénescents par exemple.

Plusieurs gènes sont impliqués dans l'induction et la maintenance de la

sénescence parmi les quels on peut citer le gène tumeur suppresseur p53 et sa

cible l'inhibiteur des CDK (CDKI) p21, activés de façon transitoire après le signal

45

induisant la sénescence. Une fois que l'activité de ces gènes est réduite, un autre

CDKI, p16, est régulé à la hausse (Fig. 7). Le fait que ces trois gènes soient des

tumeur-suppresseurs montre l'importance de la sénescence comme mécanisme

anti-carcinogène (80).

En réponse à des signaux intrinsèques ou

extrinsèques, la cellule meurt ensuite part « mort

cellulaire programmée » ou apoptose. La voie

extrinsèque a pour origine des récepteurs activés

par des ligands de la famille TNF (Tumor Necrosis

Factor) tels que TRAIL (TNF-Related Apoptosis-

Inducing Ligand). La voie intrinsèque implique les

mitochondries qui, en réponse à certains signaux

libèrent des facteurs pro-apoptotiques tels que le

cytochrome c (cyt c) dans le cytoplasme. Dans les

deux cas, l'éxécution de la réponse apoptotique

requiert l'activation de protéases : les caspases (Fig.

8 (3)). Une fois dans le cytoplasme, le cyt c forme

un complexe avec Apaf-1 (APoptosis Activating

Factor-1), de l'ATP et la procaspase-9, que l'on

nomme l'apoptosome. La procaspase-9 est activée

en caspase-9 qui est une caspase initiatrice qui à

son tour active d'autres caspases dites exécutrices

telles que caspases-3, -6 et -7. La cascade

protéolytique est alors activée entraînant le

phénotype apoptotique : condensation de la

chromatine, fragmentation de l'ADN, rétrécissement

du noyau etc. Enfin, les vésicules apoptotiques sont

phagocytées.

Parmi les gènes importants dans la régulation de

l'apoptose figurent les membres de la famille Bcl-2

parmi lesquels certains sont pro-apoptotiques : Bcl-2, Bcl-XL et Mcl-1 alors que

d'autres sont anti-apoptotiques : Bak et Bax. La balance entre ces gènes pro-

apoptotiques et anti-apoptotiques joue un rôle important dans la régulation de

46

l’exécution de l'apoptose. La conversion vers la malignité et le phénotype

tumorigène requiert l'acquisition de la résistance à l'apoptose. En effet, la

prolifération seule est insuffisante pour la formation cancéreuse et induit

l'apoptose de façon directe ou indirecte. A la prolifération doivent être associés

des signaux de survie produis par les facteurs de croissance qui sont souvent

surexprimés dans les cellules cancéreuses. Une forme particulière d'apoptose,

nommée « Anoikis », liée à des contacts anormaux entre cellules et matrice

pourrait jouer un rôle important dans le processus de métastase. Enfin, l'apoptose

est également induite par raccourcissement des télomères et le gène tumeur

suppresseur p53 est d'importance majeure dans cette forme d'apoptose (81).

Fig. 8 : Deux voies principales d’induction de l’apoptose. D’après Hippokratis (82)

47

B/ Les gènes impliqués dans la carcinogenèse

i/ Oncogènes

Pour être qualifié d'oncogène, un gène doit pouvoir entraîner la

transformation de cellules non cancéreuses. Pour pouvoir l'évaluer, on réalise

deux tests, le plus souvent sur fibroblastes après (sur)expression du gène dans

les cellules :

1/ Indépendance d'ancrage et absence d'inhibition de contact. En effet les cellules

non cancéreuses, même immortalisées requièrent un attachement à une

membrane basale et cessent de proliférer lorsqu'elles deviennent confluantes. Par

opposition, les cellules cancéreuses peuvent croitre au dessus les unes des

autres et former des foci (Fig. 9). Par ailleurs, ces cellules sont mises en culture

en gel mou (moins de 1% d'agar ou agarose), où seules les cellules cancéreuses

sont capables de croitre.

Fig. 9 : Formation de foci. D’après Hippokratis (82)

2/ Formation de tumeurs in vivo. Pour cela, on utilise des souris

immunocompétentes, le plus souvent nude, auxquels on injecte en sous cutanée

les cellules surexprimant le gène à tester. Si des tumeurs se développent au cours

des un ou deux mois suivant l'injection, le gène peut être considéré oncogène.

Ces tests sont relativement bons et prédictifs, il faut cependant garder en

mémoire certaines limites associées. En effet, le contexte cellulaire et tissulaire

est très important pour la croissance tumorale. Ainsi, les cellules de carcinomes

mammaires MCF7 par exemple ne peuvent se développer que chez des souris

nude supplémentées en hormones co-injectées avec des fibroblastes.

Inversement, la surexpression du gène à tester est extrêmement élevée par

rapport à l'expression endogène, parfois de plusieurs ordres de magnitude. De

plus, les cellules testées sont immortalisées, ce qui implique qu'elles sont déjà

porteuses d'un certain nombre de mutations. Enfin, il est à noter que les cellules

48

murines sont plus prônes à la cancérisation que les cellules humaines, en

particulier dans les conditions de ces tests.

Les oncogènes peuvent coder des protéines nucléaires (facteurs de

transcription), cytoplasmiques (enzymes solubles), membranaires (récepteurs) ou

sécrétées (facteurs de croissance). Ils sont sujets à de nombreuses mutations

donnant lieu à des allèles hyperactifs, ce qui peut se traduire par des mutations

ponctuelles générant des protéines constitutivement actives. C'est le cas des

mutations ponctuelles dans les codons 12, 13 et 16 des membres de la famille ras.

Une autre forme d'activation consiste à surexprimer le gène, sans que celui-ci ne

soit porteur de mutation. Il s'agit alors d'un changement quantitatif et non qualitatif.

Ceci peut être le résultat d'une activation de la transcription ou d'une amplification

(82)

Il est intéressant de noter que de nombreux oncogènes ont d'abord été

identifiés par l'étude de virus capables d'engendrer des cancers. On distingue

alors la version virale de l'oncogène v-onc et la version endogène, ou cellulaire, de

l'oncogène c-onc. On peut prendre src comme exemple d'un tel oncogène,

découvert par l'étude du RSV (Rous Sarcoma Virus).

a/ L'oncogène myc

L'oncogène myc est l'un des oncogènes humains les plus puissants pour

l'induction de la tumorigenèse in vitro et in vivo. Initialement identifié comme cible

de translocation dans les lymphomes primaires de Burkitt conduisant à sa

surexpression, il a ensuite été montré que sa surexpression était commune dans

les tumeurs humaines. Les protéines codées par le gène myc sont des facteurs de

transcription présentant des motifs hélice-boucle-hélice et leucine zipper. La

protéine Max peut former un hétérodimère avec la protéine Myc formant ainsi un

facteur de transcription actif. A l'inverse, lorsque la protéine Max se lie aux

protéines Mad ou Mnt, la transcription des gènes sous le contrôle de Myc est

inhibée (Fig. 10). La séquence reconnue par Myc est courte : CAYGTG, ce qui

explique que ce facteur de transcription se lie à environ 15 % des gènes humains.

L'oncogène myc est également responsable de la régulation à la hausse directe

49

du gène hTERT, codant la sous-unité catalytique des télomérases, ce qui souligne

son importance dans l'immortalisation des cellules.

Fig. 10 : L’oncogène Myc et la protéine Max. D’après Hippokratis (82)

De facon paradoxale, myc est également capable de causer l'apoptose. Par

exemple, il a été montré que myc pouvait inhiber l'activation de p21Waf1, un

inhibiteur des CDK, induite par la protéine p53. Ceci favorise la réponse

alternative engendrée par p53 qui est proapoptotique. Ceci suggère que, pour

pouvoir causer le cancer, la voie pro-apoptotique induite par myc doit être

réprimée. (83, 84, 85)

b/ L'oncogène ras

Les oncogènes ras contrôlent de nombreux processus cellulaires tels que

la prolifération, la transformation maligne et l'angiogenèse et joue aussi un rôle

d'intermédiaires dans de nombreuses voies de signalisation. Leur activation

engendre de nombreuses cascades de signalisation résultant dans la régulation

de la croissance, du développement et de l'oncogenèse.

On distingue trois membres dans la famille ras : H-ras, K-ras et N-ras. Les

gènes de la famille ras codent de petites GTPases de 21kDa p21ras localisées à la

50

surface de la membrane plasmique. La forme active de cette protéine est liée à

une molécule de GTP alors que la forme inactive est liée à une molécule de GDP.

À la réception du signal d'activation, des facteurs spécifiques d'échange du

nucléotide guanine (GEFs) induit la formation de Ras-GTP, tandis que des

protéines d'activation des GTPases (GAPs) stimulent l'activité GTPasique de ras,

induisant la transition de ras-GTP à ras-GDP, inactivant ainsi le complexe (Fig. 11).

Fig. 11 : Régulation de la protéine p21 par GEF et GAP

Des mutants de la famille ras sont fréquemment trouvés dans les tumeurs

primaires humaines. Les mutations sont le plus souvent des substitutions d'une

seule base dans les codons 12, 13 et 61. La forme altérée de la protéine p21ras

est insensible à la régulation par les GAP, ce qui la rend constitutivement active,

entrainant un signal mitogène indépendemment de toute stimulation par un ligand.

Parmi les nombreux effecteurs de ras, deux sont d'importance majeure :

Raf et PI3K (Phosphatidylinositide 3 Kinase). Raf est une protéine kinase activée

par des agents mitogènes MAPKKK (Mitogen-activated protein kinase kinase

kinase) qui active les sérine/thréonine protéine kinases MEK1/2 (MAPKK) qui à

leur tour activent les MAPKs. Enfin, les MAPKs sont transloquées dans le noyau

et activent par phosphorylation divers facteurs de transcription. La PI3K quant à

elle convertit le phosphatidylinositol-4,5-phosphate (PIP2) en phosphatidylinositol-

3, 4,5-phosphate (PIP3). La formation de PIP3 résulte dans l'activation de la

protéine kinase B / Akt qui présente une activité sérine / thréonine kinase qui

entraîne une cascade de phosphorylation. Cette cascade inhibe l'inhibition de

protéines anti-apoptotiques telles que Bcl-XL par Bad, inhibe des protéases

associées à l'apoptose telles que la caspase-9 et active NF-KB en supprimant

51

l'activité de son inhibiteur IKB. Au final on observe des effets prolifératifs et anti-

apoptotiques. (86, 87)

c/ Le récepteur tyrosine kinase ErbB2

Les récepteurs tyrosines kinases sont des récepteurs transmembranaires

dont l'extrémité N-terminale est extra-cellulaire et présente un site de liaision pour

le ligand, tandis que l'extrémité C-terminale est intra-cellulaire et présente l'activité

kinase. En réponse à la liaison du ligand, les récepteurs peuvent s'homo ou

s'hétérodimériser, activant leur activité kinase et par suite une cascade de

phosphorylation. Parmi les différents récepteurs tyrosine kinase, la famille ErbB

est particulièrement importante dans la carcinogenèse. La famille se compose de

quatre membres : ErbB1-4. ErbB2 présente un rôle majeur dans la carcinogenèse

mais est à ce jour un récepteur orphelin, c'est à dire que l'on ne connaît pas son

ligand. Le récepteur RebB3 quant à lui ne présente pas d'activité catalytique,

uniquement une activité régulatrice. Il est intéressant de noter cependant que le

dimère ErbB2-ErbB3 présente l'activité la plus importante, plus qu’ErbB2-ErbB2

par exemple. Les ligands de ces récepteurs contiennent pour la plupart le motif

spécifique des facteurs de croissance épidermiques (EGF). Ce ne sont pour

autant pas les seuls ligands ; on peut noter en particulier la liaison du facteur de

croissance TGF-beta (transforming growth factor) avec le récepteur ErbB1. Parmi

les effecteurs des récepteurs ErbB, plusieurs ont une activité oncogène reconue,

tels que Src, c-Yes, c-Abl, PI3K ou encore Ras. (88)

d/ Les microARNs comme oncogènes

Les microARNs sont de courtes molécules d'ARN, faisant en moyenne 21

nucléotides (variant le plus souvent de 18 à 24 nucléotides) résultant de molécules

plus larges, polycistroniques maturées par des ARNases spécifiques. Il a été

montré une expression aberrante de ces microARNs dans des tumeurs primaires.

De façon intéressante, l'expression de ces microARNs semble prédire l'agressivité

de la tumeur. Une étude avec le micro-ARN mir-17-92, localisé dans une région

souvent amplifiée dans les lymphomes et autres cancers s'est avéré accélérer la

52

tumorigenèse dans un modèle de lymphome murin. Si le mécanisme d'action de

ces microARNs est à ce jour encore inconnu, ils semblent présenter un grand

intérêt pour de plus amples recherches. (89, 90)

e/ Les oncogènes dans la recherche contre le cancer

La découverte des oncogènes a permis de faire d'important progrès, en

particulier dans le diagnostic. Il est en effet possible de détecter des mutations

dans ces oncogènes avant même que le patient ne présente de signe clinique. Ils

représentent également une cible thérapeutique majeure. Ainsi le récepteur Her-

2/neu (Human Epidermal growth factor Receptor 2), autre nom du récepteur

ErbB2, fréquemment surexprimé dans les cancers du sein hormone indépendants

avec un mauvais pronostique, peut être la cible d'un anticorps qui bloque son

activité. Un tel anticorps a été développé : trastuzumab (Herceptin). Un autre

exemple de médicaments ciblant l'activité des oncogène est trouvé avec

l'oncogène ras. Une modification post-traductionnelle de p21ras est nécessaire

pour que la protéine acquiert sa complète activité : la farnésylation, réalisée par

une enzyme appelée la farnésyl transférase. Des inhibiteurs de cette enzyme sont

actuellemet à l'étude clinique.

En plus des problèmes associés à tout médicament tels que leur possible

toxicité, les tumeurs acquièrent fréquemment de nouvelles mutations les rendant

indépendante de la mutation oncogénique d'origine. (91)

ii/ Gènes tumeur-suppresseurs (TSGs)

Ces gènes codent en général des protéines nucléaires impliquées d'une

façon relativement directe dans l'inhibition de la progression du cycle cellulaire,

l'arrêt du cycle cellulaire ou l'apoptose. Il existe des exceptions comme PTEN

(Phosphatase and Tensin homolog deleted on chromosome 10) qui est une

phosphatase à la fois pour les protéines et pour les lipides qui notamment inactive

certaines enzymes en les déphosphorylant. Une autre exception est le récepteur

IGF (Insulin-like Growth Factor) de type II qui est un récepteur membranaire.

53

En raison de leur rôle de régulation négative de la prolifération cellulaire,

leur activité normale doit être diminuée ou perdue au cours de la carcinogenèse.

Les gènes de maintien de l'intégrité de l'ADN sont aussi à classer parmi les TSGs

puisque, en effet, leur perte entraîne l'acquisition accrue de mutations. On appelle

ces derniers gènes gardiens ou « caretaker » par opposition aux gènes tumeurs

suppresseurs « classiques » contrôlant en particulier la prolifération cellulaire que

l'on appelle « gatekeeper ». Dans cette partie, on s'intéressera aux gènes

gatekeeper tandis que les caretaker seront vus plus en détail dans la partie

suivante sur l'instabilité génomique. Certains mécanismes de leur activation sont

cependant communs, bien que ces gènes soient traités dans deux sous-parties

distinctes. (82)

a/ Génétique des TSGs dans le cancer

1/ Hypothèse de Knudson sur l'inactivation des TSGs

Ce modèle a été proposé à l'origine pour le rétinoblastoma, en comparant

les formes héréditaires et non héréditaires de la maladie. Par la suite le modèle en

deux étapes de Knudson s'est avéré applicable à presque tous les TSGs. D'après

ce modèle, les deux allèles normaux doivent être inactivés pour permettre la

progression cancéreuse, requiérant donc deux atteintes génétiques pour la perte

de leur fonction. Dans les formes héréditaires, un allèle a déjà été inactivé par

délétion, mutation ou tout autre mécanisme affectant les cellules de la lignée

germinale. Les formes héréditaires progressent plus vite puisque la premèire étae

a déjà eu lieu et qu'une seule atteinte supplémentaire est requise pour la perte

d'activité du TSG (Fig. 12).

54

Fig. 12 : Hypothese de Knudson. Adaptee d’Hippokratis (82)

Ainsi, d'après ce modèle, la première étape peut être une mutation faux-

sens ou une petite délétion entrainant l'inactivation d'un des deux allèles ; alors

que la deuxième étape résulte dans l'inactivation fonctionnelle de l'allèle restant

qui peut se produire par divers mécanismes. La perte d'un chromosome entier ou

la fragmentation chromosomale pourraient constituer cette seconde atteinte en

réduisant l'haplotype des TSGs à l'hémizygotie. Cependant ce ne sont pas les

seuls mécanismes d'inactivation, on peut en particulier considérer des

mécanismes épigénétiques tels que l'hyperméthylation du promoteur ou une

recombinaison mitotique qui éliminerait l'allèle sauvage et le remplace par une

copie de l'allèle muté (Fig. 13). Toutes les altérations résultant dans la perte

d'hétérozygotie des TSGs et la génération de cellules porteuses uniquement de

l'allèle muté soit homozygotes soit hémizygotes, en fonction du mécanisme les

générant, sont regroupées sous le terme général « perte d'hétérozygotie » ou LOH

(Loss Of Hétérozygotie).

2/ Analyse de la perte d'hétérozygotie

Pour réaliser une telle analyse, des marqueurs répartis dans l'ensemble du

génome sont utilisés, soit des RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)

qui correspondent à la substitution d'une base unique, soit des polymorphismes de

55

microsatellites qui correspondent à un nombre de répétition différent de la

séquence microsatellite de base (Fig. 14). Dans les deux, le polymorphisme

permet de distinguer les deux allèles et par suite l'identification de la perte de l'un

de ces deux allèles dans le cas de LOH. En général, les études analyses de

banques d'échantillons pour localiser le nouveau TSG. Si un TSG est impliqué

dans la maladie, des fragments de chromosome se recoupant devraient avoir

perdu ce TSG. On appelle région minimale de délétion la portion du chromosome

qui présente la LOH avec une plus forte incidence dans plusieurs échantillons de

tumeurs ; cette région est la plus probable de contenir le TSG. Pour réduire au

maximum la taille de cette région, on utilise des marqueurs à haute densité, c'est à

dire proches les uns des autres (Fig. 15).

Fig. 13 : Perte d’heterozygotie. D’apres Hippokratis (82)

Cette analyse présente cependant des

limites qui expliquent pourquoi de nombreuses

études ne parviennent pas à identifier de TSG. La

limite majeure consiste dans le fait que la détection

de LOH suppose que la population de cellules est

homogène et a perdu l'allèle d'intérêt de façon

uniforme. Ceci est incorrect puisque les

échantillons ne contiennent pas que des cellules

tumorales. Ils contiennent également des cellules

de stroma qui sont génétiquement presque

normales. Par ailleurs, les cellules tumorales

présentent une hétérogénéité significative en raison du développement clonal des

cellules tumorales. En effet, seules les mutations apparues tôt au cours de la

carcinogenèse seront présentes dans l'ensemble des cellules ; toute mutation

acquise de façon plus tardive ne sera présente que dans une sous-population de

cellules tumorales. Une autre limitaion résulte dans le fait que le modèle de

Knudson, bien qu'applicable dans de nombreux cas, est trop simpliste. En effet, de

nombreuses cellules cancéreuses sont polyploïdes ou aneuploïdes.

56

Fig. 14 : Analyse de la perte d’heterozygotie. Adaptee d’Hippokratis (82)

Les avacées technologiques, en particulier les chips ADN ainsi que les

techniques de microdissection permettant d'isoler de façon précise différentes

populations cellulaires au sein de la tumeur devraient résoudre ces problèmes. (92,

93)

Fig. 15 : Region minimale de deletion. Adaptee d’Hippokratis (82)

57

3/ Haploinsuffisance

D'après l'hypothèse de Knudson qui est applicable à la vaste majorité des

TSGs, ces gènes sont récessifs pour la carcinogenèse du fait qu'une mutation à

l'état hétérozygote est insuffisante pour produire les changements phénotypique et

en particulier le cancer. L'allèle restant doit également être inactivé. Cependant, il

existe des exceptions pour lesquelles le TSGs à l'état hémizygote est insuffisant

pour exercer son action tumeur suppressive. Ces gènes agissent de façon dose-

dépendante. C'est notamment le cas des régulateurs du cycle cellulaire de la

famille CIP/KIP, p21 et p27, respectivement.

Pour montrer qu'un TSG se comporte de façon haploinsuffisante dans la

carcinogenèse, il doit répondre à deux critères :

1/ Une délétion allélique se produit qui est associée avec la carcinogenèse

2/ L'allèle restant est exprimé dans les cellules tumorales, dans sa forme sauvage,

non affecté par aucune mutation, à plus faible niveau en raison de l'hémizygotie.

(94)

b/ Rôle et propriétés de certains TSGs

1/ Rb

Les protéines Rb et p53 sont des protéines nucléaires et sont considérées être

parmi les plus importants régulateurs du cycle cellulaire. Lorsque le gène Rb est

muté chez l'Homme, il est responsable du développement de tumeurs de la rétine :

rétinoblastoma. Il est le TSG à l'origine de l'hypothèse de Knudson. Par la suite, le

gène muté a été trouvé dans d'autres types de cancer tels que les carcinomes

pulmonaires à petites cellules ou encore les ostéosarcomes.

Rb est responsable pour l'arrêt du cycle cellulaire en G1 en se liant aux

facteurs de transcription E2F et DP1 et prévenant la transcription des gènes

nécessaires à la phase S tels que les cyclines, CDK, DNA polymérase alpha et

autres enzymes impliquées dans la réplication de l'ADN. En revanche, le fait que

cette protéine intéragisse physiquement avec plu de 100 protéines laisse à penser

que son rôle est probablement plus complexe que pensé à l'origine.

58

L'inactivation de Rb par phosphorylation est médiée par des CDKs, en

particulier CDK4 et CDK6, elles-mêmes inhibées par le TSG p16 (Fig. 16) (95, 96)

Fig. 16 : Régulation de la protéine Rb

2/ p53

La protéine p53 est mutée dans près de 50% des tumeurs primaires

humaines. Ce gène code un facteur de transcription de 53 kDa qui est considéré

comme étant le médiateur majeur de réponse de la cellule au stress par des

agents causent des dommages de l'ADN, hypoxie, oncogènes activés et autres

facteurs génotoxiques inducteurs de stress. Son activation résulte dans l'arrêt du

cycle cellulaire ou l'apoptose par liaison aux séquences régulatrices du promoteur

des gènes cibles entrainant leur activation ou leur inhibition. La protéine p53 est

sujette à de nombreuses modifications post-traductionnelles, en particulier

phosphorylation, entrainant son activation ou inactivation par changement

conformationnel affectant sa capacité de liaison spécifique à l'ADN. L'une des

voies de régulation de l'activité de p53 est sous le contrôle de Arf1 qui inhibe la

protéine Mdm2, qui est, elle même un inhibiteur de p53 activée par feedback

négatif par la forme activée de p53 (Fig. 17). (96)

59

Fig. 17 : Régulation des TSGs Rb et p53 par Ink4a/Arf.

Mdm2 peut inhiber p53 en se liant à la région N-terminale, ce qui empêche

l’interaction avec d'autres protéines critiques pour son activité de facteur de

transcription. Par ailleurs, Mdm2 présente également une activité E3 ubiquitine

ligase qui entraine la dégradation de p53 par le protéasome. Mdm2 est

fréquemment amplifié dans les tumeurs primaires, ce qui souligne son importance

dans la tumorigenèse.

L'activation de p53 peut entrainer l'arrêt du cycle cellulaire ou l'apoptose et

le contexte tissulaire semble jouer un rôle importance dans l'orientation de la

réponse. En effet, les fibroblastes répondent à l'activation de p53 suite à des

dommages de l'ADN par arrêt du cycle cellulaire tandis que les cellules

épithéliales répondent par l'induction de l'apoptose. Trois hypothèses ont été

proposées pour expliquer cette décision.

1/ D'importants dommages de l'ADN vont entrainer une activation prolongée de

p53 aboutissent à l'apoptose tandis que des dommages moins importants

n'entrainent qu'un arrêt transitoire du cycle cellulaire.

2/ La décision est pré-déterminée en fonction du type cellulaire.

3/ La décision dépend de la disponibilité en co-facteurs exprimés dans ces

conditions. (97, 98)

La fonction de p53 est associée à sa capacité de reconnaître des

séquences spécifiques du promoteur des gènes cibles. Cependant, de plus

60

récentes études montrent que p53 peut se lier avec une haute affinité à des

structures de l'ADN, indépendamment de leur séquence. Ces structures

comprennent de l'ADN mal assorti (mismatch) ou formant des protubérances

(bulging DNA), ce qui montre l'implication directe de p53 dans la réparation de

l'ADN. (99)

3/ Famille CIP/KIP (p21Waf1/Cip1 et p27Kip1)

L'inibiteur des CDK p21 (p21Waf1/Cip1) a d'abord été identifié comme le

premier gène dont la transcription est activée par p53. Des études récentes ont

montré que son rôle était plus complexe que la simple inhibition des CDKs et

pourrait avoir une action indépendante de l'activation par p53.

La régulation du cycle cellulaire par p21 est exercée par sa capacité à se

lier aux CDKs et inhiber leur activité. Des études récentes ont montré que des

complexes de p21, cyclines et CDKs pouvaient être trouvés dans une forme active.

Par ailleurs, dans certaines conditions, p21 peut être nécessaire pour la

progression de la phase G1 à la phase S. Il semblerait que la localisation de p21

dans la cellule joue un rôle important dans son action. Si sa localisation nucléaire

entraine l'arrêt du cycle cellulaire, sa localisation cytoplasmique pourrait entrainer

la progression du cycle cellulaire et prévenir l'apoptose. Le niveau précis de p21

pourrait également jouer un rôle clef. Le niveau basal de p21 pourrait aider à la

formation de complexes cycline/CDK et donc entrainer la progression du cycle

cellulaire tandis que des niveaux plus élevés bloqueraient l'activité des CDK.

La régulation de p21 est également réalisée par sa dégradation par le

protéasome, régulée par l'antigène de prolifération nucléaire (PCNA – Proliferating

nuclear antigen)

L'autre membre de la famille CIP/KIP est la protéine p27Kip1 qui agit de

façon similaire à p21 par sa liaison aux CDKs. Il s'agit du premier exemple de TSG

haploinsuffisant dans la carcinogenèse. (100, 101)

61

iii/ Instabilité génomique

Le haut niveau de lésions génétiques dans les cellules tumorales n'étant

pas compatible avec le taux de mutation dans les cellules normales (10-7 mutation

/ nucléotide / division cellulaire), il a été proposé que les cellules tumorales avaient

acquis un phénotype « mutateur ». Cette hypothèse a été confirmé par la

découverte de formes familiales de cancer dans lesquels les mécanismes de

maintien de l'intégrité du génome étaient altérés parmi lesquels on peut citer

Xeroderma pigmentosum (XP) ou encore le cancer colorectal héréditaire sans

polypose (HNPCC – Hereditary nonpolyposis colorectal cancer) ainsi que

l'existence d'animaux prédisposés au développement de tumeurs en raison de

défauts de réparation de l'ADN ou de ségrégation des chromosomes. Par ailleurs,

des formes sporadiques de cancer portant des mutations dans les gènes de

réparation de l'ADN ont également été trouvés, ce qui suggère qu'une réduction

de la fidélité de réplication est une caractéristique intrinsèque des toutes les

tumeurs. Les mécanismes de maintien de l'ADN peuvent être divisés en deux

grandes sous parties :

1/ Les mécanismes de protection contre l'instabilité chromosomique qui incluent

tous les points de contrôle du fuseau mitotique

2/ Les mécanismes de maintien de la stabilité subchromosomique. En cas de

dommage d'un ou d'un petit nombre de nucléotides, deux mécanismes peuvent

intervenir : réparation par excision resynthèse de nucléotide (NER) ou de base

(BER). Si deux bases ne sont pas correctement appariées, le système de

réparation de mésappariements (MMR – mismatch repair) est activé. Enfin, si la

double hélice est rompue, elle peut être réparée par recombinaison homologue

(HR) ou non homologue (NHEJ – Non Homologous End Joining).

a/ Présentation des mécanismes de préservation de l'intégrité du génome

Pour la NER, les bases endommagées sont reconnues par un large

complexe protéique et un fragment de 25-30 nucléotides de long est excisé.

Ensuite, le brin d'ADN non endommagé sert de modèle pour la resynthèse. Un

62

défaut dans ce mécanisme de maintien de l'intégrité de l'ADN est impliqué dans la

grande majorité des cas de Xeroderma pigmentosum. (102)

Pour la BER, les enzymes glycosylases jouent un rôle majeur puisqu'elles

peuvent reconnaître certaines bases altérées comme par exemple la présence

d'une base uracile. Dans ce cas, la base est hydrolysée, laissant un espace sans

base qui pourra être reconnu par d'autres enzymes de réparation de l'ADN.

Lorque deux bases sont misappariées, l'ADN forme une boucle qui est

reconnue par des complexes protéiques appartenant aux familles MSH, MLH et

PMS. Des défauts de MMR sont responsables entre autres de certaines formes

familiales et sporadiques de cancer du côlon.

Lorsque la double hélice est rompue, la chromatide sœur peut être utilisée

pour guider la réparation donnant lieu à une HR qui relativement fidèle. En

revanche, si les extrêmités sont assemblées en fonction de l'homologie de courtes

répétitions, comme dans la NHEJ, de petites délétions ou translocations peuvent

avoir lieu. (103)

Au cours de la mitose, l'intégrité de l'ADN est contrôlée à trois moments

clefs : à la transition G1/S, au cours de la phase S et à la transition G2/M. La cycle

cellulaire est arrêté et ne pourra poursuivre sa progression que si l'ADN passe le

contrôle. Si l'étendu des dommages est trop importante pour une bonne réparation,

la cellule est alors redirigée vers la voie de l'apoptose. Comme nous l'avons vu

précédemment le gène tumeur suppresseur p53 joue un rôle majeur dans

l'orientation vers l'arrêt prolongé du cycle cellulaire ou l'apoptose. (104, 105, 106)

b/ Tumeurs présentant une instabilité des microsatellites

Le HNPCC a été largement étudié pour pour mieux comprendre

l'association entre réparation de l'ADN et réparations de l'ADN. Cette maladie est

autosomale dominante et commence par des lésions adénomateuses bénignes

qui par la suite se développent en cancer par accumulation de nouvelles

mutations. L'analyse moléculaire a montré une liaison génétique avec des gènes

homologues de gènes de réparation de l'ADN chez la levure ainsi qu'une

instabilité des microsatellites dans le tissu tumoral. Lors de l'analyse LOH, les

chercheurs ont détecté dans les cellules malignes de HNPCC d'allèles

63

microsatellites absents dans le tissu normal du même patient. Bien que les

microsatellites soient des régions non codantes et donc sans impact sur le

phénotype, cette observation couplée avec la liaison génétique avec des loci

contenant a priori des gènes de réparation de l'ADN, laisse à penser que cette

maladie est due à des mutations dans des gènes codant des enzymes de

réparation de l'ADN. Des résultats similaires ont été trouvés dans d'autres formes

de cancers.

c/ Tumeurs caractérisées par une instabilité chromosomique (CIN)

L'instabilité chromosomique de ces tumeurs entraine une polyploïdie ou

aneuploïdie. Ces cancers ne présentent pas de MSI. Plusieurs mécanismes ont

été proposés pour expliquer l'association de l'aneuploïdie avec la tumorigenèse :

accélération de la LOH et réduction à l'hémizygotie des TSGs ou accroissement

du signal oncogène par amplification.

Les gènes de contrôle du fuseau mitotique tels que hBUBR1 ou hMAD2 ont

été mis en cause dans cette instabilité chromosomique.

En raison de l'importance de cette instabilité dans la carcinogenèse, il a été

proposé qu'il s'agissait de l'étape d'initiation de la carcinogenèse, capable d'activer

les oncogènes par amplification et de déstabiliser les TSGs par délétion allélique.

(107)

d/ Recombinaison mitotique et cancer : l'hélicase BLM

Les hélicase de la famille RecQ sont des enzymes capables d'éliminer des

structures secondaires atypiques. L'une de ces enzymes est l'hélicase BLM qui,

lorsqu'elle est mutéé est responsable du syndrome de Bloom qui parmi ces

nombreux signes cliniques présentent une incidence de cancer très élevée.

64

e/ Réarrangements chromosomiques dus à un dysfonctionnement des

télomères

Les télomères protègent les chromatides sœurs contre la fusion. Dans les

cellules normales les télomères sont perdus progressivement, aboutissant à la

sénescence de la cellule. Au cours de la réplication d'un chromosome ayant perdu

ses télomères, les chromatides sœurs fusionnent à leur extrêmité. Un pont est

alors formé qui se rompt au cours de l'anaphase et le cycle se répète à la division

suivante. L'instabilité est due au point de rupture qui n'est jamais exactement où la

fusion a eu lieu. Ainsi, des altérations telles que des duplications ou des délétions

peuvent se produire. Par ailleurs, il est possible que les deux chromatides

fusionnées se détachent de l'un des pôles engendrant un un chromosome

dicentrique dan l'une des cellules filles et la perte d'un chromosome dans l'autre.

Dans la plupart des tumeurs, les télomérases sont actives et empêchent

l'érosion des télomères de sorte que l'étendue de ce mécanisme est inconnu mais

il a été montré dans certaines tumeurs humaines et murines. (108, 109)

f/ Valeur clinique de l'instabilité génomique

La détection de MSI est relativement aisée puiqsu'elle ne nécessite que

l'isolation d'ADN de bonne qualité. La classification de Bethesda implique l'analyse

de cinq marqueurs. Si deux ou plus sont positifs, la tumeur est considérée avoir un

haut grade de MSI ; si un seul marqueur est positif il s'agit d'un bas grade de MSI

et si aucun marqueur n'est positif, la tumeur est stable. L'avantage de cette

technique est qu'elle est très sensible et l'instabilité peut être détectée même si

l'échantillon contient des cellules normales au milieu des cellules tumorales

(cellules du stroma, cellules de l'endothélium vasculaire etc.). Par ailleurs, presque

toutes les tumeurs présentent une instabilité des microsatellites, raison pour

laquelle l'analyse des MSI peut être utilisée comme méthode diagnostique. Pour

cela des fluides biologiques pouvant contenir des cellules tumorales tels que

l'urine sont comparés à de l'ADN normal extrait de sang périphérique.

65

La détection d'altérations chromosomiques plus importantes constituant

l'instabilité chromosomique a également été proposée mais la limite majeure

consiste dans le matériel nécessaire pour la réalisation de telles analyses. (110)

iv/ Épigénétique

L'expression de plusieurs loci peut être modifiée de façon réversible par

modification de la méthylation, perte d'empreinte ou encore remodelage du

nucléosome. Ces modifications sont dites épigénétiques car elles ne changent pas

la séquence primaire de l'ADN. Ainsi, tout phénotype, y compris le cancer

s'explique par une composante génétique et une composante épigénétique et il

est important de prendre ces deux composantes en compte pour mieux

comprendre la maladie. (111, 112)

a/ Méthylation de l'ADN

On sait désormais que des modifications de la méthylation de l'ADN

constituent l'altération la plus commune dans les cellules cancéreuses, plus

encore que les substitutions et les altérations chromosomiques. La méthylation

globale des cytosines est réduite de 20 à 60 % dans les cellules cancéreuses et la

déméthylation a tendance à augmenter avec la progression de la maladie ;

cependant, certaines régions sont hyperméthylées, en particulier le promoteur de

certains TSGs. Alors qu'au début de l'analyse de la méthylation de l'ADN, on ne

disposait que d'enzymes de restriction spécifiques pour la forme méthylée ou

déméthylée, on dispose aujourd'hui d'autres techniques telles que la MS-PCR

(Méthylation Spécifique PCR) qui utilise la propriété du traitement au bisulfite,

capable de remplacer les cytosines non méthylées en thymine, engendrant une

séquence primaire distincte qui peut être sélectionnée par l'utilisation d'amorces

spécifiques. Enfin, la détection des cytosines méthylées par immunohhistochimie

a également été améliorée permettant la détection de la méthylation in situ.

66

b/ Régulation de la méthylation de l'ADN et de son maintien

La méthylation a lieu au niveau du carbone 5 des cytosines au sein des

îlots CpG et est réalisée par des méthyltransférases (DNMTs – DNA

methyltransferases). Une grande proportion des îlots CpG se situent au sein des

promoteurs et on estime qu'environ 60 % des promoteurs humains possèdent de

tels îlots.

Le profil de méthylation est établi tôt au cours de l'embryogenèse et

maintenu par la suite grâce à l'action de trois DNMTs : DNMT1, DNMT3A et

DNMT3B (Tableau 1). DNMT1 peut reconnaître les met-C sur un brin de la

fourche de réplication de l'ADN et ajouter un groupe méthyle sur la cytosine

correspondante de l'autre brin. La DNMT2 a été identifiée informatiquement par

homologie avec d'autres méthyltransférases. Elle ne présente qu'une activité

résiduelle in vitro et par conséquent son rôle reste à déterminer.

Tableau 1 : Les quatre méthyltransférases majeures identifiées chez l'Homme et leurs propriétés.

Méthyltransférase Propriétés

DNMT1 Hémiméthylase – maintient le profil de méthylation au cours

de la réplication de l'ADN

DNMT2 Activité méthyltransférase faible – Rôle inconnu

DNMT3A Méthylation de novo

DNMT3B Méthylation de novo

c/ Cancer et méthylation aberrante

En général, la méthylation inhibibe l'expression du gène mais dans le cas

du cancer, les gènes peuvent être déméthylés (oncogènes) ou hyperméthylés

(TSGs). Si les gènes de réparation de l'ADN sont hyperméthylés il s'en suit une

instabilité de l'ADN ou une instabilité chromosomique. Inversement, il a été montré

dans les tumeurs de Wilms qu'une déméthylation des séquences satellites en

67

région péricentrique entraînait des réarrangements qui n'étaient pas dus à une

instabilité de l'ADN globale.

D'une façon générale, la déméthylation progresse avec l'âge de façon tissu

spécifique, ce qui est en accord avec la plus forte incidence de cancers chez les

personnes âgées. Le groupe méthyle nécessaire à la méthylation dérive de la

méthionine et une étude a montré qu'un haut niveau de méthionine réduisait

l'incidence de cancer. (113).

La base moléculaire de l'hypométhylation des cellules cancéreuses est

encore à l'étude cependant l'altération de certains gènes a été mise en cause

dans l'hypométhylation tels que : DNMT3B ou Lsh (un membre de la famille SNF2

qui code une hélicase ATP-dépendante jouant un rôle dans le remodelage et la

maintenance du profil de méthylation normal de l'ADN).

Parmi les gènes subissant fréquemment une hypométhylation, on rencontre

des gènes jouant un rôle positif dans la carcinogenèse tels que H-ras, cycline D2

ou encore bcl-2. Inversement, les TSGs sont souvent hyperméthylés. On pourra

entre autres noter les gènes Rb, INK4a et MLH1 rencontrés précédemment. De

façon intéressante, l'hyperméthylation est une alternative à la délétion allélique.

Le mécanisme permettant de cibler l'hyperméthylation à certains loci n'est

pas très clair.

La raison pour laquelle la méthylation empêche l'expression a donné lieu à

plusieurs hypothèses, toutes trois étant supportées par des études expérimentales.

Selon la première hypothèse, la méthylation entraîne un changement de

conformation de l'ADN qui empêche sa reconnaissance par les protéines se liant à

l'ADN. La seconde hypothèse met en jeu des protéines capables de reconnaître la

forme méthylée de l'ADN et qui répriment la transcription. En particulier, la

protéine MeCP2 recrute des histones désacéthylases qui inhibent la transcription.

Inversement, la troisième hypothèse suggère que la méthylation diminue l'affinité

des facteurs de transcription pour l'ADN. (114)

d/ Perte d'empreinte dans le cancer

L'empreinte fait référence au phénomène de méthylation permettant

l'expression d'un seul des deux allèles : maternel ou paternel. Les gènes sujets à

68

ce phénomène comprennent l'IGF-II (Insulin-like growth factor), H19 (ARN non

codant jouant un rôle dans la régulation à la baisse de la masse corporelle et de la

prolifération cellulaire), BWS (Beckwith-Wiedemann Syndrome). La perte

d'empreinte, entrainant l'expression des deux allèles, est présente dans certains

cancers tels que la tumeur de Wilms.

e/ Remodelage du nucléosome

Le nucléosome consiste en huit histones (deux de chaque : H2A, H2B, H3

et H4) autour desquels l'ADN est enroulé. L'histone H1 se positionne à l'extérieur

du complexe est ferme le deuxième tour de l'ADN autour des huit autres histones.

Ce complexe est dynamique et peut être modifié par acétylation, méthylation ou

phosphorylation des histones. Le silençage égnique est souvent associé à la

déacétylation et à la méthylation des lysines.

Le gène ALL1 code une protéine qui fait partie d'un large complexe de

remodelage de la chromatine, acétylation/déacétylation et méthylation des

histones et qui est souvent altéré dans les leucémies, montrant l'importance du

nucléosome dans la carcinogenèse.

f/ Variants des histones

Il existe des variants des histones possédant des fonctions particulières. De

nombreuses études doivent être réalisées pour élucider le rôle de tous ces

variants et leur rôle dans la carcinogenèse mais quelques uns ont déjà été étudiés.

Par exemple, H2AX, variant de l'histone H2A semble indiquer une rupture de la

double hélice. La suppression de l'histone H2AX entraine le développement de

lymphomes, ce qui suggère que H2AX serait un TSG. CENP-A (Centromere

Protein A) se substitue à l'histone H3 au niveau des centromères et il a été montré

une surexpression de ce variant dans les tumeurs colorectales. (115)

g/ Intéraction dynamique entre les différents mécanismes épigénétiques

Les différents mécanismes épigénétiques présentent une forte synergie

pour réguler l'expression des gènes and agir de façon coopérative. Par exemple, il

69

a été montré que la méthylation de l'ADN pouvait entraîner des modifications de

histones et inversement (116). On peut imaginer que dans les conditions

physiologiques, cette synergie est responsable du maintien de la stabilité

génomique alors que dans le cas où une erreur se produit dans un mécanisme,

cela ait une répercussion sur les autres mécanismes.

h/ Détection du cancer

Il semble possible de détecter la maladie avec trois ou quatre marqueurs de

méthylation spécifiques (114). Avec les nouvelles méthodes telles que la MS-PCR,

il est possible de tester des matériaux biologiques (lavage broncho-alvéolaire,

nœuds lymphatiques, urine, salive etc.) et détecter la maladie à un stade précoce.

i/ Résistance à la thérapie

Comme certains gènes sont importants pour l'efficacité du traitement,

connaître le statut de méthylation de ces gènes pourrait être une bonne manière

de prédire l'efficacité du traitement. Ceci a été montré avec l'enzyme de réparation

de l'ADN MGMT (O6-methylguanine DNA methyltransferase) dont

l'hyperméthylation est associée avec une bonne réponse des patients atteints de

gliome à des traitements à base de BCN (carmustine) temozolomide.

j/ Thérapie liée à la méthylation

En raison de l'observation d'une hyperméthylation à certains loci, il est

tentant de vouloir déméthyler la chromatine. Cependant, un tel traitement ne

ciblerait pas uniquement les TSGs mais aussi les oncogènes et facteurs de

croissance. La perte d'empreinte d’IGF-II est un bon exemple des effets

indésirables d'un tel traitement. Par ailleurs, l'hypométhylation de l'ADN entraine

une élévation de l'instabilité génomique. Ce qui décidera de l'utilisation ou non de

tels traitements sera la balance bénéfice/risque. De tels traitements sont

actuellement à l'étude et nous devrions connaître les résultats dans un futur

proche.

70

v/ Importance du stroma

Dans les tumeurs primaires, les cellules cancéreuses ne croissent jamais

seules, n'établissant des contacts qu'avec des cellules de même types mais, au

contraire, elles établissent un réseau complexe avec des cellules de différentes

origines. Le microenvironnement des cellules cancéreuses est constitué de

cellules endothéliales formant les vaisseaux, de cellules inflammatoires du

système immunitaire en réponse au développement tumoral et de fibroblastes.

Ces cellules constituent le stroma. Dans certains adénocarcinomes pancréatiques,

mammaires ou colo-rectaux, le stroma et en particulier les fibroblastes peuvent

constituer jusqu'à 90 % de la masse tumorale. Lorsque l'on se réfère au stroma on

pense souvent aux fibroblastes et au matériel extracellulaire, excrété

majoritairement par les fibroblastes. Ces fibroblastes répondent aux signaux

envoyés par les cellules tumorales mais aussi, peuvent affecter la morphologie et

le comportement des cellules néoplasiques, établissant ainsi une relation

bilatérale avec les cellules cancéreuses.

L'importance du stroma dans la croissance tumorale peut être mise en

évidence par la différence de taux de croissance entre des lignées cellulaires in

vitro, sur boite de Petri et dans des souris immunodéficientes. In vitro, le taux de

croissance reflète en grande partie la capacité de division des cellules alors qu'in

vivo, greffées dans un animal, la croissance dépend également de la disponibilité

en nutriments, du support mécanique et de la sensibilité aux contacts. Par ailleurs,

l'hôte qui fournit le stroma peut influencer drastiquement le comportement des

cellules cancéreuses. Par conséquent, si l'étude de cultures cellulaires et

l'identification de leurs altérations et de leur rôle est informative et utile, il faut

garder en mémoire qu'elles présentent des limites et sont par conséquent

incomplètes.

Un exemple de l'importance des fibroblastes dans la carcinogenèse est

présenté par le fait que des fibroblastes associés à des carcinomes sont capables

de stimuler la progression tumorale de cellules épithéliales non tumorales,

suggérant que les fibroblastes suffisent à engendrer des signaux oncogéniques

puissants (117).

71

Si les fibroblastes associés aux cellules cancéreuses jouent un rôle

activateur dans la carcinogenèse, les fibroblastes en soit ne facilite pas toujours la

progression tumorale. En effet, des kératinocytes injectées avec ras forment des

tumeurs chez la souris uniquement s'ils sont injectés seuls ou en association avec

des fibroblastes 3T3 immortalisés alors que s'ils sont injectés avec des

fibroblastes normaux, la tumorigénicité est supprimée.

a/ La morphologie du stroma tumorale est modifiée

Les pathologistes ont remarqué que le stroma associé aux cellules

cancéreuses était morphologiquement distinct du stroma associé au tissu normal.

Ces altérations sont regroupées sous le terme « réaction desmoplastique » et

comprennent entre autres un index mitotique élevé, des atypies de la matrice

extracellulaire comme une auglentation de la production de certaines formes de

collagène, de fibronectine, de glycosaminoglycanes et de protéoglycanes.

Les myofibroblastes sont prédominants dans les tumeurs et peuvent être

identifiés par immunohistochimie par l'expression de marqueurs spécifiques tels

que la vimentine, l'actine des fibres lisses alpha, la chaîne lourde de myosine des

fibres lisses, la desmine la calponine et l'alpha-intégrine. De façon intéressante,

cette différenciation partielle est également rencontrée en réponse à une blessure

ou à une inflammation au cours desquelles les myofibroblastes orchestrent la

cicatrisation. Ceci est d'autant plus important qu'il existe un lien entre inflammation

chronique et cancer qui pourrait impliquer les fibroblastes. Par ailleurs,

l'inflammation induit la formation d'un stroma réactif morphologiquement identique

à celui engendré par les tumeurs malignes.

Les cellules cancéreuses sécrètent des protéases spécifiques : les

métalloprotéinases de matrice (MMPs) qui jouent un rôle clef dans la transition du

stroma vers sa forme associée aux cellules cancéreuses. L'une de ces MMPs, la

stromelysin-1 (str-1) exprimée de façon ectopique dans les cellules épithéliales

mammaires désorganise le stroma de telle sorte qu'elle est suffisante à entrainer

le développement de cancer du sein.

72

b/ Changement du profil d'expression des fibroblastes dans les tumeurs

Mis à part les marqueurs morphologiques mentionnés précédemment, les

fibroblastes associés aux cellules cancéreuses présentent une expression

différente de plusieurs autres gènes. Nombre d'entre eux sont des facteurs de

croissance qui peuvent agir à la fois sur les cellules du stroma et sur les cellules

tumorales. Un exemple est donné par le facteur de croissance HGF qui est

exprimé majoritairement par les fibroblastes tandis que son récepteur, c-Met est

exprimé par les cellules cancéreuses. D'autres facteurs de croissance sont mis en

jeu, en particulier TGF-béta mais l'intéraction entre cellules cancéreuses et stroma

est plus complexe. En effet, TGF-béta et son récepteur sont exprimés à la fois par

les fibroblastes et les cellules cancéreuses et l'activation du récepteur peut

engendrer des signaux de stimulation ou d'inhibition tumorale en fonction du tissu

et du système expérimental étudiés. (118, 119)

c/ Les fibroblastes associés aux tumeurs ne sont pas toujours

génétiquement normaux.

Pendant longtemps, les fibroblastes ont été supposés génétiquement

normaux et les changements dans leur profil d'expression attribués aux cellules

cancéreuses adjacentes. Ceci étant, il semblerait que ce ne soit pas toujours vrai ;

les fibroblastes peuvent accumuler des mutations similaires aux cellules

néoplasiques. Parmi les mutations décrites, on rencontre l'inactivation de TSGs

tels que p53 ou PTEN (Phosphatase and Tensin homolog deleted on chromosome

10). (120) Une étude portant sur l'importance de p53 dans les fibroblastes dans

laquelle des tumeurs chimères formées de cellule de cancer mammaire humain de

de fibroblastes mutés ou non pour p53, a montré que les mutations de p53 dans

les fibroblastes conféraient un taux de croissance plus élevé et des tumeurs plus

agressives à l'histopathologie que les fibroblastes normaux. (121, 122).

Il semblerait que le stroma associé aux cellules cancéreuses joue un rôle

double dans la carcinogenèse. D'une part, les fibroblastes sécrètent des facteurs

de croissance tels que SDF-1 (Stromal-cell Derived Factor 1) qui agit sur les

cellules cancéreuses par l'intermédiaire du récepteur CXCR4, et d'autre part par le

73

recrutement de cellules souches endothéliales, contribuant à l'angiogenèse (123,

124).

d/ « Modelage » du stroma tumoral

En résumé, au cours des premières divisions d'une cellule transformée qui

donnera par division clonale une tumeur, le stroma joue un rôle négatif dans la

carcinogenèse, protégeant l'organisme contre le cancer en encapsulant la tumeur

et inhibant son développement. Par la suite, cependant, certains produits des

cellules cancéreuses tels que des facteurs de croissance ou des MMPs modifient

le stroma qui devient un stoma associé aux cellules cancéreuses. À partir de ce

moment, le stroma favorise la croissance tumorale. Des modifications génétiques

et épigénétiques ciblant les fibroblastes pourraient également participer à cette

transition. Au cours de la phase initiale, si des mutations existent dans certaines

cellules du stroma, elles seront sélectionnées positivement, ajoutant à

l'hétérogénéité du stroma. À cette étape du développement, la tumeur est

hautement dépendante du stroma, ce qui fait du stroma une cible prometteuse

pour le traitement contre le cancer à un stade précoce.

vi/ Télomérase

Au cours de chaque réplication, les chromosomes se raccourcissent à leurs

extrémités : les télomères. Ce raccourcissement entraine une réponse de

dommage de l'ADN qui est irréversible et indépendante des facteurs de

croissance dans le micro-environnement de la cellule. Il s'agit de la sénescence

réplicative, contrôlée par les TSGs p53 et Rb. Ce raccourcissement est un

problème pour les cellules qui doivent pouvoir se diviser un nombre indéfini de fois

telles que les cellules de la lignée germinale, les cellules embryonnaires, les

cellules souches, les lymphocytes activés ou encore les cellules cancéreuses.

Pour résoudre se problème, une enzyme, la télomérase, est capable de réaliser

l'élongation des télomères sans avoir besoin d'un brin d'ADN comme modèle.

74

a/ Les télomères, des structures spécialisées

Les extrémités des chromosomes eucaryotes sont formés de complexes

d'ADN et de protéines appelés télomères qui protègent protègent les cellules

contre l'instabilité de l'ADN par fusion des chromosomes. Les télomères consistent

en de courtes séquences d'ADN répétées (microsatellites) riches en en bases G.

Chez l'Homme et la souris, les télomères présentent une répétition de (TTAGGG)n

générée par les télomérases. Les télomérases sont des polymérases qui ne

dépendant pas d'un modèle ADN mais d'un modèle ARN qu'elles possèdent de

façon interne, et elles se comportent comme une transcriptase inverse. Chez

l'Homme les télomères font en moyenne 15-20 kpb à la naissance et, en l'absence

de télomérase ou autre mécanisme de maintenance des télomères,

raccourcissent à chaque réplication. Cette réduction de la taille des télomères

reflète l'âge de la cellule en termes de prolifération. Cette diminution de taille des

télomères peut être vue comme une protection contre la transformation maligne

puisque la sénescence qui associée ne permet pas l'accumulation de mutations.

On verra par la suite que les télomérases jouent à la fois un rôle négatif (de

protection) et positif (permissif) en fonction du stade de transformation ou encore

du contexte génétique. (125, 126)

b/ Structure et activité des télomérases

Les télomérases sont des complexes ribonucléoprotéiques formés de

plusieurs sous-unités dont deux majeures : une unité catalytique (TERT) qui

synthétise la répétition de (TTAGGG)n à l'extrémité 3' des chromosomes et une

composante ARN (TERC) qui fournit le modèle ARN pour la sous-unité TERT.

La grande majorité des tumeurs primaires possèdent une télomérase

réactivée leur assurant la capacité de se diviser un nombre de fois indéfini. Ainsi,

même si les télomérases ne sont pas en soit des oncogènes, elles exercent une

action positive sur la carcinogenèse en permettant aux cellules de contourner la

sénescence due au raccourcissement des télomères. Même si la réactivation des

télomérases devrait être un événement précoce dans la carcinogenèse, l'étude de

lésions néoplasiques précoces semble indiquer le contraire. L'activité des

75

télomérases est en corrélation avec la progression de la maladie, avec des lésions

avancées exhibant de plus haut niveaux d'activité des télomérases que les mêmes

tumeurs à un stade plus précoce. (127)

c/ Régulation de l'activité des télomérases

De nombreux facteurs exercent une régulation dur les télomérases, parmi

lesquels l'oncogène myc qui induit l'activité des télomérases au cours de la

transformation maligne. Cette capacité à stimuler l'activité des télomérases et

donc l'immortalisation cellulaire pourrait expliquer en partie l'importance de

l'oncogène myc dans de nombreux tissus. Les hormones hypothalamiques ont

également été proposées avoir un rôle dans la régulation de l'activité des

télomérases mais cela n'a pas été démontré.

La localisation intracellulaire des télomérases constitue un autre

mécanisme de régulation. Ainsi, la protéine PinX1 inhibe l'activité des télomérases

en formant un complexe stable avec la sous-unité TERT et en la séquestrant dans

le nucléole alors qu'en l'absence de PinX1 elle se localise principalement dans le

nucléoplasme.

d/ Implications thérapeutiques des télomérases

Dans la mesure où une grande majorité de tumeurs présentent une

réactivation des télomérases, l'inhibition de ces dernières pourrait constituer une

cible thérapeutique intéressante. Cependant, les conséquences d'un tel traitement,

en particulier sur les cellules souches et les lymphocytes activés doivent être

étudiées. Par ailleurs, entre le moment où les télomérases sont inactivées et le

moment où le raccourcissement des télomères est suffisant pour entrainer la

sénescence, il existe un temps de latence au cours duquel la maladie peut

continuer sa progression. De plus, le raccourcissement des télomères est à

l'origine d'une instabilité génomique qui pourrait permettre à la tumeur de devenir

encore plus agressive. Enfin, des mécanismes alternatifs de maintien des

télomères existent qui pourraient être activés en réponse au traitement. (128)

76

e/ Mécanismes alternatifs pour la maintenance des télomères

Si la plupart des tumeurs présentent une réactivation des télomérases, ce

n'est pas le cas de toutes les tumeurs, ce qui implique qu'elles présentent des

mécanismes alternatifs de maintien de la taille des télomères. Ces mécanismes

sont dénommés ALT (Alternative Lengthening of Telomeres) et impliquent des

recombinaisons homologues entre télomères.

vii/ Angiogenèse

Les cellules cancéreuses sont caractérisées par une autonomie croissante

par rapport aux cellules normales, ceci étant, elles dépendent toujours de leur

environnement. En particulier, elles doivent satisfaire leurs besoins métaboliques.

Lorsque les tumeurs atteignent 1-2 mm3, elles deviennent hautement

vascularisées, ce qui est nécessaire pour qu'elles puissent poursuivre leur

croissance. Cette transition constitue « l'angiogenic switch » et est hautement

régulée. Parmi les signaux déclenchant l'angiogenèse, l'hypoxie est la mieux

caractérisée.

La régulation de l'angiogenèse est un processus complexe qui a deux

composantes : prolifération et morphogénie. Ces processus sont très similaires à

la néovascularisation physiologique mais présentent certaines différences comme

nous le verront par la suite.

Après avoir pensé pendant longtemps que les vaisseaux des tumeurs

provenaient exclusivement de vaisseaux pré-existants dans l'environnement, on

sait désormais qu'il existe des mécanismes complexes permettant la formation de

vaisseaux de novo à partir d'angioblastes ou un mimétisme vasculaire.

a/ L'organisation des vaisseaux tumoraux est différente de celle des

vaisseaux normaux

Dans les tissus normaux, les vaisseaux présentent une organisation

hiérarchique de sorte que toutes les cellules sont assez proches des vaisseaux

77

pour que les nutriments puissent diffuser et être complètement consommés. Dans

les tumeurs, en revanche, l'organisation des vaisseaux est anormale de sorte que

certaines régions tumorales sont souvent en condition d'hypoxie. De plus, le

diamètre des vaisseaux est irrégulier et certaines régions présentent une

accumulation de plusieurs couches de cellules épithéliales. Par ailleurs, au sein

d'une même tumeur, le flot sanguin et la perméabilité vasculaire sont hétérogènes.

Cette hétérogénéité serait due à un déséquilibre entre les facteurs angiogéniques

et anti-angiogéniques ; ainsi des facteurs tels que VEGF (Vascular Endothelial

Growth Factor) accroissent la perméabilité vasculaire, tandis que des facteurs tels

que Ang1 et Tsp1 la réduisent.

À l’échelle moléculaire, le profil d'expression peut aussi différer des cellules

normales avec par exemple l'absence d'expression du marqueur CD31. Les

molécules d'adhésion sont également différentiellement exprimées, une fois

encore en raison de l'action de facteurs de croissance ; VEGF-A stimule

l'expression de molécules d'adhésion, tandis que TGF-béta (Transforming Growth

Factor beta), bFGF (basic Fibroblast Growth factor) et Ang1 l'inhibent.

Rétablir un réseau vasculaire normal dans les tumeurs pourrait aider à

délivrer de façon plus efficace les molécules de chimiothérapie traditionnelles.

(129)

b/ Régulation de l'angiogenèse

Avec l'augmentation de sa taille, la tumeur requiert de plus en plus de

nutriments et d'oxygène. Rapidement, le micro-environnement ne permet plus

l'approvisionnement en quantité suffisante de ces éléments. Les cellules

cancéreuses le perçoivent comme un signal et sécrète des facteurs de stimulation

de l'angiogenèse dont les membres de la famille VEGF, FGF (Fibroblast Growth

Factor), PDGF (Platelet Derived Growth Factor) et angiopoïétine. (130)

c/ Déclenchement de l'angiogenèse par hypoxie

L'hypoxie est le principal signal d'induction de l'angiogenèse. La famille HIF

(Hypoxia-Inducible Factors), qui code des facteurs de transcription, joue un rôle

78

majeur dans ce processus. En condition de normoxie, HIF-1alpha est lié au

produit du TSG VHL (Von Hippel-Lindau), ce qui entraîne sa dégradation par le

protéasome.

En condition d'hypoxie, l'hydroxylase PHD (oxygen-dependent prolyl

hydroxylase) est inactivée ce qui entraine la dissociation de HIF-1alpha et VHL ; à

la suite de quoi, HIF-1alpha forme un hétérodimère avec HIF-1béta ou p53.

L'hétérodimère HIF-1alpha/HIF-1béta est un facteur de transcription qui se lie aux

séquences HRE (Hypoxia-Regulatory Elements) activant ainsi les acteurs de

l'angiogenèse dont VEGF, érythropoïétine, etc. Le facteur HIF-3alpha est quant à

lui un inhibiteur de l'angiogenèse.

Par ailleurs, la phosphorylation de HIF-1alpha est proportionnelle au niveau

d'hypoxie et le niveau de phosphorylation de HIF-1alpha détermine quant à lui si

HIF-1alpha va former un hétérodimère avec HIF-1béta ou p53. Pour des

conditions d'hypoxie moyennes, HIF-1alpha se lie à HIF-1béta, tandis que dans

des conditions d'hypoxie sévères, il se lie à p53, dirigeant ainsi la cellule vers

l'apoptose. D'autres facteurs participent à la régulation de HIF-1alpha que nous ne

détaillerons pas, parmi lesquels les PI3Ks (Phosphatidylinositol-3-kinases) et les

MAPKs (Mitogen-Activated Protein Kinases) (131)

d/ Autres stimuli déclenchant l'angiogenèse

Bien que jouant un rôle clef, la déprivation en oxygène n'est pas le seul

stimulus d'induction de l'angiogenèse. La déprivation en nutriments peut

également jouer ce rôle en entraînant une diminution de la concentration en ATP

intracellulaire, ce qui entraîne un stress similaire à l'hypoxie.

De même, le stress oxydant peut activer l'angiogenèse par la stimulation de

production de VEGF et autres facteurs angiogèniques.

Enfin, plusieurs oncogènes, dont les membres de la famille ras ou bcl-2

peuvent activer l'expression de VEGF ou inhiber l'expression de TSP-1

(Thrombospondine 1), une glycoprotéine de la matrice extracellulaire inhibitrice de

l'angiogenèse. (132)

79

e/ Vascularisation des tumeurs

On dénombre trois mécanismes principaux d'acquisition de vascularisation

par les tumeurs :

1. Bourgeonnement

Il s'agit du mécanisme prédominant. Il met en jeu la prolifération et la

migration de cellules endothéliales à partir de vaisseaux existants. Le facteur

VEGF-A induit la prolifération des cellules endothéliales mais aussi active les

metalloprotéases et les activateurs du plasminogène, responsables de la

dégradation de la matrice extracellulaire, permettant la migration des cellules

endothéliales. Dans les conditions physiologiques, les cellules endothéliales à la

pointe du bourgeon expriment le récepteur aux VEGF 2 et suivent un gradient de

VEGF. Il n'est pas clair si un tel mécanisme existe dans les tumeurs en raison de

l'irrégularité de la vascularisation. D'autres facteurs, tels que FGFs et TGF-béta

régulent également ce processus.

2. Intussusception

Il s'agit d'une variante du mécanisme de bourgeonnement au cours duquel

les cellules endothéliales situées face à face se rapprochent jusqu'à former deux

vaisseaux distincts (133)

3. Recrutement des angioblastes

Les précurseurs endothéliaux circulants (CEPs = Circulating Endothelial

Precursors) peuvent être recrutés par la tumeur pour former la vascularisation

tumorale. De nombreux facteurs entrent en jeu dans ce mécanisme parmi lesquels

les membres de la famille VEGF et leurs récepteurs, le récepteur à EGF 2 et SFD-

1 (Stromal cell-Derived Factor 1). (134)

L'importance de ce mécanisme est fortement tumeur dépendant. En effet,

les CEPs sont responsables de 90 % de la vascularisation de certains lymphomes

contre seulement 5 % des neuroblastomes. Le stade tumoral est également

important puisque la plupart des vaisseaux des lymphomes à J2 dérivent de CEPs

alors qu'à J14, seulement 50 % le sont.

80

f/ Cooptation

Il s'agit d'un mécanisme observé dans certains tissus très vascularisés tels

que le cerveau ou les poumons, dans lesquels les cellules tumorales se

développent autour des vaisseaux pré-existants. Le facteur Ang2 participe à

l'augmentation du diamètre des vaisseaux et au rétrécissement de leur taille. Par

la suite, en raison du manque de vaisseaux, les conditions deviennent hypoxiques,

stimulant l'angiogenèse par VEGF-A et donc la vascularisation en périphérie. (134)

g/ Mimétisme vasculaire

Dans certaines tumeurs, comme les mélanomes uvéaux, les vaisseaux

sont situés uniquement en périphérie. Cependant, ces tumeurs ne sont pas

nécrotiques, impliquant un flux sanguin dans ces tumeurs. Des analyses plus

détaillées montrent la présence de canaux en intéraction avec les vaisseaux

sanguins. Ces canaux ne sont pas formés de cellules endothéliales mais

partagent certains marqueurs avec ces dernières dont le facteur de Von

Willebrand, CD34 et lectine d'Ulex. (134)

h/ Vaisseaux mosaïques

Les cellules endothéliales des vaisseaux tumoraux subissent fréquemment

l'apoptose, exposant ainsi des cellules cancéreuses au lumen, entrainant la

formation de vaisseaux mosaïques constitués de cellules endothéliales et

cancéreuses en proportion variable. (134)

i/ Thérapie anti-angiogénique

Si l'expression de l'oncogène ras ou des télomérases suffit à induire la

transformation de cellules épithéliales in vitro, ce n'est pas le cas in vivo où il faut

de hauts niveaux d'expression de ras ou VEGF, ce qui implique que l'angiogenèse

est nécessaire pour la progression tumorale. Ceci est confirmé par l'inhibition de

croissance tumorale associée à des inhibiteurs endogènes de l'angiogenèse tels

81

que l'endostatine ou l'angiostatine qui réduisent la formation de métastases dans

le modèle de cancer des poumons de Lewis.

Pour réduire l'angiogenèse tumorale, des anticorps monoclonaux ont été

développés avec, en particulier, des anticorps contre VEGF : bevacizumab

(Avastin) ou l'intégrine αvβ3 : Vitaxin.

L'avantage d'une telle thérapie réside dans le fait que les cellules

endothéliales sont des cellules normales et ne présentent pas l'instabilité des

cellules cancéreuses. Par conséquent, les cellules ne devraient pas développer de

résistance au traitement et devrait être applicable à tout type de tumeur.

Cependant, des études ont montré que ce n'était pas le cas et que les tumeurs

présentaient une sensibilité très variable au traitement. Deux mécanismes majeurs

ont été avancés pour essayer d'expliquer ce phénomène : les cellules

cancéreuses exprimant un moindre besoin en oxygène pourraient être

sélectionnées ou des mécanismes alternatifs de vascularisation pourraient être

utilisés n'utilisant pas la cible du traitement. Des études vont dans le sens de

l'existence de ces deux mécanismes. Par exemple, il existe des mutations de la

protéine p53 conférant une résistance à l'hypoxie (135).

En général, une combinaison de ces traitements anti-angiogéniques avec

d'autres traitements anti-cancéreux est utilisée.

La thérapie anti-angiogénique étant peu toxique et non favorable au

développement de résistances, elle constitue un bon candidat pour une thérapie

prophylactique des patients à haut risque de développer un cancer.

viii/ Métastase

La métastase désigne la capacité des cellules cancéreuses à se propager

depuis le site primaire où elles se sont formées vers d'autres organes à travers les

vaisseaux sanguins ou lymphatiques. Les métastases sont la première cause de

mortalité chez les patients atteints de cancer. Malgré des progrès dans la

compréhension de la maladie et dans les traitements, le prognostique des patients

présentant des métastases ne s'est que peu amélioré.

Ce processus fait appelle à des facteurs de croissance, des chimiokines,

des molécules d'adhésion et des protéases de matrice. Dans de nombreux cas,

82

les cellules sont dans un premier temps latentes. Des modèles mathématiques

prévoient que durant cette période, les cellules prolifèrent lentement par

alternance de cycles de quiescence et prolifération.

Le stroma, du tissu d'origine comme du tissu receveur, joue un rôle

important dans la régulation de la métastase.

a/ Les étapes de la métastase

La métastase, comme la carcinogenèse, se déroule en plusieurs étapes et

est multifactorielle. C'est pourquoi l'acquisition d'un phénotype malin n'est pas

toujours synonyme de capacité à métastaser. Pour métastaser, les cellules

doivent accumuler des mutations leur permettant d'échapper à leur site de

développement primaire, survivre au transport dans les vaisseaux lymphatiques

ou sanguins et enfin, s'implanter dans un tissu différent qui, le plus souvent,

constitue un micro-environnement différent de celui d'origine. La métastase est un

processus qui, en général, présente une efficacité faible. Alors que l'échappement

au site primaire présente une efficacité élevée, la croissance dans des tissus

différents jusqu'à être bien vascularisées et cliniquement détectable se produit

avec une efficacité faible. Pour que cette dernière soit fructueuse, les cellules

métastasiques doivent être en mesure d'induire l'angiogenèse afin que les

micrométastases puissent se développer et elles doivent pouvoir s'adapter à leur

nouvel environnement et répondre aux signaux paracrines de croissance et de

survie.

L'injection expérimentale sous-cutanée de cellules tumorales à des souris

nude, SCID ou autres souris immunoincompétentes reflète cette dernière étape de

la maladie au cours de laquelle les cellules cancéreuses doivent croitre dans un

micro-environnement différent de celui d'origine. C'est la raison pour laquelle

certaines lignées cellulaires ne peuvent se développer que dans leur tissu

d'origine et ne présentent qu'une faible croissance ou ne croissent pas du tout en

région sous-cutanée.

Il semblerait que la capacité à métastaser soit le fruit de l'accumulation de

mutations dans les cellules cancéreuses ensuite sélectionnée parce qu'elle

83

constitue un avantage pour les cellules. Cependant, il semblerait que l'hypoxie

induise également la métastase.

Lorsque les cellules échappent à leur tissu d'origine, elles peuvent entrer

dans la circulation sanguine et être distribuées dans la circulation systémique.

C'est ainsi que les tumeurs mammaires donnent naissance à des métastases

dans les poumons par exemple. Alternativement, elles peuvent pénétrer les

vaisseaux lymphatiques et être transporter jusqu'aux nœuds lymphatiques. Depuis

les nœuds lymphatiques, les cellules cancéreuses peuvent gagner la circulation

sanguine et créer des métastases dans des organes différents. Les chercheurs

pensent que cette deuxième voie de dissémination est prédominante.

La lymphangiogenèse, comme l'angiogenèse, est régulée, au moins en

partie, par les facteurs de croissance VEGFs et leurs récepteurs. Elle s'associe à

un plus fort potentiel métastasique. (136)

b/ Bases moléculaires

1/ Interactions cellule-cellule

Les intégrines sont des protéines membranaires qui peuvent se dimériser

pour former des complexes qui interagissent avec la matrice extra-cellulaire

(MEC). Les cadhérines sont une famille de protéines régulant l'adhésion cellule-

cellule. L'E-cadherine est une protéine transmembranaire dont la portion

extracellulaire forme des jonctions adhérentes avec les cellules voisines tandis

que la portion intracellulaire intéragit avec les caténines, elles-mêmes liées à des

filaments d'actine. Il existe une relation de corrélation inverse entre l'expression

des E-cadhérines et l'agressivité de nombreuses tumeurs. Les N-cadhérines,

quant à elles, jouent un rôle différent puisqu'elles favorisent la motilité cellulaire. Il

est donc possible qu'on ait, au cours de la progression tumorale, un changement

depuis les E-cadhérines, qui favorisent l'ancrage, vers les N-cadhérines, qui

favorisent la migration. Les ephrines et récepteurs eph jouent également un rôle

important puisqu'ils sont impliqués dans la régulation de la communication, de

l'attachement, de la forme et de la motilité cellulaires. Il est intéressant de

remarquer que les signaux sont bidirectionnels. À la suite de l'intéraction entre le

84

ligand et son récepteur, un signal est envoyer vers l'intérieur de la cellule et un

signal est transduit au travers du ligand. (137, 138)

2/ Protéolyse de la matrice extracellulaire

Le remodelage de la MEC est une étape importante puisqu'elle est

nécessaire pour l'invasion locale par les cellules tumorales. De nombreuses

protéines / enzymes sont importantes pour la protéolyse de la MEC : les

métalloproteinases de matrice (MMPs), les sérine-protéases, les ADAMs

(adamalysin-related membrane proteases), les BMP-1 (bone morphogenetic

protein 1), les héparinases et les cathepsines.

Les MMPs sont, pour la plupart, sécrétées par les cellules du stroma suite à

la réception d'un signal des cellules cancéreuses. Au travers su clivage

protéolytiques, elles peuvent parfois activer des facteurs de croissance et leurs

récepteurs qui étaient jusqu'alors latents. Par exemple, le récepteur PAR-1

(Protease activated receptor 1) est activé par clivage protéolytique par MMP-1.

Les récepteurs PARs sont couplés à des protéines G et comportent leur propre

ligand en région N-terminale. Suite à son activation, il initie la migration des

cellules cancéreuses. (139)

Les ADAMs sont des protéines transmembranaires impliquées dans

l'adhésion cellulaire et la lyse de la MEC au travers de ces domaines désintégrine

et metalloprotéinase. Une autre classe d'ADAMs clive les cytokines ancrées dans

la membrane cellulaire, les protéines d'adhésion, les facteurs de croissance etc.

qui se détachent alors de la membrane plasmique.

Les sérine-protéases inclus l'uPA (urokinase plasminogen activator), la

thrombine et la plasmine. La fixation de l'uPA sur son récepteur l'active entrainant

la conversion de plasminogène en plasmine qui, à son tour, présente une activité

protéolytique dirigée contre les protéines de la MEC et contre certains facteurs de

croissance activés par clivage. La surexpression d'uPA dans certains cancers est

associée à un mauvais prognostique. Inversement, son inhibition dans des

modèles expérimentaux prévient la métastase en supprimant la capacité invasive

des tumeurs.

85

Le protéoglycane heparan sulfate joue un rôle important dans l'organisation

de la MEC et la séquestration de molécules bioactives. L'héparanase clive les

chaines d'heparan sulfate ce qui déstabilise la MEC et affecte la fonctionnalité

tissulaire. L'activité de cette enzyme est augmentée dans diiférentes tumeurs

primaires et lignée cellulaires métastatiques. De plus, son activation dans des

cellules présentant une faible capacité métastatique l'augmente.

Enfin les cystéine-cathepsines sont une famille de protéases qui jouent

également un rôle important dans la dégradation de la MEC, l'invasion locale et

l'initiation de la métastase. Elles affectent notamment la laminine, la fibronectine et

le collagène. (137, 140)

3/ Gènes suppresseurs de métastases

De la même manière que les TSGs inhibent la carcinogenèse, les « gènes

suppresseurs de métastase » préviennent la migration des cellules cancéreuses.

Leur identification se base sur l'hypothèse que ces gènes devraient être régulés à

la baisse dans les cellules de tumeurs métastatiques par rapport aux cellules

tumorales non métastatiques. Ces gènes comportent notamment MKK4 qui code

une MAPK, KiSS1 qui code un ligand d'un récepteur associée à une protéine G.

Ces gènes inhibent la capacité métastatique des cellules sans affecter leur

capacité tumotigène.

Il est à noter que certains gènes impliquées dans la transformation

malignes tels que les oncogènes ont aussi un impact sur la capacité à métastaser

des cellules cancéreuses, comme par exemple ras. Il se pourrait que ce ne soit dû

qu'à leur action stimulatrice de la prolifération. De plus amples études devraient

éclaircir ce point. (137, 141)

4/ Migration et motilité des cellules cancéreuses

En plus de la modification de la MEC et du micro-environnement, les

cellules cancéreuses doivent acquérir la capacité de se déplacer. Le mouvement

collectif des cellules tumorales est relativement courant et fait intervenir les

intégrines β1. Le mouvement de cellules seules détachées de la tumeur primaire

86

est indépendant des intégrines β1. Les cellules cancéreuses peuvent excréter des

enzymes protéolytiques qui activent des protéines de la MEC telles que les

fibronectines, laminines ou encore thrombospondines qui, à leur tour, induisent la

migration des cellules tumorales. La chimiotaxie et l'aptotaxie (mouvement dirigé

vers un substrat fixe) sont les principales sources de mouvement des cellules

cancéreuses au cours de l'invasion locale. Des facteurs dérivés du stroma tels que

IGF-I et -II (Insulin-like growth factor) ou HGF (Hepatocyte growth factor) sont des

signaux paracrines qui stimulent la motilité ainsi que la prolifération des cellules

cancéreuses. (137, 142)

5/ Implantation

Trois mécanismes ont été proposés avoir un rôle dans la sélection du site

de métastase. Le premier mécanisme consiste en la présence de facteurs de

prolifération favorisant la croissance des cellules cancéreuses au site de

métastase. Le deuxième propose l'adhésion à l'endothélium adjacent au tissu où

la métastase se produit. Enfin, le troisième implique l'attraction des cellules

cancéreuses par des facteurs produit par le tissu d'implantation. Des études

supportent chancun de ces trois mécanismes. (137)

c/ Implications cliniques

Les avancées dans notre connaissance des mécanismes moléculaires de

la métastase ont deux impacts majeurs : elles permettent d'une part d'identifier

des marqueurs qui aident au diagnostique et au pronostique et elles orientent la

recherche de nouvelles thérapies.

Comme mentionné précédemment, la néoangiogenèse est une cible

prometteuse. Des inhibiteurs plus spécifiques de la métastases ont été

développés tels que des antagonistes des MMPs mais les résultats des essais

cliniques ne sont pas très prometteurs. (143)

87

C/ Aspects spécifiques

i/ Contexte tissulaire comme déterminant de la fonction tumeur-suppressive ou

oncogène de certains gènes

Bien que les gènes impliqués dans la carcinogenèse soient pléiotropiques,

leur implication dans le développement de la maladie est souvent vue en terme

de : positif ou négatif. Par exemple, les gènes ras activés codent des

oncoprotéines qui entrainent la transformation maligne mais aussi induisent

l'angiogenèse. Ces deux processus ont un effet positif sur le développement de la

maladie. De la même manière, le TSG p53 peut entrainer l'arrêt du cycle cellulaire

ou l'apoptose, les deux inhibant la carcinogenèse. Cette simplification a été mise

en question dans la mesure où le même type d'altération dans le même gène

pouvait avoir un effet positif ou négatif, jouant donc le rôle d'un oncogène ou d'un

TSG, en fonction du type cellulaire étudié. Peu de gènes répondent à cette

description mais il est important de les mentionner puisqu'ils illustrent le fait que

les cellules cancéreuses présentent une différenciation anormale. Cette

anormalité peut être une dé-différenciation ou une trans-différenciation. Ainsi, des

gènes impliqués dans la régulation de la différenciation cellulaire pourraient

induire ou prévenir la carcinogenèse. Deux familles de gènes répondent à ces

caractéristiques : les gènes RUNX codant des facteurs de transcription et les

récepteurs Notch.

a/ Les gènes RUNX

Les gènes RUNX codent des protéines qui dans des complexes avec les

CBF-β (core binding factor β) forment des facteurs de transcription pour des gènes

de différenciation, de croissance et de survie. La famille de facteurs de

transcription RUNX est formée de trois protéines : CBF-α, PEBP-2α (polyoma

enhancer-binding protein) et AML (acute myeloid leukemia). Les trois possèdent

un domaine Runt qui est le site de liaison à la protéine CBF-β.

88

L'implication de ces protéines dans le cancer a été découverte par

l'observation de translocations dans les leucémies engendrant des protéines

chimériques possédant la région N-terminale d’AML1 contenant le domaine Runt.

Bien que le mécanisme d'action soit inconnu, l'hypothèse a été avancée que cette

protéine chimère joue le rôle d'un antagoniste de la forme normale de la protéine

RUNX1. En plus des translocations, des mutations ponctuelles de RUNX1 ont

également été observées dans certaines leucémies. Ces mutations touchent plus

particulièrement le domaine Runt affectant la liaison à l'ADN ou entrainant des

formes tronquées des protéines.

Puisque la perte de fonction de ces protéines peut engendrer des

leucémies, ces protéines semblent être des TSGs. Cette idée est supportée par la

découverte de mutations des gènes RUNX1 dans la lignée germinale de patients

souffrant de formes familiales de troubles des plaquettes, une condition qui

prédispose à la leucémie myéloïde aiguë (AML). L'activité tumeur suppressive de

RUNX1 peut être étendue aux gènes RUNX3 qui sont souvent régulés à la baisse

par hyperméthylation dans les tumeurs primaires d'origine épithéliale.

Cependant le phénotype causée par la simple de perte de RUNX1 est

différent de celui engendré par la fusion de RUNX1 avec la protéine ETO qui agit

de manière dominante, comme un oncogène. Le potentiel oncogénique des gènes

RUNX est également supporté par l'observation que les trois membres sont des

cibles de l'activation insertionnelle par des rétrovirus dans des modèles murins de

lymphomes. De plus, l'amplification de RUNX1 a été reportée dans certaines

formes agressives de leucémies lymphoblastiques aiguës (ALL) à cellules B.

RUNX2 et RUNX3 n'ont pas été autant étudiés que RUNX1 mais il semblerait

qu'ils possèdent le même potentiel oncogénique.

Ainsi, les gènes RUNX constituent un bon exemple de gènes qui peuvent

agir comme oncogènes ou TSGs dans différentes conditions. Par conséquent

l'activité oncogénique ou tumeur suppressive d'un gène n'est pas le fruit d'une

altération spécifique dans un gène donné mais plutôt la combinaison de l'altération

et du contexte développemental et histologique. Ceci est extrêmement important

puisque le même traitement pourrait entrainer des effets opposés lorsque le

contexte cellulaire change. (144)

89

b/ Les gènes Notch

Ces gènes tiennent leur nom d'une mutation chez Drosophila melanogaster

qui produit entailles dans leurs ailes : notches en anglais. L'analyse moléculaire a

révélé que ce phénotype était dû à la perte de fonction par haploinsuffisance d'un

gène codant un récepteur transmembranaire : Notch. Il existe quatre homologues

de ce gène chez l'Homme. Ces gènes sont impliqués principalement dans la

différenciation cellulaire.

Ces récepteurs possèdent au moins cinq ligands : DLL1 (delta like ligand),

DLL2, DLL3, JAG1 et JAG2. Suite à la liaison de son ligand, le récepteur subit

plusieurs clivages protéolytiques entrainant la libération de la partie intracellulaire

du récepteur qui se localise alors dans le noyau. Ce processus est hautement

régulé au travers de l'interaction avec des protéines homologues de Deltex et

Mastermind chez Drosophila. Il est intéressant de noter que Deltex, qui est un

régulateur positif de Notch chez Drosophila, est un régulateur négatif chez les

mammifères. Le récepteur Notch activé participe à un complexe contenant

l'homologue du gène de la mouche SuH (suppressor of hairless) CBF-1 qui est un

facteur de transcription. Suite à la liaison de Notch, CBF-1, qui était jusqu'alors un

répresseur de transcription, devient un activateur de transcription. Les gènes

transcrits sont hautement pléiotropiques et contexte spécifique, à tel point qu'il est

impossible de prédire les conséquences de l'activation de Notch dans différents

tissus parce que la fonction de Notch ne semble pas être l'induction mais plutôt de

permettre certains changements. On classe l'action de Notch dans différentes

catégories : maintien de l'état indifférencié, maintien des cellules souches ou

différenciation binaire. Pour ce dernier cas, pour deux cellules de même type, celle

exprimant le ligand et celle exprimant le récepteur ne s'engageront pas dans la

même voie de différenciation. (145)

Parmi les gènes cibles de Notch on a : les facteurs de transcription Hes

(Hairy-enhancer of split) qui ont un effet sur la différenciation cellulaire et p21Waf1,

qui est un inhibiteur des CDK et donc bloque la progression du cycle cellulaire.

Le locus Notch engendre des phénotypes différents en fonction du nombre

de copies du gène présent. Ainsi, la délétion ou la duplication d'un allèle

produiront des phénotypes différents de celui d'une cellule possédant deux allèles.

90

L'implication de Notch dans le cancer a commencé suite à l'observation de

translocations dans des ALL à cellules T générant des protéines chimères

contenant une version tronquée de la protéine Notch1 correspondant à la partie

intracellulaire du récepteur ce qui mime la version activée du récepteur. De façon

similaire, l'intégration du virus MuLV (Moloney murine leukemia virus) se produit

souvent au niveau du gène Notch1 générant une version tronquée de la protéine

correspondant au récepteur activé (la portion cytoplasmique). L'intégration du

virus MMTV (mouse mammary tumor virus) dans le gène Notch4 générait un gain

de fonction au travers d'une version tronquée de la protéine, de la même manière

que pour Notch1 dans les ALL à cellules T. Des études ultérieures sur souris

transgéniques exprimants la portion cytoplasmique de Notch 4 et Notch 1 a

prouvé l'association entre ces mutants et la carcinogenèse mammaire. L'activation

constitutive de Notch entraine l'arrêt de la différenciation de sorte que les animaux

présentent des cellules mammaires incapables de se différencier de façon

terminale suite à la stimulation hormonale. Il est intéressant de constater que le

modèle murin porteur d'une mutation de Notch1 présente une association entre

lésions bénignes et lactation, ce qui montre l'action contexte-dépendant de Notch.

Par ailleurs, les cancers du sein ainsi que d'autres cancers épithéliaux présentent

ne surexpression de signaux de la voie Notch, dont le récepteur et son ligand.

Ces données montrent que le récepteur activé, au moins dans certains

tissus tels que l'épithélium mammaire ou le tissu lymphatique, possède un

potentiel oncogénique. Des études in vitro sur lignées cellulaires montrent que le

récepteur seul présente un faible potentiel oncogénique mais qu'il agit en synergie

avec d'autres oncoprotéines. Les cibles du récepteurs Notch sont dans l'ensemble

inconnues mais il semblerait que la cycline D1 en soit une. Il existe également un

couplage entre Notch et la voie de signalisation de ras dans un contexte

néoplasique alors que la suppression de la voie Notch inhibe l'oncogenèse induite

par l'oncogène ras activé. (146)

De récentes études montrent cependant que l'activation de Notch dans des

kératinocytes entraine leur différenciation alors que la délétion du gène résulte

dans le développement de néoplasies et une sensibilité accrue à la carcinogenèse

chimique. Ces effets étaient associés avec l'induction de p21Waf1 par l'activation de

la voie de signalisation Notch. Ceci suggère une activité tumeur suppressive dans

91

l'épiderme qui s'oppose à l'activité oncogénique dans les cellules de l'épithélium

mammaire. Le mécanisme expliquant cette dualité est encore inconnu. (147)

ii/ Cellules souches cancéreuses

Des études ont montré qu'il y avait un nombre minimum de cellules à

injecter pour qu'un xénogreffe sur souris prenne. Or, si la population cellulaire

tumorale était homogène alors une seule cellule devrait suffire au développement

tumoral chez la souris et le nombre de cellules injectées n'influencerait que le

temps de latence pour l'obtention d'une tumeur palpable. Cependant, il s'avère

qu'un minimum d'au moins quelques centaines de cellules est nécessaire au

développement tumoral chez la souris. Des observations similaires ont été faites

in vitro avec des expériences clonogéniques dans lesquelles la survie de cellules

individuelles a été testée, par opposition à la survie de la culture entière. Ainsi, les

cellules cancéreuses ne sont pas homogènes et seulement une fraction des

cellules d'une tumeur peut croitre in vivo et générer une tumeur solide. Ces

cellules qui possèdent la capacité de se régénérer sont les cellules souches

cancéreuses et sont responsables d'une part pour le renouvellement des cellules

souches et d’autre part pour la génération de cellules cancéreuses

« différenciées ». Ces dernières contribuent de façon importante à la masse

tumorale mais n'ont pas de propriétés tumorigéniques. Une telle hétérogénéité est

apparente dans les tératocarcinomes dans lesquels une faible proportion de

cellules expriment des marqueurs spécifiques tels que β-hCG (β-human chorionic

gonadotropin), tandis que les autres cellules peuvent produire dents ou poils. Bien

que les cellules souches cancéreuses comme les cellules « différentiés » aient la

capacité de proliférer, elle est limitée dans le cas de ces dernières tandis que les

cellules souches peuvent se diviser indéfiniment. (148)

Pour prouver cette hypothèse, il faut pouvoir séparer les cellules d'une

tumeur donnée en plusieurs sous-populations et tester leur tumorigénicité (Fig. 18).

De telles études ont été menées sur des tumeurs mammaires dans lesquelles les

cellules ont été séparées en fonction de leur profil d'expression de certains

marqueurs de surfaces et ont confirmé l'hypothèse. Seulement certaines sous-

populations des cellules du cancer du sein étaient tumorigènes, correspondant

92

aux cellules souches de la tumeur mammaire primaire testée. L'injection d'une

centaine de cellules souches a permis le développement de tumeurs tandis que

l'injection de plusieurs dizaines de milliers des autres cellules n'a pas permis la

formation de tumeurs. (149)

Fig. 18 : Test de tumorigénicité. D’après Hippokratis (82)

Il reste cependant à prouver que ces cellules ont toutes les caractéristiques

de cellules souches tumorales et peuvent donc générer l'ensemble des sous-types

cellulaires de la tumeur.

Par ailleurs, l'injection de cellules de carcinome embryonnaire en sous-

cutané chez des souris entraine le développement de tératocarcinomes tandis que

l'injection des mêmes cellules dans des blastocystes donne naissance à des

souris chimères. Ainsi, le devenir des cellules souches cancéreuses est

également hautement dépendant de leur micro-envrionnement. (150)

Implication des cellules souches cancéreuses sur le pronostique et le

traitement

L'accumulation de mutations n'a un réel impact que dans les cellules

souches cancéreuses. En effet, même si une cellule « différenciée » acquiert des

mutations, elles seront perdues puisque cette cellule a une durée de vie limitée.

93

Inversement, les mutations dans les cellules souches sont transmises aux cellules

filles, participant ainsi aux caractéristiques de la tumeur, de façon plus ou moins

importante en fonction de l'avantage prolifératif que ces mutations confèrent.

Il existe une hétérogénéité au sein même des cellules souches.Lorsque les

cellules de cancer du sein ont été testées, les tumeurs les plus agressives

comportaient plus de cellules tumorigènes, qui représentent donc cellules souches,

mais aussi celle-ci pouvaient être subdivisées en plusieurs sous-populations

caractérisées par différentes mutations. On peut également imaginer qu'une

mutation dans une cellule « différenciée » résulte dans l'acquisition de l'immortalité.

Le taux de croissance tumoral reflète donc, non seulement le taux de

prolifération cellulaire et l'interaction entre les cellules cancéreuses et le stroma

mais aussi la proportion de cellules souches au sein de la tumeur.

Les cellules souches ont également une implication importante pour la

thérapie. En effet, les traitements cherchent à inhiber la croissance des cellules

cancéreuses sans affecter les cellules normales. Cette sélection passe par le biais

de marqueurs spécifiques dans ou sur les cellules cancéreuses qui constituent

soit la cible de la thérapie soit une manière de distinguer les cellules néoplasiques

auxquelles le médicament doit être délivré. Cependant, cette sélection s'exerce en

général sur les cellules cancéreuses majoritaires, à savoir les cellules

« différenciées » alors que les cellules souches devraient constituer la réelle cible.

Le fait que les cellules souches représentent une faible proportion de la tumeur

rend l'identification de leur profil d'expression plus difficile dans la mesure où il est

souvent masqué par celui des cellules « différenciées ». Par ailleurs, les cellules

souches cancéreuses sont souvent quiescentes, possèdent des capacités de

réparation de l'ADN supérieures et ainsi présentent une plus haute résistance aux

traitements que les cellules « différenciées ». Enfin, les cellules souches

cancéreuses, comme les cellules souches normales, expriment des transporteurs

comme ABC (ATP binding cassette) qui jouent un rôle important dans la

résistance aux médicaments.

Ainsi, il est possible d'envisager que le manque d'efficacité des thérapies

anti-cancéreuses classiques soit dû au fait qu'elles inhibent la croissance d'une

sous-population cellulaire, les cellules « différenciées » mais n'affectent pas les

cellules souches. Le succès de traitements répétés pourrait alors être dû à la

94

diminution périodique de la population de cellules « différentiées ». Le

développement d'un traitement hautement efficace devrait donc prendre en

compte la population de cellules souches qui est celle qui doit être éliminée. (151,

152)

iii/ Pharmacogénomique – Détermination de l'efficacité thérapeutique

Dès le début de la thérapie anti-cancéreuse, les oncologistes ont remarqué

une grande hétérogénéité de réponses au traitement. Bien que des tumeurs

répondent bien au traitement, ce n'est pas le cas d'autres, souvent hautement

similaires par ailleurs. De plus, de nombreuses tumeurs, répondant initialement au

traitement, développent des résistances après un certain temps. Par conséquent,

la thérapie anti-cancéreuse ne soigne pas mais retarde la progression de la

maladie.

De nombreux médicaments ciblant différentes voies de signalisation

existent ; ainsi, différents mécanismes peuvent expliquer leur plus ou moins

grande efficacité et dans la plupart des cas, la résistance à un médicament n'est

pas synonyme de résistance à un autre. Pour les traitements ciblant des voies de

signalisation plus générales comme par exemple l'apoptose, un défaut au niveau

de la machinerie de l'apoptose entraine la résistance à l'ensemble des thérapies

se basant sur l'induction de la mort cellulaire programmée, parmi lesquelles on

peut citer le cisplatine, l'adriamycine ou encore la radiothérapie. Ceci est

également applicable aux tumeurs de l'appareil reproducteur utilisant des

thérapies hormonales et pour lesquelles la résistance est causée par l'absence de

récepteurs (et est donc prévisible). Cependant, même si les récepteurs sont

présents, la privation en hormones, qui sont des agents mitogènes, vise à induire

l'apoptose. La réponse apoptotique est donc encore une fois recquise. Un autre

mécanisme pouvant expliquer la sensibilité réduite des cellules cancéreuses aux

traitements est la présence de pompes comme la glycoprotéine P qui excrètent le

médicament hors de la cellule. Les cellules cancéreuses surexpriment souvent

ces « détoxifiants » cellulaires.

95

a/ Lien entre chimiothérapie/radiothérapie et apoptose

L'apoptose est caractérisée par certains changements morphologiques

pour lesquels les caspases jouent un rôle important. Il s'agit d'un processus actif,

hautement contrôlé, aboutissant à la mort cellulaire « dans la dignité ». Elle peut

être déclenchée par des signaux exogènes (stress génotoxique par exemple) ou

endogènes (en particulier au cours du développement). De nombreuses

molécules de chimiothérapie ont été identifiées de façon empirique, sur la base de

leur capacité à inhiber la prolifération cellulaire et donc leur mécanisme d'action

n'est pas toujours connu. Cependant, il apparaît souvent qu'ils agissent par un

mécanisme impliquant l'initiation de l'apoptose.

La voie extrinsèque de l'apoptose fait appel aux récepteurs de mort

cellulaire : CD95, récepteur au TNF (tumor necrosis factor) et récepteur au TRAIL

(TNF-related apoptosis-inducing ligand) qui, suite à leur activation entrainent une

cascade d'événements aboutissant à l'activation des caspases, en particulier les

caspases 3 et 7. Pour la voie intrinsèque, des protéines mitochondriales telles que

Smac/DIABLO (Second mitochondrial-derived activator of caspase / direct inhibitor

of apoptosis-binding protein with low pI), HtrA2 (high-temperature requirement

protein A2) ou encore cyt c sont relarguées dans le cytosol. Le cyt c forme un

complexe avec Apaf-1 (apoptotic protease-activating factor 1) pour activer la

caspase 9 et induire l'apoptose tandis que Smac/DIABLO et HtrA2 se lient aux

protéines anti-apoptotiques et inhibent ainsi leur action. (153)

b/ Le gène tumeur suppresseur p53, un régulateur majeur de l'efficacité de

la thérapeutique anticancéreuse

Le TSG p53 joue un rôle important dans la régulation de l'apoptose. En

effet, il peut rompre l'équilibre entre les gènes pro-apoptotiques comme Bax, Bac

et puma et anti-apoptotiques comme Bcl-2 en faveur des gènes pro-apoptotiques

ou encore induire d'autres gènes impliqués dans l'apoptose tels que PTEN ou

Apaf-1 et stimuler la voie extrinsèque au travers des récepteurs CD95 et TRAIL.

En raison du rôle central qu'occupe p53, il n'est pas surprenant que ce

gène soit le plus souvent muté dans les cancers.

96

Il a été montré que la ré-expression de gènes impliqués dans l'apoptose

tels que p53 pouvait entrainer une réponse au traitement et qu'inversement,

l'inactivation de ces gènes rendait la tumeur résistante à la chimiothérapie et à la

radiothérapie. Ainsi, la voie de l'apoptose doit être intacte pour la réponse à la

plupart des traitements.

Dans le cas de la radiothérapie, suite aux radiations ionisantes, la plupart

des cellules cancéreuses connaissent ce que l'on appelle une « catastrophe

mitotique » qui résulte soit dans la mort cellulaire soit dans l'arrêt irréversible de la

croissance.

Des études présentent cependant des résultats contradictoires. En effet, il a

été démontré que la présence de p21Waf1, un TSG agissant en aval de p53 pour

induire l'arrêt du cycle cellulaire, rendait les tumeurs résistantes au traitement. Il a

été proposé que l'arrêt du cycle cellulaire permettait à la cellule de procéder à la

réparation des dommages de l'ADN engendrés par la thérapie alors que les

cellules déficientes en p21Waf1 continuaient de proliférer, accumulant ainsi des

mutations ce qui aboutit à leur mort.

Par ailleurs, p53 confère une résistance à certains agents intercalants

tandis qu'il confère une sensibilité à d'autres, comme le 5-fluorouracile, par un

mécanisme différent. Ceci reflète probablement de multiples rôles de p53 dans la

régulation de l'apoptose, de la stabilité génomique et de l'arrêt de la croissance

(réversible ou non). L'origine des cellules cancéreuses en association avec les

voies de signalisation affectées par les mutations dont elles sont porteuses

pourrait favoriser l'une ou l'autre réponse. Ainsi, les cellules prônes à entrer dans

l'arrêt du cycle cellulaire avec une réponse p53/p21 intacte seront résistantes à la

thérapie tandis que les cellules prônes à suivre la voie de l'apoptose seront

sensibles. Ceci souligne l'importance du contexte cellulaire, en plus du statut

génétique dans la prédiction de l'efficacité d'un traitement. (154, 155, 156)

c/ La résistance à la thérapie est intrinsèque aux tumeurs

Il apparaît donc que la capacité des cellules à échapper à l'apoptose est

aussi responsable de la résistance au traitement. Ainsi, la résistance à la thérapie

est intrinsèque aux tumeurs, ce qui n'empêche pas que les traitements entrainent

97

la sélection de certains génotypes présentant une plus grande résistance que les

autres. Les métastases, qui sont sujettes à une forte sélection sur la base de leur

survie dans des conditions non favorables, sont en général plus résistantes à la

thérapie que les tumeurs primaires. Ceci est en accord avec l'enrichissement des

cellules métastatiques en mutations de p53 et surexpression de Bcl-2 par rapport

aux tumeurs primaires d'origine.

Le succès plus important des thérapies combinatoires associant des agents

avec des cibles différentes s'explique par la probabilité réduite pour les cellules

cancéreuses d'avoir une résistance intrinsèque à l'ensemble de ces cibles.

d/ Pharmacogénétique

Jusqu'alors nous nous sommes intéressés aux mutations acquises et

accumulées par les cellules cancéreuses. Le polymorphisme hérité par les

patients pourrait également jouer un rôle important dans l'efficacité des thérapies

anti-cancéreuses.

Le terme pharmacogénétique réfère à la discipline étudiant les gènes

candidats susceptibles d'expliquer les variations dans la réponse d'un individu à

un médicament. Originellement destinée à l'étude de la réponse aux médicaments

contre des agents infectieux, cette discipline s'est par la suite ouverte à l'étude de

la réponse aux agents anti-cancéreux. Les mécanismes pouvant expliquer

l'efficacité d'un médicament peuvent être séparés en trois sous-catégories en

fonction de s'ils agissent en amont (transporteurs, enzyme métabolisant le

médicament etc.), au niveau (métabolisme de l'ADN, fuseau mitotique etc.) ou en

aval de la cible critique (régulation de l'apoptose).

1/ Les mécanismes en amont

Les transporteurs ABC, parmi lesquels le gène de multi-drogue résistance

MDR1 codant la glycoprotéine P, sont supposés jouer un rôle important dans

l'efficacité au traitement puisqu'ils régulent la quantité de médicaments dans les

cellules cancéreuses. Cette famille, qui en plus de MDR1 inclut également MRP1

98

et MRP2, est souvent amplifiée par mutations somatiques dans les cellules

cancéreuses mais aussi par polymorphisme hérité.

Les cytochromes P450 sont des enzymes qui peuvent soit détoxifier les

médicaments tels que le paclitaxel ou le tamoxifène soir activer des médicaments

inactifs tels que le cyclophosphamide. Le paclitaxel est métabolisé par CYP2C8

qui présente différents allèles avec une efficacité variable pour métaboliser ce

médicament. CYP17 est un membre de la famille des cyt P450 impliqué dans la

biosynthèse d'oestrogènes. Un polymorphisme dans la région non traduite du

gène entraine sa régulation à la hausse. Il a été montré que le risque de

développement d'un cancer de l'utérus suite à un traitement hormonal de

remplacement (après la ménopause) dépendait de l'allèle de CYP17 dont le

patient est porteur.

L'UGT (UDP-glucuronsyltransferase) catalyse la glucuronidation (ajout

d'acide glucuronique) de différentes molécules, les rendant solubles dans l'eau et

ainsi facilitant leur élimination. L'irinotecan est activé dans le foie en un inhibiteur

de l'ADN topoisomerase I utilisé chez les patients atteints de cancer du colon. Un

polymorphisme dans le promoteur de l'UGT conduit à une transcription réduite et

donc une moindre glucuronidation de ses cibles qui incluent l'irinotecan, ce qui

entraine dans certains cas une toxicité avec forte diarrhée. (157)

2/ Interaction médicament – cible

Le 5-fluorouracile (5-FU) est converti en 5-fluoro-2-deoxyuridine

monophosphate, un inhibiteur de la thymidylate synthase (TS) qui empêche la

division cellulaire. Dans le foie, une large proportion de 5-FU est inactivée par la

DPD (dihydropyrimidine dehydrogenase), une enzyme qui présente une forte

variabilité (d'un facteur 8 à 21) de son activité entre individus. Cette variabilité est

attibuée à un polymorphisme dans la séquence du gène. Les patients avec une

activité réduite de la DPD présentent en général une forte toxicité du 5-FU. Il

existe également un polymorphisme dans la région de régulation de la TS

affectant son niveau d'expression. Une faible activité de la TS est associée à une

mailleure réponse au traitement par le 5-FU.

99

Les enzymes de réparation de l'ADN qui corrigent les dommages causés

par certains agents anti-cancéreux jouent également un rôle dans l'efficacité des

médicaments. Par exemple, un polymorphisme de l'enzyme hMSH2 module la

susceptibilité à la chimiothérapie entrainant l'alkylation des guanines.

Les anti-folates comme le methotrexate sont utilisés dans la thérapie contre

les leucémies, les lymphomes et les cancers du sein. L'enzyme 5,10-

methylenetetrahydrofolate reductase, qui joue un rôle important dans le maintien

de niveaux faibles de folates, présente un polymorphisme qui affecte son activité

et donc le niveau de folates endogènes. (157)

3/ Les mécanismes en aval

Certains polymorphismes existent, comme par exemple dans le gène

tumeur suppresseur p53. En particulier, dans l'exon 4, un polymorphisme qui code

alternativement pour arginine ou proline à la position 72 affecte l'efficacité du cis-

platine dans les cancers de la tête et du cou.

Des polymorphismes de l'ADN mitochondrial sont également susceptibles

de moduler la réponse aux traitements anti-cancéreux. (157)

4/ Vers la thérapie individuelle

Le but de la pharmacogénétique est de prédire la réponse au traitement

d'un patient en se basant sur son génotype. Des études en cours visent à évaluer

le polymorphisme non seulement dans les régions codantes mais aussi non

codantes, qui peuvent être des séquences régulatrices, dans la réponse aux

traitements anti-cancéreux. Ainsi, dans un futur proche, le traitement administré à

chaque patient se basera sur leur génotype. (158)

iv/ Carcinogenèse chimique

Cela fait très longtemps que l'on sait qu'il existe un lien entre certains

produits chimiques et certains cancers. Par exemple, il a été décrit il y a près de

300 ans que les ramoneurs développaient des cancers du scrotum.

100

Dans la carcinogenèse chimique, le composé responsable pour l'induction

de la néoplasie entraine des dommages de l'ADN : ruptures de l'ADN,

substitutions de bases, insertions, délétions, réticulation etc. Ces mutations

échappent aux systèmes de détection de dommages et de réparation de l'ADN et

deviennent fixes dans le génome. D'autres carcinogènes ne sont pas capavles de

se lier à l'ADN et exercent leur action de façon indirecte (épigénétique, dérivés

réactifs de l'oxygène, inflammation etc.).

a/ Carcinogènes génotoxiques

La liaison directe à l'ADN de certains carcinogènes et les dommages qu'ils

entrainent représentent un mécanisme direct de carcinogenèse. Ces composés,

parmi lesquels on trouve l’oxide d'éthylène, le bis (chloro-méthyl) éther et des

dérivés de l'aziridine et de la moutarde azotée, sont électrophiles, ce qui leur

permet d'intéragir physiquement avec l'ADN.

De vastes majorité des composés en revanche nécessitent d'être activés,

en particulier par les cyt P450 : ce sont des pro-carcinogènes. (159, 160)

b/ Les hydrocarbones aromatiques polycycliques (PAHs)

Les PAHs sont des carcinogènes produits lors de la combustion de matière

organique. Par exemple, le benzo(a)pyrène pentacyclique (BP) est présent dans

le goudron. Il peut être éliminé ou activé en 7,8-dihydrodiol BP qui se lie

directement à l'ADN. (160)

c/ Les aflatoxines

Ce sont des mycotoxines qui contaminent la nourriture au cours de la

croissance de certaines moisissures. Les aflatoxines, en partculier l'aflatoxine B1

(AFB1), sont responsables du développement de carcinomes hépatocellulaires.

L'AFB1 requiert l'activation par le cyt P450. La stéréochimie du métabolite est

importante. En effet, l'activation par CYP3A4 ne produit que des exo-isomères qui

sont 1000 fois plus génotoxiques que les endo-isomères. (160)

101

d/ Les carcinogènes non génotoxiques

Certains composés n'ont pas la capacité de se lier à l'ADN mais sont

pourtant de puissants carcinogènes. C'est le cas de la 2, 3, 7,8-

tetrachlorodidenzo-p-dioxine (TCDD). Les TCDD sont produites lors de la

production de phénols polychlorés. Le mécanisme d'action supposé des TCDD

consiste à stimuler les récepteurs aux arylhydrocarbures (AhR), ce qui, au travers

d'une cascade d'événements, aboutit à la modulation de l'activité de protéines de

régulation de la différenciation, de la prolifération et de la mort cellulaires.

L'ablation du gèna Ah chez des souris les rend résistantes à la carcinogenèse

induite par les TCDD. Inversement, la surexpression d'une forme active de l'AhR

induit des cancers chez la souris. (161, 162)

v/ Hormones et cancer

Le lien entre cancer et hormones a été reconnu il y a plus d'un siècle. Ce

lien reflète le fait que les hormones sont impliquées, de façon directe ou indirecte,

dans différents aspects de la biologie tumorale. Par exemple, les hormones sont

des régulateurs de la croissance tumorale ; elles ont un effet positif ou négatif sur

la prolifération cellulaire. De plus, le statut hormonal d'une tumeur a d'importantes

implications prognostiques et thérapeutiques. Par exemple, les tumeurs

prostatiques acquièrent une indépendance à l'androgène au cours de la

métastase.

Les hormones peuvent agir au travers des voies systémiques, paracrine ou

autocrine. L'action autocrine est tout particulièrement importante dans le cadre de

la carcinogenèse puisque les cellules cancéreuses peuvent générer des boucles

autocrines qui maintiennent le signal et qui constituent une cible des traitements

d'inhibition de croissance tumorale.

Les hormones peuvent agir par le biais de récepteurs membranaires qui

déclenchent une cascade de signalisation : ce sont les hormones protéiques ; ou,

et c'est le cas majoritaire, leurs récepteurs peuvent être dans le noyau et elles

agissent alors comme facteur de transcription : ce sont les hormones stéroïdes.

102

Il est courant de voir des actions différentes de la même hormone dans

différents tissus ; ceci s'explique par la présence de co-facteurs tissu-spécifiques

qui régulent l'activité hormonale.

a/ Androgènes et cancer de la prostate

Le cancer de la prostate est le cancer avec la plus forte incidence chez

l'homme et le second en termes de mortalité, après le cancer des poumons. Trois

sources de données laissent à penser que les androgènes jouent un rôle

important dans ce cancer. En premier lieu, la castration de jeunes mâles offre une

protection contre le développement du cancer de la prostate. Ensuite, des études

épidémiologiques montrent une corrélation entre les concentrations en

androgènes dans le sérum et le risque de développer des tumeurs de la prostate.

Enfin, des études in vitro et in vivo montrent que l'équilibre entre mort cellulaire et

prolifération peut être rompu par le retrait ou la supplémentation en androgènes.

L'androgène majeur dans le sérum est la testostérone produite par les

cellules de Leydig dans les testicules. Dans la prostate, l'androgène prédominant

est la DHT (5α-dihydrotestostérone) qui est produite à partir de testostérone par la

5α-reductase. Ces deux androgènes agissent sur le même récepteur : le récepteur

aux androgènes (AR) qui est un acteur clef dans le cancer de la prostate. L'AR est

un récepteur nucléaire qui, suite à la liaison de son ligand, fonctionne comme un

facteur de transcription. La liaison des androgènes sur leur récepteur entraine la

dissociation d'une protéine chaperonne qui inhibait jusqu'alors le récepteur, sa

dimérisation et enfin sa liaison à sa séquence cible sur l'ADN. Les gènes cibles

initient une cascade de signaux aboutissant à la prolifération cellulaire et à

l'inhibition de l'apoptose. L'activation des AR entraine également la lipogenèse et

permet la synthèse de composants clefs de la membrane, tels que les

phospholipides ou le cholestérol. Cette lipogenèse persiste à tous les stades de

développement de la tumeur, même lorsque la tumeur est devenue indépendante

des androgènes, ce qui suggère que cette voie est fondamentale à la

carcinogenèse prostatique. Il est possible d'activer le récepteur en l'absence de

ligand, au travers de couplages avec d'autres voies impliquant des facteurs de

103

croissance telles que les voies de l'EGF, de l'IGF ou encore du KGF/FGF-7

(keratinocyte growth factor). (163)

Une autre action du récepteur a été proposée qui ne met pas en jeu son

rôle de facteur de transcription, à savoir, l'activation de la voie des MAPK au

travers d'un mécanisme dépendant du c-Src.

Des études in vitro et in vivo ont montré une grande hétérogénéité de

réponses suite à l'activation de l’AR. Ceci est dû à la présence de facteurs cellule-

spécifiques capable de moduler la réponse consécutive à l'activation du récepteur ;

ils sont co-activateurs ou co-répresseurs. Les co-activateurs de classe I tels que

p300/CBP lient les récepteurs nucléaires à la machinerie de transcription alors

que les co-activateurs de classe II tels que p160 sont impliqués dans le

remodelage de la chromatine. En fonction de la disponibilité en co-activateurs, ces

derniers sont recrutés seuls ou en association et suivis du recrutement de l'ARN

polymérase II (Fig. 19). Ce mécanisme est également applicable aux récepteurs

aux oestrogènes (ER). Plusieurs altérations de ces co-activateurs sont impliquées

dans le cancer de la prostate. Notamment, l'expression de SRC-1 est augmentée

dans les carcinomes prostatiques indépendants des androgènes par rapport à

ceux androgènes dépendants ou aux lésions bénignes tandis que l'expression de

RAC-3 est corrélée avec des tumeurs de hauts grades. P300 quant à lui a été

impliqué dans l'activation de l’AR par l'interleukine-6, de façon indépendante des

androgènes. (164)

Fig. 19 : Structure du récepteur aux androgènes

De nombreuses mutations du récepteur lui-même ont été reportées,

incluant des mutations accroissant l'activité du récepteur ou modifiant sa

spécificité pour son ligand. Il existe un polymorphisme poly-Glu (codon CAG) en

région N-terminale dont le nombre de répétitions varie de 14 à 35. Le degré de

répétition a été associé au risque de cancer de la prostate, avec un petit nombre

de répétitions associé à un risque plus important de développement d'un

104

carcinome de la prostate et un âge au diagnostique plus jeune. Les mutations du

AR sont, en général, rares dans les carcinomes prostatiques, du moins avant

thérapie. Les amplifications du AR qui si situe sur le bras long du chromosome 11

en position q13 sont également peu communes avant thérapie mais leur incidence

augmente, pouvant aller jusqu'à 30 %, dans les tumeurs réfractaires aux

hormones et leurs métastases. (165)

Un aspect important de la biologie du cancer de la prostate est l'acquisition

de l'indépendance aux androgènes. Après un certain point du développement, les

cellules des carcinomes prostatiques perdent leur sensibilité aux androgènes. Par

conséquent, la suppression androgénique, qui constitue une approche

thérapeutique usuelle, ne retarde plus la croissance tumorale. Cette acquisition

constitue la transition du cancer de la prostate vers un stade incurable. Cette

transition n'est cependant pas toujours associée avec la perte ou l'altération de la

structure ou de l'expression des AR. Même, une amplification peut être observée

correspondant à une hypersensibilisation des AR (Fig. 20). (166)

Fig. 20 : Surexpression des récepteurs aux androgènes en réponse à la thérapie. D’après Hippokratis (82)

b/ Stéroïdes sexuels et cancer du sein

Le cancer du sein est une autre maladie présentant une association

marquée avec les hormones stéroïdes, en particulier le 17β-oestradiol. Les rôles

105

des oestrogènes dans le cancer du sein est compliqué par l'action d'une autre

hormone : la progestérone, présente dans la glande mammaire à très hauts

niveaux à certaines phases du cycle menstruel.

De la même manière que les AR dans le cancer de la prostate, les

récepteurs aux oestrogènes (ER) joue un rôle central dans le cancer du sein. On

distingue deux récepteurs : ERα et ERβ, codés par des gènes situés sur le bras

long des chromosomes 6 et 14, respectivement. Ces récepteurs possèdent des

domaines analogues à ceux des AR, à savoir : domaine de liaison de l'ADN,

domaine de transactivation, domaine de liaison du ligand, etc. La dimérisation, qui

peut être homo- ou hétéro- entre ERα et ERβ, est essentielle à la fonction de

facteur de transcription et donc pour l'activation des gènes cibles. De la même

manière que pour les AR, des co-activateurs et co-répresseurs interviennent mais

la complexité de ce système est plus importante dans la mesure où la liaison de

leurs ligands entraine des réponses différentes en fonction du type d’ER activé.

Ainsi, leur action combinée peut entrainer des réponses différentes, et ce même

au sein du même système cellulaire.

L'activité normale des ER est requise pour le développement et la

maturation de la glande mammaire. Dans le tissu mammaire sein, seuls 10 % des

cellules épithéliales expriment ERα contre 85 % pour ERβ. Il a été montré que le

17β-oestradiol induisait la transition G1/S conduisant à une plus grande fraction de

cellules en phase S. Ceci s'explique par l'action exercée par le 17β-oestradiol sur

l'expression des gènes de progression du cycle cellulaire tels que la cycline D1,

myc etc. (167)

La régulation de l'expression des ER semble jouer un rôle important dans le

cancer du sein, cependant, le mécanisme d'action n'est pas bien connu en raison

des résultats contradictoires obtenus par différentes études. D'une façon générale,

la proportion de cellules exprimant les récepteurs ERα augmente dans les cancers

invasifs par rapport aux cellules de l'épithélium mammaire normal. Inversement,

l'expression des récepteurs ERβ est diminuée dans les lésions malignes, ce qui

suggère que ce type d’ER a une action tumeur suppressive. Cependant, l'opinion

actuelle est que, ce n'est pas le niveau d'expression en lui même qui est important

mais plutôt le rapport entre ERα et ERβ. Il semblerait qu'un rapport élevé

ERα/ERβ soit associé à une dépendance des tumeurs aux oestrogènes alors que

106

la diminution de ce rapport est associé aux tumeurs indépendantes des

oestrogènes. Ce modèle est compliqué par l'existence de variants plus courts de

ces ER possédant des propriétés de signalisation altérées. De plus, les ER

subissent souvent des altérations structurales telles que des mutations, délétions

ou amplifications dans les cancers du sein. (168)

À la fin du XIXe siècle, l'importance des oestrogènes dans la maladie

étaient déjà connue et c'est la raison pour laquelle G. Beatson a eu recours à

l'ovariectomie sur les patientes atteintes de cancer du sein. Par la suite, plusieurs

tentatives ont été faites d'antagoniser les oestrogènes, sans grand succès, jusque

dans les années 70 quand le tamoxifène a été développé. Il s'agit d'un anti-

oestrogènes non stéroïdien pouvant être utilisé à la fois pour la prévention et le

traitement du cancer du sein. Des études ont montré que, si cette molécule avait

une action anti-œstrogénique dans l'épithélium mammaire, elle agissait comme

agoniste des oestrogènes dans d'autres tissus, en particulier l'endomètre. Ceci a

créé des inquiétudes quant au possible développement d'autres cancers liés aux

oestrogènes, en particulier des carcinomes de l'endomètre ; ceci étant, les

bénéfices d'un tel traitement sont supérieurs aux risques dans le traitement du

cancer du sein. Cette dualité serait due à des différences dans les co-activateurs

et co-répresseurs.

Depuis, différents analogues du tamoxifène ont été développés que l'on

appelle SERMs (selective ER modulators). L'un de ces SERM est prometteur : le

raloxifène, dans la mesure où il conserve l'activité anti-œstrogénique dans le tissu

mammaire du tamoxifène (ainsi que son activité agoniste dans les os) mais a

perdu son activité agoniste dans l'endomètre. (169)

c/ GHRH (Growth hormone releasing hormone) et carcinogenèse

Différentes hormones protéiques ont été associées avec la carcinogenèse.

L'une d'entre elles, la somatostatine, régule à la baisse la synthèse et l'excrétion

des hormones de croissance (GH) et est utilisée sous forme d'analogues dans le

traitement de différentes tumeurs solides. L'IGF-1 (insulin-like growth factor 1), qui

est également une hormone protéique, joue un rôle mitogène dans de

nombreuses tumeurs et constitue donc une cible dans le développement de

107

nouvelles chimiothérapies. Une autre hormone, la GHRH a récemment été

impliquée dans la carcinogenèse et constitue une cible prometteuse pour le

développement de nouvelles thérapies.

La GHRH est un neuropeptide sécrété par l'hypothalamus qui stimule la

synthèse et l'excrétion de GH dans l'hypophyse. Il semblerait cependant que la

GHRH soit également présente dans plusieurs autres tissus où elle serait

impliquait dans divers processus cellulaires. Elle régule la prolifération et la

différenciation de divers types cellulaires non hypophysaires. Le mécanisme

d'action dans les tissus périphériques est mal connu mais fait sans doute appel à

des voies de signalisation autocrines et paracrines (en plus de l'action

neuroendocrine). Le rôle de la GHRH dans la carcinogenèse met en jeu, au moins

en partie, des variants du récepteur à la GHRH plus courts que le récepteur

normal.

Il a été montré que des analogues antagonistes de la GHRH réduisaient les

concentrations en GH et IGF-1 dans des modèles animaux et au final inhibaient la

croissance de différentes tumeurs dépendantes de l'IGF-1, telles que des

ostéosarcomes, carcinomes de la prostate, du rein ou des poumons chez la souris

nude. Le rôle indirect de la GHRH dans la carcinogenèse a également été montré

en utilisant des « petites » souris porteuses d'une mutation faux-sens dans le gène

du récepteur à la GHRH le rendant inactif. En effet, l'ablation de l'action de la

GHRH résulte en une sensibilité réduite à la carcinogenèse chimique dans le foie.

De plus, les mêmes animaux fournissent un environnement non permissive aux à

la croissance de cellules de cancer du sein ; la croissance de xénogreffes chez

ces animaux étant fortement compromise par rapport aux animaux de phénotype

sauvage.

Ceci étant, des études ultérieures sur le mécanisme d'action des

antagonistes de la GHRH ont révélé que l'inhibition de l'IGF-1 n'était pas leur seul

mode d'action. Ces études ont montré que la GHRH était exprimée par plusieurs

tumeurs et lignées cellulaires et que la GHRH et son antagoniste agissaient de

façon opposée dans la régulation de la prolifération cellulaire par un mécanisme

ne faisant pas intervenir l'axe GH/IGF-1. Ceci suggère que la GHRH est un facteur

de croissance agissant de façon paracrine et autocrine.

108

Les tissus non hypophysaires normaux exprimant la GHRH inclus le

placenta, les ovaires, les testicules, et les lymphocytes. Les cancers produisant de

la GHRH inclus les cancers du sein, de l'endomètre, des ovaires, de l'estomac,

des os, de la prostate et les carcinomes pulmonaires à petites cellules.

L'obstacle majeur à l'étude du rôle extra-hypophysaire de ce neuropeptide

dans la carcinogenèse a été le fait que le récepteur à la GHRH dans les cancers

est a priori différent de celui dans l'hypophyse. En effet, le récepteur pituitaire

présente un profil d'expression restreint dans les tissus tels que le rein ou le

placenta. Cependant, des études récentes ont montré qu'il existait des variants de

ce récepteur exprimés dans de nombreux tissus normaux mais surtout malins,

médiant l'effet mitogène de la GHRH. L'un de ces variants : SV1 (splice variant 1)

qui diffère du récepteur normal au niveau d'une petite portion de la région N-

terminale (domaine extra-cellulaire) est d'importance majeure dans la mesure où il

présente une activité indépendante de la fixation de son ligand. Ainsi, il peut

stimuler la prolifération cellulaire en l'absence de ligand mais la présence de

GHRH accroit son activité. (170)

Les antagonistes de la GHRH sont des anti-cancéreux prometteurs dans la

mesure où l'ablation de GHRH n'a que peu de conséquences chez l'adulte et

comme ce sont de courts peptides ils peuvent être synthétisés facilement.

vi/ Oncogenèse virale

L'oncogenèse virale est estimée responsable de 15 à 20 % des cancers

dans le monde. Cependant leur importance dans la biologie cancéreuse est plus

importante que leur incidence. En effet, leur étude a permis de mieux comprendre

la biologis des tumeurs, en particulier au début de la recherche sur le cancer.

Pour qu'un virus soit considéré oncogène, il doit répondre à quatre critères :

1. Le virus ou son acide nucléique doit être présent dans les cellules tumorales.

2. La transfection d'une certaine partie du génome viral dans une cellule doit

entrainer son immortalisation ou sa transformation.

3. Montrer qu'il existe une association causale entre l'acquisition du phénotype

malin et le génome viral (ou une portion de celui-ci).

109

4. Pertinence clinique : il doit exister une corrélation entre l'infection virale et

l'augmentation de l'incidence de tumeurs.

Plusieurs virus répondent aux critères ci-dessus, complètement ou en

partie. Certains sont des rétrovirus avec un génome à ARN simple brin tandis que

d'autres ont un génome à ADN double brin. Leurs mécanismes d'actions sont

variés. Dans certains cas ils codent une protéine présentant un potentiel

oncogène, capable d'interférer les voies de signalisation et d'initier la conversion

maligne. C'est le cas des papillomavirus, capable de se lier à des tumeur-

suppresseurs tels que p53 ou Rb et les inactiver. Dans d'autres cas, ils activent

des oncogènes endogènes tels que wnt ou Notch par mutagenèse insertionnelle.

L'étude de ces virus a permis l'identification de nouveaux gènes importants pour la

carcinogenèse.

Les tumeurs engendrées par des virus oncogènes présentent toutes les

caractéristiques des tumeurs développées de façon indépendante de toute

infection comme l'instabilité génomique, la résistance à l'apoptose et

l'augmentation de la prolifération.

a/ Papillomavirus humain (HPV)

L'infection par le virus HPV a été associée à de nombreuses néoplasies,

avec le plus grave étant le cancer du col de l'utérus. Le développement tumoral

présente une période de latence important, ce qui suggère qu'il doit y avoir

accumulation de mutations dans les gènes de l'hôte en plus de l'expression

d'oncoprotéines par le virus pour que la conversion vers la malignité s'opère. De

plus, seuls certains porteurs développent la maladie, ce qui implique une

susceptibilité différente des hôtes ainsi probablement que l'intervention de facteurs

environnementaux ou d'autres facteurs.

Plus de 200 souches ont été identifiées, que l'on peut classer dans deux

grandes catégories : les HPVs cutanés et des muqueuses. On distingue

également les souches à risque élevé et faible. Parmi les virus à risque élevé on

trouve HPV-16, -18 et -31 dont la présence est associée avec la plus forte

incidence de développement de différents types de cancers.

110

Le virus infecte dans un premier temps les cellules épithéliales basales en

division et est présent en petit nombre de copies au cours de la différenciation des

cellules infectées. Cependant, lorsque ces dernières atteignent le stade de

différenciation terminale, le virus se réplique en grand nombre de copies et des

virions sont produits.

Les HPVs sont des virus non enveloppés et leur génome consiste en une

molécule d'ADN double brin d'environ 8 kb. Le génome contient trois régions : la

région E (early) d'environ 4 kb qui code les protéines non structurales, la région L

(late) d'environ 3 kb qui code deux protéines de capside et la région LCR (long

control region) ou URR (upstream regulatory region) qui contient divers éléments

de régulation. Au total, le génome du virus contient 8 ORFs (open reading frames).

Parmi les protéines codées par le génome, E1 et E2 sont impliquées dans

la réplication du génome viral et se lie à l'ADN au niveau de l'origine de réplication.

E2 est aussi impliquée dans la régulation du nombre de copies.

Les propriétés oncogéniques du virus sont principalement attribuées aux

protéines codées par les gènes E6 et E7. L'expression de ces protéines dans des

cultures cellulaires entraine l'immortalisation des kératinocytes, augmente le taux

de mutation en entrainant une instabilité génomique et présente une synergie

avec d'autres oncogènes tels que ras ou myc pour causer la transformation

maligne des cellules. Au niveau moléculaire, l'action d’E6 et E7 est médiée par

leur abilité à se lier et à inactiver des TSGs endogènes p53 e Rb, qui sont

d'importants régulateurs du cycle cellulaire. Par ailleurs, E6 peut induire la

transcription de hTERT qui code la sous-unité transcriptase inverse des

télomérases. Il a été montré que l'affinité d’E7 pour Rb était supérieure dans les

virus à haut risque que dans les virus à risque faible. La liaison de E7 à Rb (ou

p107 et p130, les deux autres membres de la famille Rb) empêche la liaison de ce

dernier à E2F, ce qui stimule la progression du cycle cellulaire. E6 est responsable

de la dégradation de p53 par le protéasome suite à son ubiquitination. Elle a

également un rôle dans la régulation des contacts cellule-cellule au travers

d'intéractions avec des protéines contenant un domaine PDZ. (171)

La protéine E5 a également un rôle dans la carcinogenèse mais son

mécanisme d'action est inconnu. (172, 173)

111

b/ Epstein-Barr Virus (EBV)

L'EBV a été associé à de nombreuses maladies dont le lymphome de

Burkitt, la maladie de Hodgkin, certains lymphomes à cellules T, des carcinomes

naso-pharyngés indifférenciés ou encore des carcinomes gastriques.

Son génome est constitué d'une molécule d'ADN double brin linéaire

d'environ 172 kb. L'EBV présente un tropisme pour les lymphocytes B. L'infection

des lymphocytes est médiée par l'interaction entre le récepteur cellulaire CD21 et

la glycoprotéine gp350 ainsi qu'entre le HLA (human leukocyte antigen) de type II

et la protéine virale gp42. Le virus mais également infecter les cellules épithéliales

mais le mécanisme de l'infection n'est pas complétement compris.

Une grande partie de nos connaissances sur le virus dérive de l'étude de

lignées cellulaires lymphoblastoïdes (LCLs) qui correspondent à des lignées

cellulaires transformées établies à partir de la culture in vitro de lymphocytes

isolés de patients porteurs du virus. Les propriétés carcinogènes du virus sont

dues de façon prédominante à deux protéines virales : EBNA-2 (antigène

nucléaire) et LMP-1 (protéine membranaire) et de façon moindre aux protéines

EBNA-LP, EBNA-3A et EBNA-3C.

L’implication de ces gènes a été mise en évidence en utilisant des virus

recombinants dont certains gènes ont été supprimés. En réintroduisant le gène

d'intérêt, EBNA-2 par exemple, la capacité du virus à transformer les lymphocytes

B a été restaurée. EBNA-2 agit, au moins en partie, en induisant la transcription

de gènes cibles en se liant aux promoteurs contenant la séquence consensus

GTGGGAA. Cette liaison requiert le régulateur de transcription RBP-Jκ/CBF-1, qui

est aussi activé par le récepteur Notch. EBNA-2 active également l'oncogène c-

myc.

LMP-1 est la protéine la plus importante dans le processus de

transformation. Elle présente des similarités avec CD40 (un membre de la famille

des TNFs). La surexpression de LMP-1 produits de nombreux effets différents qui

impliquent souvent l'action d'autres oncogènes cellulaires, comme par exemple,

l'induction de protéines anti-apoptotiques telles que Bcl-2, la production de

cytokins telles que les interleukines IL-6 ou -8 ou l'activation de la

phosphatidylinositol-3-kinase. (174, 175)

112

c/ Virus de l'hépatite B (HBV)

L'HBV est également un virus à ADN double brin. Il est associé à un grand

nombre de carcinomes hépatocellulaires. La protéine HBx joue un rôle clef dans la

transformation. Des expériences in vitro ont montré que la surexpression de HBx

dans des cellules de rongeurs entrainait leur immortalisation tandis que des

expériences avec des souris transgéniques ont montré que HBx agissait en

synergie avec d'autres stimuli oncogènes. Son rôle exact n'est pas clair mais il

semblerait qu'il agisse par le biais de la coopération avec d'autres oncogènes.

(173)

d/ Virus BK (BKV)

Le rôle du virus BK dans la carcinogenèse est contesté de par sa présence

dans une large part de la population et dans des tissus sains, sans présenter

aucune pathogénicité. Cependant des études ont montré qu'il possédait un

potentiel oncogène.

Le BKV est un polyomavirus avec un fort tropisme pour les cellules du rein,

même s'il peut également être rencontré à d'autres sites tels que l'estomac, les

poumons ou les nœuds lymphatiques. Son pouvoir oncogène est principalement

dû à deux protéines : l'antigène grand T (Tag) et l'antigène petit t (tag). Tag peut

se lier et inactiver les protéines p53 et Rb, de la même manière que les protéines

E6 et E7 du virus HPV. Tag est également responsable d'instabilité génomique se

traduisant par de nombreuses altérations chromosomiques (gains, délétions,

cassures, etc.). Le rôle de tag serait d'agir en synergie avec Tag.

Tag est capable de transformer des cellules de rongeurs in vitro, et coopère

pour cela avec l'oncogène ras. Cet effet n'était pas aussi marqué dans les cellules

humaines, ce qui n'est pas surprenant puisque la transformation des cellules

humaines est moins efficace que celle des rongeurs. Enfin, des souris

transgéniques exprimant Tag développent des carcinomes hépatocellulaires, des

tumeurs du rein et des maladies lymphoprolifératives.

Ceci étant, l'étude de tumeurs humaines montre une prévalence très

variable du BKV, même entre tumeurs de même type. De plus, la charge virale est

113

très faible, estimée à moins d'un virus par cellule, avec une forte hétérogénéité à

l'échelle cellulaire au sein d'une tumeur positive au BKV, certaines cellules n'étant

pas porteuses du virus. L'hypothèse proposée est que le virus initie l'instabilité

génomique et les changements dans l'expression des oncogènes qui s'en suivent

mais qu'ensuite le virus n'est plus requis. De plus, une activité paracrine a été

proposée permettant à une cellule infectée d'entrainer des changements dans les

cellules voisines. (176)

e/ Virus de leucémie à lymphocytes T humain (HTLV)

Contrairement aux virus présentés jusqu'à lors, le virus HTLV-1est un

rétrovirus, c'est à dire que c'est un virus à ARN qui, au cours de l'infection, subit

une transcription inverse puis une insertion dans le génome de l'hôte.

Il a la strusture classique des autres rétrovirus à savoir qu'il contient les

gènes gag, pol et env, bordés par les séquences LTRs (long terminal repeats). De

plus, il contient le gène Tax qui joue un rôle important dans la régulation dans la

régulation de la transcription, la réplication et la prolifération du virus dans les

cellules infectées. Tax agit au travers de l'interaction avec les protéines CREB

(cAMP responsive element binding-protein), SRF, NF-κB et AP-1 qui induit des

cytokines et des gènes anti-apoptotiques tels que Bcl-xL et survivine. Tax interfère

également avec l'action de p53 et p16, inhibant ainsi l'apoptose et induisant une

instabilité génomique. Le mécanisme d'action n'est pas très clair mais pourrait

faire intervenir dans certains cas p300/CBP ou NF-κB. La protéine Tax possède

également des motifs de liaison aux domaines PDZ (cf. E6 et HPV). L'importance

de ces motifs est soulignée par l'absence de propriétés oncogènes de Tax chez le

virus HTLV-II, qui ne diffère de Tax chez HTLV-I que par l'absence de ces

domaines.

Le mécanisme de l'infection par HTLV-I est mal connu mais il semblerait

que les virions soient transmis par contacts cellule-cellule. Suite à l'entrée dans la

cellule hôte, le génome viral s'intègre de façon aléatoire dans le génome de l'hôte

et la protéine Tax induit la prolifération des cellules infectées. Ensuite, l'expression

de Tax doit être régulée à la baisse car il semblerait que les cellules exprimant

Tax constituent des cibles pour les lymphocytes T cytotoxiques. Plusieurs

114

mécanismes ont été proposés pour expliquer la suppression de l'expression de

Tax dont l'hyperméthylation de la région 5'-LTR ou l'inactivation par mutation. De

plus, les protéines virales p30, Rex et HBZ suppriment également l'expression de

Tax.

La période de latence entre l'infection et le développement de cancers est

souvent de quelques décennies, ce qui suggère que l'accumulation de mutations

est nécessaire à ce processus. (173, 177)

f/ Virus de tumeur mammaire murin (MMTV)

Ce virus infecte et cause des cancers chez les souris. Il est particulièrement

important pour nous dans la mesure ùo il nous a permis de développer notre

modèle d'étude : la souris PyVT-MMTV (cf. partie III).

L'isolation et l'identification du virus MMTV ainsi que la preuve de son

implication dans le développement de tumeurs mammaires sont consécutives au

développement de souris prédisposées aux tumeurs mammaires telles que les

souches C3H ou BR6. Des études ont montré que l'héritabilité n'était pas

Mendélienne mais due à un « facteur extra-chromosomal » associé au

développement de tumeurs mammaires chez la mère. Par la suite, il a été montré

que le « facteur extra-chromosomal » était en fait un agent infectieux transmis lors

de la lactation.

Le virus induit la carcinogenèse au travers de son intégration qui conduit à

l'activation de gènes cellulaires sous la régulation des LTRs du MMTV qui

agissent comme des promoteurs/activateurs. Il semblerait que le virus présente

une certaine spécificité d'intégration conduisant à l'activation d'un nombre limité de

gènes. Parmi ces gènes activés par le MMTV on trouve les membres de la famille

wnt, les gènes du récepteur Notch ou encore les gènes de la famille FGF. Dans le

cas du récepteur Notch, une version tronquée du récepteur est produite le rendant

constitutivement actif. Il a été montré que toutes les souris exprimant ces

oncogènes sous la régulation des LTRs du virus développaient des tumeurs

mammaires. (178)

Pendant longtemps, ce virus était considéré n'infecter que les souris ;

cependant, des études récentes ont montré que certains cancers du sein humains

115

étaient porteurs de séquences homologues à celle du gène env du MMTV. Par la

suite des séquences correspondant à l'ensemble du génome du MMTV ont été

trouvées dans les cellules de cancer du sein alors qu'elles étaient absentes des

cellules saines des individus infectés. (179)

117

Deuxième partie

Développement et

activité des quinoléines

substituées

119

I/ Synthèse et activité anti-cancer du sein des quinoléines

substituées

Traduit de l'anglais : Shi et al. (180)

Résumé

Des agents anti-cancer du sein prometteurs dérivés de quinoléines

substituées ont été découverts. Les quinoléines ont été facilement synthétisées à

grande échelle à partir d'une séquence de réactions à partir de 4-

acétamidoanisole. Le produit d'addition de Michael a été isolé sous la forme du

produit intermédiaire de réaction dans la réaction de fermeture de cycle du 4-

amino-5-nitro-2-(3-trifluoromethylphenyloxy) anisole avec la méthylvinylcétone

menant à la 6-méthoxy-4-méthyl-8-nitro-5-(3-trifluoromethylphenyloxy) quinoléine

(14) la fonction amine de la 8-amino-6-méthoxy-4-méthyl-5-(3-

trifluoromethylphenyloxy) quinoléine, préparée à partir de 14, a été reliée à

différentes chaînes latérales par alkylation avec de la N-(3-iodopropyl) phtalimide,

Michael addition avec de l'acrylonitrile et une amination réductrice avec divers

carboxaldéhydes hétérocycliques, tels que l'imidazole-4-carboxaldéhyde, le

thiophène-2-carboxaldéhyde et le 2-furaldéhyde. Les effets des quinoléines

substituées sur la viabilité cellulaire de cellules de cancer du sein T47D en utilisant

un dosage d'exclusion au bleu trypan ont été examinés. Les résultats ont montré

que la valeur de la CI50 de la 6-méthoxy-8-[(2-furanylméthyle) amino]-4-méthyl-5-

(3-trifluoromethylphenyloxy) quinoléine est de 16 ± 3 nM, CI50 la plus faible parmi

toutes les quinoléines testées. Les valeurs de CI50 de trois autres quinoléines

sont dans la gamme nanomolaire, une plage souhaitable pour les tests

pharmacologiques.

Les quinoléines sont connues pour leur actvité anti malaria (181 – 183),

leishmanicide (184), antibactérienne (185), et anticancéreuse (186 – 189).

Récemment, les quinoléines ont été examinées dans l'inhibition des cassettes de

transport de médicaments se liant à l'ATP (186), le ciblage de l'hypoxie tumorale

(187), la modulation de la polyrésistance aux médicaments (8) et l'inhibition de la

120

tyrosine kinase (189). Sur la base des résultats de ces études, nous avons étudié

les quinoléines substituées à la recherche de nouveaux composés anti-cancer du

sein. Après notre criblage initial anticancéreux, nous nous sommes concentrés sur

les quinoléines substituées avec une structure présentant un squelette dérivé de

la 8-amino-5-(aryloxy)-6-méthoxy-4-methylquinoléine (181) par une dérivatisation

de sa chaîne latérale amino en C8. Nous rapportons ici la synthèse de nouvelles

quinoléines possédant des fonctions amines, nitriles, imidates, amidines et

hétérocycliques sur la chaîne latérale amino en C8, ainsi qu'une activité anti-

cancer du sein puissante contre des cellules de cancer du sein T47D. Les

quinoléines substituées de synthèse sont résumés en figure 21.

Fig. 21 : Structure et formules des quinoléines substituées.

Nous avons utilisé

une méthode de

synthèse similaire

menant à 5-(aryloxy)-4-

methylprimaquine (181,

190) en commençant par

le 4-acétamidoanisole (8)

par l'intermédiaire d'une

fonctionnalisation séquentielle C2 et C5 suivie par une réaction de fermeture de

cycle. Par conséquent, le 2-bromo-4-acétamido-5-nitroanisole (10) (190) a été

préparé à partir de la bromation du composé 8 en C2, suivie par une nitration en

C5. Le déplacement du bromure 6 avec du potassium 3-trifluoromethylphenoxide

(11) dans du N, N-diméthylformamide (DMF) à 120 ° C a donné le composé 4-

acétamido-5-nitro-2-(3-trifluoromethylphenyloxy) anisole (12). L'élimination du

groupe protecteur acétyle du composé 12 avec de l'acide chlorhydrique dans de

l'éthanol a donné le 4-amino-5-nitro-2-(3-trifluoromethylphenyloxy) anisole (13)

(Fig. 22).

121

Fig. 22 : Préparation du 4-amino-5-nitro-2-(3-trifluoromethylphenyloxy) anisole (compose 13).

Différentes conditions de réaction ont été étudiées afin de maximiser le

rendement de la construction de l'anneau de la quinoléine à partir du composé 13

avec de la méthyl-vinyl-cétone (182). Le traitement du composé 13 avec la méthyl-

vinyl-cétone, de l’arsenic et de l'acide phosphorique a 85 % à 100°C après 20 min

(188) permet d'obtenir un mélange de la quinoléine désirée 14, du produit

d'addition 1,4 15 et du composé de départ 13 dans un rapport 1:2:1. Lorsque la

réaction a été effectuée à 120°C pendant 20 min, un rapport de 7:1:1 des

composés 14:15:13 a été atteint (Fig. 23). Les produits bruts ont été séparés par

Chromatographie sur colonne de gel de silice avec un rendement de 52% du

composé 14, un rendement de 7% du composé 15, et 7 % de récupération du

composé 13. Un temps plus long de réaction a résulté en la décomposition des

produits sans que les rendements ne soient améliorés. L'utilisation d'un excès de

méthyl-vinyl-cétone n'a pas amélioré le rendement non plus. Le produit d'addition

1,4, 15, peut être traité avec de l'acide d'arsenic et de l'acide phosphorique dans

des conditions de réaction similaires à celle mentionnées ci-dessus pour donner la

quinoléine 14 et de l'amine 13 avec du composé de départ 15 dans un rapport

7:1:1. Par conséquent, l'utilisation d'un large excès d'acide d’arsenic et d'acide

phosphorique à 85 % peut minimiser la formation de l'intermédiaire 15. Les

résultats suggèrent que le produit d'addition 15 est le produit intermédiaire de

réaction conduisant à la quinoléine 14 mais il a également subi une addition de

122

Michael inversée pour fournir l'amine 13 et de la méthyl-vinyl-cétone. Comme les

alkynones conjuguées ont été utilisées dans la synthèse de quinoléines à partir

d'amines aromatiques (184, 191), l'amine 13 a été traitée avec de la 3-butyn-2-one

et de l’acide d'arsenic et de l’acide phosphorique à 100°C. Le produit désiré 14 a

été isolé avec un rendement de 24% associé à la récupération du composé de

départ 13 à hauteur de 28%. Le produit d'addition 1,4 n'a pas été détecté et divers

oligomères non identifiables ont été obtenus. Il est possible que le rendement

inférieur contribue à la facilité de polymérisation de l'alkynone terminale ou la

décomposition du produit d'addition intermédiaire 1,4.

Fig. 23 : Préparation de la quinoléine 14.

La quinoléine 14 a été convertie en composé 16 (182), qui sert de

précurseur pour produire diverses quinoléines substituées représentées en figure

24. Par conséquent, la réduction de la fonction nitro du composé 14 avec de la

poudre de fer dans de l'acide acétique-eau au reflux a donné un rendement de

96% de l'amino-quinoléine 16 (Fig. 24). L'alkylation de 16 avec de l'iodure 17

(192) et du bicarbonate de sodium dans du DMF a produit le composé 18 qui, par

traitement avec de l'hydrazine dans de l'éthanol au reflux a permis d'obtenir la

quinoléine 1.

123

Fig. 24 : Synthèse des quinoléines substituées 1 à 4

Les quinoléines 2-4 ont été synthétisées par l'intermédiaire d'une réaction

d'addition de Michael d'arylamine 16 avec de l'acrylonitrile dans du phenol (193) à

100°C dans un tube scellé et ont donné le produit d'addition 2 (rendement de

61%). Aucune réaction n'a été trouvée lorsque le composé 16 a été traité avec de

l'acrylonitrile dans de l'éthanol au reflux (194). L'éthanolyse de la quinoléine 2

avec de l'HCl (gaz) dans de l'éthanol (195) a produit de l’éthyle imidate 3, qui, par

traitement avec NH3 (gaz) dans de l'éthanol (196) à 50°C pendant 6h a permis

d'obtenir l'amidine 4 (rendement de 57%) avec 13% de composé initial 3 récupéré.

Les quinoléines 5-7 ont été synthétisées par un amination réductrice de

l'amine 16 et d'aldéhydes (Fig. 25). Le traitement de l'amine 16 avec l'aldéhyde 19

dans du méthanol - acide acétique suivi par du cyanoborohydride de sodium (197)

a fourni la quinoléine 5. Un traitement similaire de l'amine 16 avec les aldéhydes

20 et 21 séparément a permis d'obtenir les quinoléines 6 et 7, respectivement.

L'aldéhyde 19 a été préparée à partir de l'oxydation de 4-hydroxyméthylimidazole

avec du dioxyde de manganèse dans du méthanol (rendement 99%) (198).

124

Fig. 25 : Synthèse des quinoléines substituées 5, 6 et 7.

Les effets des quinoléines 1-7 sur la viabilité cellulaire des cellules de

cancer du sein T47D en utilisant un dosage d'exclusion au bleu trypan ont été

examinés. Le test d'exclusion au bleu trypan fournit un moyen rapide et efficace

pour le criblage de multiples médicaments (199). Les essais pour chaque

composé ont été réalisés en triple exemplaire et les significations statistiques sont

affichées avec les valeurs de CI50 dans le tableau 1. Les résultats ont montré que

la valeur de CI50 de la quinoléine 7 est de 16 ± 3 nM, la CI50 la plus basse de

toutes les quinoléines testées. La faible inhibition de la quinoléine 6 pourrait être

due à l'oxydation du soufre du groupement thiophène lors de l'incubation de 2

jours avec les cellules de cancer du sein T47D. Les valeurs de CI50 des

quinoléines 1, 2 et 4 sont dans la gamme nanomolaire, une plage souhaitable

pour les tests pharmacologiques. Le composé 16 (200) n'a pas inhibé la viabilité

des cellules T47D, même à une concentration de 10 µM.

En conclusion, différentes quinoléines substituées ont été synthétisées à

partir d'une addition de Michael en tandem suivie de réactions de substitutions

aromatiques électrophiles de l'aniline substituée avec de la vinyle-méthyle-cétone,

réduction de la fonction nitro et alkylation de la fraction amine résultante. La

séquence de synthèse est courte et se prête à une synthèse à grande échelle.

Plusieurs de ces composés possèdent une activité anticancéreuse puissante

contre les cellules de cancer du sein T47D avec des concentrations de l'ordre du

nanomolaire. En particulier, la quinoléine 7 a montré une valeur CI50 de 16 ± 3 nM

et est digne de nouvelles études pharmacologiques. L'absence de centre

125

asymétrique dans ces molécules prévient la synthèse chirale et la purification

d'énantiomères pour bioévaluation. Des variants des substituants de ces

composés majeurs ainsi que le mécanisme d'action de leur activité anticancéreuse

sont à l'étude et seront communiqués en temps voulu.

Données supplémentaires

Procédé de synthèse, données d'analyse, lignée cellulaire et culture cellulaire et

protocoles de test de viabilité cellulaire. Les données complémentaires associées

à cet article peuvent être trouvées dans la version en ligne, à

doi:10.1016/j.bmcl.2008.04.024.

127

II/ Bioactivité et cibles moléculaires de nouvelles quinoléines

substituées dans des lignées de cellules tumorales murines et

humaines in vitro

Traduit de l'anglais Perchellet et al. (201)

A/ Résumé

Les quinoléines substituées (PQ), qui réduisent la formation de colonies et

augmentent la communication intercellulaire au travers des jonctions GAP, ont été

testées pour leur capacité à interagir avec différentes cibles moléculaires dans des

lignées cellulaires tumorales murines et humaines in vitro. Différents marqueurs

des voies de signalisation du métabolisme des cellules tumorales : la

fragmentation de l'ADN, la perturbation de la mitose, l'induction de l'apoptose et

les récepteurs de facteurs de croissance ont été testés in vitro pour évaluer la

cytotoxicité du médicament. Sur la base de son aptitude à inhiber l'activité

métabolique des cultures en suspension de cellules leucémiques L1210 aux jours

2 et 4, in vitro, les PQ1 avec sel d'acide succinique sont l'agent anti-prolifératif le

plus efficace parmi les analogues des quinoléines synthétiques testés. En outre,

l'activité antiproliférative des PQ1 est efficace dans toute une gamme de cultures

monocouches : cellules pancreatiques PAN02, cellules epidermoides A-431 et

cellules tumorales mammaires SK-BR-3 et BT-474. Les PQ1 bloquent également

l'expression de la proteine Ki- 67, un marqueur de la prolifération des cellules

tumorales. Un traitement de 1,5 à 3h avec PQ1 est suffisant pour inhiber

l’incorporation de [3H]-thymidine dans l'ADN, de [3H]-uridine dans l'ARN et de

[3H]-leucine dans les protéines utilisées pour évaluer les taux de synthèse de

macromolécules sur une période de 0,5 ou 1h de marquage pulse dans les

cellules tumorales L1210. Un pré-traitement de 15 min avec les PQ1 inhibe le

transport cellulaire à la fois des nucleosides purines et pyrimidines, sur une

période de 30 sec, in vitro, ce qui suggère que les PQ1 peuvent empêcher

l'incorporation de [3H]-adénosine et de [3H]-thymidine dans l'ADN, car elles

bloquent rapidement l'absorption de ces nucléosides par les cellules tumorales.

128

Dans la mesure où les PQ1 ne réduisent pas la fluorescence du complexe de

bromure d'éthidium - ADN, elles ne se lient pas ou ne destabilisent pas

directement l'ADN double brin. Sur une période de 6 à 48h, les PQ1 ont très peu

d'effets sur l'indice mitotique des cellules L1210 mais stimulent la formation de

nombreuses cellules binucléées et quelques micronoyaux, ce qui suggère que ce

composé pourrait augmenter les anomalies mitotiques, entraîner des altérations

chromosomiques ou une mauvaise ségrégation et bloquer la cytocinèse. Le fait

que les PQ1 induisent l'activité des caspases initiatrices (caspases 2) et

effectrices (caspases 3) et le clivage de la polymérase poly (ADP-ribose)-1 en 1 à

4h et la fragmentation de l'ADN internucléosomale dans les 24 h dans des cellules

L1210, suggère que ce médicament antitumoral peut déclencher les événements

précoces et tardifs nécessaires pour que les cellules subissent l'apoptose.

L'immuno-détection et l'analyse Western blot sur cellules entières montrent que,

contrairement à la 17-(allylamino)-17-déméthoxygeldanamycine et au radicicol, les

PQ1 ne parviennent pas à diminuer le niveau d'expression à 24h et

l'autophosphorylation à 3h de la protéine membranaire HER1 dans les cellules A-

431 et de la protéine HER2 dans les cellules SK-BR-3, ce qui suggère que ce

composé anti-tumoral est peu susceptible d'interagir avec et d'inhiber les voies de

signalisation de la protéine Hsp90 et du récepteur du facteur de croissance

épidermique (EGF). En conclusion, l'activité antiproliférative des PQ1 est efficace

contre un spectre de cellules tumorales et pourrait interagir avec diverses cibles

membranaires et nucléaires pour renforcer les jonctions communicantes, inhiber le

transport de nucléosides et bloquer la cytokinèse mais ne semble pas perturber

les voies de signalisation médiées par les récepteurs du EGF pour induire un arrêt

de croissance et l'apoptose.

B/ Introduction

Une nouvelle classe de quinoléines substituées (PQ) a récemment été

rapportée induire une activité anticancéreuse intéressante concernant

l'amélioration de la communication intercellulaire au travers des jonctions GAP

(GJIC) dans les cellules du cancer du sein (180, 202). La GJIC, qui est

129

responsable de la circulation directe des ions et des molécules dont le poids

moléculaire est inférieur à 1200 Da, est obtenue grâce à deux hemicanaux sur la

surface de cellules opposées (203, 204). L'utilisation du logiciel Autodock, a

permis d'observer plusieurs PQs synthétiques capables de se lier au centre inerte

de l'hemicanal des jonctions GAP, qui est formé par l'association de six protéines

de la famille des connexines. Comme la GJIC est régulée à la baisse par les

oncogènes et régulée à la hausse par les gènes tumeur-suppresseurs (TSGs) et

l'inhibition de la GJIC contribue à la carcinogenèse, la restauration de la GJIC

peut représenter une cible pour des médicaments anticancéreux (205-209). Etant

donné que la GJIC des cellules tumorales est réduite ou modifiée (210), les PQ

synthétiques ont été testées pour leur capacité à améliorer la GJIC et inhiber la

croissance des cellules tumorales. Les PQs, qui ont une affinité de liaison

relativement élevée pour la connexine 43 (Cx43) et peuvent diminuer sa

phosphorylation, ont démontré, par un essai de transfert de colorant, augmenter la

GJIC dans les cellules tumorales mammaires T47D mais pas dans les cellules

épithéliales mammaires normales (202). En outre, ces PQ ont réduit de façon

significative la capacité des cellules de cancer du sein humain T47D à se

développer et former des colonies sur gélose molle in vitro et à développer des

tumeurs lors de xénogreffes chez la souris nude in vivo (202). Étant donné que

des composés anti-tumoraux qui augmentent l'activité GJIC sont rares, la présente

étude a été effectuée pour caractériser davantage l'activité biologique et les cibles

moléculaires des PQ synthétiques dans un spectre de lignées cellulaires

tumorales murines et humaines in vitro. Par exemple, il était intéressant de

déterminer si les composés antitumoraux PQ, qui interagissent avec les jonctions

GAP de la surface cellulaire et inhibent la croissance des cellules tumorales,

pourraient agir comme inhibiteurs d'autres protéines ancrées dans la membrane,

telles que des membres de la famille des récepteurs des facteurs de croissance

épidermique humains (EGF) (HER) qui interviennent dans les voies de

signalisation intracellulaires critiques pour la prolifération des cellules tumorales et

l'angiogenèse. Ainsi, dans une tentative d'identifier le composé le plus puissant de

la série, plusieurs structures PQ ont été synthétisées et comparées avec les

médicaments anticancéreux connus pour leur capacité à inhiber la prolifération de

différentes cellules tumorales, y compris celles qui surexpriment les HER1 (ligand-

130

dépendants) et les HER2 (ligand-indépendants) et qui sont sensibles à la protéine

de choc thermique de 90 kDa (Hsp90) et les inhibiteurs des HER : 17-(allylamino)-

17-déméthoxygeldanamycine (17-AAG) et radicicol. Etant donné que la fraction de

cellules tumorales Ki-67 positives est souvent en corrélation avec l'évolution

clinique du cancer, il est également intéressant de déterminer si le traitement aux

PQ inhiberait l'expression de la protéine nucléaire humaine Ki-67, qui est un

excellent marqueur de la prolifération cellulaire tumorale (211).

C/ Matériels et méthodes

i/ Traitement médicamenteux, culture cellulaire et essai de prolifération

Comme indiqué précédemment, les analogues PQ ont été synthétisés par

une modification de la procédure en partant du 4-acétamino-anisole (180, 182,

190). Les solutions de PQ synthétiques et les médicaments anticancéreux connus,

daunorubicine (DAU), mitoxantrone (Mitox), vincristine (VCR), taxol, 17-AAG et

radicicol (tous de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), ont été dissous et dilués en

série dans du diméthylsulfoxyde. Les cultures en suspension de cellules murines

de leucémie lymphocytaires L1210 (ATCC, Manassas, Virginie, Etats-Unis) et les

cultures monocouches de cellules d'adéncarcinome canalaire pancréatique

PAN02 (banque de tumeurs DCTD, NCI, USA), de carcinome canalaire mammaire

humain T-47D, de carcinome épidermoïde surexprimant HER1 A-431,

d'adénocarcinome du sein surexprimant HER2 SK-BR- 3 et les cellules de

carcinome canalaire du sein BT-474 (tous de l'ATCC) ont été incubées à 37°C

dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2 et maintenues en

croissance exponentielle continue par passages deux fois par semaines dans un

milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10 % de sérum foetal bovin de veau (FCS ;

Atlanta Biologicals, Norcross, GA, USA), de la pénicilline (100 UI/mL) et de la

streptomycine (100 pg / mL). Les suspensions cellulaires de leucémie L1210 ont

été cultivées en triple dans 48 puits de plaques de culture cellulaire Costar

pendant 2 et 4 jours en présence ou en absence (contrôle) de différentes

concentrations de médicaments pour évaluer leur activité anti-proliférative. Les

131

cellules tumorales adhérentes PAN02, A-431, SK-BR-3 et BT-474 ont été

recueillies par traitement à la trypsine, remises en suspension dans du FCS frais,

milieu contenant du RPMI-1640, transférées dans 48 puits de plaques de culture

cellulaire Costar et laissées se fixer pendant 24 h avant d'être incubées pendant 2

à 4 jours supplémentaires en présence ou en absence (contrôle) des

médicaments ci-dessus. Etant donné que les composés ont été ajoutés au milieu

de culture par aliquots de 1 uL, la concentration de véhicule dans le volume

d'incubation final (0,5 mL) n'a jamais dépassé 0,2 % et n'a pas interféré avec les

données. Des concentrations cellulaires décroissantes, telles que 55 000 et 4688

cellules L1210 / 0.5 mL, 7500 et 1875 cellules PAN02 / 0,5 mL, 7,500 et 1,875

cellules A-431 / 0.5 mL, 15 000 et 5 000 cellules SK-BR-3 / 0.5 mL ou 15 625 et

7812 cellules BT-474 / 0,5 mL / puits, ont été mises en culture sur plaque en trois

exemplaires au temps 0 afin de prélever des échantillons contrôles avec des

densités cellulaires approximativement égales, après 2 et 4 jours de culture,

respectivement. La prolifération des cellules tumorales traitées par le médicament

a été évaluée par leur capacité mitochondrial à réduire le réactif 3-(4,5-

diméthylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophényl)-2H-tétrazolium

(MTS) (Promega, Madison, WI, USA) en présence de méthosulfate de phénazine

(PMS, Sigma) en un produit formazan soluble dans l'eau qui absorbe à 490 nm

(212). Au bout de 2 ou 4 jours de culture, les cellules L1210, PAN02, A-431, SK-

BR-3 et BT-474 contrôles et traitées par le médicament ont été encore incubées à

37 ° C pendant 1,5 à 3,0 h dans l'obscurité, en présence de 0,1 mL des réactifs

MTS et PMS (ratio 2 : 0,1) et leur activité métabolique relative a été estimée par

l'enregistrement de l' absorbance à 490 nm, en utilisant un lecteur de

microplaques Cambridge modèle 750 automatique (Packard, Downers Grove, IL,

USA). Les valeurs à blanc pour un milieu de culture supplémenté avec les réactifs

MTS : PMS en l'absence de cellules ont été soustraites des résultats. Les

données de toutes les expériences biochimiques ont été analysées en utilisant le

test t de Student avec le niveau de signification fixé à p <0,05.

132

ii/ Immunofluorescence et microscopie confocale

Pour l'expression de la protéine Ki-67, les cellules T-47D ont été cultivées

sur des lamelles dans des plaques à 6 puits dans du milieu RPMI et mises à

incuber à 37°C pendant 24, 48 et 72h en présence ou en absence (contrôle) du

composé PQ. Après fixation avec du paraformaldehyde à 2% pendant 20 min

suivie d'une neutralisation avec 50 mM de glycine pendant 5 min, les cellules ont

été lysées avec 0,1% de Triton X-100 pendant 10 min de plus. Les cellules ont été

lavées avec un tampon phosphate saline (PBS) sans Ca2 + / Mg2 + Dulbecco,

bloquées avec 2,5 % d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du PBS pendant 2h

et ensuite incubées avec un anticorps polyclonal primaire (PAB) de lapin anti- Ki-

67 (H300) (1:250 ; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) pendant 15h

à 4°C. Après incubation pendant une minute avec du 4', 6'-diamidino-2-

phénylindole (DAPI), un colorant de l'ADN bleu fluorescent, les cellules ont ensuite

été incubées avec un anticorps (Ab) secondaire de lapin conjugué avec un

colorant Alexa Fluor 488 (Ab) (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) pendant 4h à

4°C. Les échantillons ont été scellés et analysés par microscopie à fluorescence

pour la morphologie nucléaire (coloration DAPI) et l'expression du Ki-67 (immuno-

marquage), en utilisant un microscope confocal Zeiss LSM 510 META (Carl Zeiss,

Thornwood, NY, USA) équipé de micro-manipulateurs (Narishige international,

East Meadow, NY, USA).

iii/ Synthèse de macromolécules et transport de nucléosides

Pour estimer la vitesse de synthèse de l'ADN, les cellules L1210 ont été

remises en suspension dans un milieu contenant du FCS-RPM-1640 frais à une

densité de 0.5x105 cells/0.5 mL, incubées à 37°C pendant 90 min en présence ou

en absence (témoin) de médicaments et marquées par pulses pour 30 minutes

supplémentaires avec 1 uCi de [méthyl-3H]-thymidine (52 Ci / mmol ; GE

Healthcare - Amersham, Piscataway, NJ, USA) (213). Pour les synthèses d'ARN

et de protéines, les cellules ont été incubées à 37°C pendant 3h en présence ou

en absence de médicaments et ensuite marquées par pulses pendant une heure

supplémentaire avec 2 uCi de [5,6-3H]-uridine (35 Ci / mmol ; Perkin -Elmer,

133

Boston, MA, USA) ou 2,5 uCi de L-[3,4,5-3H]-leucine (115 Ci / mmol ; Perkin -

Elmer), respectivement (213). Les incubations ont été terminées par l'addition de

0,5 mL d'acide trichloroacétique à 10 % (TCA). Après avoir été maintenu sur de la

glace pendant 15 minutes, la matière insoluble en milieu acide a été récupérée sur

filtres en microfibres de verre Whatman GF/A et lavée trois fois avec 2 mL de TCA

à 5% et deux fois avec 2 mL d’EtOH à 100%. Après séchage des filtres, la

radioactivité liée à la matière précipitable à l'acide a été déterminée par comptage

en scintillation liquide (LSC) dans 6 mL de Bio-Safe NA (Research Products

International, Mount Prospect, IL, USA) (213). Pour le transport de nucléosides,

les cellules L1210 (1,2 x 106 cellules / mL) ont été pré-incubées pendant 15 min à

37°C en présence ou en absence (témoin) de médicament et ensuite exposées à

1 uCi de [2,8-3H]-adénosine (25 Ci / mmol ; Moravek biochimiques, Brea, CA,

USA) ou [méthyl-3H]-thymidine pendant seulement 30 secondes pour évaluer

l'absorption cellulaire de purines et de pyrimidines, respectivement, sur cette

période de temps très courte (213, 214). Les réactions ont été diluées avec 2 mL

de PBS glacé et le radio-marqueur non incorporé a été éliminé par centrifugation à

200 g pendant 10 min. Après avoir été lavés trois fois avec 2 mL de PBS glacé,

les culots de cellules intactes ont été récoltés par centrifugation et mis à incuber

pendant 30 min dans 1 mL de tampon de lyse hypotonique (HLB) contenant 10

mM de Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM d'EDTA et 0,2 % de Triton X-100. Les lysats

cellulaires ont été mélangés avec 6 mL de Bio-Safe II (Research Products

International) pour estimer l'absorption cellulaire de [3H]-adénosine ou de [3H]-

thymidine par les LSC. L'inhibition exercée par le médicament a été exprimée en

pourcentage de [3H]-adénosine ou [3H]-thymidine transporté dans les cellules

tumorales traitées avec le contrôle, sur une période similaire de 30 secondes (213,

214).

iv/ Liaison à l'ADN et tests de fragmentation

Un dosage de déplacement de bromure d'éthidium (EB) a été utilisé pour

évaluer la puissance d'éventuelles liaisons à l'ADN des composés PQ, sur la base

des concentrations CI50 de médicament qui provoque une réduction de 50% de la

fluorescence du complexe ADN-EB à une excitation de 525 nm / émission de 600

134

nm (215). La fluorescence de l'EB, qui est extrêmement faible lorsque non lié

dans l'eau, est stimulée 25 fois après fixation et intercalation dans le milieu

hydrophobe que constitue l'ADN double brin intact. Comme un complexe

hautement fluorescent est formé en quelques millisecondes entre l'ADN et EB,

tout médicament se liant directement à et/ou endommageant l'ADN perturberait

l'intercalation de l'EB et de compromettrait la fluorescence de ce complexe ADN -

EB. Les mélanges réactionnels (200 uL) contenant des concentrations finales de

20 µg/mL de d'ADN de thymus de veau (CT) (Sigma) et 1 µg/mL d'EB (Sigma)

dans un tampon de Tris-HCl à 5 mM, pH 7,6, avec 0,5 mM d'EDTA, ont été

pipetés dans 96 puits de plaques en polystyrène blanches opaques Costar et,

après incubation en présence ou en absence (témoin) de médicaments pendant

30 min à température ambiante, la fluorescence du complexe EB - ADN a été

détectée à une excitation de 525 nm et une émission de 600 nm, en utilisant un

spectrophotomètre à fluorescence Cary Eclipse équipé avec un lecteur de

microplaques (Varian, Walnut Creek, CA, USA).

Le clivage de l'ADN induit par le médicament a été déterminé par la

précipitation de chromatine intacte, en utilisant des cellules L1210 pré-marquées

avec 1 uCi de [3H]-thymidine pendant 2h à 37°C, lavées avec 3 x 1 mL de PBS

glacé, recueillies par centrifugation, remises en suspension dans du milieu frais à

une densité de 1.2x106 cellules/mL, puis incubées à 37°C pendant 24h en

présence ou en absence de drogues (214, 216). Après centrifugation à 200g

pendant 10 min pour éliminer les médicaments et laver les cellules, les culots de

cellules ont été lysés pendant 20 min dans 0,5 mL de HLB glacé, et centrifugés à

12 000 g pendant 15 min pour recueillir les surnageants. La radioactivité dans les

surnageants (fragments d'ADN de faibles poids moléculaires soluble dans le

détergent) et les culots (chromatine intacte) a été déterminée par LSC. Avant

d'être comptée dans 6 mL de Bio-Safe NA, la chromatine intacte dans les culots a

été incubée pendant 2h à 60°C en présence de 0,6 mL de solubilisant tissulaire

NCS (Amersham) (214, 216). Pour la fragmentation de l'ADN internucléosomale,

les cellules L1210 ont été incubées à 37°C pendant 24h en présence ou en

absence de médicaments et l'ADN a été extrait à partir d'échantillons avec des

densités cellulaires égales (2x106 cellules/mL), en utilisant un procédé de

relargage (214, 216). Les culots cellulaires ont été lavés deux fois avec du PBS,

135

lysés pendant une nuit à 37°C dans 0,34 mL de 10 mM Tris-HCl, pH 8,0,

contenant 2 mM d'EDTA, 400 mM de NaCl, 1 % de SDS et de la protéinase K (0,5

mg/mL), vortéxés pendant 15 secondes avec 0,1 mL de NaCl 6 M et centrifugés

(2500g x 30 min) ; et l'ADN a été précipité à partir des surnageants (0,44 mL) avec

0,88 mL de EtOH à 100% pendant 15 min à 4°C. Après centrifugation (14000g x

15 min) à 4°C, les culots d'ADN séchés à l'air libre ont été dissous dans 0,34 mL

de 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, avec EDTA 1 mM (tampon TE) et incubés pendant 2h

à 37°C en présence de RNase (0,1 mg/mL). Après un autre cycle de précipitation

par EtOH et centrifugation, les culots séchés à l'air libre finaux ont été dissous

dans 50 uL de tampon TE et leur concentration en ADN déterminée par

spectrophotométrie à 260 nm. Des quantités égales d'échantillons d'ADN (6 μg /

7.5 µL de tampon TE) ont été mélangées avec 1,5 uL de 10 mM Tris-HCl, pH 7,5,

contenant 50 mM d'EDTA, 10% de Ficoll 400 et 0,4 % d'Orange G et pipetées

dans chaque puits. Environ 0,5 ug de marqueur moléculaire ADN 100 pb et 0,75

ug d'ADN / EcoRI + HindIII (tous deux de Promega) a été appliqué de la même

façon à chaque gel pour fournir des marqueurs dans la gamme 100-1500 et 125-

21226 pb, respectivement. L'électrophorèse horizontale des échantillons d'ADN a

été effectuée pendant 3,7 heures à 60 V sur gels d'agarose à 1,5% contenant EB

(1 µg/mL) avec 90 mM de Tris-HCl, pH 8,0, contenant 90 mM d'acide borique et 2

mM d'EDTA comme tampon de migration. Les fragments d'ADN ont été visualisés

et photographiés avec un film Polaroid 667 sous lumière UV à 312 nm, en utilisant

un transilluminateur UV à intensité variable modèle 88A de FisherBiotech (214,

216).

v/ Index mitotique et anomalies

Pour déterminer l'index mitotique, les cellules L1210 (0,5 x 106 / 0,5 mL de

milieu RPM-1640 contenant du FCS) ont été incubées en triple pour diverses

périodes de temps à 37°C en présence ou en absence (contrôle) de

concentrations croissantes du médicament expérimental ou d'agents perturbateurs

des microtubules connus, collectées par centrifugation (200g x 10 min) et remises

en suspension dans 1 mL de KCl hypotonique 75 mM pendant 20 min à 4°C.

Après fixation dans 1 mL de MeOH : acide acétique (ratio 3:1), les culots

136

cellulaires finaux ont été recueillis par centrifugation, remis en suspension dans 75

ul de MeOH : acide acétique (3:1), distribués sur des lames de verre, séchés à l'air

à l'air libre, colorés par étalement de 40 uL de cristal violet à 0,1% et couverts par

une lamelle (213). Les figures de mitose avec chromosomes condensés ont été

identifiées au microscope et les critères publiés ont été suivis pour marquer les

cellules binucléées et micronoyaux (217). Les cellules binucléées bloquées en

cytokinèse contenaient soit deux noyaux distincts de taille égale soit deux noyaux

qui touchaient ou chevauchaient des limites nucléaires distinctes ou deux noyaux

reliés par un petit pont nucléoplasmique (217). Des structures circulaires

contenant de la chromatine dans le cytoplasme, au moins 1/3 plus petites que le

noyau principal, entourées par une membrane, soit séparées de, soit chevauchant

légèrement le noyau principal et ayant la même coloration que le noyau principal

ont été considérées comme des micronoyaux contenant soit un chromosome

entier soit un fragment chromosomique acentrique (217). Les fréquences de

cellules binucléées et de micronoyaux ont été utilisés pour estimer la capacité

cytotoxique ou génotoxiques des médicaments (mutagène ou clastogène) pour

bloquer la cytokinèse et induire des lésions chromosomiques ou une mauvaise

ségrégation (217). Le pourcentage de cellules en mitose ou de cellules binucléées

a été déterminé au microscope en comptant un total d'au moins 2000 cellules /

lame et l'indice mitotique ou l'indice de cellules binucléées ont été calculées en

pourcentage de figures de mitose ou de cellules binucléées dans les cultures

traitées / pourcentage de figures mitotiques ou de cellules binucléées dans les

contrôles (213, 217).

vi/ Test Fluorogenic de l'activité des caspases

Les cellules L1210 témoins et traitées avec le médicament (106 cellules /

mL) ont été incubées pendant 1 à 24 h à 37°C, recueillies par centrifugation (10

min à 200 g) et lavées avec 1 mL de PBS glacé. Les culots cellulaires ont été

remis en suspension dans du tampon glacé 10 mM d'HEPES, pH 7,4, contenant

100 mM de NaCl, 100 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM d'EGTA,

10 % de saccharose, 1 mM de fluorure de phénylméthyl-sulfonyle (PMSF), 1 mM

de dithiothréitol (DTT) et 100 uM de digitonine (175 u pour le dosage de la

137

caspase-3 et 120 uL pour le dosage de la caspase-2) et ont été lysés pendant 10

min sur de la glace. Les lysats cellulaires ont été centrifugés (14000 g x 20 min) à

4°C pour précipiter les débris cellulaires et les surnageants ont été stockés à -

70°C pendant une nuit (214, 216). L'activité des caspases 2 et 3 dans les lysats a

été déterminée dans des mélanges réactionnels contenant 50 uL de tampon de

lyse (Blanc) ou de surnageant (controle ou échantillons traités avec le médicament)

et 50 µl de tampon de réaction (100 mM d'HEPES, pH 7,5, contenant 1 mM

d'EDTA, 10 mM d'EGTA, 10 % de saccharose et 10 mM de DTT) initiés par

l'addition d'aliquots de 5 ul de substrats conjugués à de l'AFC : 5 mM benzyloxy-

carbonyle (z)-Val-Asp-Val-Ala-Asp (VDVAD)-7-amino-4-trifluorométhylcoumarine

(AFC) ou 1 mM de z-Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-AFC (tous de Calbiochem, La Jolla,

CA, États-Unis) (214, 216). Après incubation pendant 1h à 37°C dans des plaques

en polystyrène blanc opaque à 96 puits Costar, la fluorescence de l'AFC libre

libérée lors du clivage protéolytique du substrat par la caspase appropriée a été

détectée à une excitation de 400 nm et une émission de 505 nm, en utilisant un

spectrophotomètre à fluorescence Cary Eclipse avec lecteur de microplaques. Les

unités arbitraires de fluorescence ont été quantifiés en référence aux courbes

d'étalonnage allant de 0,01 à 6 nmol d'AFC (Sigma) ; les concentrations en

protéines des surnageants ont été déterminées en utilisant le kit BCA Protein

Assay (Pierce, Rockford, IL, USA) et l'activité de clivage VDVAD et DEVD

spécifique des échantillons a été exprimée en nmol d'AFC libéré / mg de protéine

(214, 216).

vii/ Analyse par Western blot du clivage de la poly (ADP-ribose) polymérase-1

(PARP-1)

Les suspensions de cellules L1210 contrôles et traitées avec le

médicament (1,2 x 106 cellules / mL) ont été incubées pendant 1-20h à 37°C dans

des boîtes de Pétri Falcon 15x60 mm contenant des volumes finaux de 5 mL.

Pour le clivage de la PARP-1, les cellules tumorales (12x106) ont été recueillies

par centrifugation, lavées avec 1 mL de PBS, lysées avec 45 ul de tampon 50 mM

Tris-HCl, pH 6,8 contenant du NaCl 250 mM, du CaCl2 1 mM, du NaF 50 mM,

0,1 % de Triton X-100, de l'urée 6M et des inhibiteurs de protéase (10 µg

138

leupeptine / mL, 8 ug aprotinine / mL, 1 mM PMSF et le cocktail d'inibiteurs de

protéase sans EDTA de Roche Diagnostics Corp (Indianapolis, IN, USA) et

perturbées par sonication avec une micro-pointe conique 12 coups à puissance 4,

en utilisant un processeur à ultrasons portable Vibra 250W (Sonics & Materials,

Danbury, CT, USA) (214, 216, 218). Les lysats cellulaires ont été centrifugés

(14000g x 15 min) et les concentrations en protéines des surnageants

cytosoliques ont été déterminées avec le kit de dosage de protéine BCA. Pour le

clivage de la PARP-1, des aliquotes de surnageants contenant des quantités

égales de protéines (70 µg) ont été incubés avec un tampon contenant du SDS

(concentration finale de 10% de glycerol, 2 % de SDS, 5% de ß -mercaptoéthanol,

0,02 % de bleu de bromophénol) pendant 15 min à 65°C, résolus par

électrophorèse pendant 1 h à 175 V dans un gel de polyacrylamide-SDS 8% et

transférés sur membrane PVDF pendant 90 min (Immobilon- PSQ ; Millipore,

Bedford, MA, USA) en utilisant un modèle HEP 1 Panther Semidry Electroblotter

(Owl Separation Systems, Portsmouth, NH, Etats-Unis) (214, 216, 218). Les

transferts ont été bloqués avec 5% de lait sec non gras dans un tampon 20 mM

Tris-HCl, pH 7,4, avec 0,9 % de NaCl (TBS), contenant 0,05% de Tween-20

(TBST) pendant 90 min à température ambiante. L'immunodétections de PARP-1

ou ß-actine a été effectuée à 4°C pendant une nuit dans du TBST contenant 2%

de lait sec non gras, en utilisant, respectivement : à 0,5 ug / mL d' anticorps de

souris anti-PARP-1 (Ab-2) anticorps monoclonal primaire (mAb) (C-2-10 ;

Calbiochem), qui reconnaît à la fois la protéine PARP-1 native entière de 115 à

116 kDa et son fragment de clivage de 85 à 90 kDa (214, 216, 218), ou anti-ß-

actine (AC-15) mAb primaire (dilution 1:15000 ; Sigma), qui reconnaît un épitope

situé à l'extrémité N-terminale de l'isoforme ß de l'actine dans une grande variété

de tissus et d'espèces. Après que les membranes ont été rincées trois fois avec

du TBST, elles ont été incubées pendant 1h à température ambiante dans du

TBST contenant 2% de lait sec non gras et un mAb secondaire anti-souris de

chèvre conjugué avec la peroxydase de raifort (dilution 1:30000 ; Oncogene,

Boston, MA, États-Unis) et rincés à nouveau trois fois avec du TBST. Un film

Kodak BioMax a été utilisé pour développer les images des bandes

immunoréactives révélées par coloration par chimioluminescence amplifiée (CL)

en utilisant le substrat SuperSignal West Pico CL (Pierce). Les valeurs de densité

139

intégrée des transferts Western blot ont été comparées par analyse d'image

numérique (Chemi Imager 5500 avec le logiciel AlphaEase FCTM) en utilisant un

Multi Image Light Cabinet (Alpha Innotec, San Leandro, CA, Etats-Unis) (214, 216,

218). La détection de la bande de 42 kDa de la ß-actine a été effectuée en tant

que contrôle interne afin de confirmer une charge égale en protéines.

viii/ Immunodétection du niveau protéique et de l'auto-phosphorylation de HER1 et

HER2

Pour l'immunodétection de cellules entières, les cellules A-431 et SK-BR-3

(2 x 104 cells / 0.2 mL) ont été ensemencées dans des plaques en polystyrène

blanc à 96 puits Nunc F96 MicroWell (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,

USA), laissées se fixer pendant 24h à 37°C, puis incubées pendant une période

supplémentaire de 24h en présence ou en absence (témoin) de médicaments.

Après élimination du milieu de culture par aspiration, les cellules adhérentes dans

chaque puits ont été lavées deux fois avec 70 µL de TBST et incubées à 4°C

pendant 10 minutes dans 50 µL de MeOH glacé. Le MeOH a été éliminé par

lavage avec du TBST (2 x 100 µL) et les plaques ont été incubées avec 100 uL de

SuperBlock (Pierce) pendant 1h à température ambiante. Après aspiration du

SuperBlock, les plaques ont été incubées pendant une nuit à 4°C avec un

anticorps primaire, soit polyclonal (pAb) anti-HER1 de lapin [EGFR (1005) : sc-03]

dirigé contre un épitope à l'extrémité C-terminale de l'EGFR d'origine humaine soit

monoclonal (mAb) anti-HER2 [Neu (9G6) : sc-08] dirigé contre un épitope situé sur

un domaine extracellulaire de Neu gp185 d'origine humaine (tous deux de Santa

Cruz Biotechnology), à une dilution de 1:200 dans du SuperBlock (100 µL/puits).

Chaque puits a été lavé avec du TBST (2 x 100 µL) et incubé pendant 1 h à

température ambiante à la fois avec la peroxydase de raifort liée à l'mAb

secondaire (dilution 1:1000 ; Oncogene) et le réactif Hoechst 33342 (dilution

1:5000 ; Invitrogen, Molecular Probes) dans 50 uL de SuperBlock (219). Après

lavage avec du TBST (2 x 100 µL) pour éliminer l'anticorps non lié et addition du

substrat SuperSignal West Pico CL (20 µL / puits), les plaques ont été lues dans

les 5 min par balayage de chaque puits pendant 0,1 seconde avec le mode CL

(425 nm) d'un lecteur de microplaques à fluorescence Cary Eclipse (219). La

140

lecture des puits où l'pAb primaire ou l'mAb a été omis a été utilisée pour

soustraire le fond. Enfin, les plaques ont été lues avec le modefluorescence (340

nm excitation / 460 nm émission) d'un lecteur de microplaques à fluorescence

Cary Exclipse (219). Les intensités relatives de fluorescence des complexes

réactif Hoechst - ADN ont été utilisées pour normaliser les valeurs relatives de

l'unité CL des complexes immuns pAb - ou mAb primaires - antigène liés à

l'anticorps secondaire lié à la peroxydase de raifort dans le but de comparer les

taux de protéines HER1 ou HER2 sur une base d'un nombre égal de cellules (219).

Et le rapport de luminescence relative : fluorescence des cellules traitées par le

médicament a été exprimé en pourcentage de celui des cellules témoins.

Pour l'analyse par Western blot de la phosphorylation de HER1 et HER2,

les cellules A-431 et SK-BR-3 (1 x 106 cellules / 5 mL) ont été respectivement

ensemencées dans des boîtes de Pétri Falcon 15x60 mm, laissées s'attacher 24h

à 37°C, puis incubées pendant une période supplémentaire de 3h en présence ou

en absence (contrôle) de médicament. Pour les cellules A-431, de l'EGF (100 ng /

mL, R & D Systems, Minneapolis, MN, USA) a été ajouté au cours des dernières

15 min d'incubation. Après élimination du milieu de culture et lavage avec du PBS

(2 x 2 mL), 2 x 106 cellules adhérentes ont été recueillies par raclage et rinçage

dans un volume total de 4 mL de PBS, centrifugées (800 g x 10 min) à 4°C,

remises en suspension dans 1 mL de PBS glacé pour transfert dans un tube

Eppendorf de 1,5 mL et recentrifugées (2000 g x 6 min) à 4°C. Des échantillons

de cellules ont été lysés pendant 30 min à 4°C avec 65 uL de tampon Tris-HCl 50

mM, pH 7,4, contenant du NaCl 150 mM, de l'EDTA 2 mM, du DTT 1 mM, du NaF

10 mM, 1 % de NP-40, 0,1% de SDS, du sodium d'orthovanadate 1mM, du

pyrophosphate de sodium 5 mM et le cocktail d'inhibiteurs de protéase indiqué ci-

dessus, et ensuite rompues par sonication. Les lysats cellulaires ont été

centrifugés (14000 g x 15 min) et les concentrations protéiques des surnageants

cytosoliques ont été déterminées avec le kit de dosage de protéines BCA. Des

aliquotes de surnageants contenant des quantités égales de protéines (70 ug) ont

été incubés avec un tampon contenant du SDS pendant 5 min à 90°C et résolus

par électrophorèse pendant 1,3 heures à 200 V dans un gel de SDS-

polyacrylamide à 8 % avant transfert humide sur membrane de nitrocellulose

Protran (Schleicher & Schuell BioScience, Keene, NH, USA) pendant une nuit à

141

4°C en utilisant le systèmre Mini Trans-Blot Cell (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Les sites de liaison non spécifiques ont été bloqués avec 5 % de BSA dans du

TBST. Tout d'abord, l'immunodétections de HER1 et HER2 phosphorylés (pHER1

et pHER2) a été réalisée à 4°C pendant la nuit dans du TBST contenant 2 % de

BSA, en utilisant 0,5 ug / mL d'anticorps primaire de chèvre anti-pHER1 [p-EGFR

(Tyr 1173) : sc-12351] dirigé contre une courte séquence d'acides aminés

contenant la Tyr 1173 de l'EGFR d'origine humaine phosphorylée ou d'anticorps

primaire de lapin anti-pHER2 [p-Neu (Tyr 1248-R) : sc-12352-R] dirigé contre un

courte séquence d'acides aminés contenant la Tyr 1248 de Neu (homologue de

HER2 isolé à partir de cellules de neuroglioblastome induites chez le rat) d'origine

humaine phosphorylée (tous deux de Santa Cruz Biotechnology). Les blots ont

ensuite été incubés avec un anticorps monoclonal secondaire lié à la peroxydase

de raifort et les bandes de protéines immunoréactives révélées par le réactif de

détection par CL amplifiée tel que décrit ci-dessus. Dans les mêmes expériences,

les transferts ont également été incubés une nuit avec l'anticorps primaire

polyclonal de lapin anti-HER1 et l'anticorps primaire monoclonal de souris anti-

HER2 suivis de l'anticorps secondaire monoclonal lié à la peroxydase de raifort et

la détection par le réactif de CL amplifiée a été répétée pour confirmer une charge

égale de récepteurs ainsi que pour évaluer et comparer les niveaux

d'autophosphorylation du récepteur après correction avec les niveaux des

protéines HER1 et HER2 chargés.

D/ Résultats

i/ Inhibition de la prolifération des cellules tumorales

Les structures chimiques et les noms de code des 11 quinoléines

substituées synthétisées et testées pour leur capacité à inhiber la prolifération des

cellules tumorales in vitro sont illustrés en figure 26. Les procédés généraux de

synthèse organique de ces composés ont été rapportés (180). Tous les composés

testés à 4 ou 25 µM, à l'exception des PQ2 et PQ5 (données non présentées), ont

inhibé la capacité mitochondriale des cellules leucémiques L1210 à métaboliser le

142

réactif MTS : PMS (Fig. 27). Sur une base de concentration égale, PQ1 (4 µM

inhibent de 75-99 % la prolifération à 2-4 jours), est un agent anti-prolifératif plus

efficace que PQ3 (25 µM inhibent de 84-99 % la prolifération à 2-4 jours) et est

clairement le composé antitumoral le plus puissant de la série dans le système

utilisé : tumeur L1210 (Fig. 27), et a été choisi pour des études ultérieures. En

effet, l'agent antiprolifératif PQ1 conserve son efficacité dans la gamme de

concencentration du µM à travers un spectre de lignées de cellules tumorales

pancréatiques, épidermoïdes et mammaires (Fig. 28). L'inhibition de l'activité

métabolique des cellules tumorales L1210 et SK-BR-3 par PQ1 est significative à

1,6 µM (données non présentées), maximale ou presque maximale à 4 µM et plus

prononcée au bout de 4 jours que 2 jours de culture, ce qui suggère que l'activité

anti-tumorale de ce médicament est une combinaison de concentration et de

durée d'action (Fig. 27 et 28). Cependant, lorsqu'ils sont testés en tant que

témoins positifs dans les mêmes expériences, des médicaments anticancéreux

établis comme DAU, Mitox et radicicol inhibent la croissance de diverses lignées

de cellules tumorales à des concentrations de l’ordre du nM (Fig. 27 et 28). Fait

intéressant, l'activité anti-proliférative de la 17-AAG est comparable à celle des

PQ1 dans une gamme de concentration de l’ordre du µM dans les cellules L1210

(Fig. 27) mais est amelioree de façon spectaculaire dans la plage de

concentrations de l’ordre du nM dans les cellules SK-BR- 3 (Fig. 28) et A-431 ou

BT-474 (données non présentées) qui pourraient avoir besoin de la surexpression

et de la stimulation de HER1 ou de HER2 pour leur croissance. Mais ce n'est pas

le cas pour les PQ1, pour lesquelles un tel changement d'efficacité antiproliférative

n'est pas détecté entre la lignée L1210 et les lignées de cellules tumorales

surexprimant HER1 ou HER2, ce qui suggère que, contrairement à la 17-AAG,

l'activité antitumorale des PQ1 n'est pas affectée par la dépendance du récepteur

de croissance des cellules néoplasiques (Fig. 27 et 28).

143

Fig. 26 : Structures des differentes quinoleines substituees

ii/ Inhibition de l’expression de la protéine Ki-67

Fig. 27 : Inhibition de la croissance des cellules L1210 par differentes PQ à 2 et 4 jours (barres blanches et rayees, respectivement). C = contrôle (vehicule). PQ1 = 4 µM, autres PQ = 25 µM, Mitox = 6.6 nM, radicicol et DAU = 41 nM et 17-AAG = 4 μM. a = non different du contrôle, b = p< 0,05, c = p < 0,01, d = p < 0,005 (par rapport au contrôle). n = 3

Fig. 28 : Inhibition de la croissance des cellules tumorales Pan02, A-431, BT-474 et SK-BR-3 par PQ1 à 2 et 4 jours (barres blanches et rayees, respectivement). C = contrôle (vehicule). PQ1 = 4 µM, Mitox = 6.6 nM, radicicol et DAU = 41 nM et 17-AAG = 4 μM. a = p < 0,01005 (par rapport au contrôle). n = 3

144

Étant donné que la prolifération, la viabilité et la capacité des cellules T-47D

à former des colonies ont été indiquées précédemment être inhibées par des

concentrations de PQ1 de l'ordre du nM (180, 202), la capacité de ce composé à

inhiber le marqueur de prolifération cellulaire Ki-67 a été déterminée dans cette

lignée cellulaire de tumeur mammaire (Fig. 29). La protéine nucléaire Ki-67, qui

est absente des cellules au repos (G0), est présente au cours de toutes les

phases actives du cycle cellulaire (G1, S, G2) et de la mitose. Étant donné que

l'expression de la proteine Ki-67 est strictement associée à la prolifération

cellulaire, il s'agit d'un excellent marqueur pour déterminer la fraction en

croissance de populations de cellules tumorales (211). Par rapport au niveau de la

protéine Ki-67 détecté par immuno-marquage et microscopie à fluorescence dans

les cellules tumorales T-47D non traitées, l'inhibition remarquable de l'expression

de la protéine Ki-67 provoquée par 200 nM de PQ1 à 24-48h et, dans une moindre

mesure, à 72h, donne à penser que ce nouveau composé anti-prolifératif

maintient les cellules tumorales en vie dans la phase de repos et les empêche de

se réinsérer dans le cycle cellulaire (Fig. 28). Après traitement aux PQ1, par

conséquent, il existe moins de cellules tumorales et elles ne parviennent pas à

exprimer la protéine Ki-67 mais l'efficacité des PQ1 à 200 nm peut être plus courte

que 72h (Fig. 28).

Fig. 29 : Inhibition de l’expression de la proteine Ki-67 par PQ1

145

iii/ Inhibition de la synthèse de macromolécules et transport de nucléosides

Un traitement de 90 minutes aux PQ1 est suffisant pour inhiber

l'incorporation de [3H]-thymidine dans l'ADN, utilisé pour évaluer le taux de

synthèse d'ADN sur une période de 30 min de marquage pulsé dans les cellules

tumorales L1210 in vitro (Fig. 30). Bien qu'il puisse être quelque peu trompeur de

comparer les réponses biologiques mesurées à des moments très différents,

l'inhibition de la synthèse d'ADN concentration-dépendante par les PQ1, qui est

maximale à 25 µM, donne à penser que la capacité de ce composé à empêcher

les cellules L1210 a synthétiser de l'ADN à 2h (Fig. 30) peut jouer un rôle dans

son activité anti-proliférative aux jours 2 et 4 (Fig. 27). Dans des conditions

expérimentales similaires, Mitox et 17-AAG sont des inhibiteurs de synthèse de

l'ADN plus efficaces que PQ1 mais pas radicicol (Fig. 30). Fait intéressant, un

traitement de 15 minutes avec 25 à 62,5 µM de PQ1 est suffisant pour bloquer

presque totalement l'absorption cellulaire de [3H]-adénosine (inhibition de 94 à

96%) et de [3H]-thymidine (inhibition de 75 à 99 %) se produisant au cours de

seulement 30s dans des cellules L1210 in vitro (Fig. 31). Dans les mêmes

expériences, les concentrations antitumorales de radicicol et Mitox sont inefficaces

mais 17-AAG partage la capacité des PQ1 à bloquer l'absorption cellulaire à la fois

des nucléosides purines (par inhibition de 79 à 82%) et pyrimidines (inhibition de

69 à 91 %) (Fig. 31). Ces résultats suggèrent que l'activité antiproliférative des

PQ1 et 17-AAG peut diminuer l'incorporation des nucléosides radiomarqués dans

l'ADN à 2h (Fig. 30) car ils empêchent rapidement le système de transport des

nucléosides d'incorporer ces nucleosides radiomarqués dans les cellules L1210

dans les 15 min (Fig. 31). Outre la synthèse d'ADN, un traitement de 3h avec les

PQ1 inhibe également, d'une manière dépendante de la concentration, le taux de

synthèse d'ARN et de protéines, déterminé sur une période de 1h de marquage

pulsé dans les cellules tumorales L1210 in vitro (Fig. 32). En général, les courbes

concentration-réponse pour l’inhibition de la synthèse d'ARN et des protéines par

les PQ1 sont similaires à celle de son inhibition de la synthèse d'ADN : des

concentrations de PQ1 superieures a 10 µM doivent être utilisées pour démontrer

que l'efficacité et l'inhibition maximale sont obtenues à 25 µM. Dans des

conditions similaires, Mitox et 17-AAG inhibent la synthèse d'ARN à un degré plus

146

élevé que les PQ1, alors que le radicicol est légèrement moins efficace (Fig. 32A).

Pour l'inhibition de la synthèse des protéines, Mitox et radicicol sont plus efficaces

que les PQ1 mais 17-AAG est beaucoup moins puissant et ne parvient pas à

inhiber cette réaction de plus de 50%, même à la plus forte concentration testée

(Fig. 32B).

Fig. 30 : Inhibition de l’incorporation de [3H]-thymidine

par differentes concentrations de PQ1 (●), radicicol (■),

17-AAG (▲ ) and Mitox (▼ ) dans des cellules L1210.

Incorporation mesuree pendant 30 min apres 90 min

d’incubation à 37˚C. a = non different du controle, b = p

<0,05. n = 3

Fig. 31 : Inhibition du transport cellulaire des bases puriques (A) et pyrimidiques (B) dans des cellules L1210. 15 min de traitement avec : PQ1, radicicol et 17-AAG = 25 (barres blanches) ou 62.5 μM (rayures diagonales), Mitox = 1.6 (rayures horizontales) ou 4 μM (barres noires) (closed columns). Resultats exprimes en pourcentage du contrôle (note C). a = p < 0.0005 (par rapport au contrôle), b = pas de difference par rapport au contrôle). n = 3

Fig. 32 : Inhibition de l’incorporation de [3H]-uridine dans l’ARN (A) et de [3H]-leucine dans les proteines (B) par differentes concentrations de PQ1 (●), radicicol (■), 17-AAG (▲) and Mitox (▼) dans des cellules L1210. Incorporation mesuree pendant 60 min apres une periode d’incubation de 3h a 37˚C. a = non different du controle, b = p <0,05, c = p < 0.025, d = p < 0.005 (par rapport au contrôle). n = 3

147

iv/ Liaison et fragmentation de l'ADN

Des concentrations élevées d'antiprolifératif PQ1 et de médicaments

anticancéreux de référence ont été évaluées pour leur affinité de liaison à l'ADN

dans un système acellulaire en utilisant l'essai de déplacement classique EB pour

identifier les médicaments intercalant ou non intercalant qui déstabilisent la

double hélice d'ADN. Qu'ils soient administrés en pré- ou post-traitements, les

PQ1 et le radicicol à des concentrations de 20 à 125 µM n'induisent pas une perte

de fluorescence de l’éthidium bromide (EB), ce qui suggère que ces composés

antiprolifératifs n'interagissent pas directement avec l'ADN double brin pour

perturber son intégrité structurelle et fonctionnelle et empêcher le colorant de

s'intercaler entre les paires de bases de l'ADN (Fig. 33). En revanche, les témoins

positifs traités au Mitox à des concentrations de 1,28 à 8 µM, qui déstabilisent

l'ADN double brin pour empêcher ou perturber l'intercalation d'EB, présentent une

suppression presque totale (inhibition de 53 à 95%) de la fluorescence du

complexe EB-ADN (Fig. 33). Dans ces conditions expérimentales, l'inhibition

dépendante de la concentration de la liaison de l'EB à l'ADN par Mitox a une CI50

de 1,2 µM (données non présentées). Sur une base de concentration équimolaire,

l'activité de liaison à l'ADN de 20 à 125 µM de 17-AAG, qui inhibe la fluorescence

du complexe EB-ADN de 34 à 68%, est beaucoup plus faible que celle du Mitox

mais suggère que la capacité de ce médicament anticancéreux à interagir

directement avec l'ADN peut également jouer un rôle dans son mécanisme

d'action (Fig. 33).

Fig. 33 : Inhibition de la liaison du bromure d’ethidium a l’ADN par 1,8 (rayures verticales), 3,2 (rayures diagonales) ou 8 μM (barres noires) de Mitox, 20 (barres blanches), 50 (rayures diagonales) ou 125 μM (rayures horizontales) de PQ1, 17-AAG ou radicicol. Résultats exprimés en pourcentage du contrôle (note C). a = non différent du contrôle, b = p <0,05, c = p < 0.005 (par rapport au contrôle). n = 3

148

La capacité des PQ1 à induire une fragmentation de l'ADN

internucléosomique à 24h a été évaluée et comparée à celle du 17-AAG, du

radicicol et du Mitox par deux techniques différentes : en utilisant des cellules

L1210 dont l'ADN a été préalablement marqué avec de la [3H]-thymidine pour

détecter des fragments d'ADN de faible poids moléculaire après précipitation de la

chromatine intacte (Fig. 34) ou électrophorèse sur gel d'agarose pour visualiser le

fractionnement typique de l'ADN (multiples d'environ 200 paires de bases) indicatif

de l'apoptose (Fig. 35). Par rapport aux témoins non traités (3,2% de

fragmentation de l'ADN), 25 µM de PQ1, 25 µM de 17-AAG et 4 µM de radicicol

induisent respectivement une augmentation d'un facteur 3,2, 2,1 et 2,8 du niveau

de clivage de l'ADN dans des cellules L1210 à 24h (Fig. 34). Le fait qu'une

stimulation 6,4 fois supérieure de la fragmentation de l'ADN est obtenue par une

concentration de 256 nM de Mitox, 15,6 fois inférieure à celle de radicicol et 97,7

fois inférieure à celle de PQ1 suggère que ce médicament anticancéreux est plus

cytotoxique que les composés ci-dessus (Fig. 34). La capacité des PQ1 à induire

une fragmentation internucléosomale a été confirmée par électrophorèse sur gel

d’agarose d'échantillons d'ADN extraits de cellules L1210 traitées avec des

concentrations croissantes de ce composé anti-prolifératif au bout de 24h (Fig. 35).

Par rapport au témoin non traité, les bandes de clivage de l'ADN avec un motif

caractéristique de fragmentation internucléosomal deviennent de plus en plus

visible en réponse à des concentrations de 1,6 à 25 µM de PQ1 (Fig. 35). Encore

une fois, sur une base de concentration

équimolaire, 256 nM de Mitox est un inducteur

plus puissant de la fragmentation de l'ADN

internucleo-autosomique que 4 µM de radicicol et

25 µM de PQ1 ou 17-AAG, sur la base de la plus

grande intensité des bandes d'ADN fragmenté

extrait d'échantillons de cellules L1210 traitées au

Mitox à 24 h (Fig. 35).

Fig. 34 : Induction de la fragmentation de l’ADN par 4 (barres blanches), 10 (rayures diagonales) ou 25 μM (barres noires) de PQ1, 17-AAG et radicicol à 24 h dans des cellules

149

L1210 dont l’ADN a préalablement été marque ([3H]). Contrôle positif = fragmentation de l’ADN par 256 nM de Mitox (rayures horizontales). Résultats exprimes par [cpm dans le surnageant / cpm dans le surnageant + le culot] x 100 à 24h. a = non différent du contrôle, b = p <0,025, c = p < 0.001, d = p < 0.005 (par rapport au contrôle). n = 3

Fig. 35 : Gel de fragmentation de l’ADN par : Gauche : incubation 24h à 37°C avec PQ1 1,6, 4, 10 ou 25 µM ou Mitox 256 nM Droite : incubation 24h à 37°C avec PQ1 25 µM, 17-AAG 25µM, radicicol 4 µM ou Mitox 256 nM. 6 μg d’ADN / puits

v/ Index mitotique et anomalies

Les populations contrôles de cellules L1210 en culture pendant 24h en

l'absence de médicament ne contiennent que 0,46 % de cellules en mitose (table

2). En relation avec leur capacité à perturber la dynamique des microtubules, un

traitement de 24h à la VCR (vincristine), qui bloque la polymérisation de la

tubuline et l'assemblage des microtubules, ou au taxol, qui abaisse la

concentration critique de tubuline libre nécessaire pour favoriser la polymérisation

et bloque le désassemblage des microtubules, entraîne, respectivement, une

augmentation d’un facteur 25,7 et 8,2 l'index mitotique (Table 2). De tels

médicaments anticancéreux stabilisant et déstabilisant les microtubules, connus

pour bloquer la progression du cycle cellulaire en phase M, ont par conséquent

servi de témoins positifs dans ce dosage antimitotique. Dans des conditions

similaires, les concentrations antiprolifératives de PQ1, 40 à 100 fois supérieures

à celles de la VCR et du taxol induisent une faible augmentation de 2,0 à 2,5 fois

de l'index mitotique des cellules tumorales L1210 à 24h mais stimulent la

formation de nombreuses cellules binucléées (augmentation de 3,2 à 7,4 fois) et

quelques micronoyaux, suggérant que ce composé pourrait accroître les

anomalies mitotiques, entraîner des altérations chromosomiques ou une mauvaise

ségrégation et bloquer la cytocinèse (tableau 2). Dans les mêmes expériences, le

150

composé de déstabilisation des microtubules empêche la formation et réduit le

pourcentage de cellules binucléées en-dessous du niveau de fond observé dans

les cellules témoins non traitées, tandis que le composé de stabilisation des

microtubules taxol produit de grandes augmentations de l'incidence de cellules

contenant deux noyaux (stimulation par 6,8 fois) ou des micronoyaux (stimulation

par 8,4 fois) (Table 2). Ceci est en accord avec le fait que les cellules traitées au

taxol, dont les microtubules du fuseau mitotique sont stabilisés, ne connaissent

pas de cytokinèse à la fin de la mitose et deviennent des cellules binucléées qui,

au cycle suivant de synthèse d'ADN forment des cellules polyploïdes polynucléées

qui finissent par mourir (220).

Tableau 2 : Effets des quinoléines substituées sur l’index mitotique et la fréquence de cellules binucléés ou avec des micronoyaux dans des cellules tumorales L1210. a = cellules incubées 24h à 37°C avec le compose et à la concentration indiques, b = Analyse d’au moins 2000 cellules / lame, n=3, c = Pourcentage de cellules traitées mitotiques ou binucléés divise par le % de cellules contrôles mitotiques ou binucléés, d = non différent du contrôle, e = p < 0,05, f = p < 0,025, g = p < 0.005 (plus que le contrôle) et h = p < 0,025 (moins que le contrôle)

vi/ Induction du clivage de PARP-1 et de l'activation des caspases effectrices et

initiatrices

Les traitements PQ1, 17-AAG et radicicol qui provoquent la fragmentation

de l'ADN internucléosomale dans des cellules L1210 à 24h ont été testés pour leur

capacité à induire le clivage de la PARP-1, un marqueur précoce de l'apoptose

caractérisé par la disparition de la bande de 116 kDa de l'enzyme native. Pas ou

peu de clivage de la PARP-1 est détecté dans les cellules témoins non traitées

mais la bande du fragment de 85 kDa devient de plus en plus apparente de 1 à

4,5h après le traitement des cellules L1210 avec 25 µM de PQ1 (Fig. 36). 17-AAG

151

et radicicol sont inactifs à 1 à 4,5h et de plus longs temps d'incubation sont

nécessaires pour détecter l'induction du clivage de la PARP-1 par ces

médicaments antitumoraux (Fig. 36). Contrairement aux cellules nécrotiques, qui

contiennent de grandes quantités de PARP-1 non clivée (221), pratiquement

aucune PARP-1 intacte n'est conservée après 20h dans les cellules apoptotiques

traitées avec 4 µM de radicicol, comme indiqué par la disparition presque totale de

la bande de 116 kDa de l'enzyme native (Fig. 36). Cependant, l'enzyme PARP-1

n'est que partiellement clivée par 25 µM de PQ1 à 3 - 4,5h et 10 µM de 17-AAG à

20h, sur la base de l'intensité de la bande du résidu de 116 kDa et de la plus petite

bande du fragment de 85 kDa (Fig. 36). Dans l'ensemble, les résultats suggèrent

que les composés antiprolifératifs PQ1, 17-AAG et radicicol sont des inducteurs

faibles et / ou lents du clivage apoptotique de la PARP -1 et de la fragmentation de

l'ADN internucléosomal.

Fig. 36 : Clivage de la protéine PARP-1 dans des cellules L1210 après incubation 1 à 4,5h en présence (ou absence = contrôle C) de 25 μM de PQ1 ou incubation 20h en présence (ou absence = contrôle C) de 10 μM de 17-AAG ou 4 μM de radicicol.

Flèches = PARP-1 intacte (116 kDa) ou clivée (85 kDa). Actine (42 kDa) = contrôle

Étant donné que la dégradation de la PARP-1 est catalysée par la caspase-

3, le traitement PQ1 qui s'est avéré induire le clivage de la PARP-1 et la

fragmentation de l'ADN internucléosomique a été testé pour sa capacité à activer

cette caspase effectrice post-mitochondriale clef. L'activité de la caspase 2 a

également été testée parce que la stimulation de cette caspase peut être

nécessaire pour activer la cascade en aval d'autres caspases initiatrices et

effectrices dans les cellules tumorales traitées avec le médicament (214, 216).

L'hypothèse que la cascade d'activation des caspases est impliquée dans le

clivage de la PARP-1 par PQ1 à 1-4,5h (Fig. 36) est étayée par le fait que l'activité

des caspases 2 (1258 % du témoin) et caspases 3 (1810 % du contrôle) présente

une induction maximale dans les cellules L1210 dès 1h après le traitement avec

152

25 µM de PQ1 (Fig. 37). Fait intéressant, les capacités concentration-dépendantes

de 17-AAG, radicicol et Mitox à induire l'activité maximum de la caspase 3 dans

les cellules L1210 à 9 ou 24h (Fig. 38) ressemblent à l'induction de la

fragmentation de l'ADN internucléosomique causée par ces médicaments à 24h

(Fig. 34 et 35), 17-AAG étant l'activateur le plus efficace de la caspase 3 à des

concentrations croissantes jusqu’à 25 µM (468 % du contrôle), radicicol à des

concentrations décroissantes de 4 à 1,6 µM (515 à 570 % du contrôle) et Mitox à

encore plus faibles concentrations de 256 à 640 nM (798-1068 % du contrôle) (Fig.

37).

Fig. 37 : Test fluorogenic de l’activation des caspases initiatrices et effectrices dans des cellules L1210. (A) Induction des caspases 2 (barres rayées) et caspases 3 (barres blanches) incubées pendant 1 à 6h en présence (ou absence = contrôle C) de 25 μM de PQ1 (n=3). (B) Induction des caspases 2 et 3 après incubation pendant 9h en présence (ou absence = contrôle C) de 17-AAG ou radicicol ou pendant 24h en présence (ou absence) de Mitox. a = p < 0,01, b = p < 0,005 (par rapport aux contrôles)

vii/ Niveaux protéiques et autophosphorylation de HER1 et HER2

Les petites molécules qui interagissent avec et inactivent les récepteurs de

l'EGF humains HER1 et HER2 et/ou leur chaperon Hsp90, pourraient bloquer

efficacement les aberrations des voies de signalisation ligand-dépendante et

indépendante qui soutiennent la prolifération de différentes lignées de cellules

tumorales surexprimant HER1 et HER2 (222). Après inhibition de leur chaperon

Hsp90, les protéines HER1 et HER2 déstabilisées subissent généralement la

dégradation protéosomique (223, 224). En effet, l'immunodétection de cellules

entières confirme que les inhibiteurs de Hsp90 connus 17-AAG et radicicol (219,

153

225) régulent à la baisse, d'une manière dépendante de la concentration, le

niveau de la protéine HER1 dans les cellules A- 431 et le niveau de la protéine

HER2 dans les cellules SK-BR-3, la dégradation du récepteur après 24h étant

significative à 41 ou 102 nM et maximale ou presque maximale à 256 nM ou 640 -

1600 nM (Fig. 38). En revanche, aucune des concentrations du composé

antiprolifératif PQ1 testées jusqu'à 25 µM n'a modifié les taux de protéines HER1

et HER2 dans les cellules tumorales A-431 et SK-BR-3 au bout de 24h, ce qui

suggère que ce médicament est peu susceptible d'inhiber la protéine Hsp90 pour

déstabiliser les voies de transduction médiées par HER1 et HER2 (Fig. 35).

Comme les récepteurs tyrosine kinases HER1 et HER2 sont activés par leur

oligomérisation et autophosphorylation (222, 226), il était intéressant de

déterminer si les PQ1 permettraient de réduire les niveaux de pHER1 dans les

cellules A-431 stimulées par EGF et pHER2 dans les cellules SK-BR-3 après 3h.

Dans la mesure où le premier événement de signalisation après l'oligomérisation

de HER1 et HER2 est l'autophosphorylation, l'inhibition de l'autophosphorylation

du récepteur est un indicateur de la puissance du composé et de sa sélectivité

(227, 228). Encore une fois, l'analyse Western blot indique que, sur une base de

teneur en protéines HER1 et HER2 égale, les PQ1 à 25 µM ne reproduisent pas la

capacité de 4 µM de 17-AAG et radicicol à supprimer les niveaux de pHER1 et

pHER2 respectivement détectés dans les cellules A-431 et SK-BR-3 à 3h (Fig. 39).

Les résultats suggèrent indirectement que les PQ1 ne ciblent pas Hsp90 ou HER1

et HER2 récepteurs kinases pour inhiber la

prolifération des cellules tumorales et

déclencher l'apoptose.

Fig. 38 : Immunodetection du niveau de HER1 (A) et HER2 (B). Induction de la dégradation de HER1 dans des cellules A-431 (A) et HER2 dans des cellules SK-BR-

3 (B) par différentes concentrations de PQ1 (●), 17-AAG

(■) et radicicol (▲). a = non différent du contrôle, b = p <

0,025, c = p < 0,01 (par rapport au contrôle)

154

Fig. 39 : Inhibition de la phosphorylation des récepteurs HER1 et HER2 dans des cellules A-431 et SK-BR-3, respectivement, par incubation 3h avec PQ1 (25 µM), 17-AAG (4 µM) et radicicol (4 µM). C = contrôle. Les cellules A-431 surexprimant HER1 ont été stimulées pendant 15 min avec de l’EGF

E/ Discussion

Les quinoléines, qui ont une activité antipaludéenne, leishmanicide, anti-

bactérienne et anticancéreuses, ont été rapportés inhiber les cassettes ABC

(cassette de transport de médicaments liant l'ATP), l'hypoxie tumorale, la

multirésistance aux médicaments (MDR) et l'activité tyrosine kinase des protéines

(180). La présente étude démontre que les quinoléines substituées PQ1, qui se

sont précédemment avérée inhiber la viabilité des cellules de cancer du sein

humain T-47D et leur capacité à former des colonies sur gélose molle in vitro et à

former des tumeurs suite à xénogreffe chez la souris nude in vivo (180, 202), sont

aussi systématiquement efficaces contre la prolifération des cellules tumorales

dans la gamme de concentrations de l’ordre du µM dans un petit panel de cellules

tumorales leucémiques, pancréatiques, épidermoïdes et mammaires. Le fait que

le composé antitumoral PQ1 soit efficace dans la plage des nM dans les cellules

T-47D (180, 202) est étayé par les données actuelles montrant que 200 nM de

PQ1 peuvent inhiber le marqueur de prolifération cellulaire Ki-67 dans les cellules

de tumeurs T-47D. Bien que l'ampleur de l'inhibition puisse varier et que les PQ1

puissent être plus efficaces contre les cellules T-47D que L1210, l'analyse MTS :

PMS de l'activité métabolique à 2 et 4 jours, le test d'exclusion au bleu trypan de

l'intégrité membranaire à deux jours (180), le test MTT au jour 1 et le dosage de la

croissance des colonies à 7 jours (202) concordent tous à démontrer que PQ1 est

155

un agent antitumoral puissant qui inhibe la prolifération, la viabilité et la capacité

de reproduction de différentes cellules tumorales. PQ1 est l'agent anti-prolifératif le

plus efficace parmi les analogues PQ testés dans les cellules L1210 mais PQ11 a

l'activité anti-proliférative la plus forte dans les cellules T-47D (180), ce qui

suggère que ces quinoléines substituées synthétiques peuvent inhiber

sélectivement la croissance de certaines des lignées de cellules tumorales

mammaires dans la plage des nM. Les résultats sont encourageants compte tenu

du fait que de puissants composés anti-cancéreux ont été découverts parmi une

poignée d'analogues PQ synthétisés. L'activité antitumorale des PQ1 ouvre la

possibilité de concevoir de nouveaux médicaments anticancéreux à partir de cette

étude. Les PQ1 possèdent une chaîne latérale aminopropyl sur la fonction amine

C9 du cycle quinoléine, ce qui est susceptible d'améliorer sa capacité à interagir

avec les différentes cibles moléculaires dans les cellules.

La protéine Ki-67, qui est absente des cellules au repos (G0), peut être

détectée exclusivement dans les noyaux des cellules progressant à travers les

phases G1, S et G2 du cycle cellulaire et se relocalise à la surface des

chromosomes lors de la mitose (211). Parce que l'expression de la protéine Ki-67

peut être absolument nécessaire pour maintenir la prolifération cellulaire tumorale,

la fraction de cellules tumorales Ki-67 positives est souvent en corrélation avec

l'évolution clinique du cancer (211). Par conséquent, il est important de montrer

que des concentrations de l'odre des nM de PQ1 peuvent considérablement

inhiber l'expression de l'antigène Ki-67 pour au moins 48h, ce qui suggère que ce

nouveau composé anti-tumoral pourrait être efficace pour réduire la fraction en

croissance de populations de cellules tumorales et lutter contre la progression de

la maladie. L'observation de certaines cellules tumorales traitées aux PQ1

exprimant de nouveau l'antigène Ki-67 à 72h peut être due à la dégradation

partielle des médicaments produisant des métabolites inactifs. D'autres études

pharmacocinétiques seraient nécessaires pour évaluer la demi-vie, l'absorption

cellulaire, la conservation et la distribution intracellulaire des composés PQ et

évaluer leur durée d'action.

En accord avec les effets de médicaments anti-cancéreux établis utilisés

comme témoins positifs, des concentrations de PQ1 plus élevées que celles

suffisantes pour inhiber la prolifération des cellules tumorales doivent être utilisées

156

pour inhiber le transport de nucléosides et la synthèse de macromolécules ou

induire une activité maximale des caspases, le clivage de la PARP-1 et la

fragmentation de l'ADN apoptotique. Cette contradiction apparente peut être

simplement dûe à différentes conditions expérimentales et des réponses

cellulaires distinctes à différentes périodes d'exposition au médicament :

l'assimilation cellulaire de nucléosides puriques et pyrimidiques sur une période de

30 secondes est bloquée dans les cellules traitées pour seulement 15 min par les

PQ1 et 17-AAG ; les taux de synthèse protéique et d'acides nucléiques sur 30-60

min sont inhibés dans les cellules traitées sur une période de seulement 2-3h avec

les PQ1, Mitox, 17-AAG ou radicicol ; l'activation des caspases et le clivage de la

PARP-1 sont induits dans les cellules traitées pendant seulement 1-4,5h avec les

PQ1, 9-20h avec la 17-AAG ou le radicicol et 24h avec le Mitox et la fragmentation

internucléosomale de l'ADN maximale se produit 24 heures après le traitement

avec les médicaments anticancéreux, alors que les inhibitions les plus

spectaculaires de la prolifération des cellules tumorales L1210, PAN02, A-431,

SK-BR-3 et BT-474 sont le résultat de traitements médicamenteux de 2 à 4 jours.

Bien que les PQ1 synthétiques soient plus faibles que les médicaments

anticancéreux établis comme DAU, Mitox, 17-AAG et radicicol, l'intérêt de cette

petite molécule peut être dans ses nouvelles cibles moléculaires et mécanismes

de l'activité antitumorale, sur la base de l'observation que les PQ1 peuvent être le

1er composé pouvant interagir avec les jonctions GAP et diminuer la

phosphorylation des Cx43 pour restaurer spécifiquement la GJIC et inhiber la

prolifération cellulaire tumorale et pas celle des tissus normaux (202). Le

mécanisme moléculaire par lequel les PQ1 restaurent la GJIC dans les cellules

tumorales (180, 202) est en cours d'investigation. Une hypothèse est que les PQ1

peuvent empêcher la dégradation de la Cx43 (203) par interaction avec l'ubiquitine

E3 ligase. Les PQ1 pourraient bloquer l'interaction entre le motif PY (proline-

tyrosine) des Cx43 et le domaine WW (tryptophane-tryptophane) de l'E3 ubiquitine

ligase.

Les PQ1 imitent la capacité de Mitox, radicicol et 17-AAG à inhiber la

synthèse de l'ADN, de l'ARN et des protéines dans les cellules tumorales L1210

mais, contrairement aux Mitox et radicicol inactifs, présentent l'avantage

supplémentaire de cibler le système de transport des nucléosides et de bloquer

157

rapidement l'absorption cellulaire des nucléosides pyrimidiques et puriques. Par

conséquent, les PQ1 sont susceptibles de perturber d'autres cibles de la

membrane cellulaire en plus des jonctions communicantes et leur capacité à

bloquer dans les 15 min la capture cellulaire de [3H]-adénosine et de [3H]-

thymidine est susceptible de jouer un rôle dans le mécanisme par lequel ce

composé inhibe après 2-3h les taux d'incorporation des nucléosides puriques et

pyrimidiques requis pour les synthèses d'acides nucléiques. Radicicol (25 à 62,5

µM) et Mitox (1,6 à 4 µM) sont totalement incapables de modifier le transport

cellulaire de [3H]-adénosine et de [3H]-thymidine, même si ces médicaments à de

telles concentrations inhibent de façon maximale l'incorporation de [3H]-thymidine

dans l'ADN. Fait intéressant, la 17-AAG inhibe également le transport de

nucléosides, ce qui suggère que l'inhibition de Hsp90 pourrait ne pas être la seule

cible moléculaire de son mécanisme d'action pour son activité anti-tumorale.

Pour la synthèse de nucléotides, les cellules utilisent des nucléosides

puriques et pyrimidiques générés soit par synthèse de novo soit par des voies de

sauvetage pour la réutilisation de bases préexistantes. Les cellules L1210

possèdent trois types distincts de transporteurs dse nucléosides qui agissent par

osmose (diffusion facilitée) ou mécanismes Na+ dépendants (transport actif -

concentratif) et sont soit sensibles ou insensibles aux inhibiteurs spécifiques de

transport des nucléosides (229). L'interaction directe des PQ1 avec les

transporteurs des nucléosides reste à déterminer mais ces cibles moléculaires

pourraient être utiles dans une polychimiothérapie pour potentialiser l'action

anticancéreuse des antimétabolites puisque les cellules tumorales pourraient

réguler à la hausse leur système de transport de nucléosides pour compenser les

effets inhibiteurs des antimétabolites sur la synthèse d'acides nucléiques. La MDR

(Multi Drug Resistance - Résistance à plusieurs médicaments) est parfois

associée à une augmentation du nombre de transporteurs de nucléosides et de

leur taux de transport, résultant en une absorption accrue d'adénosine et une

augmentation de la voie de sauvetage des nucléosides, ce qui limite l'efficacité du

méthotrexate et du 5-fluorouracile. En bloquant l'effet de sauvetage de

nucléosides exogènes, des inhibiteurs du transport de nucléosides peuvent

potentialiser ou prolonger l'activité anticancéreuse des antimetabolites qui inhibent

la voie de novo de la synthèse des nucléotides (213). De plus, les inhibiteurs du

158

transport des nucléosides peuvent aussi contourner la résistance à la DAU en

interférant avec à la fois les glycoprotéines et le transport des nucléosides dans

les cellules MDR (213, 229). Ainsi, les PQ1 pourraient également être utiles pour

contourner certains mécanismes de MDR et sensibiliser les cellules tumorales

MDR qui sont devenues insensibles à la cytotoxicité des médicaments

anticancéreux conventionnels endommageant l'ADN.

Le Mitox, approuvé par la FDA (Food and Drug Administration), est un 1,4-

dihydroxyanthracene-9,10-dione synthétique de la même famille que la DAU mais

moins cardiotoxique. Outre le ciblage de l'enzyme ADN topoisomérase II pour

induire des lésions de l'ADN, le mécanisme d'action des médicaments

antitumoraux de type anthracycline implique l'intercalation de groupements

aglycones plans dans l'ADN pour perturber la replication et la transcription de

l'ADN (230). Par conséquent, les présents résultats EB sont compatibles avec le

fait que le Mitox (1,28 à 8 µM) est un agent réagissant avec l'ADN qui s'intercale

dans l'ADN et provoque des liaisons transversales et des ruptures de brins.

Apparemment, des concentrations supérieures à 20 - 125 µM de 17-AAG peuvent

également se lier à l'ADN purifié et perturber le complexe EB-ADN, ce qui suggère

qu'un certain niveau de dommages à l'ADN peut jouer un rôle dans le mécanisme

d'action de ce médicament anticancéreux. Mais ce n'est pas le cas pour PQ1 et

radicicol, ce qui suggère que ces médicaments, qui ne se lient pas directement à

l'ADN pour inhiber la fluorescence du complexe EB-ADN dans un essai exempt de

cellules, ne sont pas susceptibles de cibler directement l'ADN cellulaire pour

exercer leur activité antitumorale.

L'incapacité des PQ1 à augmenter sensiblement l'indice mitotique des

cellules L1210, comme la VCR et le taxol le font à 24h, suggère que ce composé

n'est pas un poison du fuseau mitotique et présente une faible probabilité

d'intéragir avec la tubuline et de modifier la polymérisation / dépolymérisation des

microtubules pour entrainer son activité anti-proliférative. Mais des concentrations

croissantes du composé antiprolifératif PQ1 de 0,64 à 10 µM pourraient

déclencher des effets génotoxiques accroissant le taux de cellules binucléées et

de micronoyaux dans les cellules tumorales L1210 à 24h. Les cellules binucléées

indiquent que la cytokinèse suivant la division nucléaire est inhibée (217). La

formation de cellules à plusieurs noyaux peut s'en suivre si les cellules binucléées

159

réintègrent le cycle cellulaire et échappent de nouveau à la cytocinèse. Le test du

micronoyau est un indicateur de lésions et d'aberrations chromosomiques induites

par le médicament puisque de telles structures se forment généralement au cours

de la transition métaphase / anaphase de la mitose quand un chromosome retard

entier ou un fragment de chromosome acentrique résultant d'un événement

clastogène ou mutagène ne parvient pas à s'intégrer dans les noyaux des cellules

filles (217). Cependant, les aberrations chromosomiques et non-disjonction /

missegregation pourraient être la conséquence de la perturbation mitotique

prolongée induite par le médicament et pourraient être responsables de

l'incapacité cellulaire à subir la cytocinèse après régression du sillon de clivage

(231). Si compléter la cytocinèse nécessite une ségrégation chromosomique

correcte, il est possible que le traitement aux PQ1 induise des aberrations

chromosomiques et une mauvaise ségrégation augmentant la fréquence de

cellules binucléées.

A la différence du clivage précoce de l'ADN en larges fragments de 50 à

300 kpb, un événement de signalisation initial pouvant induire les cellules

tumorales traitées avec des concentrations relativement faibles de médicaments

anticancéreux endommageant l'ADN de s'engager vers l'apoptose, la dégradation

endonucléolytique secondaire au niveau des sites de liaison internucléosomiques

de l'ADN produisant de petits fragments mono- et oligonucléosomiques de 180-

200 pb à 24h est un marqueur tardif concomitant avec la preuve morphologique

de l'apoptose (232). En amont de la fragmentation de l'ADN internucléosomale,

l'activation de la cascade des caspases induit le clivage protéolytique d'une large

gamme de substrats. La caspase effectrice 3 clive et inactive l'inhibiteur de

l’ADNase activée par les caspases, libérant ainsi des endonucléases actives qui

se relocalisent dans le noyau pour réaliser la fragmentation de l'ADN

internucléosomale (232). Le clivage et l'inactivation de la PARP-1 induits par la

caspase 3 représentent également un événement précoce requis pour les cellules

tumorales qui ont été exposées à des médicaments anticancéreux endommageant

l'ADN et sont entrées dans le processus d'apoptose. Le clivage de la PARP-1 peut

empêcher la détection et la réparation des lésions de l'ADN, bloquer l'épuisement

de NAD+ et d'ATP causant la mort cellulaire nécrotique et améliorer l'activité des

endonucléases Ca2+ / Mg2+ dépendantes (221, 233). Pour cette raison, la

160

détection de la disparition du fragment de 116 kDa de l'enzyme native et

l'apparition du fragment de 85 kDa suite au clivage de la PARP-1 est un indicateur

précoce et sensible que les cellules L1210 traitées aux PQ1 ou aux médicaments

anticancéreux de référence utilisés comme contrôles positifs sont en cours

d'apoptose (216, 218). Les présentes données indiquent que les concentrations

de PQ1 qui bloquent le transport de nucléosides à 15 min et la synthèse de

macromolécules en 2-3h, stimulent une voie apoptotique qui induit une cascade

d'activation de la caspase initiatrice 2 et de la caspase effectrice 3 à 1h et de

clivage de la PARP-1 une coupure à 1-4,5h en rapport avec leur capacité à

perturber la cytocinèse et déclencher la fragmentation de l'ADN entre les

nucléosomes à 24h et à inhiber la prolifération des cellules tumorales au cours

d'une période de 2 à 4 jours, ce qui suggère que la capacité de cette quinoléine

substituée à induire l'apoptose peut jouer un rôle important dans son mécanisme

d'action moléculaire.

Que les voies extrinsèques ou intrinsèques soient impliquées, toutes les

voies de l'apoptose finissent par converger au niveau de la membrane externe des

mitochondries, où l'activation de la protéine Bcl-2, membre de la famille des

protéines pro-apoptotiques, provoque la transition de perméabilité mitochondriale

(MPT) et la libération de facteurs apoptogènes (214, 216, 232, 234). Les

médicaments anticancéreux endommageant l'ADN sont considérés déclencher

une voie intrinsèque mitochondriale-dépendante dans laquelle des signaux

nucléaires qui comportent divers gènes sensibles à la protéine p53 induisent

directement l'ouverture des pores mitochondriaux médiée par Bax et Bak et la

libération du cytochrome c (cyt c) à partir de l'espace intermembranaire dans le

cytosol qui est le facteur limitant clef dans l'initiation de la cascade post-

mitochondriale de protéases apoptotiques (232, 235). Le cyt c se lie au facteur

apoptotique 1 activateur des protéases, qui interagit avec la procaspase 9 pour

former le complexe apoptosome, ce qui active la caspase initiatrice en présence

d'ATP (235). Dans les cellules HL-60 traitées, le relargage critique du cyt c

mitochondrial peut se produire entièrement en l'absence d'activation de la caspase

apicale, ce qui suggère que le relargage du cyt c est un événement en amont et

indépendant des caspases dans l'apoptose induite par le médicament (216, 234).

Mais un inhibiteur spécifique de la caspase 2 bloque l'activation des caspases 9, 3

161

et 8 dans les cellules HL-60 traitées, démontrant que la caspase 2 peut être

activée en amont des autres caspases initiatrices et effectrices et contrôler leur

activation ultérieure (216, 234). Même si la PQ1 ne se lie pas directement à l'ADN,

la capacité de ce composé antitumoral à interagir avec des enzymes de

maintenance ou des protéines régulatrices et provoquer indirectement des

coupures ou des réticulations dans les brins d'ADN de poids moléculaires élevés,

des aberrations chromosomiques et des perturbations de la cytocinèse restent à

déterminer. Par conséquent, il est un peu prématuré de spéculer sur la nature des

cibles moléculaires initiales, des événements néfastes massifs et des signaux

nucléaires qui induisent les cellules tumorales traitées aux PQ1 à libérer leur cyt c

mitochondrial et à subir l'apoptose, ce qui active la cascade post-mitochondriale

des caspases responsable du clivage de la PARP-1, de l'activation

d'endonucléases et, au final, de la fragmentation internucléosomale de leur ADN,

qui est l'une des manifestations de la fin du processus apoptotique. Les

marqueurs de la MPT liés à l'augmentation soudaine de la perméabilité de la

membrane interne comprennent l'effondrement du potentiel transmembranaire

mitochondrial (Δæm), une expansion de grande amplitude et la libération de Ca2+

(236, 237). Le relargage du cyt c est un événement universel dans l'apoptose,

mais qui peut se produire avant, indépendamment ou en l'absence de

l'effondrement du Δæm et sans ouverture concomitante des pores de transition de

perméabilité mitochondriale (PTP) et expansion (236, 237). A la différence des

antitumoraux triptycène et analogues du 1,4-dihydroxyanthracene-9,10-dione (237,

238), les PQ1 ne provoquent ni effondrement du Δæm ni gonflement mitochondrial

ni libération de Ca2+ dans des systèmes cellulaires et acellulaires (données non

présentées), ce qui suggère que ce composé est peu probable de cibler les

mitochondries pour induire le relargage du cyt c, soit directement, par des

changements de conformation qui perturbent la transition ouvert - fermé du

complexe PTP (238), soit indirectement, par le biais de lésions séquentielles de

l'ADN et activation précoce de la PARP-1 entraînant l’épuisement en NAD+ et le

dysfonctionnement mitochondrial (239). Comme la plupart des médicaments

anticancéreux actuels, PQ1 n'a pas la possibilité de cibler les mitochondries

directement, mais doit d'abord endommager d'autres cibles moléculaires afin de

générer les signaux qui déclenchent la voie mitochondriale de l'apoptose.

162

La 17-AAG, un analogue moins toxique de l'antibiotique ansamycine

geldanamycine, et le macrolide radicicol sont de puissants inhibiteurs de la

protéine Hsp90, un chaperon moléculaire dont l'association est nécessaire pour le

repliement post-traductionnel, la stabilité et la fonction de multiples protéines de

signalisation surexprimées, mutées et chimères qui favorisent la croissance et/ou

la survie des cellules cancéreuses (240). Comme un nombre important de

tumeurs expriment des niveaux accrus de protéine Hsp90 active et de protéines

HER1 et HER2, une approche pour inhiber de multiples voies de transduction du

signal avec un seul agent est de bloquer le site de liaison de l'ATP à la protéine

Hsp90 (241). En inhibant la fonction de la protéine Hsp90, la 17-AAG et le

radicicol provoquent la dégradation protéosomale sélective de plusieurs

oncogènes : récepteurs membranaires et protéines tyrosine kinases

intracellulaires qui régulent de multiples voies de signalisation de la prolifération

des cellules tumorales, de régulation du cycle cellulaire, de survie cellulaire,

d'invasion, de métastase et d'angiogenèse, et induisent ainsi l’apoptose et les

effets antitumoraux (219, 223-225). Contrairement aux anticorps monoclonaux

volumineux et très spécifiques, les petits inhibiteurs de plusieurs kinases qui

ciblent à la fois les récepteurs HER1 et HER2 pourraient être avantageux pour

bloquer plusieurs étapes le long de différents réseaux de signalisation des

récepteurs tyrosine kinases et inhiber la croissance d'un plus large éventail de

cellules néoplasiques (222, 226-228). Dans la mesure où les PQ1 échouent à

imiter les capacités de la 17-AAG et du radicicol à réduire considérablement la

teneur en protéines et l'état de phosphorylation de HER1 ligand - dépendant et

HER2 ligand - indépendant, respectivement dans les cellules A-431 et SK-BR-3,

surexprimant ces récepteurs, ce nouveau médicament présente une faible

probabilité de cibler la protéine Hsp90 et de réguler à la baisse ou d'inactiver les

oncoprotéines de la voie de signalisation de l'EGF pour inhiber la croissance des

cellules tumorales et favoriser leur apoptose.

Combiner des médicaments qui ciblent différentes voies moléculaires et

obtenir des effets antitumoraux complémentaires ou synergiques est une stratégie

importante dans la chimiothérapie contre le cancer. PQ1, qui cible les jonctions

GAP (202) et diminue l'expression de la protéine Ki-67 dans la plage de

concentrations des nM et inhibe également le transport de nucléosides, bloque la

163

cytocinèse et induit la fragmentation de l'ADN apoptotique dans la gamme des µM,

pourrait perturber un plus large éventail de cibles moléculaires dans les

populations de cellules tumorales non synchronisées et avoir un mécanisme

d'action plus souple que d'autres médicaments affectant un seul de ces

événements. L'incapacité des PQ1 à réduire le niveau protéique et la

phosphorylation des récepteurs de l'EGF dans les membranes des cellules

tumorales renforce la notion selon laquelle l'amélioration de la GJIC (202) joue un

rôle majeur dans le mécanisme de son activité anti-tumorale.

165

III/ Les quinoléines substituées de seconde génération

comme médicament anti-cancéreux contre le cancer du sein

Traduit de l'anglais Heiniger et al. (242)

A/ Résumé

Les cellules cancéreuses ont une capacité réduite de communication inter-

cellulaire au travers des jonctions GAP (GJIC). Une approche possible pour

réduire la croissance des cellules cancéreuses est d'améliorer la GJIC. Ce rapport

montre que la quinoléine substituée de deuxième génération, PQ7, a un effet

antitumoral. Des analyses de transfert de colorant et de croissance des colonies

ont été effectuées pour mesurer la GJIC et la formation de tumeurs formées de

cellules T47D, cellules de cancer du sein. Les PQ7 à 500 nM induisent une

augmentation d'un facteur 16 de la GJIC dans les cellules T47D. En plus d'une

augmentation de la GJIC, une diminution de 50% de la croissance des colonies a

été observée avec 100 nM de PQ7. Des souris nu / nu traitées avec les PQ7 ont

montré une régression de 100% de la croissance de xénogreffes de tumeurs

formées de cellules T47D. Les résultats montrent que les PQ7 ont un rôle

prometteur en exerçant une activité antitumorale dans les cellules de cancer du

sein humain.

B/ Introduction

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez les femmes dans le

monde et la mortalité par cancer du sein est toujours due à des métastases de la

tumeur (243). Le cancer est une maladie complexe et évolutive avec la formation

de défauts à plusieurs étapes génétiques dans une cellule. Le cancer est la

première pathologie à avoir été associée à des défauts dans les jonctions

communicantes. En 1966, Lowenstein et Kanno ont associé la communication au

travers des jonctions GAP (GJIC) avec le contrôle de la croissance cellulaire (2).

Ils ont observé une diminution du couplage électrique dans des hépatomes de rat

par rapport aux hépatocytes normaux. Une série de mécanismes moléculaires a

166

montré que le phénotype du cancer est lié à une perte de couplage (244). Puisque

l'observation la plus évidente dans le phénotype des cellules tumorales est le

dérèglement de la croissance, l'hypothèse de l'ensemble des études est que les

jonctions GAP sont impliquées dans le contrôle de la croissance cellulaire (245).

Un déficit dans les jonctions GAP a été défini comme étant l'absence de plaques

de jonctions GAP observées par des approches ultra-structurales (microscopie

électronique et cryofracture-cryodécapage) ou par diminution de la GJIC (246).

Les jonctions lacunaires sont des canaux transmembranaires hydrophiles

permettant le passage de molécules de moins de 1200 Da entre les cellules à

travers l'espace intra-cytoplasmique. Le passage de petites molécules à travers

les jonctions communicantes suggère que la taille fonctionnelle maximale du pore

pour le canal est d'environ 1,5 nm de diamètre dans des cellules mammifères

(247). Les petites molécules tels que l'AMPc, l'inositol triphosphate, le glucose, et

les ions calcium peuvent passer alors que les grosses molécules telles que des

protéines ou des sucres complexes ne peuvent pas passer à travers des jonctions

GAP (248). Les jonctions GAP sont les seules structures des membranes

cellulaires qui permettent la communication entre cellules adjacentes (249).

Un déficit en jonctions GAP formées de connexines 43 (Cx43) peut être

utilisé comme un marqueur indépendant pour les tumeurs du sein (250). Des

études préliminaires ont montré une régulation à la baisse des Cx26 et Cx43 dans

les cellules primaires dérivées de tumeurs du sein humaines (251), de tumeurs

mammaires de rat (9), et de lignées cellulaires de cancer du sein (250, 252). Dans

la mesure où le promoteur de la Cx26 est situé dans un îlot CpG (cytosine

guanine phosphate), il est supposé que la méthylation de ces sites peut conduire

à la répression du gène (253). Les études cliniques de Singal et al. ont trouvé une

hyperméthylation du gène de la Cx26 ; cependant, l'inhibition d'une ADN

méthyltransférase n'a pas induit l'expression du gène (252). Au contraire, Tan et

al. ont trouvé que seule une lignée de cellules de cancer du sein sur huit testées

était hyperméthylée dans la région du promoteur de la Cx26 mais que, dans ce

cas, l’hyperméthylation est en corrélation avec une perte complète de l'ARNm qui

a été récupéré après le traitement avec un inhibiteur d'une ADN méthyltransférase

(254). En outre, le promoteur de la Cx26 s'est avéré être méthylé dans plus de

50% des échantillons de tissus de patients testés, bien que de façon hétérogène.

167

Ces résultats contradictoires suggèrent que le gène de la Cx26 peut en effet être

un suppresseur de tumeur inactivé par méthylation, mais ce n'est probablement

pas le seul mécanisme de régulation à la baisse de l'expression (253). Une

régulation à la hausse des formes phosphorylées de la Cx43 a été observée dans

les cellules myoépithéliales et les cellules luminales transformées de carcinomes

in situ et toutes les cellules de carcinomes du sein invasifs (255). Les connexines

sont principalement présentes sur la membrane cellulaire, mais dans certaines

tumeurs, malgré une augmentation de l'expression des connexines, elles sont

généralement séquestrées dans les compartiments intracellulaires. Kanczuga-

Koda et al. ont rapporté que le niveau d'expression de la Cx43, qui était

cytoplasmique dans 90% des tumeurs, est en corrélation positive avec le grade

histologique avancé de la tumeur (256).

Plusieurs petites molécules organiques, tels que l'ester caféate de

phénéthyle (CAP) (207), le sodium 4-phénylbutyrate (257), le liarozole (258), le

lycopène (259), et la lovastatine (260), ont été rapportés réguler à la hausse ou

restaurer la GJIC. Il a été précédemment rapporté qu'une nouvelle classe de

quinoléines substituées (nom de code, PQ) pouvait augmenter l'activité des

jonctions GAP dans les cellules cancéreuses du sein T47D (202). Cette étude a

démontré que la première génération de quinoléines substituées induisait

efficacement l'apoptose, diminuait la viabilité des cellules, et atténuait la

croissance tumorale. Une deuxième génération de PQ, analogue à la première

génération, a été synthétisée comme décrit dans le protocole rapporté (180). Le

but de cette étude était d'examiner une deuxième génération de quinoléines

substituées qui active spécifiquement l'activité GJIC et ensuite inhibe la croissance

tumorale de xénogreffes de cellules T47D chez des souris. Les résultats ont

démontré que cette deuxième génération de petites molécules fournissait un

traitement prometteur pour le cancer du sein.

168


i/ Matériaux

Le composé PQ7, 6-méthoxy-8-[(2-furanylméthyle) amino]-4-méthyl-5-(3-

trifluoromethylphenyloxy) quinoléine, a été préparé en suivant le mode opératoire

rapporté (180).

ii/ Lignée cellulaire et culture cellulaire

La lignée cellulaire T47D de cancer du sein humain a été achetée à

l'American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Les cellules ont été

cultivées dans un milieu RPMI supplémenté avec 10% de sérum fœtal de veau

(Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA, USA) et 10% d'antibiotiques-

actinomycosiques à 37 ° C avec 5% de CO2 dans des flacons de 75 cm2.

iii/ Analyse par Western blot

Les cellules ont été cultivées dans du milieu RPMI additionné de sérum

jusqu'à ce qu'elles soient confluentes à 90% dans des flacons de 75 cm2. Les

cellules ont été conservées dans un média de privation : DMEM sans phénol

rouge avec 5% de sérum filtré sur charbon toute une nuit. Les cellules ont été

supplémentées avec 0, 10, 100, 200, 500 ou 1000 nM de PQ7 pendant 24 heures.

Les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS froid, puis ont été récoltées en

utilisant un tampon de lyse cellulaire (20 mM Tris pH 7,5, EDTA 0,5 mM, EGTA

0,5 mM, et 0,5% de Triton X-100) avec des inhibiteurs de proteases dilués à

1:1000 (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA). Le lysat cellulaire a été traité par

ultrasons et centrifugé à 13.000 tours par minute pendant 30 minutes à 4°C. Vingt-

cinq mg d'extrait de cellules entières ont été résolus par électrophorèse sur gel de

polyacrylamide-SDS à 10% (PAGE) et transférés sur membrane de nitrocellulose

(Midwest Scientific, St. Louis, Missouri, USA). La membrane de nitrocellulose a

été bloquée dans du lait à 5% pendant une heure à température ambiante puis

incubée avec l'anticorps monoclonal de lapin anti-Cx43 à 1:500 (Santa Cruz

Biotechnologies, Santa Cruz, CA, USA), l'anticorps de lapin anti-caspase-9 à 1:

169

500 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), et l'anticorps de lapin anti-actine à

1:1000 (Sigma-Aldrich). Les transferts Western ont été détectés par

chimioluminescence (Pierce, Rockford, Illinois, USA).

iv/ Activité des jonctions GAP

Pour l'analyse de transfert de colorant (SL / DT), les cellules ont été

cultivées jusqu'à atteindre 90% de confluence sur des lamelles, supplémentées

avec 0, 10, 100, 200, 500 ou 1000 nM de PQ7 pendant 24 heures. Après cela, les

cellules ont été lavées trois fois avec du PBS puis 2,5 ul d'un mélange contenant

1% de Lucifer yellow et 75% de rhodamine dextran ont été ajoutés au centre de la

lamelle. Deux coupes se croisant au centre de la lamelle ont été effectuées. Après

trois minutes, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS et incubées à 37 °

C dans un milieu de culture tissulaire pendant 20 minutes. Les cellules ont ensuite

été lavées avec du PBS trois fois et fixées dans 2,5% de paraformaldehyde

pendant 10 minutes. Les cellules ont été montées sur une lame, scellées et

visualisées sous un microscope à fluorescence en utilisant les objectifs × 4 et ×

10.

v/ Croissance des colonies sur gélose molle

Les cellules ont été traitées avec 0, 10, 100 ou 1000 nM de PQ7 pendant

14 jours. Des plaques de gélose de base ont été préparées contenant 0,8% d'agar

et 0,4% d'agar dans un mélange d'éléments nutritifs Ham's F12. Les cellules (5 x

104444'4 cellules par puits de 33 mm2) ont été suspendues dans 100 uL de lmilieu

Ham's F12 avec 0,4% d'agar et étalées. Ces plaques ont été maintenues à 37°C

pendant 14 jours et examinées pour la présence de colonies. Des colonies

individuelles de 50 um ou plus ont été examinées.

vi/ Exclusion au bleu Trypan

La viabilité cellulaire a été mesurée en utilisant la méthode d'eclusion au

bleu trypan. Un total de 1 x 104 cellules T47D de cancer du sein ont été traitées

avec différentes concentrations de PQ7 pendant 48 heures. Une suspension

cellulaire a été mélangée avec du colorant bleu trypan, puis examinée

170

visuellement pour les cellules viables avec l'appareil Cellometer Auto T4

(Nexcelom). La présentation graphique comprend trois échantillons indépendants.

vii/ Tumeurs de xénogreffes de cellules T47D chez les souris nu / nu

Les souris nu / nu ont été commandées auprès de The Jackson Laboratory,

(Bar Harbor, ME, USA). Les souris ont été inoculées avec de l'estradiol-17β (1,7

mg / pastille) avant une injection sous-cutanée de 1 x 107 cellules T47D de cancer

du sein, dans la région du coussinet adipeux mammaire inguinal. Un test de

viabilité cellulaire des cellules T47D a été effectué avant l'injection. La taille de la

tumeur a été mesurée en trois dimensions avec un étrier tous les 2 jours à partir

du jour sept. Les souris ont été observées pour un changement de comportement,

d'apparence ou de poids. Lorsque les tumeurs ont atteint 30-50 mm3, trois

animaux ont été assignés au hasard à chaque groupe de traitement. Les animaux

ont été injectés avec 1 uM de PQ7 tous les deux jours et des mesures

quotidiennes de la taille de la tumeur ont été réalisées.

viii/ Analyse statistique

Le niveau de signification a été examiné pour une p-value inférieure à 0,05

en utilisant le t-test de Student. Toutes les données sont présentées sous forme

de moyenne ± écart-type d'au moins trois expériences indépendantes provenant

de différents lots.

D/ Résultats

La communication intercellulaire est maintenue par la GJIC dans de

nombreux organes. Plusieurs activateurs de la GJIC ont été rapportés ; toutefois,

un médicament efficace ciblant les jonctions GAP n'est pas disponible sur le

marché à l'heure actuelle. L'objectif de cette étude était de synthétiser de petites

molécules qui activent spécifiquement l'activité GJIC et inhibent la croissance des

cellules cancéreuses. Une deuxième génération de quinoléines substituées a été

conçue et son activation de l'activité des jonctions GAP et sa capacité à entrainer

la mort de cellules de cancer du sein humain ont été démontrées. L'effet des PQ7

171

sur l'activité GJIC dans les cellules de cancer du sein T47D a été testé. Les

résultats ont démontré que 500 nM de PQ7 entrainaient une augmentation

significative de l'activité des jonctions GAP par rapport aux témoins, sans

traitement PQ7, en utilisant le test de transfert de colorant (Fig. 40A). La distance

de transfert de colorant entre la section de coupe et les cellules contenant le

colorant les plus éloignées a été mesurée. Une présentation graphique de trois

expériences indique que 500 nM de PQ7 provoquent une augmentation d'un

facteur 16 de la distance de transfert du colorant par rapport au contrôle (Fig.

40B). Auparavant, il a été démontré que les cellules épithéliales mammaires

normales (CEM) présentent une absorption uniforme du colorant Lucifer yellow

(202). Ceci est dû à la forte activité des jonctions GAP existant dans ces cellules

normales. Ces résultats ont démontré que les PQ7 sont suffisantes pour

provoquer une augmentation de l'activité GJIC dans le test SL / DT.

Fig. 40 : Activité des jonctions GAP. A. Traitement

pendant 24h avec différentes concentrations de PQ7.

Lignes rouges : sections initiales (rhodamine-

dextran). Fluorescence verte : passage du colorant

depuis la ligne de section. B. Distance de transfert (3

réplicas)

172

Divers oncogènes (par exemple ras, raf, neu, src, mos) régulent à la baisse

la GJIC, tandis que plusieurs gènes suppresseurs de tumeur peuvent réguler à la

hausse la GJIC. Ainsi, l'effet de l'activité régulée à la hausse par les PQ7 des

jonctions communicantes sur la formation et la croissance de colonies de cellules

T47D a été examiné. Les cellules ont été cultivées dans de la gélose molle pour

évaluer leur capacité de croissance indépendante d'ancrage, ce qui est une

caractéristique clef de la transformation des cellules en raison de l'importance des

interactions cellule-cellule et cellule-matrice pour la suppression tumorale. Les

cellules T47D ont été traitées avec 0, 10, 100 et 1000 nM de PQ7 pendant 7 jours.

Une présentation graphique des trois résultats de l'expérience est présentée avec

une échelle logarithmique de concentrations de PQ7. L'effet des PQ7 sur les

cellules T47D s'est avéré être une inhibition significative de la croissance des

colonies de cellules T47D par rapport au témoin (Fig. 41). Les PQ7 à 100 nM ont

inhibé de 50% la croissance des colonies par rapport aux témoins sans traitement.

Fait intéressant, la même concentration (100 nM de PQ7) n'a eu aucun effet sur

les CEM (données non présentées). Ceci suggère que 100 nM de PQ7 peuvent

provoquer une augmentation de l'activité GJIC et par la suite peuvent réduire la

croissance des colonies de cellules T47D. En outre, la viabilité cellulaire des

cellules T47D a également été testée (Fig. 42). A 100 nM pendant 48 heures, les

PQ7 réduisent la croissance des cellules T47D de 94%. Cela confirme l'idée que

les monocouches de cellules ont plus de surface exposée pour la prise du

traitement.

Fig. 41 : Formation de colonies sur gélose molle

après 14 jours à 37°C en présence de différentes

concentrations de PQ7. C = contrôle. * = p<0,0.5.

Fig. 42 : Effet des PQ7 sur la viabilité cellulaire. 1x104

cellules ont été traitées avec différentes

concentrations de PQ7. * = p<0,05

173

Des extraits de cellules entières traitées à la PQ7 ont été analysés pour des

changements dans les protéines de jonctions GAP, connexines. Les cellules ont

été traitées avec 0, 10, 100, 200, 500 ou 1000 nM de PQ7 pendant 24 heures.

L'analyse Western blot a été réalisée contre Cx43 (Fig. 43). Un anticorps anti-

actine a été utilisé comme témoin de chargement. Les résultats montrent que les

PQ7 augmentent l'expression de Cx43 dans des cellules de cancer du sein T47D.

Ce résultat a été confirmé par microscopie confocale (données non présentées).

L'effet des PQ7 sur l'apoptose a été examiné en effectuant une analyse par

Western blot contre la caspase 9 (Fig. 44). Pour les traitements à 500 et 1000 nM,

les résultats ont montré une augmentation de l'expression de la caspase 9.

Fig. 43 : Effet des PQ7 sur l’expression de Cx43 dans

des cellules T47D après 24h de traitement.

Fig. 44 : Effet des PQ7 sur les caspases 9 activées

après 24h de traitement

L'effet anti-tumoral des PQ7 a également été observé avec l'utilisation d'un

modèle animal. Des souris nu / nu ont été implantées avec du 17β œstradiol (1,7

mg / pastille) avant l'injection sous-cutanée de 1 x 107 cellules T47D de cancer du

sein, dans la région du coussinet adipeux mammaire inguinal. Les résultats de

xénogreffes de tumeurs ont montré une diminution de la taille des tumeurs dans le

groupe traité aux PQ7 par rapport au témoin au jour 2. Les résultats ont montré

une diminution de 100% de la croissance tumorale après sept injections du

traitement PQ7 par rapport au témoin (Fig. 45). Les résultats détudes précédentes

in vivo (180) suggèrent que le composé PQ est éliminé du corps de la souris en

environ deux jours ; par conséquent, des injections du médicament ont été

effectuées tous les deux jours pour obtenir des résultats optimaux.

174

Fig. 45 : Croissance de xénogreffes de cellules T47D

chez des souris nu/nu préalablement traitées au 17β-

œstradiol (1,7 mg / pastille). Injection sous-cutanée de

1x107 cellules en région inguinale. Résultats après 14

jours de traitement (7 injections)

E/ Discussion et conclusion

Les effets anti-tumoraux de la première génération de quinoléines

substituées ont déjà été mis en évidence. Ces effets comprennent une

augmentation de l'activité GJIC, ainsi que l'atténuation de la croissance tumorale

de xénogreffes chez des souris nudes (202). Cette étude a démontré l'efficacité

d'une molécule de deuxième génération et le rôle de ces composés prometteurs

dans le traitement du cancer.

Il y a plus de 40 ans, la perte de GJIC a été décrite dans les cellules

cancéreuses et a conduit à l'hypothèse que les déficits de GJIC sont impliqués

dans la carcinogenèse (261). De nombreux rapports ont confirmé que les

jonctions GAP sont souvent réduites ou absentes dans les cellules cancéreuses.

Une co-culture de cellules tumorales avec des cellules normales, ou avec des

cellules sur-exprimant des connexines, conduit à un retard de la croissance

néoplasique par l'établissement d'une communication fonctionnelle comme

observé avec le transfert de colorant (261). Ce retard de croissance tumorale a

été empêché par la co-culture des cellules transformées avec des cellules

normales présentant des jonctions compétentes transfectées avec un réactif anti-

sens spécifique des connexines (262). Ainsi, ces résultats indiquent que des

signaux provenant de cellules normales adjacentes peuvent inverser le phénotype

malin et que leur incapacité à accomplir ceci est due à un manque de GJIC.

La relation entre la communication cellulaire et la croissance cellulaire a été

établie de telle sorte que la capacité des cellules à communiquer au travers des

jonctions GAP est négativement liée à leur activité de croissance. Dans cette

étude, il a été démontré que l'augmentation de l'activité GJIC dans les cellules

T47D pouvait provoquer une diminution de la croissance des cellules (Figures 40,

41 et 42). Saez et al. (263) ont également observé que l'augmentation de GJIC est

175

directement liée à l'effet anti-tumoral dans des lignées cellulaires de cancers

mammaires humains. Dans les tissus normaux, les jonctions communicantes sont

actives et bien régulées avec le cytoplasme des cellules voisines (264-266). Grâce

au passage de molécules de signalisation, la GJIC contribue à la régulation de la

prolifération cellulaire, de la différenciation, de la mort cellulaire, et au maintien de

l'homéostasie. De nombreuses études montrent clairement que l'altération de la

GJIC est impliquée dans la progression du cycle cellulaire. Dans la plupart des

types cellulaires, la GJIC est réduite à la fin des phases G1, S et M (205). L'état

spécifique du cycle cellulaire dans lequel la GJIC et/ou l'expression des

connexines sont modifiées, cependant, dépend à la fois du type cellulaire et de la

nature de la connexine à l'étude. Cette étude a apporté la preuve que la PQ7

augmentait l'expression de la Cx43 dans des cellules de cancer du sein humain

T47D (Figure 43). Cette information peut aider à expliquer l'augmentation

subséquente de la GJIC dans les cellules traitées avec PQ7.

Pour étudier l'effet de PQ7 chez les souris porteuses de tumeur, une étude

de xénogreffes de tumeurs formées de cellules T47D a été effectuée. Les

résultats ont montré une diminution de 100% de la croissance tumorale avec le

traitement à la PQ7 par rapport au témoin après sept injections (Figure 45),

fournissant ainsi la preuve que PQ7 a un effet anti-tumoral dans ce modèle

animal. Les données montrent clairement que PQ7 est un agent anticancéreux

efficace. Par rapport à la diminution de 70% dans une étude similaire utilisant des

quinoléines substituées de première génération (202), il est clair que la quinoléine

substituée PQ7 est une amélioration par rapport à la première génération de ces

composés.

En résumé, PQ7 améliore spécifiquement l'activité GJIC. Une augmentation

de l'activité GJIC induite par PQ7 provoque une diminution significative de la

croissance cellulaire des colonies. La diminution de la viabilité des cellules et de la

croissance des cellules des colonies peut être attribuée à l'apoptose induite par

PQ7 à la suite d'une régulation de la caspase-9 active. Le traitement par PQ7

conduit ensuite à une augmentation de l'expression de la Cx43 dans des cellules

de cancer du sein T47D, conduisant probablement à l'augmentation de la GJIC.

176

Dans l'ensemble, il est évident que la deuxième génération de quinoléines

substituées a un effet plus puissant sur la GJIC que la première génération de ces

composés. Par conséquent, cette deuxième génération a un rôle encore plus

prometteur dans le traitement du cancer du sein. Le mécanisme de mise en valeur

de la GJIC par des composés PQ est encore à l'étude.

177

IV/ Les activateurs des jonctions GAP augmentent l'efficacité

du cisplatine dans la réduction des tumeurs mammaires

Traduit de l'anglais Shishido SN, Nguyen TA (267)

A/ Résumé

Le traitement au cisplatine a un taux de réponse global de 19% dans des

modèles animaux de tumeurs malignes. L'augmentation de l'activité des jonctions

GAP dans les cellules tumorales est une cible pour améliorer les thérapies

antinéoplasiques. Nous avons montré auparavant qu'une nouvelle classe de

quinoléines substituées (PQs) agissait comme enhancer des jonctions GAP et

avait la capacité d'augmenter la communication intercellulaire au travers des

jonctions GAP dans les cellules des tumeurs mammaires. Nous avons examiné

l'effet d'un traitement combinant les PQ et les traitements antinéoplasiques actuels

dans un modèle animal, montrant une augmentation de l'efficacité de ces derniers

par l'amélioration des jonctions communicantes. Les souris ont été implantées

avec de l'estradiol-17ß (1,7 mg/pastille) avant injection de 16107 cellules T47D

(cancer du sein) en sous-cutanée, en région inguinale dans le coussinet adipeux

mammaire. Les animaux ont été traités par voie intrapéritonéale avec du DMSO

(témoin), du cisplatine (3,5 mg/kg), PQ (25 mg/kg), ou une combinaison de

cisplatine et PQ. Le cisplatine seul entraîne une diminution de la croissance de la

tumeur mammaire de 85% tandis que le traitement combinant cisplatine et PQ1 ou

PQ7 a montré une réduction supplémentaire de 77 % et 22% de la croissance

tumorale après sept traitements tous les 2 jours, respectivement. Les résultats

histologiques ont montré une augmentation significative des protéines des

jonctions GAP : Cx43 et Cx26, dans les tissus traités avec PQ comparés au

contrôle ou au traitement au cisplatine. En outre, la coloration des capases 3 dans

les tumeurs traitées par une combinaiseon PQ et cisplatine est augmentée par

rapport au traitement avec le cisplatine seul. Nous avons montré pour la première

fois une augmentation de l’efficacité des traitements antinéoplasiques par leur

association avec les PQ, une classe d'activateurs des jonctions GAP.

178

B/ Introduction

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez les femmes dans le

monde entier et la mortalité est causée par les métastases de la tumeur (268).

Des anomalies dans les cellules néoplasiques, telles que l'excès de prolifération,

l'invasion et les métastases, ont un rôle crucial dans la perte de l'homéostasie

tissulaire (264, 265, 269). Les jonctions GAP sont les seuls jonctions

communiquantes trouvées dans les tissus animaux, dans toutes les espèces,

responsables du passage direct des ions et des molécules de poids moléculaire

inférieur à 1200 daltons (3). Les jonctions GAP connectent directement les

cytoplasmes de cellules voisines, afin de permettre le passage de molécules de

signalisation intercellulaires et les régulateurs homéostatiques tels que les signaux

anti-apoptotiques et les facteurs de croissance. Les jonctions intercellulaires sont

importantes dans le maintien de l'homéostasie cellulaire, la différenciation

cellulaire, et la mort cellulaire. Une des caractéristiques principales de la

formation de cancer est la perte de communication intercellulaire au travers des

jonctions GAP (GJIC) par la diminution de l'expression ou l'absence de jonctions

GAP (2).

La restauration de GJIC dans les cellules tumorales est une approche

permettant d'augmenter la propagation de médicaments cytotoxiques et, par suite,

d'améliorer la chimiothérapie. L'utilisation d'un enhancer des jonctions GAP peut

potentialiser l'effet de voisinage de composés cytotoxiques, tels que le cisplatine

et le paclitaxel. Récemment, une nouvelle classe de quinoléines substituées (PQs)

a été synthétisée et s'est révélée posséder une activité inhibitrice puissante contre

les cellules de cancer du sein T47D (valeur de CI50 de 16 nM pour PQ7 et 119

nM pour PQ1) par le renforcement des GJIC (180, 202). PQ7 a la capacité de

renforcer la GJIC entre les cellules néoplasiques en augmentant l'expression de

connexines 43 (Cx43) (242). De plus, in vivo, le traitement PQ7 sur des souris

nudes ayant subit des xénogreffes de T47D a montré une diminution de 100% de

la croissance tumorale après sept injections intrapéritonéales (242). Cet agent est

capable de normaliser la GJIC et a des propriétés de prévention de la

carcinogénèse.

179

Le cisplatine est un des agents de chimiothérapie les plus largement

utilisés en clinique mais l'insuffisance rénale est un problème commun chez les

patients. La néphrotoxicité du cisplatine est dose-dépendante et ainsi la dose qu'il

est possible d'utiliser est limitée (270). Le principal mécanisme de toxicité du

cisplatine est par l'intermédiaire de la formation d'adduits platine-ADN qui

induisent un arrêt du cycle cellulaire (271, 272). Les autres principaux

mécanismes d'action comprennent une protéine de réticulation de l'ADN, la

production de dérivés réactifs de l'oxygène (DRO) qui entraînent un stress oxydatif

(273), et une voie cellulaire interdépendante médiée par les jonctions GAP (274).

La voie cellulaire interdépendante de la toxicité du cisplatine requiert une protéine

kinase ADN-dépendante (PK) de signalisation ainsi qu'une communication

intercellulaire par les jonctions GAP efficace (274). He et al. (275) ont montré que

les jonctions GAP composée de Cx32 sont des éléments nécessaires de toxicité,

ce qui suggère que les cellules doivent être compétentes pour la GJIC. Les

dommages engendrés par le cisplatine dans une cellule déclenchent un signal

DNA-PK dépendant transmis par GJIC aux cellules voisines. Jensen et Glazer

(274) ont montré qu'en inhibant la GJIC au lindane, les fibroblastes embryonnaires

de souris (MEF) immortalisés sont protégés contre la toxicité du cisplatine, alors

qu'en augmentant la GJIC par transfection de cellules MCF-7 du cancer du sein

avec des Cx43 entrainait une sensibilité accrue au traitement. L'induction de

l'apoptose/nécrose par le cisplatine dans une cellule peut provoquer un "signal de

mort" qui est transmis aux cellules voisines à travers des jonctions communicantes.

L'augmentation de l'activité des jonctions GAP ou l'amélioration de la GJIC

dans les cellules tumorales fournissent les cibles pour l'amélioration des thérapies

antinéoplasiques. Tanaka et Grossman (276) ont démontré que la transfection de

cellules de cancer de la vessie humaines avec des Cx26 pouvait empêcher la

formation de tumeurs. En association avec le cisplatine, une augmentation de la

GJIC promeut apoptose, arrêt du cycle cellulaire et diminution de BCL-2 (276).

Une nouvelle classe de quinoléines substituées (PQs) possède une activité

inhibitrice contre les cellules cancéreuses du sein grâce à l'amélioration de la

GJIC. L'objectif de cette étude était d'examiner l'effet du traitement combinant PQ

et traitements antinéoplasiques dans un modèle xénogreffe de tumeur, montrant

180

une augmentation de l'efficacité du traitement antinéoplasique cisplatine (cis-

diamminedichloroplatine), via l'amélioration des jonctions communicantes.


i/ Déclaration éthique

L'élevage des animaux est effectué par le Groupe de médicine comparée

(CMG) au Collège de médecine vétérinaire de l'Université d'État du Kansas. Les

animaleries du CMG sont entièrement accréditées par l'association internationale

pour l’évaluation et l’accréditation du traitement des animaux de laboratoire

(AAALAC). La conformité de certains aspects de la protection des animaux est

contrôlée régulièrement par le personnel vétérinaire. Les protocoles de soins aux

animaux et leur utilisation ont été approuvés par le Comité institutionnel de

protection et d'utilisation des animaux (IACUC) à l'Université d'État du Kansas,

Manhattan (Numéro de protocole : 2985), suivant les directives du NIH.

ii/ Composés

Les composés PQ1, 6-Methoxy-8-[(3-aminopropyl) amino]-4-methyl-5-(3-

trifluoromethyl-phenyloxy) quinoléines, et PQ7, 6-méthoxy-8-[(2-furanylméthyle)

amino]-4-méthyl-5-(3-trifluoro-methylphenyloxy) quinoléine, ont été gracieusement

fourni par le Dr Duy H. Hua (Kansas State University, Manhattan, KS). Le

cisplatine, cis-diamminedichloroplatine (II), a été acquis auprès de Sigma Aldrich

(St. Louis, MO).

iii/ Lignées cellulaires et culture cellulaire

La lignée cellulaire de cancer du sein humain T47D a été achetée auprès

de l'American Type Cell Culture (ATCC, Manassas, VA). Les cellules ont été

cultivées dans du milieu RPMI supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal

181

(Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA) à 37°C avec 5% de CO2 dans des

flasques T- 125 cm2.

iv/ Xénogreffe de cellules tumorales T47D chez la souris nude

Les souris nu/nu ont été commandées auprès de Charles River

Laboratories International (Wilmington, MA, USA) et implantées avec du 17-b-

estradiol (1,7 mg/pastille, Innovative Research of America, Sarasota, FL) avant

l'injection de 16107 cellules cancéreuses T47D par voie sous-cutanée, en région

inguinale, dans le coussinet adipeux mammaire. La viabilité cellulaire des cellules

T47D a été évaluée avant l'injection. La taille des tumeurs a été mesurée en deux

dimensions avec des pieds à coulisse tous les 2 jours en commençant au jour 7.

Les souris ont été observées pour un changement de comportement, l'aspect et le

poids. Lorsque les tumeurs ont atteint 0,50 mm3, six animaux ont été assignés au

hasard à chaque groupe de traitement. Les souris ont reçu 25 mg/kg de PQ1 ou

PQ7 dans du sel d'acide succinique, 3,5 mg/kg de cisplatine, ou une combinaison

de cisplatine et de PQ par injection intrapéritonéale de 100 mL. Les composés ont

été dissous dans du DMSO, qui a été utilisé en tant que contrôle en utilisant le

même volume.

v/ Analyse Western blot

Le tissu a été récolté à partir des souris et des extractions de cellules

entières effectuées en utilisant un tampon de lyse (20 mM Tris pH 7,5, EDTA 0,5

mM, EGTA 0,5 mM et 0,5 % de Triton X-100) un inhibiteur de protéase dilué à

1:1000 (Sigma- Aldrich, Saint Louis, M, USA). Le tissu a été homogénéisé par

l'intermédiaire de l'OMNI Bead Ruptor 24 à une vitesse de 5,65 m/s pendant 45

secondes, suivi par une centrifugation à 13 000 rpm pendant 30 minutes à 4°C. 25

mg d'extrait de cellules entières ont été résolus par électrophorèse sur gel SDS-

PAGE à10% et transférés sur une membrane de nitrocellulose (Midwest

scientifique, Saint Louis, MO, USA). La membrane de nitrocellulose a été bloquée

dans 5% de lait pendant une heure à température ambiante puis mis à incuber

avec des anticorps monoclonaux dirigés contre Cx43, Cx32, Cx26 , caspase 3,

182

caspase 8, et caspase 9 (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, USA) et

actine (Sigma-Aldrich) à une dilution de 1:1000. Les transferts ont été détectés par

des réactifs de détection par chimioluminescence amplifiée (Pierce, Rockford,

Illinois, Etats-Unis) et visualisés par Fluorochem E système d'imagerie.

vi/ Immunohistochimie

Toutes les tumeurs ont été prélevées et fixées dans une solution de

formaldéhyde à 10% et incorporées dans de la paraffine préalablement à leur

sectionnement sur des lames à une épaisseur de 5 mm. Des sections de paraffine

(5 mm) ont été séchées à 60°C pendant 25 minutes. Le déparaffinage a été

réalisé avec 100 % de xylène et 100 %, 90%, 75%, 50 % d'éthanol. L'antigène

extraction a été effectuée dans une solution tampon de citrate et de la vapeur. Les

lames ont été ensuite incubées pendant une nuit à température ambiante avec un

anticorps polyclonal (dilution 1:50). Les anticorps comprennent : connexines 43,

32, 26 ; caspases 3, 8, 9 ; survivine ; Cycline D1 ; Ki- 67 et Mig (Santa Cruz

Biotechnologies, Santa Cruz, Californie, États-Unis). Après lavages dans plusieurs

bains de PBS, les lames ont été incubées avec des anticorps secondaires

biotinylés (1:1000) pendant 15 minutes. Les lames ont été lavées et les

immunomarquages ont été amplifiés par incubation avec du complexe avidine

biotine (ABC) pendant 10 minutes. Les cellules ont été visualisées avec de la 3,3-

diaminobenzidine (DAB) suivie d'une contre-coloration hemalun-eosine. Les

sections ont été observées et les images capturées avec un microscope Nikon 80i

sous un grossissement 40x et 60x.

vii/ Analyse statistique

La signification statistique a été examinée avec une p-value de 0,05 en

utilisant l'analyse t- test de Student. Toutes les données sont présentées en tant

que moyennes pour l'intervalle de confiance de 95 % d'au moins trois expériences

indépendantes.

183

D/ Résultats

i/ Croissance de xénogreffes de cellules tumorales T47D chez la souris nude

Les souris ont été implantées avec le 17ß -estradiol (1,7 mg/pastille) avant

injection de 16 107 cellules T47D (cancer du sein) par voie sous-cutanée en

région inguinale dans le coussinet adipeux mammaire. Sept jours après l'injection

des cellules, les animaux ont été répartis au hasard dans chaque groupe de

traitement. Les animaux ont été traités par voie intrapéritonéale avec du DMSO en

tant que témoin (solvant du médicament), du cisplatine, PQ1, PQ7, ou une

combinaison de cisplatine et PQ dans un volume total de 100 ml. Tous les

traitements ont réduit significativement la taille de la tumeur (Fig. 46) par rapport

au témoin. Le cisplatine seul a entrainé une diminution de la croissance de la

tumeur mammaire de 85% tandis que le traitement combinant cisplatine et PQ1 a

montré une réduction supplémentaire de 77% après sept traitements tous les 2

jours (p-value de 0,012). PQ1 diminue davantage la croissance de la tumeur de

97% au bout de sept injections par rapport au traitement au cisplatine seul avec

une p-value de 0,001. Les données démontrent que PQ7 seul et en combinaison

avec le cisplatine a réduit significativement les tumeurs de xénogreffes de T47D

par rapport au témoin (p-value 0,001). Avec PQ7 seul, il y avait une réduction de

19% supplémentaire de la taille de la tumeur par rapport au cisplatine. Le

traitement combinatoire avec le cisplatine a encore diminué la taille de la tumeur

T47D par 77 % et 22 % pour PQ1 (p-value : 0.028) et PQ7, respectivement, par

rapport au cisplatine seul. Le traitement combinant le cisplatine avec PQ a montré

une plus grande réduction du

volume de la tumeur par rapport au

cisplatine seul.

Fig. 46 : Croissance de xénogreffes chez la

souris nude. Résultats après 7 injections

intra-péritonéales de DMSO, cisplatine (3.5

mg/kg), PQ7 (25 mg/kg) ou une association

de cisplatine et PQ7.

184

ii/ Expression de protéines des xénogreffes

Fig. 47 : Immunohistochimie sur des tumeurs de xénogreffes de cellules T47D. A. Magnification

x40 B, C et D. Magnification x60

185

Les modifications morphologiques sont la base pour le diagnostic de cancer

contemporain. La coloration à l'hémalun éosine (H&E) une morphologie

consistente de toutes les xénogreffes en dépit du traitement reçu (Fig. 47A). Les

sections de tumeurs ont montré un nid solide de cellules tumorales à

prédominance mal différenciées avec de grands noyaux irréguliers, chromatine

granulaire grossière, nucléoles proéminents, et activité mitotique élevée. Les

cellules néoplasiques étaient plus grandes que l'épithélium normal avec une

morphologie épithélioïde caractéristique et pléomorphisme nucléaire marqué.

L'histologie ne montre pas de caractéristiques importantes d'apoptose ou de

nécrose pour aucun des groupes de traitement.

Les cellules adjacentes sont en mesure d'échanger des régulateurs

d'homéostasie tels que des signaux anti-croissance et des facteurs apoptotiques,

par la voie des jonctions GAP hydrophiles. Chaque jonction GAP est constituée de

deux hémi-canaux (connexons) qui sont incorporés dans la membrane plasmique.

Ces connexons sont formés par six protéines de connexines (265), dont on

dénombre 21 différents gènes humains identifiés (277). Seules trois protéines de

connexine sont exprimées dans le tissu du sein humain : Cx43, Cx32 et Cx26

(278). L'analyse immunoblot et l'immunohistochimie ont été menées sur les

xénogreffes de tumeurs T47D de souris récoltés après 7 injections intra-

péritonéales de DMSO, cisplatine, PQ1, PQ7, ou un traitement associant du

cisplatine et PQ. Les tumeurs traitées avec PQ seuls et en combinaison ont

montré une augmentation des protéines des jonctions GAP (connexines 43, 32 et

26), par rapport aux témoins et aux tumeurs traitées au cisplatine seul (Figure 2B).

Le traitement au cisplatine a diminué l'expression des Cx43 par rapport au témoin

(Figure 47B). L'analyse Western blot des homogénats de tumeur des souris

traitées a montré que PQ1 a augmenté de manière significative l'expression de

Cx43 dans des xénogreffes T47D par un facteur de 3,9 par rapport au témoin (p-

value = 0,003) et 4,9 par rapport au cisplatine (p-value : 0,007) (Figure 48A).

186

Fig. 48 : Expression protéique dans des tumeurs de xénogreffes de cellules T47D. En gras :

p<0,05 par rapport au control ou au traitement au cisplatine.

La voie de signalisation apoptotique induite par le traitement est déterminée

par analyse de l'expression de la caspase. Deux grandes voies de signalisation

conduisent à l'apoptose. L'une est la libération mitochondriale d'effecteurs pro-

187

apoptotiques tels que les caspases-9, ce qui conduit à l'apoptose caspase-

dépendante ou indépendante (279). L'autre implique l'interaction des récepteurs

de mort cellulaire avec des protéases associées et l'activation des caspases-8

(280). Les données indiquent qu'il ya une augmentation de la densité de coloration

des protéines apoptotiques (caspase-3, -8 et -9) avec le traitement PQ en

comparaison du contrôle et du cisplatine seul (Figure 48C), ce qui est confirmé par

analyse par Western blot (Figure 48B). Le traitement au cisplatine a augmenté

l'expression des capases-9 d'un facteur 3,76 (p-value : 0,007) et des caspases-3

d'un facteur 2,7 (p-value : 0,0004) dans les xénogreffes T47D par rapport au

témoin (Figure 3B). Le traitement PQ1 a augmenté l'expression des caspases-3, -

8, -9 dans les tumeurs par rapport au contrôle par un facteur 5.4 (p-value : 0,0001),

2,0 (p-value : 0,003) et 1,6 respectivement. Comparativement au traitement

cisplatine, PQ1 a augmenté l'expression des caspases-3 d'un facteur 2,0 (p-value :

0,0007). PQ7 a également augmenté l'expression des caspases-3, - 8 et -9 par

rapport au témoin d'un facteur 1,6 (p-value : 0,015), 2,8 et 3,8 (p-value : 0,001)

respectivement. Ceci suggère que PQ régulent positivement l'expression de

molécules de signalisation apoptotique entrainant une augmentation de la mort

cellulaire. Le traitement combinant PQ et cisplatine n'a pas augmenté

significativement l'expressiona des caspases-3 ou -9 par rapport au cisplatine seul.

L'expression des caspases-8 était significativement augmenté avec le traitement

combinant PQ et cisplatine par un facteur 2,6 (p-value : 0,02) et 2,2 (p-value : 0,01)

pour les associations avec PQ1 et PQ7, respectivement. Il existe une

augmentation significative de l'apoptose dans les cellules traitées avec PQ7 par

rapport à celles traitées avec le cisplatine seul, mais la taille des tumeurs entre les

groupes ne sont pas significativement différentes.

Des protéines qui inhibent l'apoptose assurent la protection des cellules

tumorales contre des composés cytotoxiques. La survivine est un membre de la

famille des inhibiteurs de l'apoptose qui est exprimée au cours de l'embryogenèse

et dans les cellules tumorales en tant que protéine anti-apoptotique qui est

capable de réguler la mitose (281-283). La survivine est fortement exprimée dans

une variété de tumeurs et son expression est corrélée avec une rechute accélérée

et la résistance à la chimiothérapie (284). Les tumeurs de xénogreffe T47D ont été

isolées après le traitement pour déterminer l'expression de la survivine. Toutes les

188

tumeurs qui ont reçu le traitement montrent une coloration immunohistochimique

intense pour la survivine mais l'expression nétait pas uniforme dans le tissu

comme pour le contrôle (Fig. 47D). L'analyse par Western blot des tumeurs

indique que le traitement au cisplatine a réduit de manière significative

l'expression de la survivine par rapport au témoin 1,4 fois (p-value : 0,02 ; Fig.

48C). Le traitement PQ1 a augmenté l'expression de la survivine d'un facteur 2,1

(p-value : 0,04) par rapport au cisplatine. PQ7 a montré une augmentation d'un

facteur 0,36 dans l'expression de la survivine par rapport au témoin (p-value :

0,006) et une augmentation d'un facteur 2,25 par rapport au traitement au

cisplatine (p-value : 0,0045).

La prolifération cellulaire a été évaluée avec les biomarqueurs Ki-67 et

cycline D1. Ki- 67 se trouve dans les cellules se divisant rapidement et est utilisé

pour déterminer la vitesse de prolifération cellulaire. La cycline D1 est un

régulateur clé du cycle cellulaire dont la surexpression entraine une progression

rapide de la phase G1 à la phase S de la mitose (285). Toutes les tumeurs isolées

qui ont été traitées ont montré une diminution de l'expression de Ki- 67 par

immunohistochimie (Fig. 47D). Les tumeurs traitées ont moins de cellules

exprimant le Ki- 67 mais les cellules qui expriment cette protéine présentent une

régulation à la hausse par rapport au témoin. L'expression de la cycline D1 dans

les xénogreffes T47D a été significativement plus faible avec le traitement PQ par

rapport au contrôle par un facteur 1,5 (p-value : 0,0007) et 0,46 (p-value : 0,008)

pour PQ1 et PQ7 respectivement (Fig. 47D et 48C). Ceci indique que le traitement

PQ régule à la baisse l'expression de protéines de prolifération Ki-67 et cycline D1

dans les xénogreffes.

iii/ Étude histologique des organes métaboliques

L'examen histologique des reins et du foie chez des souris ayant subi une

xénogreffe n'a montré aucune différence significative de la morphologie en raison

du traitement reçu. Pour déterminer s'il y avait un changement dans l'expression

des protéines des organes métaboliques, une analyse par immunoblot et

immunohistochimie a été réalisée. Dans les reins, on a observé une augmentation

de l'expression de Cx43 et une diminution de l'expression de la survivine suite au

189

traitement PQ (Fig. 49A). L'expression des caspases-3 était augmentée après le

traitement par le cisplatine, ce qui n'est pas surprenant étant donné que la

néphrotoxicité est commune suite à un traitement au cisplatine. Le rein a montré

une diminution de l'expression des caspases 3 par traitement PQ1. Le foie a

montré une augmentation de l'expression de la caspase-3 par traitement par le

cisplatine (Fig. 49B), suggérant la possibilité d'une hépatotoxicité induite par le

cisplatine. Le traitement PQ en association avec le cisplatine a semblé diminuer

l'expression des caspases-3 comparativement au cisplatine seul. Une

augmentation supplémentaire dans l'expression de la survivine due au traitement

PQ a été observé mais pas de différence significative de l'expression des Cx43

dans le foie entre les différents groupes de traitement.

Les lymphokines induites par l'interféron-gamma (LIG) sont utilisées

comme biomarqueur pour la signalisation inflammatoire, ce qui indique la

cytotoxicité due au traitement. La libération accrue de chimiokines CXC cible les

lymphocytes T activés, ce qui provoque une augmentation des concentrations

intracellulaires d'ions de calcium et le chimiotactisme (286). Les reins isolés à

partir d'animaux traités au cisplatine ont montré une augmentation de l'expression

de LIG (Fig. 49A). Les associations de cisplatine et PQ ont montré moins de

coloration que le cisplatine seul alors que le traitement aux PQ montre de faibles

niveaux d'expression de LIG. Le foie a révélé un schéma de coloration similaire

pour l'expression de LIG avec chaque traitement (Fig. 49B). La diminution de

l'expression de LIG suggère que PQ peut fournir une protection contre la réponse

inflammatoire du traitement par le cisplatine. Pour déterminer si la GJIC normale

de divers organes a été potentiellement affectée par le traitement, l'expression de

Cx43 a été observée. L'utérus, le cœur et le cerveau n'ont montré aucun

changement dans l'expression de Cx43 avec aucun des traitements (Fig. 50). Il n'y

a pas d'effet délétère observable successif à l'augmentation de l'expression des

connexines dans les cellules du foie et des reins. D'autres études doivent être

menées pour déterminer les effets de cette réponse.

190

Fig. 49 : Immunohistochimie des organes métaboliques. MIG = monokine induced by IFN-gamma.

A. Reins. B. Foie. Organes prélevés après 7 injections intra-péritonéales. Magnification x60

191

Fig. 50 : Expression de la Cx43 dans des organes prélevés sur des souris nude après 7 injections

intra-péritonéales. Magnification x40

E/ Discussion

Dans cette étude, on a utilisé des xénogreffes de cellules T47D afin de

déterminer les effets du traitement combinant cisplatine et enhancers des

jonctions GAP, PQs, chez des souris porteuses de tumeurs. Les résultats ont

montré une diminution de la croissance tumorale avec le traitement PQ, à la fois

seuls et en association avec le cisplatine, par rapport au témoin au bout de sept

injections (Figure 46). L'association cisplatine et PQ1 a significativement réduit la

taille des tumeurs par rapport au cisplatine seul, ce qui prouve que PQ1 peut

augmenter l'efficacité des médicaments anti-néoplasiques dans ce modèle animal.

Auparavant, PQ7 a démontré sa capacité à augmenter la GJIC par une

augmentation de l'expression des connexines 43 (242). Ici, nous montrons une

expression accrue des connexines 43, 32 et 26, ce qui suggère une augmentation

subséquente de la communication cellule-cellule qui permettrait une circulation

plus efficace du cisplatine. L'expression des protéines dans les coupes de tissus

indique que la connexine 43 est régulée par le traitement PQ. Les résultats

confirment les données antérieures (287) : la cytotoxicité du cisplatine dépend de

la GJIC. Il existe une augmentation de la réponse médiée par le cisplatine avec

l'amélioration de la GJIC.

192

La diminution de la taille des tumeurs observée avec le traitement PQ peut

être attribuée à une augmentation de l'apoptose à la suite d'une régulation à la

hausse des caspases- 3, caspases-8 et caspases-9 (Figure 47B). L'analyse

Western blot a montré une augmentation significative de l'expression des

caspases-3 dans les tumeurs traitées au PQ1 par rapport au témoin (Figure 48).

Ces résultats suggèrent que PQ1 et PQ7 sont des agents anticancéreux. Le

traitement au cisplatine n'a pas réguleé à la hausse l'expression des caspases-8

dans la mesure où l'apoptose induite par le cisplatine est régulée par les

caspases-9 (288). De plus, l'expression des caspases n'a pas été diminuée suite

au traitement au cisplatine, ce qui indique qu'il n'y a pas de résistance au

cisplatine observée au sein des tumeurs induites par xénogreffes de cellules T47D.

L'expression des caspases-8 dans les tumeurs T47D de souris traitées au PQ

montre une augmentation de l'apoptose par induction des voies de signalisation

des caspases 8 et 9 par rapport au cisplatine et au contrôle.

L'apoptose est reconnue comme l’un des principaux modes d'induction de

mort cellulaire par le cisplatine. À partir des résultats histologiques, on observe

une augmentation significative de l'apoptose dans les cellules traitées aux PQ par

rapport à celles traitées avec le cisplatine seul. Les tailles des tumeurs traitées au

cisplatine seul, PQ7 seul et l'association cisplatine et PQ7 ne sont pas

significativement différentes en dépit des différences dans l'expression des

caspases. Le processus d'apoptose produit plusieurs populations distinctes de

cellules à différents stades : du stade précoce au stade de nécrose secondaire

(289, 290). Par conséquent, la différence de taille des tumeurs peut être dûe à une

évacuationt insuffisante au cours de la période de 14 jours. Il a été démontré

précédemment que les jonctions GAP induisaient une mort cellulaire synchrone

des cellules couplées (291), ce qui suggère que les PQ affectent la mort cellulaire

par augmentation de l'expression des connexines et, indirectement, par induction

des deux voies de l'apoptose par le biais d'une augmentation de l'expression des

caspases.

L'analyse Western blot a montré une expression fortement variable des

protéines avec des homogénats d'organes entiers, probablement en raison de la

présence de plusieurs types de tissus dans chaque organe. Kadle et al. (292) ont

montré que les différentes formes de Cx43 ont une distribution tissu-spécifique, ce

193

qui suggère des différences importantes dans l'expression des protéines à 'échelle

des tissus. Plus de données sur la distribution tissu-spécifique de protéines, en

particulier des connexines, sont nécessaires pour déterminer avec précision les

effets de l'utilisation d'un enhancer des jonctions GAP.

Le traitement associant cisplatine et PQ n'était pas significativement

différent des PQ seules. Wang et al. (287) ont démontré que des concentrations

élevées de cisplatine inhibent fortement la GJIC par des interactions directes avec

les connexines et par une réduction indirecte de l'expression des connexines. Le

cisplatine peut donc agir comme un compétiteur des enhancers des jonctions GAP.

Il est possible que PQ7 n'ait pas augmenté de manière significative l'efficacité du

cisplatine dans le traitement combinatoire en raison de la compétition directe entre

les composés lorsqu'ils ciblent les jonctions communicantes. Le cisplatine a

montré une inhibition pour les hémicanaux formés d'hétéromères de façon

concentration dépendante (287), ce qui est supporté par les données

immunohistochimiques et immunoblot des Cx32 et Cx26 (diminution de

l'expression). Le cisplatine induit un ''signal de mort'' transmis aux cellules voisines

via GJIC (274). L'amélioration de la GJIC peut permettre la transmission de ce

"signal de mort" plus efficacement entre les cellules. Peterson - Roth et al. (293)

ont montré que le niveau de Cx43 exprimées dans une cellule cancéreuse module

la réponse cellule-cellule médiée par le cisplatine. La surexpression et l'activation

de la tyrosine kinase src sont observées en clinique dans de nombreux types de

cancer traités au cisplatine (294-296). Les oncoprotéines telles que src,

promeuvent la croissance et la survie cellulaire lors de l'exposition à des agents

cytotoxiques (297-299), protégeant ainsi les cellules cancéreuses des agents de

chimiothérapie. Le cisplatine induit spécifiquement Src à phosphoryler les résidus

tyrosines des Cx43, diminuee la GJIC, et augmenter la survie des cellules ;

élevant ainsi la survie des cellules voisines en perturbant la transmission du

"signal de mort" via la GJIC (293). L'amélioration de la GJIC avec les PQ peut

contrer les effets de src dans les cellules cancéreuses at ainsi augmenter

l'efficacité du cisplatine en améliorant la transmission du "signal de mort". Il est

largement accepté que les cellules cancéreuses sont déficientes en GJIC et/ou

connexines et le fait que le cisplatine inhibe la GJIC peut contribuer au

développement de tumeurs résistantes au cisplatine. Le développement de

194

médicaments et de méthodes qui peuvent améliorer ou restaurer la GJIC peut être

une nouvelle façon efficace pour améliorer les méthodes de chimiothérapie et de

radiothérapie, également dépendante de la GJIC (291).

L'insuffisance rénale chez les patients atteints de cancer est un problème

commun. La néphrotoxicité du cisplatine est clairement dose-dépendante et

augmente avec la fréquence d'administration et la dose cumulative (300).

L'augmentation de la communication cellule-cellule présentée par les cellules

tumorales est observée dans le rein et le foie mais pas dans les autres organes

vitaux. Il n'y a pas d'anomalie morphologique ou moléculaire observabls en raison

de l'augmentation de l'expression des connexines. Le traitement au cisplatine seul

induit une augmentation des caspases et de l'expression des LIG, ce qui n'est pas

le cas du traitement aux PQ (Figure 50). Le traitement combinatoire réalisé dans

cette étude montre que les PQ peuvent être utilisées pour diminuer la cytotoxicité

du cisplatine. Ceci fournit la possibilité d'un nouveau traitement combinatoire

contre le cancer du sein utilisant du cisplatine à une dose réduite pour éviter la

toxicité rénale. Les données de cette étude conduisent à l'idée que les PQ, à des

concentrations inférieures à celles requises pour des effets anticancéreux,

peuvent améliorer l'efficacité des agents de chimiothérapie, permettant l'utilisation

de concentrations plus faibles de médicament, ce qui diminue l'étendue des effets

secondaires néfastes en raison de la cytotoxicité des composés.

Les enhancers des jonctions GAP s'avèrent accélérer la mort cellulaire par

apoptose dans les cellules tumorales du cancer du sein tout en augmentant

l'expression des connexines. Ceci est prometteur pour l'utilisation des PQs pour le

transfert d'effets toxiques médié par les jonctions GAP. La diminution de la

distribution de la survivine dans les cellules tumorales traitées aux PQs indique

aussi un bon pronostic pour les patients après le traitement dans la mesure où la

survivine est fortement exprimée dans une gamme de tumeurs humaines et son

expression est directement corrélée avec, à la fois une rechute accélérée et une

résistance à la chimiothérapie (284). Les études futures se concentreront sur la

potentialisation d'autres médicaments antinéoplasiques grâce à l'amélioration de

l'activité des jonctions GAP, ainsi que sur l'allongement de la période de traitement

à 21 ou 28 jours et l'observation d'une potentielle réapparition de tumeurs après

rémission.

195

L'effet suppresseur de croissance des PQs a déjà été établi dans plusieurs

lignées cellulaires de cancer du sein (202, 242). Les effets antitumoraux des PQs

sur des xénogreffes de cancer du sein en association avec des agents

antinéoplasiques chez des souris nude montrent des résultats encourageants,

démontrant que les PQs seules peuvent atténuer la croissance des tumeurs.

L'augmentation de l'efficacité du cisplatine par les PQs n'est pas additive en raison

de l'effet significatif des PQs sur la croissance de la tumeur. Il est intéressant de

noter que le cisplatine diminue la communication cellulaire pour antagoniser

l'expression des connexines et les PQs. Le traitement combinant PQs et

médicaments antinéoplasiques est un traitement prometteur contre le cancer du

sein, qui montre que l'efficacité de composés anti-néoplasiques peut être accrue

par la stimulation des jonctions communicantes. Les résultast de notre étude ont

introduits une nouvelle classe de médicaments anticancéreux, améliorant le

traitement actuel du cancer du sein.

197

V/ Traitement combinatoire avec l'activateur des jonctions

GAP et le tamoxifène dans des cellules de cancer du sein

Traduit de l'anglais Shishido SN, Nguyen TA (301)

A/ Résumé

Le tamoxifène est un médicament de choix pour les patients atteints de

tumeurs du sein répondant au système endocrinien. Cependant, la résistance au

tamoxifène est devenue une préoccupation majeure pour le traitement du cancer

du sein. Des thérapies combinant le tamoxifène et différents médicaments sont

fréquemment étudiées. Dans cette étude, nous avons testé l'efficacité de

quinoléines substituées (nom de code = PQ1, un activateur des jonctions GAP) en

association avec le tamoxifène dans les cellules T47D. Un test de croissance

cellulaire a été réalisé en utilisant de la gélose molle pour mesurer la croissance

des colonies, tandis que la prolifération cellulaire a été mesurée par le test MTT

dans les cellules T47D. Les niveaux de Ki67, survivine et BAX ont été mesurés en

utilisant la microscopie confocale ainsi qu'une analyse western blot. Le marquage

au bromodéoxyuridine triphosphate pour visualiser l'apoptose a également été

examiné dans le traitement des cellules T47D. Nous avons observé une

diminution de 55% de la croissance des colonies en présence de la combinaison

de tamoxifène et PQ1, alors que le tamoxifène seul avait peu d'effet. Une

combinaison de 10 umol / L de tamoxifène et 200 ou 500 nmol / L de PQ1 a abouti

à une viabilité cellulaire de seulement 16 % par rapport aux témoins à 48 h dans

les cellules T47D par le test MTT. Nous avons constaté une augmentation

significative de la protéine BAX à 1h en présence de 500 nmol / L de PQ1 seule,

10 umol / L de tamoxifène seul, et la combinaison de PQ1 et de tamoxifène. Une

augmentation d'un facteur deux de la caspase active 3 a été observée en

présence d'un traitement combinant 10 umol / L tamoxifène et 200 ou 500 nmol / L

de PQ1. En outre, l'analyse par cytométrie de flux a montré une augmentation de

50% du nombre de cellules apoptotiques en présence de la combinaison de

tamoxifène et PQ1 par rapport au contrôle. Par ailleurs, les résultats montrent que

le traitement combinant tamoxifène et PQ1 réduit de manière significative

198

l'expression de la survivine dans les cellules T47D. Des études d'inhibiteurs des

jonctions GAP avec le carbenexolone ont également été réalisées qui confirme le

rôle des jonctions lacunaires dans la prolifération cellulaire et la mort cellulaire. Le

traitement associant tamoxifène et PQ1 présente une augmentation significative

de l'expression de la protéine BAX, de l'activation de la caspase 3 et de la

fragmentation de l'ADN. Le tamoxifène seul et en combinaison avec PQ1 a montré

une diminution de l'expression de la survivine, alors que PQ1 seule s'est révélée

être indépendante de la voie médiée par la survivine. Ceci suggère que

l'augmentation de l'activité des jonctions lacunaires peut potentialiser l'effet du

tamoxifène. Le traitement associant tamoxifène et PQ1 a également montré une

diminution significative de la viabilité cellulaire par rapport à un traitement au

tamoxifène seul. L'inhibiteur des jonctions GAP carbenexolone s'est avéré

augmenter la prolifération cellulaire par augmentation de l'expression de la cycline

D1, test MTT et expression du facteur Ki67. Il a en outre diminué la mort cellulaire.

Cette étude montre pour la première fois que le traitement combinatoire de

tamoxifène et PQ1 (un activateur des jonctions GAP) peut être utilisé pour

potentialiser l'apoptose de cellules de cancer du sein humain T47D. Ainsi, un

activateur des jonctions lacunaires, PQ1, pourrait modifier soit la durée soit la

dose de tamoxifène utilisées cliniquement chez les patients atteints de cancer du

sein.

B/ Introduction

Le tamoxifène est l'un des agents de chimiothérapie les plus fréquemment

utilisés avec succès pour le traitement des cancers du sein répondant au système

endocrinien (302). Le tamoxifène est mieux connu comme un modulateur des

récepteurs aux œstrogènes en raison de ses multiples activités (303). Chez la

plupart des patients, les cancers qui répondent initialement au tamoxifène

acquièrent progressivement une résistance au traitement et nécessitent des

thérapies systémiques alternatives (304). Malgré l'utilisation extensive de ce

médicament, les mécanismes précis qui confèrent une résistance restent

inconnus. Un certain nombre de mécanismes ont été proposés pour contrôler la

résistance anti-oestrogène des cancers du sein positifs aux récepteurs aux

199

œstrogènes (ER +) (305) mais de nombreux détails de ces mécanismes

continuent de ne pas être clairs (306). Il s'agit notamment de changements dans

l'immunité de l'hôte, du système endocrinien de l'hôte, ou la pharmacocinétique de

l’anti-œstrogène (302). Dans le cadre du système endocrinien de l'hôte, certaines

tumeurs deviennent spontanément hormone indépendantes malgré la présence

de ER; dans d'autres, les tumeurs qui sont d'abord ER + deviennent ER- au cours

du temps (307, 308). De nombreux essais ont été effectués en utilisant le

traitement combinant des molécules de chimiothérapie et le tamoxifène, mais les

résultats ont été controversés (309-314).

Les jonctions lacunaires sont les canaux intercellulaires de la membrane

plasmique qui permettent le passage de petites molécules d'une cellule à l'autre.

Le flux de molécules à travers les canaux est appelé communication intercellulaire

au travers des jonctions GAP (GJIC) (315). La GJIC existe dans la plupart des

cellules de mammifère et est impliquée dans la croissance, la différenciation et

l'homéostasie cellulaires. Elle joue également un rôle clef dans la survenue de la

mort cellulaire par apoptose (316). Pendant des décennies, il a été montré que les

cellules en mitose dans le cycle cellulaire présentent une GJIC diminuée (317-

319). Par conséquent, elle conduit à un état où la communication entre les cellules

est négativement liée à la capacité de la cellule de croître. En raison de son effet

sur la croissance cellulaire, de nombreuses études ont été menées pour trouver

une corrélation entre GJIC et cancer. De nombreuses études in vitro et in vivo ont

montré que les agents favorisant les tumeurs conduisent à une diminution de la

GJIC (320-325). L'analyse des protéines et des l'ARNm a montré une diminution

de l'expression des connexines dans les lésions prénéoplasiques, ainsi que dans

les carcinomes hépatocellulaires (326, 327).

Dans une étude précédente, nous avons présenté un nouvel activateur des

jonctions lacunaires, une quinoléine substituée (nom de code = PQ1). Nous avons

montré que PQ1 (200 nmol / L) provoquait une augmentation de 70% de la GJIC

dans les cellules T47D ; cependant, il n'y avait aucun effet du traitement PQ1 sur

la GJIC des cellules épithéliales mammaires normales. En plus d'une

augmentation de la GJIC, 80 à 95% d'atténuation de la croissance a été observée

par le traitement PQ1 dans un essai de croissance des colonies. En outre, on a

observé une augmentation de la caspase 3 dans les cellules traitées avec PQ1,

200

suggérant une possible implication de l'apoptose ainsi que l'augmentation de

l'activité des jonctions GAP (202).

Les effets antitumoraux du tamoxifène sont présumés être dus à son

activité anti-oestrogénique, médiée par l'inhibition compétitive de la liaison des

œstrogènes aux ER et ensuite l'activation de l'apoptose (328, 329). L'inhibition de

l'expression de gènes régulés par les œstrogènes entraîne une diminution de la

croissance et de la prolifération cellulaire (330). Comme les PQ1 ont également

montré une augmentation de la caspase-3 et une diminution de la croissance des

tumeurs du sein, nous émettons l'hypothèse que le traitement combinant

tamoxifène et activateur des jonctions lacunaires, PQ1, pourrait encore améliorer

l'effet apoptotique dans les cellules de cancer du sein humaines T47D. Le but de

cette étude était d'examiner l'effet du traitement combinatoire de PQ1 et du

tamoxifène sur les cellules de cancer du sein T47D. Les résultats ont montré une

augmentation de la mort cellulaire T47D dans une thérapie combinatoire de

tamoxifène et PQ1. Une augmentation significative de la protéine BAX et de la

caspase 3 suivie par une augmentation de l'apoptose a été observée par

incorporation à différents temps de dosage de l’apoptose-bromodéoxyuridine

triphosphate (APO-BrdU) en présence de PQ1 et de tamoxifène. En outre, une

diminution de la croissance des colonies, de la viabilité cellulaire estimée par le

test au 3 - (4,5-dimethyl thiazol-2-yl) -2,5-diphényltétrazolium bromure (MTT), et

une augmentation de la fragmentation de l'ADN a été observée lors du traitement

combinatoire de PQ1 et de tamoxifène. Nous avons également réalisé des études

portant sur les inhibiteurs en utilisant le carbenoxolone (CBX), un inhibiteur connu

des jonctions GAP (331), seul et en combinaison avec le tamoxifène. CBX (20

mmol/L) a entrainé une diminution significative des protéines Cx43, BAX et

caspase 3 et une augmentation significative de la cycline D1. Le test MTT a

montré une augmentation significative de cellules en prolifération. En outre,

l'expression du Ki67 a été augmentée en présence de la combinaison de CBX et

de tamoxifène. Le dosage de l'apoptose par Apo-BrdU a montré une diminution

significative de la mort cellulaire en présence du CBX (20 mmol / L) par rapport au

tamoxifène.

201


i/ Lignées cellulaires et culture

La lignée cellulaire de cancer du sein humain T47D a été achetée chez

American Type Cell Culture (ATCC, Manassas, Virginie, USA). Les cellules ont

été cultivées dans un milieu RPMI supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin

(Atlanta Biologicals, Lawrenceville, Géorgie, États-Unis), 10% d'antibiotique-

antimycosique à 37°C avec 5% de CO2 dans des flacons de 75 cm2. Le citrate de

tamoxifène et carbenexolone ont été achetés chez Sigma (St. Louis, Missouri,

USA).

ii/ Morphologie cellulaire

Les cellules (5.000 cellules / mL) ont été ensemencées dans une plaque à

six puits et supplémentées avec 200 nmol / L de PQ1 seul, 10 mmol / L de

tamoxifène seul, une combinaison de tamoxifène et PQ1 ou une combinaison

d'oestrogènes et de tamoxifène (10 nmol / L) pendant 1, 24, 48 et 72 h. Les

cellules ont été observées sous un microscope en utilisant un objectif � 40.

iii/ Croissance des colonies en utilisant de l'agar mou

Les cellules ont été traitées avec de l'éthanol, 200nmol / L de PQ1, 10

mmol / L de tamoxifène ou une combinaison de 200 nmol / L de PQ1 et 10 mmol /

L de tamoxifène pendant 7 jours. Des plaques de gélose de base sont préparées,

contenant 0,8 ou 0,4% de gélose dans du milieu RPMI. Les cellules (5 x 104

cellules / puits de 33 mm2) ont été mises en suspension dans 100 ml de milieu

RPMI avec 0,4% de gélose et étalées. Ces plaques ont été maintenues à 37°C

pendant 7 jours et examinées pour la présence de colonies. Des colonies

individuelles de 50 mm ou plus ont été examinés.

iv/ Test MTT

Le test au MTT a été réalisé avec des cultures de cellules dans une plaque

à 96 puits incubées avec 200 ou 500 nmol / L de PQ1, 10 mmol / L de tamoxifène

202

seul ou une combinaison de 10 mmol / L de tamoxifène et 200 ou 500 nmol / L de

PQ1 à 1, 48 et 72 h. Les études d'inhibiteurs des jonctions GAP en utilisant 20

mmol / L de CBX seul, 10 mmol / L de tamoxifène ou une combinaison de 10

mmol / L de tamoxifène et 20 mmol / L de CBX ont été effectuées à 72 h dans des

cellules T47D. La solution MTT a été métabolisée par les cellules (période

d'incubation) pendant 1h à 37°C. MTT est un sel de tétrazolium (jaune) clivé

cristaux de formazan par la succinate déshydrogénase. Dans les cellules viables,

plus de colorant formazan sera produit. Après solubilisation des cristaux de MTT

avec la solution de solubilisation 0,35 N HCl, le colorant a été mesuré par

spectrophotométrie à 540 nm avec soustraction de l'arrière-plan à 650 nm.


Les cellules ont été cultivées dans du RPMI supplémenté de sérum jusqu'à

ce qu'elles soient confluentes à 90% dans des flacons de 25 cm2. Les cellules ont

été incubées avec PQ1 seule, tamoxifène seul à 10 mmol / L ou une combinaison

de tamoxifène et PQ1 pendant 1, 48 ou 72 h. Pour les études d'inhibition des

jonctions GAP, les cellules ont été incubées avec 20 mmol / L de CBX seul, 10

mmol / L de tamoxifène ou une combinaison de 10 mmol / L de tamoxifène et 20

mmol / L de CBX pendant 72 h. Les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS

froid et récoltées en utilisant un tampon de lyse cellulaire (20 mmol / L de Tris pH

7,5, 0,5 mmol / L d'EDTA, 0,5 mmol / L d'EGTA, 0,5% de Triton X-100) avec une

des inhibiteurs de protéases à une dilution de 1:1000 (Sigma-Aldrich, St. Louis,

Missouri, USA) pendant 10 minutes avant d'être incubées sur un agitateur pendant

30 minutes à 41°C. Les cellules ont été vortexées et centrifugées à 13000 rpm

pendant 30 minutes à 41°C. La concentration en protéines de tous les échantillons

a été estimée par la méthode de Bradford en utilisant un spectrophotomètre.

Quarante microgrammes d'extrait de cellules entières ont été résolus par

électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS à 10% et transférés sur membrane

de nitrocellulose (Midwest Scientific, St. Louis, Missouri, USA). La membrane de

nitrocellulose a été bloquée dans du lait à 5% pendant 1 h à température ambiante

et incubée avec des anticorps polyclonaux anti-Bcl2 de lapin (1 : 200), anti-BAX

de souris (1 : 200) ; (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, Californie, États-

203

Unis), un anticorps polyclonal de lapin anti-caspase 3 (1: 500 ; BD Pharmingen,

San Diego, Californie, Etats-Unis), un anticorps polyclonal de lapin anti-survivine

(1: 1000 ; Novus Biologicals, Colorado, USA), un anticorps anti-cycline D1 de lapin

(1 : 1000 ; Cell Signaling Technology, Danvers, Massa- chusetts, USA) et un

anticorps polyclonal de lapin anti-actine (1 : 1000 ; Sigma-Aldrich). Les transferts

Western ont été détectés par chimioluminescence (Amersham, Pittsburgh,

Pennsylvanie, États-Unis).

vi/ Immunofluorescence et microscopie confocale

Les cellules ont été cultivées sur lamelles dans des plaques à six puits

dans du milieu RPMI. Les cellules ont été traitées avec PQ1 seule, tamoxifène

seul ou une combinaison de tamoxifène et de PQ1 pendant 1, 48 ou 72 h. Les

cellules ont également été incubées avec 20 mmol / L de CBX seul, 10 mmol / L

de tamoxifène ou une combinaison de 10 mmol / L de tamoxifène et 20 mmol / L

de CBX pendant 72 h. Les cellules ont été fixées avec du paraformaldehyde à 2%

pendant 20 min et ensuite neutralisées avec 50 mmol / L de glycine pendant 5

min. Les cellules ont été lysées avec 0,1% de Triton X-100 pendant 10 min

supplémentaires. Après lavage avec du PBS, les cellules ont été bloquées avec

2,5% de BSA dans du PBS pendant 2 h et ensuite incubées avec des anticorps

primaires de lapin anti-Ki67 (1: 250 ; Santa Cruz) et anti-BAX souris (1: 50 ; Santa

Cruz), anti-survivine de lapin (1 : 250 ; Novus Biologicals) pendant 15 h à 41°C.

Après cette étape, les cellules ont été incubées dans du 40-6-diamidino-2-

phenylindole (DAPI) pendant une minute et ensuite incubées avec des anticorps

secondaires anti-souris et anti-lapin Alexa fluor 488 et 568 (Molecular Probes,

Eugene, Oregon, États-Unis) pendant 4h à 41°C, respectivement. Les cellules ont

été analysées pour déterminer la morphologie nucléaire par coloration avec du

DAPI. Les échantillons ont été scellés et analysées en utilisant un microscope

confocal (Carl Zeiss LSM 510 META, Narashige, Minnesota, États-Unis).

vii/ Dosage de l'apoptose par cytométrie de flux

Les cellules ont été cultivées dans des flacons de 35 mm2 et ensuite le

milieu a été additionné de PQ1 seul, tamoxifène seul ou une combinaison de

204

tamoxifène et PQ1 pendant 1, 48 ou 72h. Les cellules ont été traitées à la trypsine

et colorées grâce au kit APO-BrdU TUNEL Assay (Molecular Probes # A23210,

Carlsbad, Californie, USA) selon le protocole du fabricant. La liaison APO-BrdU a

été analysée par cytométrie de flux en utilisant un système BD FACSCalibur (BD

Biosciences, San Jose, Californie, États-Unis) et les données obtenues ont été

analysées en utilisant le logiciel CellQuest (BD Biosciences). De l'iodure de

propidium a été utilisé pour distinguer les cellules nécrotiques des cellules

apoptotiques.

viii/ Analyse statistique

Le niveau de signification a été examiné pour une p-value inférieure à 0,05

à l'aide de l'analyse t-test de Student. Toutes les expériences ont été réalisées au

moins trois fois individuellement et sont présentées sous forme de moyenne ±

écart-type.

D/ Résultats et discussion

Le cancer du sein est la deuxième cause de décès par cancer chez les

femmes en Amérique du Nord. Le tamoxifène a été le seul agent de choix dans le

traitement des cas de cancer du sein hormono-sensible depuis 1971. Bien qu'il ait

été montré que le tamoxifène était 50% plus efficace que le placebo dans la

prévention de l'apparition du cancer du sein chez les populations à haut risque, le

risque de développer un cancer de l'utérus était augmenté de plus de 40% (332).

Le traitement au tamoxifène inclut l'utilisation de ce médicament pendant au moins

5 ans chez la plupart des patients. Le traitement à long terme au tamoxifène induit

une résistance, dont le mécanisme reste encore à élucider (303). Par conséquent,

il est nécessaire d'élaborer des modalités efficaces pour améliorer l'efficacité du

tamoxifène. Dans cette étude, nous avons étudié l'effet combinatoire de la PQ1 et

du tamoxifène. PQ1 a été montrée être un activateur des jonctions intercellulaires

et induire la mort cellulaire à la fois dans les traitements in vitro et in vivo (202). Le

tamoxifène a également montré une induction de la mort cellulaire par apoptose in

vitro et in vivo (333-335). Cet effet était concentration-dépendant. A des

concentrations nanomolaires (nmol / L) de tamoxifène, seul un arrêt de croissance

205

se produit, alors qu'à des concentrations micromolaires (umol / L), une induction

de la mort cellulaire a été observée dans des cultures cellulaires (332). La plupart

des patients atteints de cancer du sein reçoivent une dose quotidienne de 20-40

ug de tamoxifène (336, 337). Il est difficile de traduire directement la dose de

tamoxifène depuis un contexte clinique vers des études in vitro ou in vivo.

Cependant, Mandlekar et Kong (332) ont montré une CI50 de 9-10 umol / L dans

les lignées cellulaires de cancer du sein BT-20, MCF-7, et MDA-231. Les résultats

d'études cliniques ont montré qu'à l'état d'équilibre les concentrations de

tamoxifène dans le plasma pouvaient atteindre jusqu'à 1 umol / L et les

concentrations moyennes intratumorales étaient encore plus élevées, environ 4

umol / L. Nous avons trouvé différentes concentrations (1-20 umol / L) de

tamoxifène être utilisées dans différents tests sur cellules (338-340). Sur la base

de ces études, nous avons choisi d'observer l'effet de 10 umol / L de tamoxifène

dans des cellules de cancer du sein T47D. La PQ1 et le tamoxifène affectent la

morphologie cellulaire, la prolifération et la croissance des colonies des cellules

T47D.

Notre étude antérieure a montré une augmentation considérable de la GJIC

et l'activation des caspases 3 en présence de PQ1 dans les cellules T47D (202).

La morphologie cellulaire était également affectée en présence de 200 nmol / L de

PQ1 à 24, 48 et 72 h, avec des cellules qui se détachaient de la plaque de culture.

En présence de 10 umol / L de tamoxifène pendant 24, 48 et 72 h, les cellules ont

montré un changement marqué dans la morphologie, incluant contraction, forme

irrégulière, et certaines cellules flottantes dans le milieu de culture (Fig. 51A-C).

Cependant, aucun effet sur la morphologie cellulaire n'a été observé à 1 h en

présence de 200 à 500 nmol / L de PQ1 seul et en combinaison avec 10 umol / L

de tamoxifène (données non présentées). La combinaison de tamoxifène et PQ1 a

également montré une perte complète de la structure des cellules. Les cellules ont

partiellement retrouvé leur structure en présence de 10 umol / L de tamoxifène et

10 nmol / L de 17b-oestradiol. Ces résultats suggèrent que le traitement

combinatoire de tamoxifène et PQ1 peut potentialiser l'effet du tamoxifène.

206

Fig. 51 : Effet des PQ1 sur la morphologie des cellules T47D. PQ1 200 nmol/L, tamoxifène 10

µmol/L, œstradiol 10 nmol/L. A/ 24h de traitement B/ 48h de traitement C/ 72h de traitement

L'essai de croissance de colonies mesure la formation de colonies dans la

gélose molle, qui est utilisée pour mesurer l'indépendance d'ancrage des cellules

(une caractéristique des cellules cancéreuses). Nous avons observé une

diminution de 55% de la croissance des colonies en présence de la combinaison

de tamoxifène et de PQ1 (Fig. 52). Ceci suggère que le traitement combinatoire

de tamoxifène et PQ1 est suffisant pour provoquer une diminution significative de

la croissance des colonies après une incubation de 7 jours par rapport aux

traitements au tamoxifène ou PQ1 seuls. Le traitement à l'éthanol, un solvant

témoin, ne montre aucun effet sur la croissance des colonies de cellules T47D. Le

test MTT avec 200 et 500 nmol / L de PQ1 a montré une viabilité cellulaire à 48

heures de 60 et 50%, respectivement (Fig. 53). Le tamoxifène (10 mmol / L) a

montré 30% de viabilité cellulaire, tandis que la combinaison de tamoxifène et

PQ1 a abouti à une viabilité des cellules à 48 heures de 16% par rapport aux

témoins dans des cellules T47D. L'utilisation combinée du tamoxifène (10 mmol /

207

L) et PQ1 (200 et 500 nmol / L) conduit à une diminution de la croissance

cellulaire de 50% par rapport au traitement au tamoxifène seul à 48 h. A 72 h, le

traitement combinatoire de tamoxifène et PQ1 (200 et 500nmol / L) a donné lieu à

20 et 13% de viabilité cellulaire, respectivement. Ainsi, 48 h suffisent pour

provoquer une diminution significative de la viabilité cellulaire avec le traitement

combinant tamoxifène et PQ1. Fait intéressant, la viabilité cellulaire n'a été

affectée par aucune des deux concentrations de PQ1, 200 ou 500 nmol / L, à 1 h ;

cependant, le traitement au tamoxifène seul a entraîné une diminution de 28% de

la croissance cellulaire. La viabilité cellulaire, mesurée par le test MTT, a été

grandement affectée après 48 h par rapport à 72 h en présence de PQ1 seule ou

de tamoxifène seul ou de leur combinaison.

Fig. 52 : Réduction de croissance des

colonies de cellules T47D (par rapport au

control). PQ1 : 200 nmol/L, tamoxifène : 10

µmol/L. Apres 7 jours sur agar mou, seules

les colonies de plus de 50 µm ont été

comptées. * = p<0,05

Fig. 53 : Évaluation

de la prolifération

des cellules T47D

au moyen du test

MTT, en présence

de PQ1 (200 ou

500 nmol/L) et/ou

de tamoxifène (10

µmol/L). * = p <

0.005 à 48 h et ** =

p < 0.05 à 72 h

(dans la comparaison du traitement au tamoxifène seul ou en association avec PQ1)

208

Fig. 54 : Expression du marqueur de

division cellulaire Ki-67. Œstrogènes

utilisés comme antagonistes du

tamoxifène

L'expression des protéines

est mesurée dans certains cas de

cancer du sein symptomatique

afin d'identifier les facteurs

pronostic qui sont associés avec

le comportement biologique des

tumeurs individuelles. Ki67 est

une protéine nucléaire largement

utilisée comme marqueur de la

prolifération cellulaire. Le

tamoxifène a été montré entrainer

une diminution de l'expression de

Ki67 chez les patients atteints de

cancer du sein et dans des lignées

cellulaires de cancer du sein

(341). Par conséquent, l'effet du

traitement combinatoire de

tamoxifène et PQ1 sur la

coloration Ki67 dans les cellules T47D a été mesurée. La coloration Ki67 a été

réduite en présence de 200 nmol / L de PQ1 à 24, 48 et 72 heures (Fig. 54). En

présence de tamoxifène seul, aucune coloration Ki67 n'a été observée à 24, 48 et

72h. Le traitement combinatoire de tamoxifène et PQ1 a également montré une

absence de coloration Ki67, tandis que le traitement combinatoire d'œstrogènes et

de tamoxifène a montré une expression de Ki67, ce qui suggère que les

œstrogènes peuvent partiellement antagoniser l'effet du tamoxifène. Ces résultats

suggèrent que PQ1 a un effet sur la coloration Ki67 et il ne contrecarre pas l'effet

du tamoxifène lorsqu'il est utilisé en combinaison, alors que les œstrogènes

peuvent inverser l'effet du tamoxifène. En outre, PQ1 a clairement un effet sur la

prolifération des cellules T47D.

209

i/ Effet des PQ1 et du tamoxifène sur des protéines apoptotiques

La mort cellulaire programmée ou apoptose, a lieu soit par l'activation des

récepteurs de mort soit en raison d'une rupture de l'intégrité de la membrane

mitochondriale. Le cytochrome c, un acteur clef dans l'induction de la cascade de

l'apoptose, est libéré de l'intérieur des mitochondries dans le cytosol de la cellule

par l'interaction de deux protéines importantes impliquées dans l'apoptose, BAX et

Bcl2. En fonction des signaux apoptotiques, la protéine pro-apoptotique BAX est

activée, tandis que les protéines anti-apoptotiques, tels que Bcl2, empêchent

l'apoptose par hétérodimérisation avec BAX (342, 343). Globalement, le ratio de

BAX et Bcl2 détermine l'intégrité de la membrane mitochondriale. Dans cette

étude, nous avons réalisé une étude temps-dépendante par traitement des

cellules avec PQ1 et tamoxifène seuls et en combinaison pendant 1, 48 et 72 h.

Nous avons constaté une augmentation significative de la protéine BAX à 1 h en

présence de 500 nmol / L de PQ1 seul, tamoxifène seul, et d'une combinaison de

tamoxifène et PQ1 (Fig. 55A). Nous avons également observé une diminution de

Bcl2 en présence de tamoxifène seul et de tamoxifène en combinaison avec PQ1

à 1 h. À 48 h, une diminution significative a été observée dans l'expression de

Bcl2 avec 500 nmol / L de PQ1 seul et avec une combinaison de tamoxifène et

PQ1. En outre, il y avait une augmentation significative de la protéine BAX dans le

traitement combinatoire utilisant PQ1 (200 et 500 nmol / L) et tamoxifène à 48 h.

Zhang et al. (338) ont montré une diminution de Bcl2, mais aucun effet sur BAX

dans les cellules MCF-7 en présence de 10 mmol / L de tamoxifène à 72 h. Nous

avons constaté qu'à 72 h, les protéines BAX et Bcl2 ont été considérablement

augmentée et diminuée, respectivement, en présence de tamoxifène et de

l'association de tamoxifène et de 200 ou 500 nmol / L de PQ1. Ces résultats

indiquent que le traitement combinatoire non seulement augmente

significativement BAX mais également diminue Bcl2. Le rapport de Bcl2 et BAX

est diminué de manière significative à une heure en présence de tamoxifène seul

et PQ1 seule ou en combinaison. Par conséquent, il indique que PQ1 a une action

rapide sur l'activation de Bax. L'effet sur la réduction de l'expression de Bcl2 est

relativement lent, restant constante à 48h avant d'augmenter de nouveau à 72 h.

210

Fig. 55 : Expression des protéines impliquées dans les voies de l'apoptose.

Après l'activation de Bax, une cascade d'événements conduits

principalement par l'activation des caspases protéolytiques résultant dans le

traitement des protéines intracellulaires de structure et des enzymes de régulation,

ce qui aboutit à la mort cellulaire par apoptose (344). L'activation de la caspase 3,

une caspase exécutive, est considérée être l'une des dernières étapes dans la

voie de la cascade de l'apoptose (339). Par conséquent, nous avons examiné

l'effet de la combinaison de tamoxifène et PQ1 sur l'activation de la caspase 3.

Fait intéressant, nous n'avons trouvé aucune activation de la caspase 3 à 1 h (Fig.

55B). Cependant, il y avait une augmentation significative de la caspase 3 à 48 et

72 h en présence de PQ1 seule, de tamoxifène seul, et de la combinaison de

tamoxifène et PQ1, ce qui indique que l'activation de la caspase 3 prend du temps

et persiste au moins jusqu'à 72h. Une augmentation de 50% de la caspase active

3 a été observée avec 200 et 500 nmol / L de PQ1 à 72 h. Une augmentation d'un

211

facteur deux a été observée de caspase active 3 en présence d'un traitement

combinatoire de tamoxifène et PQ1. Un histogramme des trois expériences avec ±

SD (standard deviation) et la signification statistique p <0,05 pour 48h et pour 72h

pour la caspase 3 fournit des informations plus détaillées (Fig. 55B). L'analyse

densitométrique montre que la caspase 3 augmente de façon significative à 48 et

72 h en présence de 200 et 500nmol / L de PQ1 seule et en combinaison avec le

tamoxifène, par rapport à leurs témoins respectifs. Ceci suggère que la

combinaison de tamoxifène et de PQ1 aboutissent à une mort cellulaire accrue

des cellules T47D.

Dans cette étude, nous avons également observé l'effet du tamoxifène et

de la PQ1 sur un inhibiteur des protéines de l'apoptose, la survivine (un groupe de

protéines impliquées dans l'inhibition des caspases 3, 7 et 9) (282, 345).

L'augmentation de l'expression de la survivine est censée protéger les cellules

contre une possible induction de l'apoptose par défaut dans le cas de mitose

aberrante (346). De nombreuses études sur des échantillons cliniques ont montré

que l'expression de la survivine est invariablement régulée à la hausse dans les

cancers humains et est associée à la résistance à la chimio-thérapie liée à un

mauvais pronostic, ce qui suggère que la survivine module la survie des cellules

cancéreuses (347). Gazzaniga et al. (345) ont trouvé que la survivine ne peut pas

être utilisée comme un facteur pronostique de la rechute d'un cancer superficiel de

la vessie. Cependant, dans des modèles précliniques de tumeurs de la vessie,

l'inhibition de l'expression et / ou de la fonction de la survivine a été montré

empêcher la prolifération des cellules tumorales, et induire l'apoptose spontanée

ou induite par la chimiothérapie de façon marquée (348). Nous n'avons trouvé

aucun effet sur la survivine à 1h (Fig. 55C) ; cependant, à 48 et 72 h, nous avons

trouvé une importante diminution de l'expression de la survivine dans le traitement

utilisant le tamoxifène seul et le traitement combinatoire de tamoxifène et PQ1

(200 ou 500 nmol / L). Ceci suggère que le tamoxifène diminue l'expression de la

survivine, alors que PQ1 seule n'a pas d'effet sur l'expression de la survivine dans

les cellules T47D jusqu'à 72 h. En outre, ces données ont été confirmées par

microscopie confocale avec laquelle a été détectée une diminution des protéines

survivine et BAX (Fig. 56A et B). Les résultats de la microscopie confocale ont

montré l'absence de survivine dans les cellules traitées au tamoxifène à 48 et 72h.

212

Fig. 56 : Expression des protéines survivine et BAX observée par immunofluorescence. A/

survivine B/ BAX

ii/ Mesure de l'apoptose par la morphologie nucléaire et cytométrie de flux

L'effet du tamoxifène et de PQ1 sur la coloration nucléaire a été mesuré en

utilisant le DAPI. L'apoptose est caractérisée par des changements

morphologiques tels que le rétrécissement de la taille de la cellule, la

condensation de la chromatine et la désintégration de la cellule en petits

fragments (corps apoptotiques) (349). Dans cette étude, nous avons trouvé plus

de cellules subissant le processus d'apoptose, ce qui se présentait par

213

bourgeonnement et fragmentation en présence de PQ1 et de tamoxifène seuls et

en combinaison (données non présentées). Le kit de dosage TUNEL APO-BrdU a

été utilisé pour détecter la fragmentation de l'ADN des cellules apoptotiques. Au

cours de l'apoptose, la fragmentation de l'ADN expose les groupes 30-OH

auxquels la désoxy-nucléotidyl transférase peut ajouter des

désoxyribonucléotides. La 5-Bromo-20-50 désoxyuridine-triphosphate est un

analogue de la désoxythymidine, qui est incorporé au niveau du groupe 30-OH.

Nous avons constaté une augmentation de l'incorporation de la 5-bromo-20-50

désoxyuridine-triphosphate en présence de PQ1 et de tamoxifène seuls et en

combinaison à 48 et 72 h (Fig. 57). Une augmentation de 50% de cellules

apoptotiques a été observée à 48 et 72 h, en présence d'un traitement

combinatoire de tamoxifène et PQ1. Il n'y avait pas d'effet sur l'apoptose du

tamoxifène ou de PQ1 à 1h. Bien que la cascade de l'apoptose commence en une

heure, indiquée par une augmentation de BAX et une diminution de Bcl2,

l'activation des caspases et les dommages de l'ADN requièrent plus d'une heure.

Les résultats indiquent que la combinaison de PQ1 (200 et 500 nmol / L) et de

tamoxifène (10 mmol / L) entraîne une augmentation de l'apoptose par rapport à

des traitements individuels.

Fig. 57 : Analyse des cellules

apoptotiques par marquage APO-BrdU et

flow cytométrie. Green = 72h

214

iii/ Effet de l'inhibiteur des jonctions GAP, CBX, sur les protéines Cx43, BAX,

caspase 3 et cycline D1

CBX a été utilisé comme inhibiteur non spécifique des jonctions GAP dans

de nombreuses études. Jusqu'à présent, dans nos études, nous avons conclu que

PQ1 était un activateur des jonctions GAP, qui, en présence de tamoxifène,

diminue la prolifération cellulaire et augmente la mort cellulaire. Des expériences

utilisant un inhibiteur des jonctions lacunaires peuvent en outre confirmer le rôle

important des jonctions lacunaires dans la prolifération cellulaire. Par conséquent,

nous avons mené des études utilisant 20 mmol / L de CBX seul, et 20 mmol / L de

CBX en présence de 10 mmol / L de tamoxifène. Nous avons effectué des études

Western blot, de morphologie cellulaire et de dosage MTT à différent temps et on

a trouvé que 20 mmol / L de CBX à 72 h étaient suffisants pour diminuer la Cx43,

sans provoquer de changement dans la morphologie des cellules et sans être

cytotoxique pour les cellules T47D (données non présentées). Nous avons

effectué un Western blot pour les protéines Cx43, BAX, caspase 3 et cycline D1.

Nous avons observé que CBX (20 mmol / L) dans les cellules T47D diminuait

l'expression des protéines Cx43, BAX, et caspase 3 et augmentait l'expression de

la cycline D1, alors que la combinaison de tamoxifène et CBX diminuait

l'expression de la caspase 3 et de la cycline D1 à 72h (Fig. 58A). La cycline D1 est

un proto-oncogène et un régulateur important de la transition de la phase G1 à la

phase S dans de nombreux différents types de tissus. La concentration de la

protéine Cycline D1 augmente à mesure que la cellule entre dans la phase G1 et

la transition des phases G1 à S (350). Nos données suggèrent que l'inhibition des

jonctions GAP par CBX provoque une plus importante entrée de cellules dans le

cycle cellulaire et augmente la prolifération cellulaire, ce qui setraduit par une

augmentation significative de l'expression de la cycline D1. Cet effet a été observé

en présence de la combinaison de CBX et de tamoxifène, ce qui suggère en outre

que l'inhibition des jonctions GAP diminue l'effet du tamoxifène sur la prolifération

cellulaire. CBX seul a diminué significativement l'expression des protéines BAX et

caspase 3, alors que la combinaison de CBX et de tamoxifène n'a pas eu d'effet

significatif sur BAX et caspase 3. Cela pourrait être dû soit à un fort effet du

tamoxifène sur la mort cellulaire soit à une diminution de l'activité du CBX.

215

Fig. 58 : Etude de l'inhibition des jonctions GAP en utilisant le CBX. A/ Western blot B/ Test MTT *

= p < 0.05 à 72 h en présence de CBX seul par rapport au contrôle et ** = p < 0.05 à 72 h en

présence de CBX et tamoxifène par rapport au tamoxifène seul C/ Expression de la protéine Ki-67

D/ Marquage APO-BrdU et analyse par flow cytométrie

iv/ Effet du CBX sur le test MTT, l'expression de la protéine Ki67 et le dosage de

l'apoptose par cytométrie de flux

Le test MTT a montré une augmentation de la prolifération cellulaire en

présence de CBX seul et de la combinaison de CBX et de tamoxifène à 72 h (Fig.

58C). Cependant, le tamoxifène seul a montré une diminution significative de la

prolifération cellulaire. Ceci suggère que l'inhibition des jonctions lacunaires

affecte la prolifération des cellules, ce qui confirme que les activateurs des

jonctions GAP, en présence de tamoxifène peuvent réduire la croissance

cellulaire. Nous avons également observé l'effet de CBX sur l'expression de la

protéine Ki67 dans les cellules T47D à 72 h (Fig. 58B). La protéine Ki67 était

significativement accrue en présence de CBX seul par rapport au tamoxifène. La

combinaison de tamoxifène et CBX a également montré une expression de Ki67,

ce qui indique que l'inhibition des jonctions lacunaires affecte la prolifération des

216

cellules. Cela a été confirmé par l'expression de la cycline D1 et le test MTT. Le

dosage de l'apoptose la méthode TUNEL d'incorporation d'APO-BrdU a montré

une diminution de la mort cellulaire en présence de CBX ; cependant, la mort

cellulaire n'a pas été affectée en présence de tamoxifène et CBX (Fig. 58D). Le

tamoxifène seul a par ailleurs provoqué une augmentation de la mort cellulaire par

rapport au témoin. Dans le dosage de l'apoptose, nous avons utilisé de l'iodure de

propidium pour établir une distinction entre cellules nécrotiques et apoptotiques.

Les cellules qui n'ont pas incorporé l'iodure de propidium mais pnt incorporé

l'APO-BrdU-isothiocyanate de fluorescéine ont été comptées comme

apoptotiques. Par conséquent, ce dosage exclut les cellules nécrotiques et permet

de mesurer la quantité de cellules apoptotiques. Dans l'ensemble, les données

permettent de conclure que l'inhibition des jonctions lacunaires à l'aide de 20

mmol / L de CBX peut augmenter la prolifération cellulaires et réduire la mort des

cellules, mais une plus forte dose de CBX est nécessaire pour réduire la mort

cellulaire en présence de la combinaison de tamoxifène et de CBX. Ces données

concernant les inhibiteurs des jonctions GAP suggèrent que des activateurs de

jonctions GAP tels que PQ1 peuvent être utilisés comme cibles thérapeutiques

dans les cellules cancéreuses dans lesquelles les activateurs des jonctions

lacunaires peuvent diminuer la prolifération des cellules et provoquer la mort

cellulaire.

E/ Conclusion

Le tamoxifène a été le médicament de choix pour le traitement des tumeurs

du sein sensibles aux hormones, mais la résistance au tamoxifène été un

problème pour très longtemps. On montre pour la première fois que l'effet

combinatoire de PQ1, un activateur des jonctions GAP, avec le tamoxifène a une

utilisation potentielle pour le traitement contre le cancer du sein. Nous avons

constaté une diminution de la prolifération cellulaire par le test MTT et une

diminution significative dans le test de croissance des colonies. Nous avons

observé une augmentation significative de l'expression de la protéine BAX,

l'activation de la caspase 3 et la fragmentation de l'ADN en présence d'un

traitement combinatoire de PQ1 et de tamoxifène par rapport aux traitements

217

individuels. Nous avons également constaté que l'expression de la survivine était

significativement diminuée en présence de tamoxifène seul, et d'une combinaison

de tamoxifène avec soit 200 soit 500 nmol / L de PQ1. Cependant, la PQ1 seule

n'affecte pas l'expression de la survivine dans les cellules T47D comme observé à

1, 48, et 72 h. Les études d'inhibiteurs des jonctions lacunaires réalisées à l'aide

de 20 mmol / L de CBX confirment en outre que les jonctions communicantes

jouent un rôle important dans la prolifération cellulaire et la mort cellulaire. En

outre, la possibilité que PQ1 affecte d'autres caspases pour induire l'apoptose n'a

pas été couverte par cette étude ; par conséquent, nous ne pouvons pas exclure

la participation d'autres caspases. Nous proposons que PQ1 permette au

tamoxifène (poids moléculaire = 371,51) de passer à travers les jonctions

communicantes entre les cellules, provoquant une action rapide du tamoxifène. À

l'appui de nos données, Jensen et Glazer (274) ont montré que l'expression forcée

de la Cx43 dans des cellules MCF-7 a donné lieu à une sensibilité accrue des

cellules au cisplatine à haute densité. Notre travail montre que la thérapie

combinatoire avec tamoxifène et PQ1 montre un rôle plus prometteur dans

l'induction de l'apoptose par activation de la caspase 3. Les études futures

porteront sur l'effet combinatoire de PQ1 et tamoxifène in vivo ainsi que la

réduction de la concentration du tamoxifène en présence de PQ1.

F/ Importance

Notre étude suggère que le traitement combinatoire permet une diminution

de la concentration du tamoxifène (inférieure à 10 mmol / L) dans l'utilisation

clinique. Le fait que le traitement combinatoire avec des activateurs des jonctions

GAP puisse abaisser la concentration de l'agent chimiothérapeutique aura une

forte implication puisque cela pourrait réduire les effets secondaires de ces

médicaments. Cependant, dans un contexte clinique, de nombreux facteurs sont

impliqués et les résultats ne peuvent pas être complètement prévisibles. En outre,

des études pharmacocinétiques sur la PQ1 pourraient faire la lumière sur l'effet

possible de la PQ1 en combinaison avec d'autres agents de chimiothérapie dans

un essai clinique. À l'avenir, nous procéderons à des études combinatoires de

PQ1 et de tamoxifène (dose réduite de mmol / L à nmol / L) et nous observerons

218

ses effets sur des systèmes cellulaires. Une grande partie des travaux présentés

ont porté sur des cellules de cancer du sein ; cependant, le rôle des activateurs

des jonctions lacunaires (PQ1) dans la sensibilité au médicament n'a pas besoin

d'être limitée au cancer du sein. Une variété d'autres cancers pourrait profiter d'un

mécanisme très similaire et, par conséquent, d'autres maladies pourraient

bénéficier des voies de modulation par les jonctions GAP

219

Troisième partie

Tests thérapeutiques

sur un modèle de

tumeurs spontanées

chez la souris MMTV-

PyVT

221

I/ La souris transgénique MMTV-PyVT comme modèle de

carcinome mammaire à plusieurs stades et efficacité du

traitement antinéoplasique

Traduit de l'anglais Shishido SN, Delahaye A, Beck A, Nguyen TA (351)

A/ Résumé

Les modèles animaux sont couramment utilisés pour analyser le

mécanisme de la carcinogenèse ainsi que le développement et le criblage de

médicaments puissants. Bien que de nombreux modèles animaux de cancer du

sein aient été utilisés dans la recherche, peu présentent plusieurs phases de la

tumorigenèse. La souche transgénique FVB/N-Tg (MMTV-PyVT) 634 Mul/J

(également connue sous le nom PyVT) a été établie pour déterminer l'effet de

l'expression de l'antigène moyen T du polyomavirus spécifiquement dans la

glande mammaire. Ici, le modèle PyVT avec trois stades distincts de

développement de la tumeur (Phases de pré-développement, développement

précoce et tardif) a été utilisé comme système modèle pour la mesure de la

croissance tumorale, la charge tumorale et les métastases de carcinomes

mammaires. En outre, le profil d'expression des marqueurs moléculaires survivine

et Ki-67, a été déterminé. Trois composés antinéoplasiques ont été testés sur une

période de 14 jours pour déterminer leur efficacité à atténuer la croissance

tumorale à chaque stade de développement. Il est intéressant que le cisplatine et

le paclitaxel aient été déterminés comme étant des médicaments anticancéreux

inefficaces, tandis que le tamoxifène a significativement réduit la croissance

tumorale aux stades de pré-développement et de développement précoce de la

formation tumorale.

B/ Introduction

Les modèles in vivo sont importants pour la recherche translationnelle et

peuvent être utilisés pour explorer le mécanisme de carcinogenèse ou la

222

pharmacodynamie et le développement de thérapies contre le cancer. Les

modèles animaux pour étudier la formation de cancer devraient inclure des

caractéristiques telles que les cibles moléculaires, le métabolisme des

médicaments, la pharmacocinétique / dynamique, la distribution des médicaments,

des similitudes anatomiques, le microenvironnement, l'angiogenèse et la

métastase. Variation de la taille de la tumeur est le point critique le plus largement

utilisé pour déterminer l'efficacité d'un médicament, mais la fréquence de tumeur,

la survie et la charge tumorale sont d'autres facteurs importants. Ainsi, les

systèmes de modèles spécifiques sont avantageux pour la mesure de la charge

tumorale, de la sensibilité aux médicaments et du potentiel métastatique. L'activité

antitumorale des agents de chimiothérapie est généralement déterminée chez la

souris immunodéficiente transplantée avec des tumeurs humaines, mais ces

xénogreffes de tumeurs présentent une perte potentielle de pouvoir tumorigène,

un potentiel métastatique limité dans de nombreuses lignées cellulaires et une

perte de linéarité avec un volume de plus en plus important de la tumeur (352).

Des modèles animaux ont évolué depuis les modèles de tumeurs

syngéniques transplantables de souris aux modèles animaux à tumeurs induites

chimiquement, transgéniques, et de tumeurs spontanées. De nombreux agents de

chimiothérapie ont montré des résultats prometteurs dans des modèles

précliniques et malgré tout eu une activité minimale dans les essais cliniques.

Cela a conduit au scepticisme vis à vis des xénogreffes et des modèles de

tumeurs syngéniques. De nouvelles techniques, y compris des modèles de souris

transgéniques, ont le potentiel d'être plus prédictives. La carcinogenèse est un

processus en plusieurs étapes et toutes les étapes de développement doivent être

prises en compte dans la conception de traitements plus efficaces. Dans la

mesure où plusieurs modèles transgéniques mammaires de cancer du sein

humain progressent au travers des phases bien définies du cancer, ce sont des

systèmes pré-cliniques utiles pour tester l'efficacité de la chimio-prévention et des

agents de chimiothérapie. L'utilisation de modèles de carcinome mammaire

transgéniques permet une étude détaillée des réponses spécifiques de chaque

stade aux agents antinéoplasiques, définissant le moment opportun pour

l'intervention avec des composés spécifiques.

223

La souche transgénique FVB/N-Tg (MMTV-PyVT) 634 Mul/J (également

connue sous le nom PyVT) est un nouveau modèle in vivo pour l'étude de la

formation des carcinomes mammaires et des metastases avec une utilité clinique

importante. Le modèle PyVT est porteur de l'antigène moyen T du polyomavirus

avec le promoteur du virus de tumeur mammaire de la souris (MMTV) qui dirige

l'expression de façon spécifique dans le tissu mammaire (353). L'oncogène PyVT

active de multiples voies oncogènes, telles que la protéine tyrosine kinase src et la

phosphatidylinositol-3-kinase (354), conduisant à un phénotype de tumeur

agressive. Des études antérieures indiquent que les femelles vierges portant le

transgène développent un carcinome canalaire multifocal, peu différencié, très

envahissant avant 10 - 12 semaines d'âge, avec une incidence élevée de

métastases pulmonaires issues de la tumeur mammaire primaire (355). A 5

semaines d'âge les femmes développent des lésions focales non invasives qui

sont classés en quatre groupes : simples, solides, kystiques et mixtes (solides et

kystiques) (356). Les lésions solides sont constituées de grands foyers d'une

masse dense de cellules atypiques en feuillets nodulaires. Les lésions kystiques

varient en taille et en complexité et sont bordées par un épithélium multicouche

avec des quantités importantes de liquide clair (356). Les tumeurs précancéreuses

sont morphologiquement des cellules néoplasiques hétérogènes et très

proliférantes avec atypies qui contiennent une micro-vascularisation anormale et

restent dans la membrane basale (356).

L'expression de MMTV - PyVT est variable dans les tumeurs (356), ce qui

suggère que le transgène n'est pas nécessaire pour le maintien de la tumeur

maligne. Le modèle PyVT représente un processus en plusieurs étapes en raison

de lésions progressant d'une hyperplasie à un phénotype mixte adénome /

néoplasie mammaire, puis aux carcinomes précoce et tardif avec métastases

pulmonaires (355, 356). La métastase de la tumeur primaire à des sites distants

demeure une cause importante de décès dans de nombreux types de cancer, ce

qui souligne l'importance d'un modèle métastatique. Ce modèle de carcinogenèse

mammaire spontanée est un outil puissant pour étudier le mécanisme associé à la

progression tumorale et le développement de nouveaux agents

chimiothérapeutiques.

224

Ce modèle n'a pas été utilisé pour tester l'efficacité de nombreux composés

anti-néoplasiques malgré sa pertinence clinique pour le cancer du sein humain.

Les composés utilisés ici sont le cisplatine, le paclitaxel et le tamoxifène. Le

mécanisme d'action est brièvement expliqué. Le cisplatine induit des dommages

au sein des tumeurs par formation d'adduits d'ADN, suivie par une inhibition de la

croissance cellulaire et induction de l'apoptose. Le paclitaxel empêche la

prolifération cellulaire en se liant à la tubuline et en inhibant le désassemblage des

microtubules dans la cellule. Le tamoxifène est un modulateur sélectif des

récepteurs aux oestrogènes (SERM) qui inhibe de façon compétitive la liaison de

l'oestradiol aux récepteurs aux oestrogènes. Les effets de ces composés sur la

souris porteuse du transgène MMTV-PyVT n'ont pas encore été rapportés.

La présente étude examine les caractéristiques du développement tumoral

et détermine les effets du traitement anti-néoplasique sur la carcinogenèse et la

métastase en utilisant le modèle de tumeur mammaire induit par le transgène

MMTV-PyVT. De façon intéressante, avec la progression e la malignité, on

observe une augmentation des niveaux d'expression de la protéine Ki-67 et de la

survivine associée à une diminution de l'expression des récepteurs aux

œstrogènes (ER) et à la progestérone (PR). Cela confirme les travaux antérieurs

sur ce modèle. Nous avons montré pour la première fois l'activité anticancéreuse

du tamoxifène, pas du cisplatine ou du paclitaxel, sur un modèle de tumeur

mammaire à plusieurs étapes de développement.


i/ Animaux

Une colonie de souris transgéniques FVB-TgN (MMTV-PyVT) (The Jackson

Laboratory, Bar Harbor, ME) a été établie. Pour identifier la descendance

transgénique, l'ADN génomique a été extrait à partir d'un écrêtage de queue de

1,5 cm. Toutes les souris porteuses du transgène PyVT ont développé des

tumeurs mammaires. Le développement de tumeurs chez les souris femelles

positives pour le transgène a été suivi de près tous les 2 - 3 jours. L'apparition de

225

tumeurs a été enregistrée ainsi que l'âge de l'animal auquel des masses

anormales palpables ont été détectées. La taille des tumeurs a été mesurée en

deux dimensions avec un pied à coulisse tous les 2 jours. Les souris à chaque

stade de développement tumoral ont été réparties au hasard en quatre groupes

expérimentaux : 1) les animaux témoins recevant le solvant (DMSO) ; 2) les

animaux traités avec 3,5 mg / kg de cisplatine ; 3) les animaux traités avec 10 mg /

kg de paclitaxel ; et 4) les animaux traités avec 20 mg / kg de tamoxifène. Tous les

traitements ont été administrés par injection par voie intrapéritonéale (IP) tous les

deux jours pendant 14 jours. Les soins aux animaux et les protocoles utilisés ont

été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des

animaux (IACUC) à Kansas State University, Manhattan, Kansas suivant les

directives du NIH.

ii/ Composés

Le cis-Diammineplatinum (II) dichlorure (P4394), le paclitaxel (T1912) et le

tamoxifène (T5648) ont été achetés chez Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA).

iii/ Anticorps

Les anticorps primaires : Anti-ERa (sc-8002, anticorps monoclonal de

souris), anti-ERb (sc-8974, anticorps polyclonal de lapin), anti-PR (sc-166170,

anticorps monoclonal de souris), anti-survivine (sc- 374616, monoclonal de souris)

et anti-Ki67 (sc-23900 , anticorps monoclonal de souris), de Santa Cruz

Biotechnology (Santa Cruz, CA) ; anti-GAPDH (2118, anticorps monoclonal de

lapin) de Cell Signaling (Boston, MA) ; anti-pan épithéliale (MAB1631) et anti-

épithélium pigmentaire (MAB1059) de Chemicon ; et anti- Her2 (AP7629e,

anticorps polyclonal de lapin) et anti-p53 (AP 6266b, anticorps polyclonal de lapin)

de Abgent (San Diego, CA) ont été utilisés à la fois pour les analyses western blot

et immunohistochimiques (IHC).

226

iv/ Analyse Western Blot

Le tissu de tumeur de la glande mammaire a été homogénéisé dans 500

mL de tampon de lyse (20 mM Tris pH 7,5, EDTA 0,5 mM, EGTA 0,5 mM, 0,5 %

de Triton X-100) avec des inhibiteurs de protéase à une dilution de 1:1000

(Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO). Les tissus ont été homogénéisés avec l'OMNI

Bead Ruptor 24 (Omni International, Kennesaw, GA) à une vitesse de 5,65 m / s

pendant 45 secondes, suivi par une centrifugation à 13 000 rpm pendant 30

minutes à 4°C. Vingt -cinq ug d'extrait de cellules entières ont été résolus sur gel

de SDS polyacrylamide à 10% (PAGE) et transférés sur une membrane de

nitrocellulose (Midwest scientifique, Saint Louis, MO). La membrane de

nitrocellulose a été bloquée dans du lait à 5% pendant une heure à température

ambiante, puis mise à incuber avec des anticorps monoclonaux (1:1000). Les

transferts western blot ont été détectés par des réactifs de détection par

chimioluminescence amplifiée (Pierce, Rockford, IL) et visualisés par le système

d'imagerie Fluorochem E (ProteinSimple, Santa Clara, CA).

v/ Immunohistochimie (IHC)

Les carcinomes mammaires et les organes ont été prélevés et fixés dans

une solution de formaldéhyde à 10% et incorporés dans de la paraffine

préalablement à leur sectionnement sur lames à une épaisseur de 5 um. Les

coupes en paraffine (5 um) ont été séchées à 60 ° C pendant 25 minutes. Le

déparaffinage a été réalisé avec 100 % de xylène et 100 %, 90%, 75%, 50 %

d'éthanol. L'antigène extraction a été effectuée dans une solution tampon de

citrate (1 x) dans une chambre à vapeur. Les lames ont ensuite été incubées

pendant une nuit à température ambiante avec un anticorps polyclonal (Dilution

1:50). Après lavages dans plusieurs bains de PBS, les lames ont été incubées

avec des anticorps secondaires biotinylés (1:1000) pendant 15 minutes. Les

lames ont été lavées et les immunomarquages ont été amplifiés par incubation

avec du complexe avidine biotine (ABC) pendant 10 minutes. Les cellules ont été

visualisées avec de la 3,3-diaminobenzidine (DAB) suivie d'une contre-coloration

227

hemalun-eosine. Les sections ont été observées et les images capturées avec un

microscope Nikon 80i sous un grossissement 40x et 60x.

vi/ Analyse statistique

La signification statistique a été déterminée pour une p-value ≤ 0,05 en

utilisant un t-test standard. Les données sont présentées comme la moyenne ±

l'intervalle de confiance à 95 % d'un minimum de six échantillons par groupe de

traitement.

D/ Résultats

Les souris transgéniques femelles FVB-TgN (MMTV-PyVT) ont développé

des tumeurs dès l'âge de 4 semaines. Tous les 10 coussinnets adipeux

mammaires ont développé des tumeurs avec une charge tumorale maximale

atteinte autour de 12 semaines d'âge. Le développement tumoral a été divisé en

trois phases sur la base de la mesure de la taille des tumeurs et de la fréquence

de formation de tumeurs. Le stade de pré-développement tumoral a commencé à

4 - 5 semaines d'âge, consistant en un état précancéreux où aucune tumeur n'a

été palpée et le tissu mammaire est apparu normal à l'observation brute. Le stade

précoce de développement a été limité à 6 - 8 semaines d'âge, représenté par

l'observation brute de 1 - 2 tumeurs solides dans le tissu mammaire. La phase

tardive a été basée sur la présence de l'ensemble des 10 tumeurs mammaires

primaires avec métastases pulmonaires secondaires ; cette phase est apparue

après 10 semaines d'âge. Des sections représentatives du tissu pulmonaire ont

été colorées avec de l'hémalun-éosine (H & E) pour l'examen histopathologique

afin de déterminer la présence de métastases.

Pour confirmer que les tumeurs PyVT étaient d'origine épithéliale, une

analyse immunohistochimique a été réalisée à chaque étape du développement

avec le facteur pan épithélium, facteur dérivé de l'épithélium pigmentaire, et l’E-

cadhérine (Fig. 59). Il y avait une forte coloration positive pour le facteur pan

épithélium aux stades de pré-développement et de développement précoce,

228

tandis que le stade tardif a montré une faible coloration. Ceci était cohérent pour le

facteur dérivé de l'épithélium pigmentaire (PEDF) et l'E-cadhérine. Ceci est

indicatif d'une transition dans le phénotype cellulaire, ce qui démontre le

processus de transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) dans ce modèle.

Les cancers du sein sont régulièrement testés pour le statut des récepteurs

hormonaux [récepteur aux œstrogènes (ER), récepteur à la progestérone (PR) et

récepteur humain au facteur de croissance épidermique 2 (HER2)] en raison de

leur relation avec les différents sous-types et leur impact sur le pronostic, le

traitement et la survie globale. Les tumeurs PyVT isolées à partir de tous les

stades de développement se sont avérées ER- et HER2-positives (Figure 60).

Seules les tumeurs de stades précoce et tardif exprimaient des niveaux

détectables de PR. Ceci a été confirmé par analyse Western blot (données non

présentées). L'expression du récepteur aux oestrogènes (ER), du récepteur à la

progestérone (PR) et du récepteur humain au facteur de crissance épidermique 2

(HER2) est un facteur pronostique et prédictif reconnu. L'ER est trouvé dans 50 %

- 80% des cancers du sein (357). Le PR est un marqueur de substitution d'un ER

fonctionnel et est exprimé dans 60 % - 70 % des cancers du sein invasifs avec

une positivité plus importante chez les femmes plus âgées et ménopausée (358).

HER-2/neu également connu sous le nom C-erbB2 (HER-2), est un proto-

oncogène situé sur le chromosome 17 et la protéine (HER 2) est surexprimée

dans 15 % - 25 % des carcinomes du sein invasifs associés à un mauvais

pronostic (359).

229

Fig. 59 : Immunohistochimie de tumeurs de souris PyVT aux stades de pré-développement,

développement précoce et développement tardif. Bleu = contre-coloration hemalun. Barre = 50µm.

Fig. 60 : Immunohistochimie de tumeurs de souris PyVT. Barre = 50µm. n=6

230

Il a été montré que les tumeurs exprimaient p53 (Fig. 60). P53 est un

marqueur pronostique pour le cancer du sein inflammatoire, une forme plus

agressive que le cancer du sein localement avancé (360). Il s'agit d'un senseur de

stress cellulaire et régulateur majeur de la programmation apoptotique (361). Le

rôle de la protéine p53 est de maintenir la stabilité du génome en tant que

régulateur de la transcription multifonctionnel participant au cycle cellulaire (362).

Dans les cellules dans lesquelles le gène p53 est actif, il fonctionne comme un

gène de survie et sa perte sensibilise la cellule au stress génotoxique (363). Des

niveaux élevés d'expression de p53 ont été associés à un mauvais pronostic (364).

Les cellules néoplasiques ont de multiples techniques de survie contre les

signaux de mort, telles que l'utilisation d'inhibiteurs de l'apoptose. La protéine anti-

apoptotique survivine est une protéine membre de la famille des inhibiteurs de

l'apoptose exprimée dans une gamme de types de tumeurs qui régule la mitose

(281-283). L'expression de la survivine est corrélée avec la résistance à la

chimiothérapie et à une rechute accélérée (284). L'analyse par immunotransfert de

l'homogénat de tumeur a indiqué que l'expression de la survivine augmentait avec

le développement de la tumeur (Fig. 61A). Ceci a été confirmé par

immunohistochimie (Fig. 61C).

La prolifération cellulaire a été déterminée par l'expression du facteur Ki- 67,

qui est détectable pendant toutes les phases actives du cycle cellulaire (G1, S, G2,

et la mitose) mais absent dans les cellules au repos (G0) (365). Une expression

élevée de la protéine Ki-67 est associée avec un taux de récidive plus élevé du

cancer du sein et une mauvaise survie des patients (366). Ki- 67 est l'un des cinq

gènes de prolifération parmi les 16 gènes associés au cancer, qui contribuent de

manière significative au score Oncotype (367). L'analyse Western blot du Ki-67

sur les tumeurs PyVT a montré une augmentation des niveaux d'expression avec

la progression de la tumeur vers un phénotype malin (Fig. 361). Ceci a été

confirmé par immunohistochimie (Fig. 61C).

231

Fig. 61 : Expression de marqueurs moléculaires aux trois stades de développement. A et B/

Western blot et leur analyse des protéines survivine (A) et Ki-67 (B). C/ Immunohistochimie des

tumeurs aux trois stades de développement. Bleu = contre-coloration hemalun. Barre = 20 µm

L'examen histopathologique des tumeurs mammaires a été réalisé pour

chaque groupe de traitement aux trois stades de développement tumoral.

Lorsqu'elles sont présentes, les tumeurs ont été classées comme adénome /

néoplasie mammaire intraépithéliale (MIN), carcinome précoce ou carcinome tardif

(Fig. 62). Adénome / MIN impliquaient l'expansion des acini et canaux par une

prolifération de cellules épithéliales néoplasiques polygonales avec coalescence

multifocale des canaux et des acini affectées. Les cellules néoplasiques

présentaient des atypies cellulaires minimales et un index mitotique faible (0-

2/champ à un grossissement x400). La prolifération néoplasique n'a pas franchi la

membrane basale et il y avait un manque de tissu conjonctif fibreux au sein de la

tumeur. Les carcinomes précoces étaient non encapsulés et modérément bien

délimités, avec des nids serrés et acini de cellules néoplasiques présentant des

atypies cellulaires légères à modérées et de 1 - 3 cellules en mitose par champ à

fort grossissement. Les cellules néoplasiques ont violé la membrane basale et

étaient séparées multifocalement par une quantité faible à modérée de stroma

fibro-vasculaire. Les carcinomes tardifs étaient non encapsulés, mal délimités et

232

invasifs, composés de feuillets de nids serrés et acini de cellules néoplasiques

séparées par des quantités modérées de stroma fibro-vasculaire. L'anisocytose et

l'anisocaryose étaient modérées et il y avait en moyenne 1-3 mitoses / champ à

grossissement 400x. Les tumeurs au stade de pré-développement tumoral étaient

soit des adénomes / MIN ou des carcinomes précoces, tandis que les tumeurs

précoces étaient toutes des carcinomes précoces. Les tumeurs tardives étaient

toutes des carcinomes tardifs.

Fig. 62 : Evaluation histo-pathologique de tumeurs mammaires de souris PyVT colorées à

l’hemalun-éosine (H&E). A/ Adénome / MIN B/ Carcinome précoce C/ Carcinome tardif. Barre = 50

µm. n = 3

Le carcinome mammaire développé par le modèle transgénique PyVT est

caractérisé par un modèle métastatique impliquant le tissu pulmonaire. Aucune

métastase pulmonaire n'a été observée au cours de la phase préliminaire de

développement tumoral. Les foyers métastatiques n'étaient pas généralement

trouvés chez les souris au stade précoce, mais quelques-unes développent de

petites lésions à environ 8 semaines d'âge (Fig. 63A). Les souris au le stade tardif

de développement avaient formées de grosses tumeurs secondaires dans

l'épithélium pulmonaire ; ce qui a été déterminé par observation macroscopique et

histopathologie (Fig. 63B-D). Les tumeurs pulmonaires présentaien des

caractéristiques histopathologiques similaires à celles du tissu mammaire.

Fig. 63 : Métastases de tumeurs mammaires

dans les poumons, colorées à l’hemalun-éosine.

A/ Stade précoce de développement B-D/ Stade

tardif de développement Barre = 50 µm. n = 3

233

La croissance tumorale a été surveillée pendant deux semaines au cours

de chaque étape de développement. Le volume tumoral initial pour les souris au

stade de pré-développement était de 7,57 ± 10,77 mm3 à 5 semaines d'âge. Deux

semaines après l'évaluation initiale des souris au stade de pré-développement, les

tumeurs se sont développées pour attaindre un volume total moyen de 309,04 ±

16,63 mm3 (Fig. 64A). Lors de la phase précoce de développement, le volume

tumoral initial a été mesuré à 6 semaines d'âge pour être 133,33 ± 76,59 mm3. A

8 semaines d'âge, 14 jours après la mesure initiale, les souris au stade précoce

ont développé un volume tumoral total moyen de 450,71 ± 39,56 mm3 (Fig. 64B).

Le stade tardif de développement tumoral a commencé à 10 semaines d'âge,

lorsque les souris avaient un volume tumoral initial de 588,3 ± 78,87 mm3. 14

jours après la mesure initiale du volume tumoral, le volume tumoral total était de

1727,21 ± 50,82 mm3 (Fig. 64C).

L'effet des trois composés anti-néoplasiques sur le développement de

tumeurs a été testé dans le modèle de souris PyVT. Le traitement par le cisplatine

ou le paclitaxel n'a pas atténué de manière significative la croissance tumorale aux

stades de pré-développement, de développement précoce ou tardif (données non

présentées). En revanche, le traitement par le tamoxifène a, quant à lui,

significativement atténué la croissance tumorale au cours des phases de pré-

développement et de développement précoce des tumeurs (Fig. 64A-B). Le

volume tumoral était significativement différent entre les souris traitées au

tamoxifène et celles traitées au DMSO au cours de la phase de pré-

développement tumoral du jour 10 au jour 14 (Fig. 64A). Le changement de

volume tumoral au cours de cette période de 14 jours a montré une réduction

significative de 124 mm3 du traitement au tamoxifène par rapport au témoin (p-

value = 0,018). Lors de la phase précoce de développement, il existait une

différence significative en termes de volume tumoral entre les groupes traités au

tamoxifène et contrôles au jour 14 (Figure 64B). Le tamoxifène a significativement

diminué le volume tumoral initial de 148 mm3 à un volume final de 306 mm3 après

14 jours de traitement (p = 0,013) avec une taille moyenne des tumeurs après 14

jours de traitement au tamoxifen 144 mm3 inférieure à celle du volume de final

des tumeurs contrôles, ce qui représente une réduction de 31 %. Le traitement au

tamoxifène n'a pas réduit de manière significative la croissance des tumeurs au

234

cours du stade tardif de développement tumoral (Fig. 64C). Il n'y avait pas de

changement observable dans la formation de lésions pulmonaires métastatiques.

Fig. 64 : Croissance tumorale chez les souris PyVT femelles. Tumeurs mesurées tous les deux

jours. A/ Stade de pré-développement B/ Stade précoce C/ Stade tardif. Tamoxifène : 20 mg/kg.

DMSO = véhicule. 7 injections intra-péritonéales sur une période de 14 jours. * = p < 0,05 (par

rapport au contrôle)

E/ Discussion

Tout au long de l'histoire, les scientifiques ont utilisé une multitude de

modèles animaux pour résoudre des problèmes médicaux, développer de

nouvelles techniques et traitements et guérir les maladies. Des souris

génétiquement modifiées sont produitent dans le domaine du cancer, ce qui

permet aux chercheurs d'étudier plusieurs aspects du cancer. De nombreux types

d'animaux transgéniques ont été développés, dont la plupart ont été utilisés en

petits nombres comme outils d'investigation de la fonction des gènes in vivo.

Plusieurs caractéristiques du modèle PyVT le rendent idéal pour la recherche,

telles que la stabilité de la colonie, le comportement prévisible de la croissance

tumorale, le phénotype métastatique et sa similitude clinique avec les néoplasmes

humains.

Le procédé EMT implique que les cellules épithéliales de carcinome

acquièrent des marqueurs mésenchymateux, tels que la vimentine, de manière à

accroître leur potentiel métastatique [367, 368], ainsi que la perte des molécules

d'adhésion cellulaire épithéliales [368, 369]. L'altération de l'expression des E-

cadhérines est le marqueur typique des cellules épithéliales dans l'EMT (370) ; en

outre, la perte de fonctionnalité des E-cadhérines favorise l'EMT (371). Les

changements observés dans l'expression du marqueur épithélial dans les tumeurs

235

PyVT isolées sont compatibles avec le processus d'EMT. Par ailleurs, la

diminution de PEDF, une protéine sécrétée multifonctionnelle avec des fonctions

anti-angiogéniques et anti-oncogènes, est associée à la progression vers la

malignité et un mauvais pronostique pour le patient (372).

Les tumeurs mammaires PyVT se sont avérées ER +, PR +, P53 + et HER-

2 + par immunohistochimie. Cela contredit les résultats de Maglione et al. (356),

qui indiquaient que les tumeurs identifiées comme des néoplasies mammaires

intraépithéliales (MIN) n'avaient pas de niveaux détectables d'antigène PR.

Maglione et al. utilisaient des femelles vierges de 9 semaines d'âge avec le

transgène PyVT ; c'est dans la tranche d'âge entre les stages de développement

précoce et tardif définis ici. La différence entre les résultats peut être due au taux

de dilution de l'anticorps primaire utilisé pour l'immunohistochimie. Maglione et al.

utilisaient un rapport de 1:1800, résultant en aucune présentation de l'antigène. Ici,

nous avons utilisé un rapport de 1:50 selon les recommandations du fabricant,

fournissant plus d'anticorps pour se lier à une petite quantité d'antigène. De plus,

l'expression des récepteurs hormonaux montre un changement cyclique au cours

du cycle oestral chez la souris (373, 374). Cette variation implique que la phase du

cycle, et donc le moment de la récolte des tissus, peut déterminer l'expression de

PR dans les carcinomes mammaires recueillis.

D'autres études sur le phénotype tumoral PyVT indiquent une perte de

l'ERa et du PR lors de la progression vers la malignité de la tumeur (355). Les

résultats présentés ici appuient ces conclusions. En outre, ERß s'est également

avéré diminuer avec l'augmentation de malignité (Fig. 60). Les gènes ER

partagent une large homologie mais diffèrent quant à leur distribution et à leurs

fonctions dans de nombreux types de tissus. Alors qu’ERα est un marqueur

pronostique connu dans le cancer du sein, le rôle d’ERβ est moins clair. Une

diminution de l'expression de la protéine ERß a été montrée dans la transition de

la glande mammaire normale à une tumeur pré-invasive (375). La perte de la

protéine ERß dans les carcinomes invasifs est en corrélation avec les taux

d'ARNm reportés dans les tumeurs du sein (376). Dans l'ensemble, ces résultats

démontrent pour la première fois une régulation à la baisse au cours de la

carcinogenèse du récepteur ERß dans le modèle PyVT.

236

Il est intéressant que l'expression de ER et Ki- 67 soit mutuellement

exclusive dans les tissus mammaires normaux avant la ménopause, mais la co-

expression se produit dans le cancer du sein ER +. Avec l'âge, la population de

cellules ER + augmente, tandis que le nombre de cellules Ki-67+ diminue dans le

tissu mammaire sain (377). La transformation d'un tissu normal à une néoplasie

peut inverser ce phénotype. Les résultats présentés ici montrent que le nombre de

cellules ER + diminue et le nombre de cellules Ki-67 + augmente avec la

progression tumorale vers un phénotype malin. L'augmentation observée de

l'expression du facteur Ki-67 correspond à la constatation précédente que la

cycline D1, un régulateur du cycle cellulaire également utilisé en tant que

marqueur moléculaire pour la prolifération, augmente au cours de la progression

tumorale PyVT (355).

Une forte expression de la protéine survivine est observée dans la majorité

des types de cancer et est associée à une tumeur progression et chimiorésistance

(378). Une expression élevée est aussi associée à une maladie agressive et a une

forte corrélation avec un mauvais pronostic pour le malade. Le modèle PyVT a

une expression accrue de la protéine survivine avec progression du phénotype de

la tumeur vers la malignité. La survivine peut réguler le cycle cellulaire, la

cytocinèse et l'apoptose à travers de multiples interactions, comme par exemple

avec la protéine de choc thermique 90 (379), Smac/Diablo (380), Cdk4 (381) et

p53 (382). L'augmentation observée de l'expression de la survivine suggère

qu'elle joue un rôle dans la formation et le développement tumoral dans le modèle

PyVT.

La protéine p53 est un suppresseur de tumeur qui empêche la progression

du cycle cellulaire et pourrait induire l'apoptose (383, 384). Les tumeurs PyVT se

sont révélées être positives pour la protéine p53 à chaque étape de

développement. Fait intéressant, la séquence du promoteur de la survivine a deux

sites de liaison de p53 (385). La surexpression de la protéine survivine sauve les

cellules néoplasiques de l'apoptose induite par p53 (382). L'augmentation de

l'expression de la survivine avec la progression tumorale associée à une forte

expression de la p53 suggère que la cellule éhappe à l'apoptose dépendante de

p53 par le biais de la régulation à la hausse de la survivine.

237

De précédentes investigations sur le modèle transgénique PyVT se sont

limitées à étudier la fonction des gènes ou la caractérisation histologique afin de

prouver la similitude clinique avec le cancer du sein humain. Ce modèle n'a pas

été utilisé pour tester l'efficacité de composés anti-néoplasiques, malgré le

développement tumoral en diférents stades et les similitudes avec le cancer du

sein humain. Les composés cisplatine, paclitaxel et tamoxifène ont été choisis en

raison de leur popularité dans le traitement du cancer. Il est intéressant de

constater que le cisplatine et le paclitaxel ne sont pas des traitements

anticancéreux efficaces, alors que le tamoxifène atténue efficacement la formation

tumorale dans le modèle PyVT. L'absence de réponse au cisplatine et au

paclitaxel suggère des mécanismes potentiels de résistance, comme une

réduction de l'accumulation du composé à l'intérieur des cellules néoplasiques en

raison de barrières membranaires ou d'une augmentation de l'efflux, des

mécanismes de réparation rapide, ou une modulation des voies de l'apoptose.

Il y a un besoin urgent de médicaments chimiothérapeutiques efficaces et à

faible toxicité et d'agents de chimio-prévention contre les carcinomes mammaires.

Ici, l'effet inhibiteur du tamoxifène est démontré sur le développement de tumeurs

dans le modèle MMTV-PyVT. Le tamoxifène a été amplement étudié mais c'est la

première fois que son efficacité dans un modèle de carcinome mammaire en

plusieurs étapes avec métastases pulmonaires a été démontrée. L'exposition au

tamoxifène avant l'apparition de tumeurs mammaires palpables réduit

significativement la charge tumorale et atténue la croissance tumorale. Toutefois,

lorsque l'exposition au tamoxifène a commencé après l'apparition de tumeurs

mammaires visibles, il a été moins efficace sur l'atténuation de la croissance et du

développement de métastases tumorales, sans modifier la charge tumorale

primaire. Le mécanisme par lequel le tamoxifène a supprimé le développement

tumoral peut être associé à la séquence du promoteur MMTV dans ce modèle

induit par le transgène. La séquence du promoteur MMTV contient un élément de

réponse aux hormones (HRE) qui peut se lier aux récepteurs aux progestatifs,

androgènes et glucocorticoïdes. Une hormone qui se lie à son récepteur peut

entrer dans le noyau où le complexe peut se lier à l'HRE et stimuler la séquence

MMTV. Le MMTV est activé par un niveau élevé d'oestrogènes et un progestatifs,

régulant à la hausse l'expression des gènes cibles et induisant la formation de

238

cancer (386). Des traitements avec de l'oestradiol exogène et de la progestérone

a montré une augmentation de l'expression de l'ARNm MMTV (387). Par

conséquent, par traitement avec le tamoxifène, l'hormone est incapable de se lier

à l’ER, de se transloquer vers le noyau et lier l'HRE dans la séquence du

promoteur MMTV. Cela empêche l'activation du promoteur et réduit l’expression

de l'antigène PyVT.

Il a été montré que le tamoxifène était efficace seulement pendant les

phases de pré-développement et de développement précoce des tumeurs. Des

recherches précédentes ont montré que les tumeurs avaient une expression

variable de l'antigène PyVT, ce qui indique une importance de l'expression du

transgène dans l'initiation de la formation de tumeurs mais pas dans la persistance

d'un phénotype malin (356). Ceci suggère que, lors des étapes de pré-

développement et de développement précoce des tumeurs, lorsque le transgène

est plus fortement exprimé, le tamoxifène peut empêcher l'activation subséquente

du MMTV et l'expression de l'antigène PyVT. En outre, la constatation que le

tamoxifène supprimait efficacement le développement des tumeurs mammaires

spontanées à ces stades fournit la preuve que ce composé peut être

bénéfiquement utilisé comme agent de chimioprévention et de chimiothérapie pour

une intervention précoce pour réduire la morbidité et la mortalité associées à cette

maladie néoplasique.

La région de la longue répétition terminale (LTR) du promoteur du MMTV a

été montré précédemment de ne pas être modulée à la baisse par les effets anti-

œstrogéniques du tamoxifène (388) mais cette étude a été menée dans la lignée

cellulaire de cancer du sein T47D transfectée de façon stable avec la LTR du

MMTV. Il n'existe pas de données indiquant que les concentrations systémiques

en œstrogènes ou le traitement au tamoxifène dans le modèle de souris

transgénique ne modifient pas l'activation du promoteur. De multiples études

menées sur des souris transgéniques en utilisant la séquence de promoteur

MMTV présentent des effets anticancéreux avec l'utilisation du tamoxifène (389-

392) mais elles n'indiquent pas si la séquence du promoteur joue un rôle dans

l'efficacité du composé.

Cette étude porte sur la souris transgénique PyVT utilisée comme modèle

pour la recherche sur le cancer du sein et le développement de médicaments. La

239

croissance tumorale a été contrôlée depuis un stade pré-cancéreux jusqu'à un

stade métastatique. Le phénotype de la tumeur a été déterminé pour trois

périodes distinctes de développement mettant l'accent sur un changement dans le

phénotype cellulaire (i.e. EMT) et l'expression des récepteurs hormonaux, une

modification de la prolifération, les modes de survie et une analyse

histopathologique détaillée des lésions de carcinome mammaire. Pour la première

fois ce modèle a été utilisé pour déterminer l'efficacité de trois composés

antinéoplasiques communs sur le développement des carcinomes mammaires

spontanés. Le tamoxifène peut atténuer la formation du carcinome du sein s'il est

administré suffisamment tôt pour inhiber la transformation des cellules normales.

Le mécanisme de chimioprévention par le tamoxifène pourrait impliquer une

réduction du nombre total de cellules transformées par le transgène MMTV-PyVT.

Ces données suggèrent que le tamoxifène, et pas le cisplatine ou le paclitaxel,

peut améliorer les résultats cliniques chez les patients avant le diagnostic de la

maladie au stade métastatique et pourrait réduire la morbidité et la mortalité

associée au cancer du sein.

241

II/ Effet anticancéreux de la molécule PQ1 sur le modèle de

souris MMTV-PyVT

Traduit de l'anglais : Shishido SN, Delahaye A, Beck A, Nguyen TA (393)

A/ Résumé

Les modèles animaux sont couramment utilisés pour analyser les

mécanismes de la carcinogenèse, ainsi que le développement et le criblage de

médicaments puissants. Ici, la souche transgénique FVB / N-Tg (MMTV-PyVT)

634Mul / J (également connue sous le nom PyVT) a été utilisée en tant que

système modèle pour mesurer la charge tumorale, la sensibilité aux médicaments,

et les métastases de carcinomes mammaires. La perte de communication

intercellulaire au travers des jonctions GAP (GJIC) et la régulation à la baisse de

l'expression des connexines sont caractéristiques des cellules néoplasiques. La

quinoléine substituée, 6-méthoxy-8-[(3-aminopropyl) amino]-4-méthyl-5-(3-

phényloxy-trifluorométhyl) quinolone (PQ1), a été démontrée pour rétablir la GJIC

et augmenter l'expression des connexines dans des lignées cellulaires de cancer

du sein tout en n'affectant pas les cellules mammaires normales, ce qui suggère

que cette molécule peut fournir un traitement anticancéreux efficace avec moins

d'effets néfastes. Le modèle de souris développant des tumeurs mammaires de

façon spontanée : PyVT a été utilisé pour déterminer les effets biologiques et

histologiques de PQ1 sur la tumorigenèse et les métastases à trois stades de

développement : Pré-tumeur, tumeur précoce et tumeur tardive. Le traitement par

PQ1 à chacun des trois stades de développement a significativement réduit la

croissance tumorale. Le traitement PQ1 a également augmenté l'expression de

Cx43 aux stades pré-tumoral et tumeur précoce, alors qu'il a empêché une

augmentation de l'expression de la Cx46 au cours du stade de formation tumorale

tardive. Cette étude montre que l'expression de la Cx43 et la croissance cellulaire

néoplasique sont inversement liées, mais que PQ1 peut modifier la croissance des

tumeurs par le ciblage des protéines des jonctions lacunaires pour prouver

l'efficacité clinique dans le traitement de tumeurs mammaires spontanées.

242

B/ Introduction

Les traitements du cancer à l'aide de chimiothérapies qui ciblent la

destruction des cellules qui prolifèrent conduisent à des effets secondaires graves

en raison du manque de spécificité pour les cellules cancéreuses. Une

caractéristique des cellules cancéreuses est la perte de communication

intercellulaire au travers des jonctions GAP (GJIC). La GJIC maintient

l'homéostasie tissulaire par le partage de petits métabolites via des canaux dans

la membrane cellulaire de cellules voisines. Kanno et Loewenstein ont rapporté

l'absence de couplage électrique dans les hépatomes de rat en 1966 (2). Ceci a

été observé dans des hépatomes chimiquement induits et transplantés (2, 394)

qui diffèrent de manière significative des cellules hépatiques normalement bien

couplées. Le manque de couplage électrique est vite devenu une caractéristique

commune trouvée dans les tumeurs solides, chimiquement induites, transplantées

ou spontanément formées. Il y a plus de 40 ans, la recherche a confirmé qu'une

carence en jonctions GAP et donc en GJIC était associée aux phénotypes

cancéreux (245, 265). De nombreux agents de promotion des tumeurs, tels que le

phénobarbital, ont été montré pour empêcher laGJIC (321, 395). Ceci renforce

l'hypothèse qu'une carence en GJIC conduit à la tumorigenèse.

Des traitements qui ciblent les jonctions communicantes offrent une

spécificité pour les cellules néoplasiques, tandis que la restauration de GJIC

pourrait efficacement atténuer la croissance des tumeurs avec moins d'effets

néfastes pour l'hôte. La PQ1, 6-méthoxy-8-[(3-aminopropyl) amino]-4-méthyl-5-(3-

trifluorométhyl-phényloxy) quinolone, a été trouvée présenter des activités

inhibitrices puissantes contre des cellules de cancer du sein T47D grâce à

l'amélioration de la GJIC (180, 202). Ce composé a la capacité d'améliorer la GJIC

dans les cellules cancéreuses et a des propriétés anticancéreuses. Des études

antérieures indiquent que l'administration de PQ1 par gavage a une faible toxicité

pour les tissus normaux, est sans effet indésirable observable (396) tout en

atténuant considérablement la croissance tumorale (267).

La souche FVB transgénique / N-Tg (MMTV-PyVT) 634Mul / J (également

connue sous le nom PyVT) est utilisée dans cette étude comme un nouveau

243

modèle in vivo pour la formation de cancer du sein humain et de métastases. Le

modèle PyVT est porteur de l'antigène moyen T du polyomavirus avec le

promoteur du virus de tumeur mammaire de la souris (MMTV) qui dirige

l'expression de façon spécifique dans le tissu mammaire (353). Les femelles

vierges qui portent le transgène développent des carcinomes canalaires mal

différenciés, multifocaux et invasifs avant l'âge de 10 à 12 semaines de l'âge, avec

une forte incidence de métastases pulmonaires provenant de la tumeur mammaire

primaire (355). Des lésions non invasives se développent dès l'âge de 5 semaines

et sont classées en quatre groupes : simple, solide, kystique et mixte (solide et

kystique) (356). Les tumeurs pré-malignes PyVT sont formées de cellules

néoplasiques morphologiquement hétérogènes, très proliférantes, avec des

noyaux atypiques, qui restent dans confinées au sein de la membrane basale

(356). Des études antérieures indiquent de faibles niveaux de récepteurs aux

oestrogènes (ER) et de p53 détectables, et pas de cellule positive pour les

récepteurs aux progestérones (PR) (356). Le modèle PyVT peut être utilisé pour

représenter un processus en plusieurs étapes en raison des lésions progressant

d'une simple hyperplasie à un phénotype mxte adénome / néoplasie intra-

épithéliale mammaires, suivies par un carcinome précoce puis tardif avec

métastases pulmonaires (355, 356). Les lésions PyVT sont également

cliniquement similaires aux hyperplasies atypiques humaines, ce qui ajoute à la

valeur de ce modèle spontané.

La présente étude se focalise sur l'utilisation de la PQ1 comme traitement

du carcinome mammaire dans le modèle spontané murin PyVT. Nous avons

profité de la production in situ de tumeurs mammaires chez les souris

transgéniques pour déterminer les effets biologiques et histologiques de PQ1 sur

la tumorigenèse spontanée et les métastases. Le développement des tumeurs a

été divisé en trois périodes : stade pré-tumoral (souris de 4 semaines d'âge),

stade tumoral précoce (souris de 6 à 8 semaines d'âge) et stade tumoral tardif

(souris de plus de 10 semaines d'âge). Pour chaque étape, les groupes traités et

les groupes témoins ont été évalués. Les résultats ont démontré une réduction

significative de la croissance tumorale chez les souris traitées par avec PQ1 par

rapport aux contrôles traités avec du DMSO ou sans traitement. En outre, des

études Western blot et immunohistochimiques ont montré une augmentation de

244

l'expression des connexines dans les tumeurs traitées. Pour la première fois, la

modification de l'expression des connexines a été corrélée à la croissance

tumorale dans un modèle animal spontané de carcinome mammaire.

C/ Matériel et méthodes

i/ Composés

La quinoléine substituée PQ1, 6-méthoxy-8-[(3-aminopropyl) amino]-4-méthyl-5-

(3-tri-fluorométhyl-phényloxy) quinolone, a été synthétisée par le laboratoire du Dr

H. Hua Duy (180).

ii/ Animaux


Laboratory, Bar Harbor, ME) a été établie. Pour identifier la descendance

transgénique, l'ADN génomique a été extrait à partir d'un écrêtage de queue de

1,5 cm. Le développement de tumeurs chez les souris femelles positives pour le

transgène a été suivi de près. L'apparition de tumeurs a été enregistrée ainsi que

l'âge de l'animal auquel des masses anormales palpables ont été détectées. La

taille des tumeurs a été mesurée en deux dimensions avec un pied à coulisse tous

les 2 jours à partir de quatre semaines d'âge. Les souris ont été observées pour

un changement de comportement, d'apparence ou de poids. Lorsque les animaux

ont atteint la tranche d'âge spécifique, six animaux ont été assignés au hasard à

chaque groupe de traitement. Les animaux traités ont reçu 25 mg / kg de PQ1 par

injection intrapéritonéale (IP). Les soins aux animaux et les protocoles utilisés ont

été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des

animaux (IACUC) à Kansas State University, Manhattan, Kansas suivant les

directives du NIH.

245

iii/ Anticorps

Les anticorps primaires : Anti-Cx46 (sc-20859, anticorps polyclonal de

chèvre), anti-PKCa (sc-8393, anticorps monoclonal de souris) et anti-Cx43 (sc-

13558, anticorps monoclonal de souris), de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz,

CA) ; anti-GAPDH (2118, anticorps monoclonal de lapin) de Cell Signaling (Boston,

MA) ; anti-p53 (AP6266b, anticorps polyclonal de lapin) de Abgent (San Diego, CA)

ont été utilisés à la fois pour les analyses Western blot et immunohistochimiques

(IHC).

iv/ Analyse Western blot

Le tissu des tumeurs mammaires et d'organes sélectionnés (cerveau, cœur,

foie et reins) a été homogénéisé dans 500 mL de tampon de lyse cellulaire (Tris

20 mM, pH 7,5, EDTA 0,5 mM, EGTA 0,5 mM, 0,5% de Triton X-100) avec des

inhibiteurs des protéases à une dilution de 1:1000 (Sigma-Aldrich, Saint Louis,

MO). Les tissus ont été homogénéisés avec l'OMNI Bead Ruptor 24 (Omni

International, Kennesaw, GA) à une vitesse de 5,65 m / s pendant 45 secondes,

suivi par une centrifugation à 13 000 rpm pendant 30 minutes à 4 ° C. Vingt-cinq

microgrammes d'extrait de cellules entières ont été résolus sur gel de SDS

polyacrylamide à 10% (PAGE) et transférés sur une membrane de nitrocellulose

(Midwest scientifique, Saint Louis, MO). La membrane de nitrocellulose a été

bloquée dans du lait à 5% pendant une heure à température ambiante, puis mise

à incuber avec des anticorps monoclonaux (1:1000). Les transferts western blot

ont été détectés par des réactifs de détection par chimioluminescence amplifiée

(Pierce, Rockford, IL) et visualisés par le système d'imagerie Fluorochem E

(ProteinSimple, Santa Clara, CA).

v/ Immunohistochimie


une solution de formaldéhyde à 10% et incorporés dans de la paraffine

préalablement à leur sectionnement sur lames à une épaisseur de 5 um. Les

246

coupes de paraffine (5 um) ont été séchées à 60�°C pendant 25 minutes. Le

déparaffinage a été réalisé avec 100% de xylene et 100%, 90%, 75% et 50%

d'éthanol. L'extraction antigénique a été effectuée dans une solution tampon de

citrate (1x) dans une chambre à vapeur. Les lames ont ensuite été incubées

pendant une nuit à température ambiante avec un anticorps polyclonal (dilution

1:50). Après lavage dans plusieurs bains de PBS, les lames ont été incubées avec

des anticorps secondaires biotinylés (dilution 1: 1000) pendant 15 min. Les lames

ont été lavées et les immunomarquages ont été amplifiés par incubation avec du

complexe avidine biotine (ABC) pendant 10 minutes. Les cellules ont été

visualisées avec de la 3,3-diaminobenzidine (DAB), suivie d'une contre-coloration

à l'hémalun-eosine. Les sections ont été observées et les images capturées avec

un microscope Nikon 80i sous un grossissement 40x et 60x.


La signification statistique a été déterminée pour une p-value inférieure ou

égale à 0,05. Les données sont présentées comme la moyenne plus ou moins

l'intervalle de confiance à 95% d'un minimum de trois échantillons par groupe de

traitement.

D/ Résultats

Les souris transgéniques femelles FVB-TgN (MMTV) PyVT ont développé

des tumeurs à 5 semaines d'âge, avec le potentiel de développer des tumeurs

dans les 10 coussinets adipeux mammaires. Le développement tumoral a été

divisé en trois phases en fonction de la taille des tumeurs et de la fréquence de

formation tumorale. Le stade de pré-développement tumoral a eu lieu de 4 à 5

semaines d'âge et se composait d'un état précancéreux où aucune tumeur n'état

palpable et le tissu mammaire semblait normal à l'observation. Le stade précoce

de développement représentait la formation de tumeurs solides dans le tissu

mammaire à 6-8 semaines d'âge avec l'observation d'une ou deux tumeurs solides.

Le stade tardif commençait après 10 semaines d'âge et se présentait sous forme

247

de tumeurs primaires sur l'ensemble des 10 glandes mammaires avec métastases

pulmonaires secondaires. La présence de métastases a été confirmée par

coloration hémalun-éosine (H&E) des sections représentatives du poumon et

examen histopathologique.

La croissance tumorale sur une période de 14 jours avec sept injections IP

de DMSO pour le contrôle ou PQ1 a montré un effet significatif du traitement PQ1

sur le développement néoplasique à chacun des trois stades de développement

chez la souris PyVT femelle (Fig. 65). Il n'y avait pas de différence significative

entre les témoins (groupe sans aucun traitement et groupe de traitement DMSO).

Le volume tumoral initial pour toutes les souris au stade de pré-développement

était de 14,74 ± 11 mm3. Il y avait une différence significative dans les volumes

des tumeurs entre les souris traitées avec PQ1 et DMSO au cours du stade de

pré-développement tumoral du jour 4 au jour 14 (Fig. 65A). Le traitement PQ1 a

diminué de manière significative la taille de la tumeur initiale (évaluée au jour 0) à

6,4 mm3 au cours de la période de traitement de 14 jours (p = 0,046). La

croissance tumorale finale des souris témoins traitées au DMSO était de 377 mm3.

Le changement de volume de la tumeur au cours de la période de 14 jours a

montré une réduction significative de 40 mm3 avec le traitement PQ1 par rapport

aux deux témoins (p <0,0001 ; Figure 65B). Il y a eu une réduction de 56% de la

taille initiale de la tumeur chez les souris au stade de pré-développement tumoral

après traitement PQ1.

Le volume de la tumeur initiale pour toutes les souris à un stade précoce

était de 129 ± 49 mm3. Au cours de ce stade de développement il y avait une

différence significative de volume tumoral entre les groupes de traitement des

jours 8 à 14 (Fig. 65C). Le traitement PQ1 a diminué de manière significative la

taille initiale de la tumeur à un volume final de 72 mm3 après 14 jours de

traitement (p = 0,0002), tandis que le volume final pour le groupe témoin traité au

DMSO était de 410 mm3. La taille moyenne des tumeurs après 14 jours de

traitement PQ1 était 57 mm3 inférieure au volume initial, ce qui est une réduction

significative de 44% de la taille initiale de la tumeur par rapport aux témoins (p

<0,0001; Figure 65D). Le traitement PQ1 au cours de la phase précoce de

développement a entraîné une réduction de 53 et 56% du volume initial de la

tumeur par rapport aux contrôles : absence de traitement et traitement au DMSO,

248

respectivement.

Au stade tardif de développement de la tumeur, les souris ont commencé le

traitement avec un volume tumoral initial de 610 ± 104 mm3. Le traitement PQ1 a

atténué la croissance des tumeurs par rapport au témoin, indiqué par un volume

final de 1 727 mm3 pour le contrôle traité au DMSO et 968 mm3 après traitement

PQ1 sur une période de 14 jours (p = 0,0001 ; Fig. 65E).

Fig. 65 : Croissance tumorale (en mm3) chez la femelle PyVT femelle. A, B/ Stade de pré-

développement tumoral. C, D/ Stade précoce. D, E/ Stade tardif. Les jours 0-12 correspondent aux

7 injections et le jour 14 correspond à la fin de l’étude (mesures avant prélèvement des organes).

PQ1 : 25 mg/kg. * = p < 0,05 (par rapport aux contrôles : pas de traitement et traitement au DMSO).

n = 6

249

Le traitement PQ1 conduit à une réduction significative de la croissance

tumorale par rapport aux témoins (psans ttt = 0,001, pDMSO = 0,016); les contrôles ont

augmenté de 1 463 et 1 008 mm3 pour l'absence de traitement et le DMSO,

respectivement, tandis que les tumeurs traitées avec la PQ1 n'ont augmenté que

de 382 mm3 (Fig. 65F). Il s'agit d'une réduction de 26 et 38% de la croissance

tumorale avec le traitement PQ1 par rapport aux contrôles : aucun traitement et

DMSO, respectivement.

Les souris PyVT ont un total de 10 coussinets adipeux mammaires qui

peuvent développer des tumeurs au cours de leur vie. La charge tumorale a été

surveillée au cours du traitement, et le nombre final de tumeurs pour chaque

traitement à chaque étape de développement est présenté en figure 2. Au cours

de toutes les étapes, il n'y avait pas de différence significative entre les charges

tumorales des groupes témoins. Le traitement avec PQ1 au cours du stade de

pré-developpement a réduit significativement le nombre de tumeurs développées

après le traitement (p = 0,0002 ; Fig. 66A). Au cours de la phase précoce de

formation tumorale, le traitement PQ1 a réduit significativement la charge tumorale

par rapport au groupe témoin traité au DMSO (p = 0,02 ; Fig. 66B). Le groupe

contrôle sans traitement pour ce stade de développement avait une plus grande

variation dans le nombre de tumeurs développées que dans le groupe témoin

traité au DMSO, ceci étant la différence n'était pas significative. Il n'y avait pas de

différence significative dans la charge tumorale entre les groupes expérimentaux

au stade tardif de dévloppement (Fig. 66C).

Fig. 66 : Nombre de tumeurs développées chez la souris PyVT femelle. A/ Stade de pré-développement tumoral. B/ Stade précoce. C/ Stade tardif. PQ1 : 25 mg/kg. * = p < 0,05 (par rap-port au contrôle : traitement au DMSO).

250

L'examen histopathologique a été mené sur les tumeurs mammaires pour

chaque groupe de traitement aux trois stades de développement tumoral. Les

tumeurs ont été classées comme adénome / néoplasie intra-épithéliale mammaire

(MIN), carcinome précoce, ou carcinome tardif. Les tumeurs contrôles au stade de

pré-développement étaient soit des adénomes / MIN soit des carcinomes

précoces, tandis que les tumeurs traitées avec PQ1 semblaient être des

carcinomes précoces ou tardifs. Les tumeurs contrôles au stade précoce de

développement étaient toutes des carcinomes précoces. Les tumeurs traitées

avec PQ1 variaient de adénome / MIN à carcinomes précoces et tardifs. Aucune

métastase pulmonaire n'a été observée pour les phases de développement pré et

précoce pour les deux groupes de traitement. Les tumeurs témoins et traitées

avec PQ1 au stade tardif de développement étaient toutes des carcinomes tardifs.

Les souris témoins au stade tardif présentaient plusieurs foyers métastatiques

dans les poumons, tandis que le traitement PQ1 a entrainé moins de souris

présentant des lésions métastatiques et moins de foyers métastatiques par souris.

L'analyse immunoblot de l'expression des connexines indique que le

traitement PQ1 a diminué l'expression de la Cx46 (Fig. 67A) et augmenté

l'expression de la Cx43 (Fig. 67B) au cours de la cancérogenèse. Au cours du

développement tumoral chez les souris PyVT contrôles, l'expression des Cx43 et

Cx46 a augmenté du stade de pré-développement au stade tardif. Les données

suggèrent que la protéine des jonctions GAP connexine 43 est exprimée à des

niveaux plus élevés chez les animaux traités avec PQ1 par rapport aux témoins et

le contraire pour la connexine 46. L'expression de la Cx46 dans les tumeurs PyVT

traitées avec PQ1 depuis le stade de pré-développement et le stade tardif

présentaient des niveaux significativement inférieurs à celui des contrôles (ppré =

0,019, pprécoce = 0,007). Au stade de pré-développement et au stade précoce les

tumeurs traitées avec PQ1 présentaient un niveau d'expression de la Cx43

significativement plus élevé que les témoins (ppré = 0,0003, pprécoce = 0,03). Au

cours du stade tardif de formation tumorale, la connexine 46 est moins exprimée

chez les souris traitées que chez les témoins, alors qu'il n'y avait pas de

changement significatif dans l'expression de la connexine 43. Ceci s'explique par

l'augmentation globale des deux connexines 43 et 46 au cours du développement

tumoral et des métastases.

251

L'expression des connexines est régie par un certain nombre de facteurs,

tels que la tension transmembranaire et transjonctionnelle, les ions cytosoliques

(Ca2+ et H+) et des modifications post-traductionnelles, principalement le statut de

phosphorylation (397-399). Toutes les connexines, à l'exception de la Cx26, sont

des phosphoprotéines ciblées par plusieurs kinases telles que la sarcoma kinase

(Src), la protéine kinase C (PKC), la protéine kinase A (PKA) et la proteines kinase

activée par le facteur mitogène (MAPK), requises pour un trafic efficace,

l'assemblage et le désassemblage, la dégradation et l'ouverture des hémicanaux

et / ou des jonctions GAP (398, 400, 401). La régulation de la GJIC par

phosphorylation est à la fois connexine et kinase spécifique (398, 402). Le rôle de

la PKCa dans la modification de l'expression des connexine induite par le

traitement PQ1 a été déterminé dans les tumeurs PyVT à chaque stade de

développement par analyse western blot (Fig. 67C) et IHC (Fig. 68). Il n'y avait

pas de changement significatif dans l'expression de la PKCα.

Fig. 67 : Expression des protéines x46 (A), Cx43 (B), PKC-α (C) et survivine (D) dans les tumeurs

PyVT aux trois stades de développement. Western blot et leur analyse. C = contrôle (DMSO). PQ

= PQ1 25 mg/kg, 7 injections IP. * = p < 0,05 par rapport au contrôle. n = 4

252

Les cellules néoplasiques utilisent des inhibiteurs de l'apoptose comme

protection contre les composés cytotoxiques. La protéine anti-apoptotique

survivine est un membre de la famille des protéines inhibitrices de l'apoptose

exprimée dans une variété de types de tumeurs qui régule la mitose (281-283).

L'expression de la survivine est en corrélation avec la résistance à la

chimiothérapique et une rechute accélérée. Les tumeurs PyVT traitées avec du

DMSO ou PQ1 à chaque stade de développement ont été analysées pour

l'expression de la protéine anti-apoptotique survivine. Le traitement PQ1 a diminué

significativement l'expression de la survivine dans les tumeurs mammaires au

cours des stades de pré-développement (p = 0,014) et de développement précoce

(p = 0,028) (Fig. 67D).

L'histopathologie des tumeurs PyVT récoltées n'a pas montré de différence

significative de morphologie. L'IHC des tumeurs traitées avec PQ1 à toutes les

étapes de la formation tumorale a montré une coloration cytoplasmique positive de

la Cx43 plus forte et une coloration positive cytoplasmique de la Cx46 plus faible

que dans les tumeurs contrôles (Fig. 68). Il n'y avait pas de changement significatif

dans l'expression de la protéine Ki-67. Le carcinome mammaire développé par le

modèle transgénique PyVT est caractérisé par un modèle métastatique impliquant

le tissu pulmonaire. Les souris au stade de développement tumoral tardif

présentaient de nombreuses grosses tumeurs secondaires dans l'épithélium

pulmonaire, ce qui a été déterminé par observation et histopathologie. Une seule

lésion métastatique a été trouvée dans les échantillons de poumon recueillis à

partir des souris traitées avec PQ1, ce qui indique une diminution à la fois de la

taille et de la fréquence des métastases pulmonaires secondaires avec traitement

PQ1 (Fig. 69). Les tumeurs représentées sur les figures 69A et 69B présentent un

volume calculé de 5,9 x 106 um3 et 4188 um3 respectivement. Les tumeurs

pulmonaires présentaient des caractéristiques histopathologiques similaires à

celles du tissu mammaire.

Plusieurs organes vitaux (cerveau, cœur, foie et reins) ont également subis

un examen histopathologique afin de déterminer les effets néfastes potentiels de

l'administration de PQ1. Il n'y avait pas de changement morphologique dans les

tissus par rapport au témoin, ce qui indique que PQ1 a une spécificité pour cibler

les cellules néoplasiques plutôt que le tissu sain (Fig. 70A). Un examen plus

253

approfondi par IHC des Cx43, Cx46, PKCa et Ki-67 dans le foie a montré une forte

coloration cytoplasmique positive des Cx43, Cx46 et PKCa dans le tissu traité

avec PQ1 (Fig. 70B). Il n'y avait pas de changement significatif pour la protéine Ki-

67. L'exposition systémique à la PQ1au cours d'une période de 14 jours n'a eu

aucun effet nocif observable sur la santé ou le comportement des animaux.

Fig. 68 : Immunohistochimie de tumeurs issues de souris PyVT femelles. A/ Stade de pré-

développement tumoral. B/ Stade précoce. C/ Stade tardif. PQ1 : 25 mg/kg. Barre = 10 µm. n = 6

E/ Discussion

PQ1 est le premier composé ciblant les jonctions lacunaires en tant que

médicament anticancéreux dans un modèle de tumeur mammaire spontané. Cette

254

molécule a été montrée précédemment pour être un activateur spécifique de la

GJIC in vitro (8) et conduire à une augmentation de l'expression des connexines

conduisant à une diminution significative de la croissance tumorale sur modèle de

xénogreffe de cellules de cancer du sein humain T47D chez des souris nude (242).

Cette étude traduit les résultats in vitro de PQ1 obtenus précédemment dans un

contexte in vivo utilisant un modèle de carcinome mammaire spontané. Les souris

génétiquement modifiées permettent aux chercheurs d'étudier plusieurs aspects

du cancer. Plusieurs caractéristiques du modèle PyVT en font un modèle idéal

pour la recherche, comme la stabilité des colonies, le comportement prévisible de

la croissance tumorale et la similitude avec les néoplasmes humains. L'efficacité

de PQ1 à réduire la croissance des cellules tumorales est mise en évidence dans

le modèle de souris PyVT sur une période de 2 semaines. Les résultats ont

montré une réduction de 43 et 53% en volume des tumeurs par rapport à la taille

initiale aux stades de pré-développement et de développement précoce,

respectivement, alors que la réduction du volume tumoral au stade tardif de

développement avec le traitement PQ1 était de 26% par rapport aux témoins

traités au DMSO après sept injections de traitement.

Fig. 69 : Métastases de tumeurs mammaires dans l’épithélium pulmonaires, colorées à l’hemalun-

éosine. A/ Contrôle au stade tardif de développement B/ Femelles traitées avec PQ1 au stade

tardif de développement. Barre = 50 µm. n = 3

L'analyse moléculaire de l'expression des protéines a montré une

augmentation générale de l'expression de la Cx43 et une diminution de la Cx46

chez les souris PyVT traitées avec PQ1. Au stade de pré-développement tumoral,

255

l'expression de la Cx43 était augmentée et l'expression de la Cx46 diminuée avec

le traitement PQ1. PQ1 modifie le profil global des connexines par la régulation

positive de la Cx43 et la régulation à la baisse de la Cx46. La perte générale de la

GJIC est en corrélation avec des phénotypes tumorigènes, mais les différentes

connexines jouent des rôles distincts à des stades spécifiques de la progression

cancéreuse. Il a été observé dans des études antérieures que la proportion des

connexines constitutives des jonctions communicantes diffère suivant le stade

tumoral. La protéine Cx46 est exprimée à haut niveau à la fois dans les lignées

cellulaires de cancer du sein et les tumeurs du sein humaines (403). La réduction

d'expression de la Cx46 dans des xénogreffes de tumeurs du sein humain inhibe

la croissance tumorale chez des souris nude (403). Ceci indique que la Cx46 est

régulée à la hausse pour promouvoir la croissance et le développement des

tumeurs dans les tumeurs de cancer du sein au stade précoce. D'autres

connexines des jonctions GAP (Cx43, Cx32 et Cx26) sont considérées comme

des suppresseurs de tumeurs car la perte de celles-ci est corrélée avec une

progression des tumeurs du sein (404).

Cx46 est une nouvelle protéine des jonctions GAP dans le tissu mammaire

qui est spécifique de l'hypoxie. Burr et al. (405) ont émis l'hypothèse que la Cx46

avait des effets pro-tumoraux en raison de sa capacité à empêcher la mort

hypoxique. Les tumeurs solides peuvent présenter une régulation à la hausse de

la Cx46 pour survivre aux conditions hypoxiques répandues au cours du stade de

développement avancé, tout en induisant une perte de la Cx43, ce qui promeut la

croissance tumorale. Le traitement PQ1 altère l'expression à la fois de la Cx43 et

de la Cx46 de telle sorte qu'il normalise le tissu tumoral et empêche la croissance

tumorale. L'augmentation de la Cx43 pourrait induire une régulation à la baisse de

la Cx46, la sensibilisation des cellules tumorales à des conditions hypoxiques et

atténuer le développement tumoral. Les stades avancés de développement des

tumeurs solides sont généralement constitués de tumeurs avec plusieurs centres

hypoxiques, ce qui les rend difficiles à traiter en raison du taux plus faible de

prolifération cellulaire. PQ1 pourrait être utilisé pour restaurer l'homéostasie

normale des cellules hypoxiques et induire la mort cellulaire des cellules non

régulées.

256

Fig. 70 : Evaluation de tissus normaux issus de souris PyVT. A/ Coloration H&E n = 3. B/

Immunohistochimie Contrôle = DMSO, PQ1 = 25 mg/kg, 7 injections IP au stade tardif de

développement. Bleu = contre-coloration à l’hemalun n = 6. Barre = 10 µm

La diminution de l'expression de la protéine survivine dans le tissu

néoplasique due au traitement PQ1 trouvée pendant les phases de pré-

développement et de développement précoce des tumeurs soutient l'hypothèse ci-

dessus. L'expression de la survivine dans les tissus normaux est régulée au cours

du développement et est faible dans la plupart des tissus les plus différenciées.

Dans les cellules cancéreuses, la survivine élevée est souvent associée avec un

indice de prolifération élevé (406), des niveaux réduits d'apoptose (407), la

résistance à la chimiothérapie (408) et l'augmentation du taux de récurrence

tumoral (409). Le traitement PQ1 a diminué l'expression de la survivine, ce qui

suggère que les cellules tumorales sont sensibilisées aux conditions de stress,

comme l'hypoxie. Nos données suggèrent que la PQ1 peut agir comme un

257

perturbateur de la survivine, indépendant de sa fonction sur les jonctions GAP,

pour sensibiliser les cellules cancéreuses.

Les taux de prolifération des tumeurs ont été évalués dans le but de

corréler l'expression avec un pronostic. La protéine Ki-67 est l'un des régulateurs

du cycle cellulaire que l'on peut observer par IHC. L'anticorps anti-Ki-67 réagit

avec une protéine nucléaire non histone qui est exprimée à haut niveau dans

toutes les phases actives de la mitose, sauf G0 (410). Un index Ki-67 élevé par

IHC est associé à une mauvaise différenciation des tumeurs, une taille importante

et un risque accru de récurrence (411). Il n'y avait pas de changement observable

dans l'expression de la protéine Ki-67 due au traitement PQ1, ce qui indique que

PQ1 n'est pas impliquée dans la prolifération des cellules néoplasiques dans le

modèle PyVT.

Avec le développement des tumeurs PyVT, se produit une augmentation de

l'expression des Cx43 et Cx46, qui peut être caractéristique d'une augmentation

du potentiel métastatique de la lésion. La tumeur métastatique, représenté par le

stade tardif de développement, a une expression significativement plus élevé de

Cx46 par rapport aux autres stades de développement (Fig. 68A), ce qui suggère

que cette régulation à la hausse pourraitt contribuer à la tumorigenèse. Avec le

traitement PQ1, l'élévation de l'expression de la Cx46 au cours du développement

est diminuée, ce qui laisse supposer que le traitement atténue la formation de

tumeurs et de retarde le processus de métastase. Cette hypothèse est étayée par

la réduction de l'incidence de formation de tumeurs secondaires dans l'épithélium

pulmonaire avec le traitement PQ1. Les tumeurs primaires qui présentent

initialement une GJIC diminuée deviennent compétentes pour la GJIC au cours du

stade métastatique (246). L'expression accrue des connexines et la GJIC

diminuée sont en corrélation avec une capacité invasive et la métastase dans une

variété de types de cellules cancéreuses, notamment du cancer du sein. Les

profils d'expression des connexines changent de celui d'une cellule métastatique à

un profil plus semblable à celui d'une cellule de l'épithélium mammaire normal

avec expression du gène suppresseur de métastase BRMS1 (412). Ceci suggère

que la composition en connexines des jonctions communicantes contribue au

potentiel métastatique. Bien que la fonctionnalité des jonctions GAP n'ait pas été

testée, les données présentées montrent un haut niveau d'expression des Cx43 et

258

Cx46 au cours du stade tardif de développement et de la métastase.

L'expression de la PKCa ne varie pas entre les groupes de traitement. La

PKC est la principal kinase régulant la GJIC par phosphorylation du domaine C-

terminal (398), qui a été montré être nécessaire pour le désassemblage des Cx43

dans les cellules épithéliales du cristallin (413). Morley et al. (414) ont montré que

l'inhibition de la PKC (PKCa et / ou PKCb1) augmentait la GJIC pour réduire la

prolifération des cellules tumorales, ce qui était dû à un acheminement modifié

des connexines. Les données présentées ici montrent une altération de

l'expression des connexines sans changement dans l'expression de la PKCa. Ceci

suggère que la PQ1 affecte l'expression des connexines à travers un mécanisme

qui soit n'a pas d'incidence sur la PKCa, mais plutôt une autre isoforme de la PKC;

soit n'implique pas la phosphorylation du domaine C-terminal des connexines.

Le promoteur MMTV est un promoteur inductible par une hormone

glucocorticoïde (415) qui a été utilisé comme un système idéal pour la génération

de modèles de développement de tumeurs chez des souris transgéniques dans

les glandes mammaires et les tissus urogénitaux en raison de sa haute et

inductible activité dans ces tissues (416). L'évaluation pathologique des tumeurs

après le traitement a conduit à l'observation que que les tumeurs traitées avec

PQ1 au stade de pré-développement étaient histologiquement décrites comme

étant des carcinomes précoces ou tardifs, alors que les tumeurs contrôles étaient

des adénomes / MIN ou carcinomes précoces, ce qui implique que le traitement

conduit à une augmentation de la malignité. Pour préciser les résultats, une seule

des six tumeurs évaluées dans ce groupe de traitement a été caractérisée comme

carcinome tardif, ce qui peut être dû à la variation biologique dans le modèle

transgénique. Cette augmentation de la malignité peut être expliquée par

différents niveaux d'expression du transgène due à la variation du nombre de

copies, ou différentes expressions spatiale ou temporelle du transgène dans le

tissu. Une augmentation de l'incidence des tumeurs est commune avec une

expression élevée du transgène dans le tissu mammaire avec des effets

hormonaux sur le MMTV (417). Des niveaux d'expression quantitativement

différents sont possibles en raison de différences dans le nombre de copies du

transgène, ce qui conduit à une variation de l'incidence tumorale et du phénotype.

Par conséquent, la tumeur unique caractérisée comme plus agressive par

259

l'évaluation pathologique peut simplement avoir des niveaux plus élevés du

nombre de copies du transgène. En outre, le stade de pré-développement tumoral

se produit en concurrence avec la puberté, au cours de laquelle des niveaux

d'hormones en circulation proche des niveaux adultes sont présents. La maturité

sexuelle murine coïncide normalement avec une augmentation de la circulation de

gonadotrophine peu après 4 semaines d'âge. Le moment précis où la maturité

sexuelle se produit est très variable entre les souris. Des niveaux élevés

d'hormones circulantes peuvent affecter l'activation de la séquence du promoteur,

conduisant à une variation dans la tumorigenèse. Les niveaux d'expression du

transgène pour les échantillons tumoraux n'ont pas été déterminés.

L'efficacité de plusieurs médicaments anticancéreux est limitée par leur

toxicité pour les cellules normales et à croissance rapide des tissus vitaux.

L'administration par gavage de PQ1 a montré que l'exposition des organes vitaux

avait une faible toxicité (396). Pour cette étude, le foie et les reins ont été

examinés histologiquement pour déterminer les effets potentiellement néfastes de

l'exposition systémique à un activateur des jonctions GAP. Le traitement PQ1 n'a

montré aucun effet nuisible observable sur ces organes. Il est certain que

l'augmentation observée par IHC dans l'expression des Cx43 et Cx46 dans le foie

peut provoquer des lésions. Aucune toxicité aiguë n'a été observée dans cette

étude. Des études de survie à long terme après le traitement PQ1 sont

nécessaires pour déterminer si le tissu normal est vraiment affecté.

Les cellules normales peuvent envoyer un signal aux cellules malignes

adjacentes pour qu'elles restaurent leur phénotype ou induisent l'apoptose (261)

mais le défaut d'expression des connexines intervient dans la régulation de la

prolifération, la différenciation et la mort cellulaire, l'entretien de l'homéostasie et la

réduction de la mitose en fin de G1, S et M (205), ce qui suggère une implication

dans la carcinogenèse (2). Une nouvelle classe d'activateurs des jonctions GAP

modifie la croissance tumorale dans un modèle animal de carcinome mammaire

spontané, sans effets secondaires apparents. Cette étude apporte une preuve

supplémentaire que l'expression des connexines et la croissance cellulaire sont

inversement corrélées dans les lésions malignes, ce qui confirme les résultats de

Saez et al. (263). Les études antérieures sur la PQ1 effectuées sur des cellules

T47D chez des souris nude, et ces résultats obtenus en utilisant un modèle de

260

carcinome mammaire spontané, sont prometteurs pour le développement d'une

nouvelle chimiothérapie pour le traitement du cancer du sein et potentiellement

d'autres types de cancer, chez l'Homme. PQ1 peut également être combinée avec

d'autres médicaments anticancéreux pour réduire leur toxicité et augmenter leur

efficacité.

261

III/ Biodisponibilité et efficacité d'un stimulant des jonctions

GAP (PQ7) dans un modèle de tumeur mammaire murin

Traduit de l'anglais : Shishido et al. (418)

A/ Résumé

La perte de communication intercellulaire au travers des jonctions GAP

(GJIC) est caractéristique des cellules néoplasiques, ce qui suggère que la

restauration avec un enhancer des jonctions GAP peut être une nouvelle option

thérapeutique avec moins d'effets néfastes que les traitements antinéoplasiques

traditionnels. Un enhancer des jonctions GAP, le 6-methoxy-8-[(2- furanylmethyl)

amino]-4-methyl-5-(3-trifluoromethylphenyloxy) quinoline (PQ7), a été évalué sur

le tissu normal chez des souris C57BL/6J saines dans une étude systémique de la

distribution des médicaments. L'analyse par immunotransfert des organes vitaux

indique une réduction de l'expression de Cx43 chez les animaux traités aux

quinoléines substituées PQ7 sans changement morphologique observable.

Ensuite, la souche transgénique FVB/N-Tg (MMTV-PyVT) 634Mul/J (également

connue sous le nom PyVT) a été utilisée comme modèle murin de formation

spontanée de tumeurs mammaires pour déterminer les effets biologiques et

histologiques des PQ7 sur la tumorigenèse et la métastase à trois stades de

développement : pré-tumeur formation, tumeur précoce, tumeur tardive. Les PQ7

ont été évaluées avoir une faible toxicité par administration intrapéritonéale, avec

la majorité du composé détectée dans le cœur, le foie et les poumons six heures

après injection. Le traitement des animaux porteurs de tumeur avec PQ7 a montré

une réduction de 98% de la croissance des tumeurs, tout en diminuant la charge

tumorale totale par rapport aux souris témoins au cours de l’étape de pré-

développement. Le traitement PQ7 a entrainé une augmentation de l'expression

des Cx43 dans le tissu néoplasique pendant la pré-formation tumorale ; toutefois,

cet effet n'a pas été observé au stade tardif de formation des tumeurs. Cette étude

montre que l'enhancer des jonctions GAP, PQ7, a une faible toxicité pour les

tissus normaux des souris C57BL/6J en bonne santé, tout en ayant une efficacité

clinique dans le traitement de tumeurs mammaires spontanées chez les souris

262

PyVT. En outre, la communication intercellulaire au travers des jonctions GAP et

la croissance cellulaire néoplasique se sont avérées être inversement liées, tandis

que le traitement aux PQ7 inhibe la croissance tumorale en ciblant l'expression

des jonctions GAP.

B/ Introduction

La communication intercellulaire au travers des jonctions GAP (GJIC) joue

un rôle important dans le maintien de l'homéostasie tissulaire. La GJIC est le

processus dans lequel de petits métabolites sont partagés directement par des

cellules contiguës qui ont leurs cytoplasmes reliés par des canaux aqueux appelés

jonctions communicantes. La perte de GJIC est liée à la pathogenèse de plusieurs

maladies telles que la surdité et la perte auditive, les cataractes, maladies de la

peau, la dysplasie oculodentodigital et le cancer (419). L'amélioration ou la

restauration de jonctions communicantes fonctionnelles pourraient être une option

de thérapeutique pour ces maladies. Ici nous nous concentrons sur la

pathogenèse du cancer en relation avec la perte de l'expression des protéines de

jonctions GAP. Une classe de quinoléines substituées a été décrite dans l'article

de Shi et al. et les effets du composé de première génération (PQ1) comme

enhancer des jonctions GAPdans des lignées cellulaires de cancer du sein ont été

explorés (180, 202). Le composé de deuxième génération, le 6-methoxy-8-[(2-

furanylmethyl) amino]-4-methyl-5-(3- trifluoromethylphenyloxy) quinoline (PQ7), a

montré une amélioration de l'activité GJIC dans les cellules cancéreuses, avec un

effet plus puissant sur la GJIC que la première génération PQ1 (242).

De nombreux procédés de traitement du cancer utilisent des agents de

chimiothérapie qui ciblent les cellules mitotiques mais ce n'est pas spécifique des

cellules cancéreuses et conduit à des effets secondaires graves. La perte de la

GJIC par les cellules cancéreuses est spécifique, ce qui suggère que la

restauration de la GJIC peut fournir un traitement avec moins d'effets néfastes sur

l'hôte. Des études antérieures indiquent que l'administration de PQ1 par gavage

oral a une faible toxicité pour les tissus normaux de souris C57BL/6J en bonne

santé, sans effet indésirable observable (396), tout en atténuant sensiblement la

263

croissance des xénogreffes de tumeurs chez des souris nude (267). Ici, on explore

la distribution et les effets anti-néoplasiques des PQ7.

Cette première étude a déterminé la distribution systémique des PQ7 après

injection intrapéritonéale chez des souris C57BL/6J saines. La distribution du

médicament aux organes vitaux a été déterminée à différentes périodes de temps

après l'injection. L'analyse par observation histologique des tissus traités aux PQ7

n'a pas montré de modification significative dans l'organisation ou la structure des

tissus, ce qui suggère une faible toxicité. Ensuite, les PQ7 ont été utilisées en tant

que traitement du carcinome mammaire dans un modèle murin formation

spontanée de tumeurs mammaires. La génération in situ de tumeurs mammaires

chez la souche transgénique FVB/N-TgN (MMTV-PyVT) 634Mul/J (également

connue sous le nom PyVT) a été utilisée pour déterminer les effets biologiques et

histologiques des PQ7 sur la tumorigenèse et la métastase spontanée. Le modèle

de PyVT porte l'antigène moyen T du polyomavirus avec une expression

spécifique au tissu mammaire entraînée par le virus de la tumeur mammaire de la

souris (MMTV) (353). Les femelles vierges qui portent le transgène développnt

des carcinomes canalaires infiltrants peu différenciés, multi-focalaux avant 10-12

semaines d'âge, avec une incidence élevée de métastases pulmonaires issues de

la tumeur mammaire primaire (355). Les lésions focales non invasives se

développent en 5 semaines et sont classées en quatre groupes : simples, solides,

kystiques et mixtes (solides et kystiques) (356). Le développement des tumeurs a

été divisé en trois périodes de temps : stade pré-tumoral (jusqu'à l'âge de 4

semaines), stade tumoral précoce (de 6 à 8 semaines) et stade tumoral tardif (plus

de 10 semaines). Pour chaque stade, l'effet de l'administration de PQ7 a été

évalué et l'expression de protéines des jonctions GAP a été mesurée sur le tissu

traité.

264



L'élevage des animaux est effectué par le Groupe de médicine comparée









ii/ Composés

PQ7, 6-methoxy-8-[(2-furanylmethyl) amino]-4- methyl-5-(3-

trifluoromethylphenyloxy) quinoléine a été préparé comme indiqué précédemment

(180).

iii/ Animaux

Des souris femelles C57BL/6J (The Jackson Laboratories, Bar Harbor,

Maine 04609 USA) d'environ 5 semaines d'âge ont été utilisées dans les

expériences de distribution. Toutes les souris ont été logées ensemble dans un

environnement à température contrôlée (72 F / 22°C) avec un cycle lumière-

obscurité de 12 heures et un accès illimité à de la nourriture standard pour souris

et de l'eau. Six animaux ont été assignés au hasard à chaque groupe de

traitement et 25 mg / kg de PQ7 leur ont été administrés par injection

intrapéritonéale (IP). A 6, 12, 24 et 36 heures après injection, tous les organes ont

été prélevés à partir des animaux euthanasiés par inhalation de dioxyde de

carbone.

265


Laboratory, Bar Harbor, ME) a été créée pour les études de carcinomes

mammaires. Pour identifier la descendance transgénique, l'ADN génomique a été

extrait à partir d'un écrêtage de queue de 1,5 cm. Toutes les souris portant le

transgène PyVT ont développé des tumeurs mammaires. Le développement de

tumeurs chez lessouris femelles positives a été suivi de près tous les 2-3 jours.

L'apparition de tumeurs a été enregistrée comme l'âge auquel des masses

palpables anormales ont été détectés. La taille des tumeurs a été mesurée en

deux dimensions avec un pied à coulisse tous les 2 jours dès 5 semaines d'âge.

Le volume des tumeurs a été déterminé par l'équation suivante : Volume = 1/2

(Longueur) * (largeur)2. Les souris ont été observées pour un changement de

comportement, l'aspect et le poids. Lorsque les animaux ont atteint une tranche

d'âge spécifique, six animaux ont été assignés au hasard à chaque groupe de

traitement et administré 25 mg / kg par injectionIP de PQ7. Les protocoles de

soins aux animaux et leur utilisation ont été approuvés par le Comité institutionnel

de protection et d'utilisation des animaux (IACUC) à Kansas State University,

Manhattan, Kansas, suivant les directives du NIH.

iv/ Études de distribution des PQ7 chez la souris (HPLC et spectrométrie de

masse)

a/ Extraction des PQ7 des organes et du plasma

Les organes ont été coupés en petits morceaux, suivi par l'addition de 4 mL

d'eau déminéralisée et 10 ml d'une solution de rapport 9:1 d'acétate d'éthyle et de

1-propanol. Des échantillons de plasma ont été directement mélangés avec 4 mL

d'eau et 10 mL d'une solution 9:1 d’acétate d'éthyle et de 1-propanol. Les

solutions de tissus et de plasma ont été séparément traitées par ultrasons pendant

40 minutes et 10 minutes, respectivement ; et la couche organique a été séparée

à l'aide d'une ampoule à décanter. La couche aqueuse a été extraite deux fois

avec 10 mL d'une solution 9:1 d'acétate d'éthyle et de 1-propanol. Les couches

organiques ont été combinées, lavées avec 5 mL de saumure, séchées sur

MgSO4 anhydre et concentrées à sec à l'aide d'un évaporateur rotatif. Le résidu a

266

été dilué avec 1 mL de 1-propanol et filtré à travers un filtre discal de 0,2 um

(polytetrafluoroethylene, or PTFE, de 0,2 um, Fisherbrand) et analysé par

chromatographie liquide haute performance (HPLC) et spectrométrie de masse

comme décrit ci-dessous.

b/ Quantification de PQ7 par HPLC

L'analyse par HPLC a été réalisée sur un Varian Prostar 210 avec un

détecteur UV-visible et une colonne en phase inverse (250 x 21,20 mm, 10

microns, Phenomenex, S. No : 552581-1). Un flux de 5 mL / min et une détection

de la longueur d'onde de 254 nm ont été utilisés. Un gradient d'élution du solvant

A, contenant de l'eau désionisée et 0,01 % d'acide trifluoroacétique, et du solvant

B, contenant de l'acétonitrile et 0,01 % d'acide trifluoroacétique, a été appliqué

pour l'analyse. L'acide 1, 2, 4,5-benzènetétracarboxylique (BTA) a été utilisé

comme étalon interne pour quantifier la quantité de PQ7 dans les extraits

tissulaires. Des solutions de 100 uL de divers mélanges de PQ7 et BTA ont été

injectés dans un instrument de HPLC, les aires des pics correspondant aux PQ7

et BTA et ont été intégrées à partir du chromatogramme HPLC et les rapports

entre les pics ont été obtenus. Les résultats des rapports des aires des pics HPLC

et des ratios de concentrations de PQ7 et BTA ont été placés sur un graphique, et

une ligne de corrélation linéaire a été obtenue à partir du graphique. Par

conséquent, l'utilisation de ce schéma de corrélation, le rapport des surfaces des

pics HPLC de PQ7 et BTA à partir d'extraits de tissus et la quantité connue

ajoutée de BTA aux extraits de tissus, la quantité de PQ7 dans l'extrait tissulaire a

été determinée. Ensuite, 100 µL d'un mélange 1:1 en volume des extraits de

tissus ou de plasma et de BTA de concentration connue ont été injecté dans l'

HPLC ; les pics correspondant aux PQ7 et BTA ont été intégrées dans le

chromatogramme HPLC, et le rapport de leurs masses a été déterminé. Comparer

le rapport des masses des pics de PQ7 dans l'extrait et le niveau de BTA au

rapport des masses des pics de PQ7 et BTA de la courbe de référence, la masse

de PQ7 dans les organes et le plasma a été quantifiée.

267

v/ Spectroscopie de masse

Un spectromètre de masse Applied Biosystem API 2000 LS/MS/MS a été

utilisée pour l'analyse. L'éluant correspondant au pic de PQ7 de la HPLC a été

recueillie et injecté dans le spectromètre de masse. Une masse de 406,

correspondant à la masse M + 1 de PQ7, a été trouvée dans le spectre de masse,

et le motif de fragmentation de cette masse M + 1 est similaire à celui de la PQ7

d'origine, vérifiant l'identité de PQ7.

vi/ Anticorps

Les anticorps primaires : anti-Cx46 (sc-20859, anticorps polyclonal de

chèvre), anti-PKCa (sc-8393, anticorps monoclonal de souris) et anti-Cx43 (sc-

13558, anticorps monoclonal de souris), de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz,

CA) ; anti-GAPDH (2118, anticorps monoclonal de lapin) de Cell Signaling (Boston,

MA) ont été utilisés à la fois pour les analyses western blot et l'immunohistochimie

(IHC).

vii/ Analyse Western blot

Les tissus des tumeurs des glandes mammaires et des organes choisis

(coeur, poumons, foie, rate, reins, utérus et cerveau) ont été homogénéisés dans

500 mL de tampon de lyse (20 mM Tris pH 7,5, EDTA 0,5 mM, EGTA 0,5 mM,

0,5 % de Triton X- 100) et des inhibiteurs de protéases à une dilution de 1:1000

(Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO). Les tissus ont été homogénéisés avec l'OMNI

Bead Ruptor 24 (Omni International, Kennesaw, GA) à une vitesse de 5,65 m / s

pendant 45 secondes, suivi par une centrifugation à 13 000 rpm pendant 30

minutes à 4°C. Vingt-cinq microgrammes d'extrait de cellules entières ont été

résolus par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS 10% (PAGE) et

transférés sur une membrane de nitrocellulose (Midwest scientifique, Saint Louis,

MO). Les membranes de nitrocellulose ont été bloquées dans 5% de lait pendant

une heure à température ambiante, puis mis à incuber avec des anticorps

monoclonaux (1:1000). Les transferts ont été détectés par des réactifs de

268

détection par chimioluminescence amplifiée (Pierce, Rockford, Illinois, Etats-Unis)

et visualisés par le système d'imagerie Fluorochem E (ProteinSimple, Santa Clara,

CA).

viii/ Immunohistochimie (IHC)


une solution de formaldéhyde à 10% et incorporées dans de la paraffine

préalablement à leur sectionnement sur des lames à une épaisseur de 5 mm. Les

sections de paraffine (5 mm) ont été séchées à 60°C pendant 25 minutes. Le

déparaffinage a été réalisé avec 100 % de xylène et 100 %, 90%, 75%, 50 %

d'éthanol. L'antigène extraction a été effectuée dans une solution tampon de

citrate dans une chambre à vapeur. Les lames ont été ensuite incubées pendant

une nuit à température ambiante avec un anticorps polyclonal (dilution 1:50).

Après lavages dans plusieurs bains de PBS, les lames ont été incubées avec des

anticorps secondaires biotinylés (1:1000) pendant 15 minutes. Les lames ont été

lavées et les immunomarquages ont été amplifiés par incubation avec du

complexe avidine biotine (ABC) pendant 10 minutes. Les cellules ont été

visualisées avec de la 3,3-diaminobenzidine (DAB) suivie d'une contre-coloration

hemalun-eosine. Les sections ont été observées et les images capturées avec un

microscope Nikon 80i sous un grossissement 40x et 60x.

ix/ Analyse statistique

La signification statistique a été déterminée pour une p-value ≤ 0,05. Les

données sont présentées comme la moyenne ± l'intervalle de confiance à 95 %

d'un minimum de trois échantillons par groupe de traitement.

\

269

D/ Résultats

i/ Distribution des PQ7

La connaissance de la distribution des PQ7 dans un système biologique est

importante pour l’utilisation potentielle de ce composé comme agent anti-

cancéreux. PQ7 à 25 mg / kg a été administrée à 5 semaines d'âge chez les

souris femelles par injection intrapéritonéale. La quantité totale de PQ7

administrée à chaque animal a été définie comme 100%. Six heures après

l'injection de PQ7, seulement 8,14 % du composé était détectable dans le tissu

prélevé. À 12, 24 et 36 heures après l'administration 4,65, 1,53 et 0,29 % du

composé d'origine étaient mesurable par HPLC, respectivement. Six heures après

le traitement, la majorité des PQ7 ont été détectées dans le cœur, le foie, les

poumons et l'utérus à des taux de 1,4 % (107 uM), 1,3 % (98,74 uM), 1,2 % (90,90

uM) et 1,1 % (82,02 uM) de la quantité totale administrée, respectivement (Fig. 71).

Un niveau inférieur détectable a été mesuré dans les reins 0,85 % ; 65,94 uM) et

le cerveau (0,92 % ; 71,34 uM). A 12 heures post-exposition, la concentration de

PQ7 a changé dans le foie de 1,28 % 6 heures après l'injection à 0,47 % (34,73

M). A ce temps, PQ7 n'était plus détectable dans la rate. 24 heures après injection,

le composé n'était plus détectable dans le cœur ou l'utérus, tandis que les

poumons et l'intestin présentaient les concentrations les plus élevées, 0,41 %

(31,83 uM) et 0,48 % (38,05 uM), respectivement. Après 24 heures de traitement,

aucune PQ7 n'a été trouvée dans la plupart des organes testés ou le plasma. À 36

heures après l'exposition, le composé a été détecté en quantité limitée dans

l'intestin (0,21 % ; 15,01 uM) et le foie (0,07 % ; 5,21 uM). La tendance de

distribution des PQ7 est restée assez constante dans tous les tissus testés, dont

le plasma.

Les résultats ont été obtenus à partir d'échantillons de taille n = 6 souris.

270

Fig. 71 : Distribution du compose PQ7. Les souris traitées avec 25 mg/kg de PQ7 ont été

euthanasiées après 6, 12, 24 ou 36h. Quantité totale de PQ7 administrée = 100%. n = 6

271

ii/ Analyse des organes vitaux après exposition aux PQ7

Fig. 72 : Effet du

compose PQ7 sur

l’expression des

Cx43 dans les

tissus normaux. A/

Immunohistochimi

e. Injection unique

de PQ7 25 mg/kg.

Bleu = contre-

coloration à

l’hemalun. n = 6.

B/ Représentation

graphique de

l’analyse Western

blot. Contrôle =

souris non traitées.

Résultats

exprimés en

pourcentage de

l’intensité de la

bande d’actine

(contrôle). * = p <

0,05 par rapport

au contrôle (souris

non traitées)

Plusieurs organes vitaux (cerveau, cœur, foie et reins) ont été examinés

par histopathologie afin de déterminer les effets potentiellement néfastes de

l'administration de PQ7 en une dose unique ou en 7 doses réparties sur une

272

période de 14 jours. Aucun changement morphologique, signe d'hémorragie ou

d'inflammation dans les tissus n'ont été observés par rapport au contrôle. Ceci

indique que les PQ7 n'avaient pas de toxicité pour les tissus normaux des souris

C57BL/6J saines. Toutes les souris exposées au PQ7 n'ont pas souffert d'effets

néfastes sur leur état de santé ou de modification du comportement.

Les PQ7 se sont avérées améliorer la GJIC et augmenter l'expression des

connexines (Cx) dans les cellules néoplasiques (242, 267). Les niveaux

d'expression des Cx43 dans les organes traités aux PQ7 et les organes non

traités ont été comparés. Cx43 ont été détectées dans tous les tissus testés (Fig.

72A). Le traitement aux PQ7 a initialement diminué l'expression des Cx43 dans le

cœur, les poumons, le foie, l'utérus et le cerveau à 6 heures après injection (Fig.

72B). La rate présentait une diminution significative de l'expression des Cx43 à 12

heures après l'injection. Le coeur et le foie ont récupérés des niveaux d'expression

normaux après 24 heures. L'expression des Cx43 dans les poumons, l'utérus et le

cerveau est restée nettement inférieure à la normale au cours des 36 heures

observées. Il n'y avait aucun effet secondaire observable en raison des niveaux

d'expression diminués. Les reins n'ont pas connu de changement dans

l'expression des Cx43.

iii/ Effet des PQ7 sur la croissance tumorale dans un modèle de formation

spontanée de tumeurs mammaires

Les souris transgéniques FVB-TgN (MMTV) PyVT femelles ont développé

des tumeurs dès l'âge de 5 semaines et atteint la charge tumorale maximale à

environ 15 semaines d'âge. Le développement des tumeurs a été divisé en trois

phases sur la base de la mesure de : la taille des tumeurs, la fréquence de

formation des tumeurs et la présence de métastases pulmonaires. Le stade pré-

tumoral s'est produit à environ 4-5 semaines d'âge, constitué d'un état

précancéreux où aucune tumeur n'était palpable et le tissu mammaire semblait

normal sur simple observation. Le stade précoce de développement est

représenté par la formation de tumeurs solides dans le tissu mammaire et

l'observation de 1 ou 2 tumeurs solides entre 6-8 semaines d'âge. Le stade tardif

s'est produit après 10 semaines d'âge et se composait de la présence de

273

l'ensemble des 10 tumeurs mammaires primaires et des métastases pulmonaires

secondaires. La présence de métastases dans le poumon a été confirmée par

coloration hémalun-éosine (H&E) de sections représentatives du tissu suivie par

examen histopathologique.

Fig. 73 : Croissance tumorale (en mm3) chez la souris PyVT femelle. A, B/ Stade de pré-

développement tumoral. C, D/ Stade précoce. D, E/ Stade tardif. Les jours 0-12 correspondent aux

7 injections et le jour 14 correspond à la fin de l’étude (mesures avant prélèvement des organes).

PQ7 : 25 mg/kg. * = p < 0,05 (par rapport aux contrôles : pas de traitement et traitement au DMSO).

n = 6

274

La croissance tumorale sur une période de 14 jours avec 7 injections IP de

PQ7 ou DMSO a montré un effet significatif du traitement PQ7 sur le stade pré-

développement néoplasique chez les souris femelles PyVT. Le volume des

tumeurs initiales pour toutes les souris au stade pré-tumoral était de 14,27 ± 13

mm3. Il y avait une différence significative du volume tumoral entre les souris

traitées aux PQ7 et au DMSO pendant la phase pré-développement du jour 8 au

jour 14 (Fig. 73A). Les PQ7 ont considérablement atténué la croissance des

tumeurs avec un volume final de 27,8 mm3 après la période de traitement de 14

jours (p-value = 0,0008). La croissance tumorale finale des souris témoins traitées

au DMSO était de 377 mm3. Le changement de volume de la tumeur au cours de

la période de 14 jours montre une atténuation significative de la taille des tumeurs

suite au traitement PQ7 par rapport aux deux contrôles (p-value sans traitement =

0,005, p-value DMSO = 0,0005 ; Fig. 73B). Il y avait une différence de 98% entre

les changements globaux de croissance tumorale après traitement aux PQ7.

Le volume initial des tumeurs pour toutes les souris au stade précoce était

de 104 ± 53 mm3. Au cours de ce stade de développement il n'y a pas eu de

différence significative dans la croissance des tumeurs entre les groupes de

traitement (Fig. 73C et 73D). Lors de la phase tardive de développement tumoral,

les souris ont commencé le traitement avec un volume initial des tumeurs de 676

± 134 mm3. Les PQ7 n'ont pas atténué la croissance tumorale par rapport au

contrôle lors de la phase tardive de développement (Fig. 73E et 73F). Les

souris PyVT ont un total de 10 coussinets adipeux mammaires qui peuvent

développer des tumeurs au cours de leur vie. Le nombre total de tumeurs

palpables, défini comme étant la charge tumorale, a été contrôlé au cours du

traitement et le nombre final de tumeurs pour chaque groupe de traitement à

chaque étape du développement est présenté (Fig. 74A et 74C). Au cours de

chacune des trois étapes il n'y avait pas de différence significative entre les

charges tumorales entre les deux groupes de contrôle. Le traitement aux PQ7 lors

de l'étape de pré-développement réduit significativement le nombre de tumeurs

développées après traitement (p < 0,00001 ; Fig. 74A). Il n'y avait pas de

différence de la charge tumorale entre les groupes expérimentaux de stade

précoce ou tardif de développement tumoral (Fig. 74B et 74C).

275

Les tumeurs ont été analysées afin de déterminer la quantité de PQ7

détectable environ 48 heures après la dernière injection IP. A chaque stade de

développement, le composé d'origine était mesurable dans le tissu néoplasique

récolté à partir des animaux traités. Les stades pré-tumoral et précoce de

formation tumorale présentaient une concentration de 37 pM de PQ7, alors que

les tumeurs de stade tardif avaient une concentration de 1,1 nM de PQ7 (Fig. 75A).

Ceci indique que le composé d'origine est resté dans la tumeur pendant au moins

48 heures après une période de traitement de 14 jours avec 7 injections IP.

iv/ Analyse pathologique des tumeurs PyVT après traitement aux PQ7

Fig. 74 : Nombre de tumeurs développées chez la

souris PyVT femelle. A/ Stade de pré-

développement tumoral. B/ Stade précoce. C/

Stade tardif. PQ7 : 25 mg/kg. * = p < 0,05 (par

rapport aux contrôles).

L'examen histopathologique des

tumeurs mammaires de souris PyVT a été

réalisé pour chaque groupe de traitement

aux trois stades de développement

tumoral. Lorsqu'elles sont présentes, les

tumeurs ont été classées comme

adénome / néoplasie intra-épithéliale

mammaire (MIN), carcinome précoce ou

carcinome tardif. Un adénome / MIN

impliquait une expansion des acini et

canaux par une prolifération de cellules

épithéliales néoplasiques polygonales

avec coalescence multifocale des canaux

et des acini affectées. Les cellules

néoplasiques présentaient des atypies

276

cellulaires minimales et un index mitotique faible (0-2 par champ à un

grossissement de 40x). La prolifération néoplasique était limitée par la membrane

basale et il y avait un manque de tissu conjonctif fibreux au sein de la tumeur. Les

carcinomes précoces étaient non encapsulé et modérément bien délimités, avec

des nids serrés et acini de cellules néoplasiques avec des atypies cellulaire

légères à modérées et 1-3 mitoses par champ à 40X. Les cellules néoplasiques

ont passé la membrane basale et étaient séparées de façon multifocale par une

quantité faible à modérée de stroma fibro-vasculaire. Les carcinomes tardifs

étaient non encapsulés, mal délimités et invasifs, composés de feuillets de nid

serrés et d'acini de cellules néoplasiques séparées par une quantité modérée de

stroma fibro-vasculaire. Les anisocytoses et anisocaryoses étaient modérées et

on observait en moyenne 1-3 mitoses par champ à 40X. Les carcinomes

adénosquameux étaient des carcinomes tardifs avec différenciation squameuse.

Fig. 75 : Analyse de tumeurs isolées de souris PyVT femelles 48h après la dernière injection. A/

Quantité de PQ7 dans l’homogénat. B, C et D : Expression des protéines Cx43, Cx46 (B) et PKC-α,

respectivement. Représentation graphique de l’analyse Western blot. PQ7 25 mg/kg, 7 injections

IP aux trois stades de développement. * = p < 0,05 par rapport au contrôle. n = 4

277

Les tumeurs de pré-développement des contrôles étaient soit des

adénomes/MIN soit des carcinomes précoces tandis que les tumeurs traitées aux

PQ7apparaissaient comme des hyperplasies focales ou des adénomes/MIN ou

des carcinomes précoces. Les tumeurs contrôles de stade précoce étaient toutes

des carcinomes précoces. Les tumeurs traitées aux PQ7 au même stade variaient

entre adénomes / MIN, carcinomes précoces et carcinomes tardifs. Au stade tardif,

les tumeurs contrôles comme traitées aux PQ7 étaient des carcinomes tardifs. En

outre, quelques tumeurs traitées aux PQ7 au stade tardif ont été identifiées

comme des carcinomes adénosquameux. L'examen histologique des tissus

pulmonaires à partir de toutes les souris à un stade avancé n'a montré aucune

différence significative en termes de présence de foyers métastatiques entre les

groupes de traitement.

v/ Effet de PQ7 sur l'expression de la connexine dans le tissu néoplasique

Il a été montré que les PQ7 amélioraient la GJIC et augmentaient

l'expression des Cx43 dans les cellules de cancer du sein (242) ; par conséquent,

la composition différentielle de protéines connexines dans les tumeurs traitées aux

PQ7 a été déterminée. Bien que la plupart des connexines soient des tumeur-

suppresseurs, il a été montré que les Cx46 étaient régulées à la hausse dans des

lignées cellulaires de cancer du sein et d'autres tumeurs pour fournir une

protection dans des conditions d'hypoxie (403). L'analyse immunoblot de

l'expression des connexines indique que le traitement PQ7 a augmenté

l'expression des Cx43 (Fig. 75B) et diminué l'expression des Cx46 (Fig. 75C)

durant les stades précoces de la carcinogenèse. Au cours du développement des

tumeurs PyVT chez les souris contrôles, il y avait une augmentation de

l'expression des Cx43 et Cx4 du stade pré-tumoral au stade tardif. Les données

suggèrent que la protéine connexine 43 des jonctions GAP a été exprimée à des

niveaux plus élevés chez les animaux traités aux PQ7 par rapport aux témoins et

le contraire pour la connexine 46 en début de formation des tumeurs. L'expression

des Cx46 dans les tumeurs traitées aux PQ7 aux stades pré-développement et

tardift était significativement moins élevée que celle des témoins (p-value pré =

0,016, p-value tardif = 0.0007). Les tumeurs traitées aux PQ7 au stade de pré-

278

développement avaient des niveaux d'expression des Cx43 significativement plus

élevés que les témoins (p-value pré = ,040) tandis que durant la phase tardive,

elles avaient

significativement

moins de Cx43 que

les témoins (p-

value tardif = 0.03).

Ceci peut

s'expliquer par

l'augmentation

globale à la fois

des connexines 43

et des connexines

46 durant le

développement

tumoral et létastase

chez les souris

PyVT.

Fig. 76 :

Immunohistochimie de

tumeurs issues de

souris PyVT femelles.

Contrôle = DMSO. PQ7

25 mg/kg, 7 injections

IP aux trois stades de

développement. Barre

= 10 µm. n = 6

279

L'histopathologie des tumeurs PyVT récoltées n'a montré aucune différence

significative dans la morphologie. L'immunohistochimie des tumeurs traitées aux

PQ7 aux stades de pré-développement et de développement précoce montrait

une plus forte coloration cytoplasmique des Cx43 alors que durant la phase

tardive la coloration cytoplasmique des Cx43 était plus forte dans le tissu contrôle

par rapport au tissu traité (Fig. 6A). L'immunohistochimie des Cx46 a indiqué une

coloration positive plus faible des tumeurs traitées par rapport aux témoins. Cela

confirme l'analyse moléculaire mentionnée précédemment.

Les protéines des jonctions GAP sont des phosphoprotéines qui sont

ciblées par des kinases pour l'acheminement, l'assemblage et désassemblage, la

dégradation et la fermeture des hemicanaux (398, 400, 401). La phosphorylation

régule la GJIC de manière spécifique à la fois de la kinase et de la connexine (398,

402). Comme les PQ7 modifient l'expression des connexines, nous avons exploré

le rôle de PKCa dans les tumeurs traitées aux PQ7 à chaque étape du

développement par analyse western blot (Fig. 75D) et immunohistochimie (Fig.

76C). Aucune modification significative de l'expression de la protéine kinase PKCa

n'a été observée suite au traitement PQ7. De façon intéressante, dans les tumeurs

contrôles, il semblait y avoir une plus forte coloration au stade de pré-

développement par rapport au stade tardif de développement des tumeurs, ce qui

suggère une diminution de la phosphorylation et de la dégradation des connexines.

E/ Discussion

L'utilisation efficace des médicaments antinéoplasiques dépend de la

capacité à équilibrer la mort des cellules tumorales et la toxicité inhérente pour

l'hôte. Les agents antinéoplasiques qui agissent principalement sur la division

rapide et la croissance des cellules ont de multiples effets secondaires et sont

dose-limitante. La première génération de stimulants des jonctions GAP

administrée par gavage a précédemment montré une faible toxicité chez les

animaux sains (396). Dans cette étude, nous avons réalisé des injections intra-

péritonéales pour assurer une exposition systémique d'une quantité constante de

PQ7 à toutes les souris. L'exposition systémique de souris C57B/6J et PyVT aux

280

PQ7 en une seule ou plusieurs doses, respectivement, n'a montré aucun effet

préjudiciable pour les organes vitaux. L'absorption du composé dans un tissu

spécifique dépend de la disponibilité du composé dans le sang et l'importance de

la vascularisation. Les plus hauts niveaux de PQ7 étaient détectables dans le foie,

le cœur, les poumons et l'utérus, ce qui peut être dû au fait que ce sont des tissus

fortement vascularisés. De façon intéressante, les PQ7 sont détectables dans le

cerveau, ce qui indique une bonne pénétration de la barrière hémato-

encéphalique. Les 25 mg / kg de PQ7 administrés à des souris d'environ 20g

étaient équivalents à 9,56 mM. Les résultats indiquent que la concentration de 9,5

mM de PQ7 peut être distribuée à tous les organes vitaux et métabolisée chez la

souris C57B/6J.

L'exposition de souris C57B/6J et PyVT à une seul ou plusieurs doses de

PQ7 systémique, respectivement, n'a montré aucun effet préjudiciable sur les

organes vitaux, ce qui indique une faible toxicité (353, 396). La quantité totale de

PQ7 détectée dans le tissu au bout de six heures était seulement de 8,1%. Ceci

suggère que la majorité de la molécule mère est métabolisée et / ou éliminée en

moins de six heures. La demi-vie de PQ7 dans le foie semble être d'environ 6

heures, suggérant un métabolisme ou une complète en 48 heures. Le délai

optimal entre les injections à des fins de traitement serait donc de 48 heures, ce

qui s'est avéré avoir des effets chez les souris porteuses de tumeur (267).

Les niveaux de PQ7 mesurés dans le tractus intestinal ont une forte

variabilité, cependant le composé était détectable au plus haut niveau dans cet

organe 36 heures après l'exposition. La muqueuse muqueuse intestinale

accumule des lipides et des composés hydrophobes, qui ont une perméabilité

accrue dans le tractus intestinal. Ceci suggère que PQ7 les peuvent être

sécrétées dans le tractus gastro-intestinal par le canal biliaire pour l'excrétion

fécale et potentiellement réabsorbées par la muqueuse intestinale en raison de

son caractère lipophile. Cette hypothèse est étayée par l'absence de PQ7

détectées dans le plasma ou les reins après 24 heures, ce qui indique que

l'excrétion urinaire de la molécule mère est complète en 24 heures après l'injection.

Collectivement, ces résultats suggèrent que le traitement PQ7 peut être utile dans

le ciblage des néoplasies du tractus gastro-intestinal.

281

Les souris PyVT représentent un nouveau modèle in vivo pour la formation

de carcinomes mammairse avec métastases présentant une utilité clinique

importante. Les tumeurs précancéreuses PyVT sont morphologiquement

hétérogènes avec des cellules néoplasiques hautement prolifératives contenant

une microvasculature anormale et des noyaux atypiques, tout en restant à

l'intérieur de la membrane basale (356). L’expression du MMTV-PyVT est variable

dans les tumeurs (356), ce qui indique que le transgène n'est pas nécessaire pour

le maintien de la malignité mais uniquement pour l'initiation des cellules

néoplasiques. Le modèle PyVT peut être utilisé comme un modèle à plusieurs

niveaux de la cancérogenèse due à l'évolution des lésions d'un état précancéreux

avec un phénotype mixte d'hyperplasie et adénome / néoplasie intra-épithéliale

mammaires, suivi d'un carcinome précoce et tardif avec métastases pulmonaires

éventuelles [8,9]. La formation de tumeurs secondaires dans les poumons est

avantageuse pour l'étude du processus métastatique, qui est la cause de décès

dans de nombreux types de cancer. La pathologie des lésions néoplasiques est

cliniquement semblable à celle des humains (356), soulignant la valeur de ce

modèle spontané dans cette étude.

La prolifération cellulaire et l'apoptose sont des facteurs importants dans la

carcinogenèse (420) et la GJIC est un facteur clef dans le processus

cancérogène. Une GJIC réduite dans les tissus pré-néoplasiques et néoplasiques

peut mener à une prolifération excessive des cellules, différenciation anormale et

inhibition de l'apoptose, ce qui conduit à la perte d'homéostasie. Plus de 100

carcinogènes non mutagènes et mutagènes ont été signalés inhiber la GJIC in

vitro et in vivo (421-423). Ces composés sont chimiquement divers et incluent des

produits pharmaceutiques, des hydrocarbures aromatiques polycycliques, des

produits végétaux et des pesticides. L'inhibition de la GJIC est le mieux corrélée

avec la carcinogénicité dans plusieurs tests in vitro (424). Ceci montre que le

mécanisme carcinogène de multiples agents implique la régulation à la baisse de

la GJIC. Par conséquent, un composé qui restaure la GJIC est essentiel pour la

prévention et le traitement du cancer. La capacité à normaliser la GJIC dans les

cellules néoplasiques pourrait restaurer l'homéostasie et prévenir le

développement d'autres tumeurs.

282

Beaucoup de promoteurs de tumeurs régulent à la baisse GJIC pour

permettre à la cellule initiée de proliférer et d'échapper à l'apoptose (425). La

régulation à la baisse de la GJIC est un processus réversible, ce qui indique que

l'intervention qui renforcerait la GJIC pourrait prévenir la promotion et la

progreesion du tissu néoplasique. Les PQ7 se sont précédemment avérées

augmenter l'expression des protéines des jonctions GAP et améliorer la GJIC (202,

242). Les données présentées ici montrent que les PQ7 retardent le

développement des carcinomes mammaires, ce qui suggère qu'elles pourraient

être utilisées comme un composé de chimio-prévention primaire du cancer du sein.

Les souris PyVT ont une modification génétique qui les prédispose au

développement de carcinomes mammaires mais avec un traitement aux PQ7 au

stade pré-cancéreux, le développement de ces tumeurs malignes a été retardé de

façon significative. L'utilisation d'intervention chimique avant qu'une cellule initiée

ne devienne indépendante des stimuli promoteurs pourrait induire une régression

du tissu néoplasique, ce qui est un procédé de chimio-prévention.

Le cancer est une maladie importante dans le monde, en dépit d'une

amélioration des connaissances sur la carcinogenèse et des options de traitement.

Des traitements plus efficaces contre le cancer sont nécessaires. En raison de

l'implication de la GJIC dans le développement du cancer et la métastase, il s'agit

d'une cible prometteuse pour de nouvelles thérapies. L'amélioration de la GJIC a

été démontrée améliorer l'efficacité de divers types de thérapies contre le cancer à

travers l'effet de voisinage (426-432). La GJIC pourrait augmenter la distribution

des composés chimiothérapeutiques dans des tissus qui sont faiblement

vascularisés et présentent une faible distribution des médicaments, ce qui est

particulièrement important pour les composés hydrophiles qui sont incapables de

passer à travers la membrane cellulaire (433). En outre, il a été démontré qu'une

amélioration de la GJIC augmentait la sensibilité des cellules cancéreuses à des

agents chimiothérapeutiques classiques (276, 434). Bien que les PQ7 ne soient

pas un composé anticancéreux efficace à lui seul au cours des stades avancés du

développement tumoral, il peut être utilisé en association avec de multiples types

de chimiothérapies pour améliorer la mortalité des cellules néoplasiques.

L'analyse moléculaire de l'expression protéique a montré une augmentation

générale de l'expression des Cx43 et Cx46 au cours du développement tumoral.

283

Cx46 est une protéine des jonctions GAP spécifique des conditions d'hypoxie

dans le tissu mammaire suggérée avoir des effets pro-tumoraux en empêchant la

mort par hypoxie (405). Lorsqu'une tumeur se développe en taille, les cellules

néoplasiques dans le centre de la masse pourraient réguler à la hausse

l'expression des Cx46 afin de survivre aux conditions d'hypoxie. En outre, une

augmentation de l'expression des Cx43 est normalement corrélée à un potentiel

métastatique (246, 412). De façon intéressante, l'expression des Cx43 chez les

animaux traités aux PQ7 a une relation de réciprocité avec l'expression des Cx43

chez les souris témoins, tandis que l'expression des Cx46 dans le tissu traité reste

faible malgré le stade de développement. Les PQ7 affectent l'expression de

chaque connexine différemment au cours du développement tumoral. En

particulier, la diminution d'expression des Cx46 et l'augmentation des Cx43

observées suite au traitement aux PQ7 au cours de la phase de pré-

développement peut être la clef pour la prévention ou le retard à la formation des

tumeurs. De plus amples connaissances sur le rôle de chaque protéine des

jonctions GAP dans la tumorigenèse sont nécessaires.

Le stimulant des jonctions GAP PQ7 ne présente ici aucun effet secondaire

apparent sur les organes vitaux lorsqu'il est distribué en systémique à tous les

organes vitaux ; et est capable d'altérer le développement d'un carcinome

mammaire spontané. Ces résultats sont prometteurs pour le développement d'un

nouveau composé de chimio-prévention ou pour une utilisation en association

avec d'autres molécules de chimiothérapie dans le traitement du cancer du sein.

285

IV/ Effet de molécules anti-néoplasique sur un modèle de

tumeur spontanée chez le mâle

Traduit de l'anglais : Shishido et al. (435)

A/ Résumé

Le cancer du sein chez le mâle est une maladie rare. Le nombre limité de

cas cliniques est la raison pour laquelle les traitements primaires pour les hommes

sont tirés d'études de cancer du sein chez la femme. Ici, la souche transgénique

FVB/N-TgN (MMTV-PyVT) 634Mul/J (également connue sous le nom PyVT) a été

utilisée en tant que système modèle pour mesurer la charge tumorale et l'effet

d'agents antinéoplasiques : tamoxifène cisplatine et paclitaxel sur la tumorigenèse

à un stade précoce de développement de carcinome mammaire dans un modèle

de souris mâles. Le traitement au cisplatine a réduit significativement le volume

tumoral alors que le paclitaxel et le tamoxifène n'ont pas diminué la croissance

tumorale. Il a été montré que le traitement au cisplatine induisait l'apoptose,

observée par une formation réduite de tumeurs, grâce à la réduction de

l'expression des protéines Bcl- 2 et survivine ainsi qu'une augmentation de

l’expression des caspases 3 par rapport aux témoins. Le traitement au tamoxifène

altère de manière significative les niveaux d'expression des récepteurs hormonaux

de la tumeur, tout en régulant à la hausse Bcl-2 et cycline D1. Ceci suggère une

importance de la signalisation hormonale chez les hommes dans la pathogenèse

du cancer du sein. Les résultats de cette étude fournissent des informations

précieuses vers une meilleure compréhension du cancer du sein masculin et

peuvent aider à guider les décisions thérapeutiques.

B/ Introduction

Le cancer du sein masculin représente 1% de tous les cas de cancer du

sein etl provoque environ 0,5% de tous les décès par cancer chez les hommes

aux Etats-Unis (436). La connaissance de cette pathologie et des traitements

286

appropriés demeure limitée en raison de la rareté de grandes cohortes de patients

masculins souffrant de cancer du sein. Le traitement du cancer du sein masculin

est donc extrapolé à partir d'études cliniques menées chez les femmes (437). Le

cancer du sein masculin présente, le plus souvent, à un stade avancé, des

masses fermes et indolores en région sous-aréolaire qui deviennent adhérentes

au muscle grand pectoral et à la peau (438). Le cancer du sein chez l'homme est

diagnostiqué à un stade plus avancé que le cancer du sein des femmes,

conduisant à une tendance pour de petites tumeurs à se propager aux ganglions

lymphatiques axillaires. Le taux de survie à 5 ans pour le cancer du sein

métastatique chez les hommes est inférieur à 20 % tandis que la médiane de

survie est seulement d'environ 15 mois (439, 440). Le pronostic du cancer du sein

masculin est similaire à celui des femmes pour le même stade évolutif.

Le cancer du sein masculin diffère du cancer du sein des femmes dans de

nombreux aspects. Notamment, le cancer du sein masculin est diagnostiqué chez

des patients plus âgés, à un stade plus avancé, avec une répartition bimodale de

l'âge/fréquence (439, 441). Il présente également des différences raciales (441),

de sous-types histologiques, des variations immunophénotypiques distinctes (439,

441, 442), de faibles taux de survie (439) et des mutations génétiques

différentielles, comme un polymorphisme de CYP17 (443), des récepteurs

androgènes (AR) (444), et des mutations de CHEK2 (445). Il a également été

démontré que le cancer du sein masculin présentait une fréquence plus élevée

d'expression de récepteurs hormonaux (RH) (80 à 90 %) que es femmes (75%), le

récepteur aux œstrogènes (ER) et le récepteur à la progestérone (PR) (439, 440).

On ne sait pas s'il ya une relation entre ER + carcinomes mammaires masculins et

la survie des patients (439, 446, 447). Cela peut être dû à des différences dans la

fonction de l’ER chez les hommes par rapport aux femmes (448). Il s'agit d'une

régulation à la hausse de l'expression des ER chez les mâles en raison de

niveaux d'oestrogène naturellement plus faibles dans le micro-environnement

tissulaire, ce qui conduit à une augmentation des oestrogènes cibles (449). Un

exemple est la protéine Bcl-2 qui est un inhibiteur de l'apoptose et est surexprimée

dans le cancer du sein chez l'homme (450).

Les sous-types moléculaires des cancers mammaires des mâles sont

basés sur l'expression de certains marqueurs de protéines dans le tissu

287

néoplasique qui sont utilisés pour évaluer leur liaison avec les caractéristiques

pathologiques observées et l'évolution chez les patients. Il est important de noter

que la positivité des RH des carcinomes mammaires des mâles peut ne pas avoir

la même valeur pronostique dans le cancer du sein chez la femme. Il est difficile

de savoir si le récepteur épidermique humain du facteur de croissance 2 (HER2)

joue un rôle pronostique ou prédictif dans le cancer du sein chez l'homme (451,

452). Dans une étude comparative entre les cancers du sein invasifs chez les

hommes et les femmes, le phénotype le plus commun était luminal A (HR+ /

HER22), tandis que HR2 et HER2 + n'ont pas été identifiés chez les hommes

(453). Dans une autre étude, les tumeurs luminales A représentaient 82,8%,

luminal B (+) HR2/HER2 6,2% et les tumeurs de type basal (HR2/HER22) 9,6% de

la cohorte de cancers du sein chez l'homme (454). Contrairement à ceux-ci, une

autre série n'a rapporté aucune différence significative entre les sous-types de

tumeurs (455). Ces études montrent que la distribution des sous-types

moléculaires dans le cancer du sein masculin est variable mais qu'il est également

différent comparativement aux cohortes de cancers du sein chez la femme. Ceci

est indicatif d'une différence dans la carcinogenèse entre les hommes et les

femmes.

Certaines populations sont plus à risque de développer un cancer du sein

masculin. Les principaux facterus de risques sont des facteurs génétiques ou un

déséquilibre hormonal. Environ 20% des hommes atteints d'un cancer du sein ont

des antécédents familiaux de cancer du sein ou de l'ovaire (456). Des mutations

dans les gènes BRCA1 ou BRCA2 sont les plus importants facteurs de risque

génétiques connus du cancer du sein masculin. Plus spécifiquement la mutation

du gène BRCA2 entraine un risque de développer un cancer du sein masculi au

cours de sa vie de 7% (457), ce qui représente un plus grand risque que pour les

femmes ayant une prédisposition génétique pour cette maladie. Un changement

dans le rapport des oestrogènes et de la testostérone est également un facteur

important contribuant à un cancer du sein chez l'homme. Les personnes atteintes

du syndrome de Klinefelter ont des niveaux bas de testostérone, ce qui augmente

le risque de développer un cancer du sein masculin au cours de sa vie à environ

5% (456).

288

L'approche thérapeutique couramment utilisée consiste en une

mastectomie, une évaluation des ganglions axillaires et une hormonothérapie,

potentiellement une chimiothérapie adjuvante supplémentaire. L'hormonothérapie,

principalement le tamoxifène, est la pierre angulaire du traitement contre le cancer

du sein masculin et est considérée comme le traitement de première ligne du

cancer métastatique du sein masculin, avec un taux de réponse global de 49%

(458). Dans une autre étude (459), il a été signalé que le tamoxifène a augmenté

le taux de survie actuarielle à 5 ans (61% contre 44%) et la survie sans maladie

(55% contre 28%) de 39 patients masculins souffrant de cancer du sein par

rapport au groupe contrôle historique (460). Les hommes tolèrent en général bien

le tamoxifène, avec des effets secondaires les plus fréquemment rapportés tels

que diminution de la libido, prise de poids, bouffées de chaleur, troubles de

l'humeur et dépression. Cependant, il est important de noter qu'il n'y a pas eu

d’études randomisées afin d'évaluer les taux de réponses réelles ou la toxicité du

tamoxifène chez les hommes. Le rôle des autres médicaments anti-néoplasiques

couramment utilisés pour le traitement du cancer du sein chez les femmes n'a pas

encore été déterminé chez les hommes.

Les progrès dans le diagnostic et le traitement du cancer du sein des

femmes ont entraîné une baisse constante de l'incidence et une amélioration des

résultats cliniques tandis que le cancer du sein masculin a connu une constante

une augmentation de l'incidence au cours des dernières décennies et une

amélioration beaucoup plus lente sur les résultats cliniques (461). Le traitement

contre le cancer du sein masculin est extrapolé à partir des essais cliniques

portant sur les femmes, en dépit de tableaux cliniques et de pathogenèses

distincts, ainsi que l'absence d'amélioration clinique chez les patients. Il existe un

besoin pour une nouvelle prise en charge clinique du cancer du sein masculin. Les

différences majeures entre les patients masculins et féminins en matière

d'endocrinologie et de réponse des cancers du sein suggèrent la nécessité

d'explorer des options de traitement alternatives.

La souche de souris transgéniques FVB/N-TgN (MMTV-PyVT) 634-Mul/J

(aussi dénommée PyVT) est un nouveau modèle in vivo de la formation de

tumeurs mammaires et de leurs métastases. Le modèle PyVT a une expression

tissu-spécifique de l'antigène moyen T du Polyoma virus sous le contrôle du

289

promoteur du virus de tumeur mammaire de la souris (353). Les tumeurs

prémalignes des souris PyVT sont morphologiquement hétérogènes avec une

microvascularisation anormale, hautement prolifératives avec des noyaux

atypiques et restent confinées à l'intérieur de la membrane basale avant

métastase dans les poumons (356). Des études montrent que, même à des

stades précoces de développement mammaire, les coussinets adipeux

mammaires étaient clairement anormaux avec une croissance irrégulière des

branches latérales, des bourgeons terminaux agrandis et d'importantes masses

tumorales. Les mâles développent généralement des tumeurs mammaires au plus

tard à 15 semaines et atteignent la charge tumorale maximale à environ 25

semaines d'âge.

La présente étude se focalise sur l'utilisation de la génération in situ de

tumeurs mammaires mâles par le modèle PyVT pour déterminer l'efficacité des

médicaments anti-néoplasiques : le cisplatine, le paclitaxel et le tamoxifène pour

atténuer la croissance des tumeurs. Les avantages potentiels de chaque option de

traitement sont révélés pour un modèle de tumeur mammaire masculin.

C/ Matériel et méthode


L'élevage des animaux est effectué par le Groupe de médecine comparée









290

ii/ Modèle de souris

Les souris PyVT ont été achetées auprès de Jackson Laboratory (Bar

Harbor, Maine, Etats-Unis). Les souris ont été suivies tous les deux jours pour

contrôler l'apparition de tumeurs. La taille des tumeurs a été mesurée en deux

dimensions avec un pied à coulisse. Les souris ont été observées pourun

comportement anormal, un changement de l'apparence ou une perte de poids. Si

les animaux présentaient des signes de douleur, une croissance extrême de la

tumeur (supérieure à 1,5 cm) ou une perte de l'état corporel, ils ont été

euthanasiés avant la fin de la période d'expérimentation. Les souris ont été

sacrifiées à 10, 15 et 20 semaines d'âge afin d'examiner l'épithélium mammaire et

la formation des tumeurs. Tous les traitements ont été effectués sur des souris

jugées à un stade de développement précoce des tumeurs soit 15 semaines d'âge.

Le poids moyen de ce groupe d'âge était de 28-32 grammes. Les souris ont été

divisées au hasard en quatre groupes expérimentaux : 1. animaux témoins

recevant uniquement le solvant (DMSO) ; 2. Animaux traités avec 3,5 mg/kg de

cisplatine ; 3. Animaux traités avec 10 mg/kg de paclitaxel ; et 4. Animaux traités

avec 40 mg/kg de tamoxifène. Tous les traitements ont été administrés par voie

intra-péritonéale.

iii/ Anticorps

Les anticorps primaires : Survivin (sc-8807, anticorps polyclonal de chèvre),

caspase 3 (sc-56046, anticorps monoclonal de souris), cycline D1 (sc-8396,

anticorps monoclonal de souris), Bcl-2 (sc-492, anticorps polyclonal de lapin), ERa

(sc-8002, anticorps monoclonal de souris), ERb (sc-8974, anticorps polyclonal de

lapin) et PR (sc-166170, anticorps monoclonal de souris) de Santa Cruz

Biotechnology (Santa Cruz, CA) ; anti-GAPDH (2118, anticorps monoclonal de

lapin) et anti-HER2 (4290, anticorps monoclonal de lapin) de Cell Signaling

(Boston, MA) ont été utilisés à la fois pour les analyses Western blot et

immunohistochimiques (IHC).

291

iv/ Immunohistochimie

Toutes les tumeurs ont été prélevées et fixées dans une solution de

formaldéhyde à 10% et incorporées dans de la paraffine préalablement à leur

sectionnement sur des lames à une épaisseur de 5 mm. Des sections de paraffine

(5 mm) ont été séchées à 60°C pendant 25 minutes. Le déparaffinage a été

réalisé avec 100% de xylène et 100%, 90%, 75%, 50% d'éthanol. L'antigène

extraction a été effectuée dans une solution tampon de citrate et de la vapeur. Les

lames ont été ensuite incubées pendant une nuit à température ambiante avec un

anticorps polyclonal (dilution 1:50). Après lavages dans plusieurs bains de PBS,

les lames ont été incubées avec des anticorps secondaires biotinylés (1:1000)

pendant 15 minutes. Les lames ont été lavées et les immunomarquages ont été

amplifiés par incubation avec du complexe avidine biotine (ABC) pendant 10

minutes. Les cellules ont été visualisées avec de la 3,3-diaminobenzidine (DAB)

suivie d'une contre-coloration hemalun-eosine. Les sections ont été observées et

les images capturées avec un microscope Nikon 80i sous un grossissement 40x et

60x.


Le tissu de tumeurs des glandes mammaires a été homogénéisé dans 500

ml de tampon de lyse (20 mM Tris pH 7,5, EDTA 0,5 mM, EGTA 0,5 mM, 0,5 % de

Triton X-100) avec un inhibiteur de protéase à une dilution de 1:1000 (Sigma-

Aldrich, Saint -Louis, MO). Le tissu a été homogénéisé par l'intermédiaire de

l'OMNI Bead Ruptor 24 à une vitesse de 5,65 m/s pendant 45 secondes, suivi par

une centrifugation à 13 000 rpm pendant 30 minutes à 4°C. Vingt-cinq

microgrammes d'extrait de cellules entières ont été résolus par électrophorèse sur

gel SDS-PAGE à10% et transférés sur une membrane de nitrocellulose (Midwest

scientifique, Saint Louis, MO, USA). Les membranes de nitrocellulose ont été

bloquées avec 0,5 % de lait dans une solution de Tris saline tamponnée et de

Tween 20 (TBST) en utilisant le dispositif SNAPid (Millipore) à température

ambiante. Les membranes ont ensuite été incubées avec un anticorps primaire à

une dilution de 1:1000, suivi par un anticorps secondaires lié à la la peroxidase de

292

Raifort (HRP) (1:2000). Les transferts ont été détectés par des réactifs de

détection par chimioluminescence amplifiée (Pierce, Rockford, Illinois, Etats-Unis)

et visualisés par Fluorochem E système d’imagerie (ProteinSimple, Santa Clara,

CA).


Toutes les données sont présentées comme moyennes pour l'intervalle de

confiance de 95 % d'au moins trois expériences indépendantes pour l'analyse

moléculaire et six échantillons pour les études animales. La signification

statistique a été examinée avec une p-value de 0,05.

D/ Résultats

i/ Caractérisation du modèle de souris PyVT et effets du traitement sur

l'expression des récepteurs hormonaux

Les mâles de la lignée transgénique FVB/N-TgN (MMTV-PyVT) 634Mul/J

ont développé des tumeurs dès l'âge de 14 semaines. Les dix coussinets adipeux

mammaires ont développé des tumeurs et la charge tumorale maximale a été

atteinte à environ 25 semaines d'âge. Le développement des tumeurs dans ce

modèle spontané a été divisé en trois phases sur la base de la mesure de la taille

des tumeurs, la fréquence de formation de tumeurs, et la présence de métastases

dans les poumons. La phase de "pré-développement" tumoral chez les souris

PyVT s'est produite à 10-13 semaines d'âge et consistait en un état précancéreux

où aucune tumeur n'était palpable et le tissu mammaire semblait normal sur

simple observation. Le stade précoce de développement représente la formation

de tumeurs solides dans le tissu mammaire à 15-18 semaines d'âge. A ce stade,

on observe 1 ou 2 tumeurs solides. Le stade tardif consiste en la présence de

l'ensemble des 10 tumeurs mammaires primaires et de métastases secondaires

aux poumons, ce qui apparaît eu lieu à plus de 20 semaines. La présence de

métastases a été confirmée par coloration hémalun-éosine (H&E) de sections

293

représentatives du poumon et examen histopathologique. Ce rapport met l'accent

sur le stade précoce de la formation de tumeurs et a examiné l'effet de

médicaments antinéoplasiques sur la croissance de la tumeur à ce stade.

Les tumeurs mammaires ont été isolées à partir de chaque groupe de

traitement pour déterminer l'expression des récepteurs hormonaux (ER, PR et

HER2). L'immunohistochimie de coupes de tumeurs témoins montre une faible

coloration positive de HER2 et une forte coloration positive d’ERβ (Fig. 77A). Le

traitement au tamoxifène a entraîné une augmentation de la coloration nucléaire

positive des ERa dans les tumeurs isolées, tout en diminuant la coloration positive

des ERb. L'analyse Western blot a été réalisée pour déterminer les niveaux

d'expression quantifiables de chaque récepteur hormonal dans le tissu traité. Les

tumeurs contrôles expriment ERa, ERb, PR et HER2 (Fig. 77B). Les animaux

traités au tamoxifène présentaient une expression accrue des ERa (p-value =

0,0021) et PR (p-value = 0,0300 ; Figure 77B), tout en induisant une diminution

significative de l'expression des HER2 (p-value = 0,0002) et ERb (p-value =

0,0002). Les souris ayant reçu le traitement au paclitaxel ont présenté une

réduction significative de l'expression des ERa et ERb par rapport aux souris

témoins (p = 0,0201 et 0,0219, respectivement), sans changement de l'expression

de PR et HER2. De façon intéressante, les animaux traités au cisplatine n'ont

montré aucun changement dans l’expression d’ERa, ERb, PR ou HER2, ce qui

suggère que le traitement n'affecte pas l'expression des marqueurs moléculaires.

ii/ Effet du cisplatine sur le développement précoce des souris PyVT

La croissance tumorale sur une période de 14 jours de traitement au

cisplatine avec une administration tous les deux jours indique un effet significatif

du traitement sur le développement néoplasique au cours de la phase précoce de

la formation des tumeurs (Fig. 78). Le volume initial des tumeurs pour toutes les

souris était de 66.86 +/- 21.99 mm3. La différence entre les volumes tumoraux

chez les souris traitées au DMSO et au cisplatine était significative à partir de 8

jours de traitement et jusqu'à 14 jours (Fig. 78A). Le volume final des tumeurs

pour les souris traitées au DMSO (témoins) était de 293.33 +/- 71.39 mm3, tandis

que les souris traitées au cisplatine avait un volume final de 100.18 +/- 105.78

294

mm3. Le changement de volume de la tumeur au cours de la période de 14 jours

montre une réduction significative de 215,59 mm3 avec le traitement au cisplatine

par rapport au témoin (p-value = 0,00044 ; Fig. 78B). Il s'agit d'une différence

globale de 90,71 % de croissance tumorale après traitement au cisplatine.

Les souris contrôles ont un total de 10 coussinets adipeux mammaires

ayant développés des tumeurs au cours de la période de traitement.

Fig. 77 : Phénotype des souris PyVT males au cours du stade précoce de développement.

Contrôle = DMSO, tamoxifène 40 mg/kg, paclitaxel 10 mg/kg et cisplatine 3,5 mg/kg ; 7 injections

IP. A/ Immunohistochimie. Bleu = contre-coloration à l’hemalun. n = 6. B/ Western blot. n = 4 C/

Représentation graphique de l’analyse Western blot. Reference = intensité de la bande du contrôle

(DMSO)

295

Fig. 78 : Croissance tumorale (en mm3)

chez la souris PyVT male traitée au

cisplatine. A/ Cisplatine 3,5 mg/kg Les

jours 0-12 correspondent aux 7

injections et le jour 14 correspond à la

fin de l’étude (mesures avant

prélèvement des organes). B/

Modification de la taille des tumeurs à

la fin de l’étude. C/ Nombre de tumeurs

développées chez la souris PyVT male

à la fin des 14 jours. * = p < 0,05 (par

rapport aux contrôles : pas de

traitement et traitement au DMSO). n =

6

iii/ Effet du paclitaxel sur le développement précoce de PyVT souris

Le volume initial des tumeurs pour toutes les souris traitées avec soit

paclitaxel soit DMSO était de 137.34 +/- 93.05 mm3. Il n'y avait pas de différence

significative dans les volumes tumoraux entre les groupes de traitement à

n'importe quel moment au cours de la période de traitement de 14 jours (Fig. 79A).

Le changement dans la croissance tumorale au cours de la période de traitement

de 14 jours a indiqué une réduction significative de la croissance suite au traitment

au paclitaxel (p-value = 0,029, Fig. 79B). Les souris témoins ont présenté une

croissance tumorale globale du 237.68 +/- 65.78 mm3, tandis que chez les souris

296

traitées au paclitaxel elle était de 75.10 +/- 134.57 mm3. En outre, le traitement au

paclitaxel a réduit significativement la charge tumorale en moyenne de 2,5

tumeurs (p-value = 0,00022, Fig. 79C).

iv/ Effet du tamoxifène sur le développement précoce des souris PyVT



paclitaxel. A/ Paclitaxel 10 mg/kg Les

jours 0-12 correspondent aux 7 injections

et le jour 14 correspond à la fin de l’étude

(mesures avant prélèvement des

organes). B/ Modification de la taille des

tumeurs à la fin de l’étude. C/ Nombre de

tumeurs développées chez la souris

PyVT male à la fin des 14 jours. * = p <

0,05 (par rapport aux contrôles : pas de

traitement et traitement au DMSO). n = 6

Les souris traitées au

tamoxifène et leurs contrôles

respectifs ont commencé le

traitement avec un volume initial

des tumeurs de 127.91+/-122.53

mm3. Le traitement au tamoxifène

n'a pas affecté la croissance des

tumeurs par rapport aux animaux

témoins au cours de la période de

traitement (Fig. 80A et 80B). On a

noté cependant une réduction significative de la charge tumorale d'environ quatre

tumeurs (p-value = 0,00478, Fig. 80C).

297

v/ Expression protéique dans les tumeurs isolées de souris PyVT



tamoxifène. A/ Tamoxifène 40 mg/kg

Les jours 0-12 correspondent aux 7

injections et le jour 14 correspond à la

fin de l’étude (mesures avant

prélèvement des organes). B/

Modification de la taille des tumeurs à la

fin de l’étude. C/ Nombre de tumeurs

développées chez la souris PyVT male à

la fin des 14 jours. * = p < 0,05 (par

rapport aux contrôles : pas de traitement

et traitement au DMSO). n = 6

Une analyse par

immunotransfert a été réalisé afin

de déterminer l'expression de

marqueurs moléculaires du

cancer du sein chez le mâle :

protéine Bcl-2, caspase-3,

survivine et cycline D1 (Fig. 81A).

Bcl-2 a montré une corrélation

avec un faible taux de cellules

mitotiques et des tumeurs de bas grade, ce qui suggère qu'il peut être un

marqueur biologique important dans la pathogenèse du cancer du sein des

patients de sexe masculin (462). Le tamoxifène a augmenté l'expression de Bcl- 2

de 65% par rapport au témoin (p = 0,0131). Le paclitaxel a réduit de manière

significative l'expression de Bcl-2 de 22% (p-value = 0,0346). Le traitement au

cisplatine a entrainé une diminution significative de 17% de l'expression de Bcl-2.

L'immunohistochimie montre une forte coloration de Bcl- 2 du contrôle et des

tumeurs traitées (Fig. 81B). Les tumeurs traitées au tamoxifène semblent avoir

une plus forte coloration de Bcl-2, ce qui confirme l'analyse western blot.

298

La capacité à induire la signalisation apoptotique dans les cellules

tumorales a été déterminée par analyse de l'expression des caspases. Le

cisplatine a augmenté l'expression de caspase 3 de 55% (p-value = 0,0001) par

rapport aux tumeurs contrôles (Fig. 81A). Les traitements au tamoxifène et au

paclitaxel n'ont pas changé l'expression des caspases 3. Les tumeurs contrôles

présentent une très faible coloration positive pour la caspase 3. Tous les

composés anticancéreux montrent une augmentation de coloration positive par

rapport au témoin mais le cisplatine et le tamoxifène ont la coloration positive la

plus forte pour la caspase 3 (Fig. 81B).

Les cellules tumorales sont hautement prolifératives ; par conséquent, nous

avons exploré l'expression de la cycline D1 en tant que biomarqueur pour la

prolifération cellulaire. Cycline D1 est un régulateur clef du cycle cellulaire dont la

surexpression entraîne une rapide progression de la phase G1 à la phase S de la

mitose [30]. L'analyse de l'expression de la cycline D1 a indiqué que le tamoxifène

a augmenté de manière significative l'expression de 96% (p-value = 0,0115),

tandis que le paclitaxel et le cisplatine ne modifient pas de manière significative

les niveaux d'expression (Fig. 81A). Les tumeurs contrôles avaient une faible

coloration positive pour la cycline D1. Les tumeurs traitées au tamoxifène

présentaient une forte coloration positive tandis que les tumeurs traitées au

paclitaxel et cisplatine présentaient une faible coloration positive pour la cycline

D1 (Fig. 81B).

Des protéines qui inhibent l'apoptose assurent la protection des cellules

tumorales contre des composés cytotoxiques. La survivine est une protéine

membre de la famille des inhibiteurs de l'apoptose qui est exprimée au cours de

l'embryogenèse et dans les cellules tumorales en tant que protéine anti-

apoptotique qui est capable de réguler la mitose (281-283). La survivine est

fortement exprimée dans une variété de tumeurs et son expression est corrélée à

la fois à une rechute accélérée et à une résistance à la chimiothérapie (284). Les

traitements au tamoxifène et au cisplatine ont réduit de manière significative

l'expression de la survivine de 77% (p-value = 0,0019) et 48% (valeur p 0,0001),

respectivement (Fig. 81A). L'immunohistochimie des tumeurs témoins ont montré

une forte coloration positive pour la survivine (Fig. 81B). Les tumeurs traitées au

299

tamoxifène et au cisplatine ont une faible coloration positive pour la survivine par

rapport au paclitaxel et au tissu contrôle.

vi/ Examen pathologique des tumeurs mammaires chez le mâle

Fig. 81 : Expression des marqueurs moléculaires Bcl-2, caspase 3, cycline D1 et survivine.

Contrôle = DMSO, tamoxifène = 20 mg/kg, paclitaxel = 10 mg/kg et cisplatine = 3,5 mg/kg A/

Western blot et représentation graphique au stade précoce de développement. Reference =

intensité de la bande du contrôle. n = 4. B/ Immunohistochimie. n = 3

300

L'examen pathologique des tumeurs mammaires a été réalisé pour chaque

groupe de traitement. Les tumeurs ont été classées en deux catégories carcinome

au stade précoce ou carcinome au stade tardif. Un carcinome débutant consistait

en un néoplasme modérément délimité avec des acini de cellules épithéliales

néoplasiques proliférantes avec atypie cellulaire et invasion de la membrane

basale. Un carcinome tardif consistait en des tumeurs mal délimitées composées

de feuillets d'acini de cellules épithéliales néoplasiques séparés par un stroma

fibro-vasculaire avec une perte de l'architecture mammaire, une augmentation de

la prolifération et une plus vaste invasion.

Les tumeurs témoins ont été caractérisées par une hyperplasie focale avec

des ganglions lymphatiques et tissus adipeux normaux ou des lésions de

carcinome précoce. Les traitements au cisplatine et au paclitaxel n'ont montré

aucun changement significatif de l'histopathologie et les tumeurs ont conservé

leurs caractéristiques de carcinome précoce. Les souris traitées au tamoxifène ont

développé des tumeurs caractéristiques de cancer tardif, ce qui suggère une

augmentation de la malignité due au traitement.

E/ Discussion

Le modèle transgénique PyVT a été utilisé ici pour les études

translationnelles de cancer du sein masculin en raison de son profil pathologique

et d'expression de protéines cliniquement pertinentes. Les modèles de cancer du

sein masculin sont limitées mais le manque de cas cliniques fait de ce modèle de

souris transgéniques un modèle vital pour comprendre les différences

pathologiques du cancer du sein masculin par rapport aux homologues féminins.

Le modèle PyVT mâle a fourni l'occasion d'aborder l'efficacité des traitements en

utilisant les médicaments anti-néoplasiques : tamoxifène, paclitaxel et cisplatine.

Le tamoxifène est mieux connu comme un modulateur des récepteurs aux

œstrogènes (SERM) en raison de ses multiples activités (303). En raison de la

forte positivité des récepteurs hormonaux dans le cancer du sein masculin, le

tamoxifène est le traitement adjuvant standard. Le paclitaxel, approuvé par la

Food and Drug Administration (FDA, "Agence américaine des produits

301

alimentaires et médicamenteux") pour traiter les cancers du sein et de l'ovaire, est

un traitement de première ligne du cancer du sein métastatique chez la femme. Le

paclitaxel favorise l'assemblage des microtubules stables et inhibe leur

dépolymérisation (463), interférant par conséquent avec la fonction normale des

microtubules et prévenant la progression du cycle cellulaire (464). Le cisplatine est

un médicament de chimiothérapie à base de platine utilisé pour traiter une variété

de cancers par la formation d'adduits de platine-ADN qui induisent l' arrêt du cycle

cellulaire (271, 272). Ces composés ont des modes d'actin radicalement différents.

Ici, nous avons déterminé l'efficacité de chacun à atténuer la croissance de la

tumeur mammaire dans un modèle masculin.

Cette étude montre que la formation précoce de tumeurs mammaires chez

le mâle est sensiblement atténuée par un traitement au cisplatine tandis que le

tamoxifène et le paclitaxel n'ont pas d'effet sur la croissance tumorale. Ceci

suggère que les options de traitement doivent être réexaminées pour les patients

masculins souffrant de cancer du sein. Le tamoxifène est le traitement principal

actuel mais les résultats indiquent qu'il n'atténue pas efficacement la croissance

tumorale. Le cisplatine s'est avéré être le traitement anti-néoplasique le plus

efficace testé, ce qui suggère une nécessité de changer les composés pour les

traitements primaires des patients mâles atteints de cancer du sein. De façon

intéressante, les trois composés anti-néoplasiques : cisplatine, paclitaxel et

tamoxifène réduisent le nombre total de tumeurs développées, indiquant qu'ils

pourraient avoir une propriété chimio-préventive.

L'expression des récepteurs hormonaux est le principal moyen de profil des

carcinomes mammaires. Les tumeurs PyVT mâles se sont avérées ERa/b +, PR +

et HER2 +. Le traitement au tamoxifène a augmenté l'expression à la fois des ERa

et PR, tout en conduisant à une diminution de l'expression des HER2 et ERb, ce

qui indique une relation inverse entre les isoformes des ER due au traitement par

le tamoxifène. Les tumeurs sensibles aux hormones sont généralement basées

sur l'expression du seul ERα. Le rôle d’ERβ dans la pathologie et le traitement du

cancer du sein reste largement inconnu. Les fonctions de ces deux récepteurs aux

oestrogènes sont radicalement différentes en réponse à la fois aux œstrogènes et

aux composés anti-œstrogéniques (465, 466). Plusieurs rapports indiquent que

l'exposition aux œstrogènes des cellules de cancer du sein exprimant ERα conduit

302

à une augmentation de la prolifération, tandis que l'exposition de cellules

exprimant ERβ, soit seule, soit en association avec ERα, aboutit à une inhibition

de la prolifération cellulaire (467-469). Ceci suggère qu’ERβ peut fonctionner plus

comme un suppresseur de tumeur qu'un promoteur de tumeur. L'expression du

récepteur ERβ a été trouvée dans 47% des tumeurs du sein classées comme ERα

négatives (470). De façon intéressante, le paclitaxel a réduit l'expression du

récepteur ERβ mais n'a pas affecté l'expression du récepteur ERα, PR ou HER2.

La pertinence clinique de l'expression de ERβ est incertaine ; plusieurs études

indiquent une corrélation avec l'amélioration de la survie (471, 472), tandis que

d'autres suggèrent une faible corrélation ou un mauvais pronostic (473, 474). Ces

résultats soulignent la nécessité d'élucider la fonction du récepteur ERb dans la

pathologie et le traitement du cancer du sein.

La régression tumorale se produit lorsque la vitesse de prolifération

cellulaire est inférieure au taux de mort cellulaire. Pour déterminer la signalisation

apoptotique en réponse aux traitements anti-néoplasiques, les niveaux

d'expression de caspase 3 ont été mesurés dans toutes les tumeurs. Le cisplatine

a été le seul composé à induire une augmentation significative des caspases 3, ce

qui indique l'induction de l'apoptose due au traitement. Ceci est observé

grossièrement par une réduction significative de la taille de la tumeur. Le

tamoxifène et le paclitaxel n'ont pas d'effet apoptotique observable. La survivine,

inhibiteur de l'apoptose, a été mesuré dans le tissu tumoral après traitement aux

composés anti-néoplasiques. Une diminution significative de l'expression de la

survivine a été observée après traitement au tamoxifène ou au cisplatine. Ceci

indique que les deux traitements réduisent les signaux anti-apoptotiques,

favorisant ainsi la mort cellulaire. Le traitement au cisplatine favorise et induit

l'apoptose, ce qui entraîne une diminution de volume tumoral. Le traitement au

tamoxifène favorise seulement l'apoptose, sensibilisant ainsi les cellules à la

signalisation apoptotique mais ne conduisant pas directement à la mort cellulaire.

Bcl-2 est un autre régulateur de l'apoptose mais il a été démontré être un

marqueur biologique important dans la pathogenèse du cancer du sein masculin,

en corrélation avec un faible nombre de cellules mitotiques et de plus petites

tumeurs de grade histologique inférieur (462). Bcl-2 est un biomarqueur

également critique pour le cancer du sein féminin dans la prédiction de la survie

303

du patient (475). Dans cette étude, le tamoxifène s'est révélé augmenter

l'expression de Bcl-2 tandis que le paclitaxel et le cisplatine ont diminué les

niveaux d'expression par rapport aux tumeurs contrôles. L'expression de la

survivine avec d'autres gènes anti-apoptotiques tels que Bcl-2 réduit l'apoptose

des cellules cancéreuses (476). L'expression de Bcl-2 devrait présenter une

corrélation avec la survivine, qui a été observée avec le traitement par le cisplatine

dans lequel les deux protéines présentent une expression réduite par rapport aux

tumeurs témoins. Il est intéressant d'observer que les tumeurs traitées au

tamoxifène montrent une relation inverse entre Bcl-2 et survivine. Les protéines

Bcl-2 se trouvent dans la membrane mitochondriale externe sous forme de

dimères (477). Il est suggéré que le rôle physiologique de l'expression de la

protéine Bcl-2 et le contrôle de l'homéostasie dans le tissu mammaire normal

impliquent une régulation positive par l'estradiol et négative par la progestérone

(478). De plus, dans les cellules cancéreuses du sein, il a été montré que

l'oestradiol stimulait, alors que la progestérone inhibait, l'expression de la protéine

Bcl-2 (479). Ceci suggère une régulation de Bcl-2 par les récepteurs hormonaux,

en particulier une régulation positive de Bcl-2 par ERα et une régulation négative

par PR. Ici, nous montrons que le traitement au tamoxifène augmente l'expression

d’ERα et diminue ERb, ce qui peut conduire à l'augmentation de l'expression de

Bcl-2.

Les cellules néoplasiques hautement proliférantes et les tumeurs de grade

histologique élevé ont été associées à une expression accrue des marqueurs

cellulaires pour la prolifération. Une expression anormale de la cycline D1 est

commune dans le cancer du sein chez la femme (480, 481). La pertinence

pronostique des protéines de prolifération Ki67 et cycline D1 n'ont pas été

confirmés chez les patients masculins atteints de cancer du sein. Il a été montré

que la cycline D1 était surexprimée dans 77% des cancers du sein chez l'homme

(462). Fait intéressant, dans une cohorte de patients de sexe masculin souffrant

de cancer du sein, la surexpression de la cycline D1 était prédictive d'une

meilleure survie des patients tandis que les niveaux élevés d'expression des

cyclines A et B augmentent le risque de décès de cancer du sein d'un facteur 2-3

(482). Chez les souris mâles PyVT, le traitement au tamoxifène a accru

l'expression de la cycline D1 sans altérer de manière significative la croissance

304

tumorale. Ceci est en contradiction avec les conclusions de Nilsson et al., tout en

affirmant que la cycline D1 ne peut pas être un marqueur moléculaire approprié

pour le cancer du sein masculin.

Les différences dans la physiologie des patients hommes et femmes

atteints de cancer du sein requièrent une approche de traitement différente, en

particulier en ce qui concerne la thérapie hormonale. De plus amples recherches

sont nécessaires pour déterminer le rôle des composés anti-œstrogéniques tels

que le tamoxifène dans le traitement du cancer du sein masculin. Des rapports

épars sont insuffisants pour recommander des directives de traitement. Sur la

base des différences connues dans la biologie du cancer du sein mâle et femelle,

il serait pragmatique de considérer des options de traitement qui ne modifient pas

la signalisation hormonale ou au moins pas en tant que seul agent de traitement

du cancer du sein chez l'homme.

Cette étude offre une occasion unique d'étudier les effets de certains

médicaments anticancéreux dans un modèle de tumeur mammaire masculin. Les

résultats montrent les effets du traitement avec trois médicaments anti-

néoplasiques reconnus qui n'ont pas été évalués de manière efficace dans le

système mâle en raison des faibles taux d'événements cliniques de cancer du sein

masculin. Les résultats de cette étude fournissent des informations précieuses

vers la meilleure compréhension du cancer du sein masculin et peuvent aider à

guider les décisions thérapeutiques.

305

Conclusion

Au travers de ces études, nous avons vu que les quinoléines substituées

entrainaient un ralentissement de la croissance, voire une réduction du volume

tumorale. Leur effet est d'autant plus marqué que le traitement est effectué à un

stade précoce de développement. Des études plus poussées de toxicité seraient

requises, mais ces premières études suggèrent une possible application

préventive chez les patients à haut risque. Par ailleurs, conformément à

l'hypothèse émise à l'origine, les quinoléines substituées agissent en synergie

avec d'autres molécules de chimiothérapie comme le cisplatine ou le tamoxifène

permettant d'obtenir une meilleure efficacité dans le traitement contre le cancer du

sein. Ces études se sont montrées prometteuses dans un modèle de xénogreffes

de lignées cellulaires de cancer du sein humain, ce qui est intéressant puisque les

cellules humaines sont la cible du traitement ; mais aussi dans un modèle de

tumeurs spontanées murin qui est également essentiel puisque la tumeur est avec

son micro-environnement. En effet, dans de nombreux cas, des molécules

prometteuses dans des modèles de xénogreffes s'avèrent inefficace chez les

patients, ce qui peut être attribué, au moins en partie, aux interactions des cellules

cancéreuses avec leur stroma qui, comme nous l'avons vu précédemment, joue

un rôle majeur dans la carcinogenèse.

Nous avons également vu que le traitement était d'autant plus efficace que

la tumeur était traitée à un stade précoce, ce qui souligne l'importance d'un

diagnostic tôt au cours du développement tumoral. Ceci étant, le diagnostic se

base essentiellement sur les examens cliniques et mammographies. Ces deux

méthodes sont certes utiles mais requiert que la tumeur atteigne une taille

suffisante pour être détectée. Au cours des dernières années, des progrès

énormes ont été faits en matière de connaissance des gènes impliqués dans la

carcinogenèse. Ainsi, nous savons qu'un patient porteur d'une mutation dans un

allèle des gènes BRCA présente un risque de développer un cancer du sein au

cours de leur vie s'élevant à 60 à 80%. Le problème que nous rencontrons,

cependant, réside dans la quantité de mutations accumulées par les cellules

306

cancéreuses. Par exemple, une cellule de mélanome possède, en moyenne, plus

de 30 000 mutations dans ses génomes. Par conséquent, même si nous

connaissons de nombreux gènes impliqués dans la carcinogenèse, il est encore à

ce jour difficile d'évaluer les quels sont absolument critiques pour la formation de

tumeurs. Mon projet de recherche actuel se concentre sur la base moléculaire de

l'évolution de l'état multicellulaire en utilisant les algues vertes Volvocine comme

modèle d'étude. L'hypothèse étant que les gènes ayant permis l'acquisition de

l'état multicellulaire sont des gènes clefs dans la carcinogenèse. En comprenant

mieux quels sont ces gènes clefs, il serait alors possible d'élargir les tests qui

existent pour BRCA à d'autres gènes mais aussi de développer des tests

permettant la détection de cellules cancéreuses dans le flux sanguin.

307

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