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ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE LYON

Année 2005 - Thèse n° 91

ETUDE EPIDEMIOLOGIQUE DE L’EHRLICHIOSE GRANULOCYTIQUE BOVINE DANS UNE CLIENTELE DES

MONTS DU LYONNAIS

THESE

Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie)

et soutenue publiquement le 18 Octobre 2005 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire

par

CARLONE Maryline

Née le 13 Septembre 1980 à Le Creusot (71)

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3

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5

MERCI

AUX

Docteur Marie-Anne ARCANGIOLI

Maître de conférence à l’Ecole Vétérinaire de LYON

Merci de votre aide, de votre disponibilité et de votre patiente

Notre collaboration m’a beaucoup appris

Docteur Marie-Pierre CALLAIT-CARDINAL

Maître de conférence à l’Ecole Vétérinaire de LYON

Merci de nous avoir aidé à mettre en place cette étude

Et bien entendu merci d’avoir accepté d’en être le second assesseur

Docteur Dominique PEYRAMOND

Professeur au centre hospitalier et universitaire de la Croix Rousse

Merci d’avoir accepté la présidence de ce jury

6

7

MERCI

A

Mon p’tit mari,

Mes parents, Fred, Christelle, Emelyne et Anthony, j’aurais eu à choisir ma famille, je vous

aurais choisi. Merci pour tout…

Ma Coco, de la vendeuse de tout et n’importe quoi au traxx en passant par le ski et tout le

reste, je t’adore

Mes tatas, tontons, cousines et cousins, mon petit monde où je me sens si bien

Toute la famille Dossena

Marie, Lise, Ade et tous les amis du Creusot

Manue, pour tous tes conseils et ta confiance

Rachel, Gilles et Sophie, nos soirées à Charbonnières me manquent déjà. Ma p’tite cloque, 4

ans de vie commune de soirée canapé, arrosée et parfois déprimée.

Anne-Laure pour nos chevauchés en Lancia Y, parfois glissantes, sur la Nationale 6.

Kenny, Julie, leur maison du bonheur, Mathias et tous les autres pour ces 4 années d’amitié.

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SOMMAIRE

Table des illustrations....................................................................................................12

Liste des abréviations.....................................................................................................15

INTRODUCTION..............................................................................................................16

I ANAPLASMA PHAGOCYTOPHILUM (EHRLICHIA PHAGOCYTOPHILA )..............19

I.A ETUDE BACTERIOLOGIQUE............................................................................................19

I.A.1) Taxonomie ...........................................................................................................19

I.A.2) Morphologie et cycle de développement ...............................................................22

I.A.3) Pouvoir immunologique, antigénique...................................................................25

I.A.4) Pouvoir pathogène...............................................................................................29

I.B EPIDEMIOLOGIE............................................................................................................30

I.B.1) Epidémiologie descriptive ....................................................................................30

I.B.1) a) Population affectée .......................................................................................30

I.B.1) b) Répartition....................................................................................................31

I.B.2) Epidémiologie analytique.....................................................................................33

I.B.2) a) Vecteur : Ixodes ricinus ................................................................................34

I.B.2) b) Réservoir ......................................................................................................36

I.B.2) c) Mode de transmission ...................................................................................39

I.B.3) Facteur de réceptivité ..........................................................................................39

I.C PATHOGENIE................................................................................................................41

I.C.1) Contamination .....................................................................................................41

I.C.2) Dissémination ......................................................................................................42

I.C.3) Persistance ..........................................................................................................42

I.C.4) Expression clinique..............................................................................................43

I D ETUDE CLINIQUE..........................................................................................................44

I.D.1) Symptômes...........................................................................................................44

I.D.2) Modifications paracliniques ................................................................................45

I.D.3) Lésions ................................................................................................................46

I.D.4) Evolution.............................................................................................................47

I.D.5) Complication .......................................................................................................47

10

I.E DIAGNOSTIC .................................................................................................................48

I.E.1) Clinique ...............................................................................................................48

I.E.1) a) Epidémiologie ...............................................................................................48

I.E.1) b) Clinique et lésionnel ......................................................................................49

I.E.1) c) Différentiel....................................................................................................49

I.E.2) Expérimental........................................................................................................53

I.E.2) a) Frottis et numération formule ........................................................................53

I.E.2) b) sérologie .......................................................................................................54

I.E.2) c) PCR..............................................................................................................55

I.F TRAITEMENT ................................................................................................................57

I.G PROPHYLAXIE ..............................................................................................................59

I.G.1) Sanitaire et hygiénique ........................................................................................59

I.G.2) Médicale..............................................................................................................62

I.H CONCLUSION...............................................................................................................62

II ETUDE EPIDEMIOLOGIQUE ET CLINIQUE............... ...........................................65

II.A MATERIEL ET METHODE..............................................................................................66

II.A.1) Epidémiologie.....................................................................................................66

II.A.1) a) Population d’éleveurs ..................................................................................66

II.A.1) b) Enquête.......................................................................................................66

II.A.2) Définition des cas ...............................................................................................67

II.A.2) a) Cas suspect .................................................................................................67

II.A.2) b) Cas clinique.................................................................................................67

II.A.2) c) Cas témoins.................................................................................................68

II.A.3) Les prélèvements sanguins et analyses sérologiques ...........................................68

II.A.3) a) Les prélèvements et leur traitement..............................................................68

II.A.3) b) Les analyses cyto-hématologiques ...............................................................69

II.A.3) c) PCR ............................................................................................................69

II B RESULTATS.................................................................................................................71

II.B.1) Etude épidémiologique .......................................................................................71

II.B.1) a) Population d’éleveur....................................................................................71

II.B.1) b) Enquête.......................................................................................................72

II.B.2) Les résultats des prélèvements sanguins..............................................................78

11

II.B.2) a) Numération formule et frottis.......................................................................78

II.B.2) b) PCR ............................................................................................................79

II.C DISCUSSION................................................................................................................80

ANNEXE N°1......................................................................................................................91

ANNEXE N°2......................................................................................................................92

ANNEXE N°3......................................................................................................................93

ANNEXE N°4......................................................................................................................96

ANNEXE N°5......................................................................................................................97

ANNEXE N°6....................................................................................................................100

ANNEXE N°7....................................................................................................................101

ANNEXE N°8....................................................................................................................102

BIBLIOGRAPHIE ...........................................................................................................105

12

Table des illustrations

Annexes :

Annexe n°1 : Cycle biologique d’Ixodes ricinus. p 91

Annexe n°2 : Durée des différentes phases du cycle d’Ixodes ricinus. p 92

Annexe n°3 : Mode d’invasion et de développement intracellulaire d’A. phagocytophilum

[105]. p 93

Annexe n°4 : Questionnaire de sélection des éleveurs p 96

Annexe n°5 : Questionnaire de l’enquête épidémio-clinique. p 97

Annexe n°6 : Symptômes de l’ehrlichiose. p 100

Annexe n°7 : Document d’accompagnement des prélèvements. p 101

Annexe n°8 : Résultats cyto-hématologiques des cas cliniques et suspects d’ehrlichiose. p 102

Figures :

Figures 1 : Schématisation du cycle de développement d’A. phagocytophilum [105]. p 24

Figure n°2 : Schématisation du gène de la protéine majeure de surface msp2(p44) [16]. p 27

Figure n°3 : Répartition nationale de l’Ehrlichiose bovine à A. phagocytophilum (juin 2002)

[49]. p 32

Figure n°4 : Anaplasma phagocytophilum dans un PNN chez une vache atteinte uniquement

d’hyperthermie, ENVL, Pathologie du bétail (x1000). p 53

Figure n°5 : Répartition des élevages contactés. p 71

Figure n°6 : Répartition moyenne des animaux dans les élevages. p 73

Figure n°7 : Répartition des cas d’ehrlichiose au cours d’une année. p 74

Figure n°8 : Répartition géographique des cas cliniques d’ehrlichiose. p 75

Figure n°9 : Type de végétation des bois. p 76

Figure n°10 : Premiers signes cliniques constatés par l’éleveur. p 77

Figure n°11 : Migration des PCR nichées. p 80

13

Tableaux :

Tableau n°I : Caractères différentiels épidémio-cliniques du diagnostic de la toux d’été [86]. p 51

Tableau n°II : Caractères épidémiologiques et diagnostiques d’autres arbo-rickettsioses [11, 66].p 52

Tableau n° III : Le diagnostic de l’ehrlichiose bovine et ses limites (Etude régionnale URGTV

Bretagne 1999/2003) [48]. p 56

Tableau n° IV : Activité de divers antibiotiques sur A. phagocytophilum [63]. p 58

Tableau n°V : Traitement préventif antiparasitaire [60, 28]. p 61

Tableau n°VI : Modalités de réalisation des PCR nichées et simples utilisées pour le diagnostic de

l’ehrlichiose bovine. p 70

Tableau n°VII : Répartition du nombre de cas cliniques et de cas éleveurs par élevage et par année.

p 72

Tableau n°VIII : Résultats cyto-hématologiques des cas d’avortements tardifs. p 79

14

15

Liste des abréviations

AMM : Autorisation de mise sur le marché

CMH : Complexe majeur d’histocompatibilité

CVR : Région centrale hypervariable

EGH : Ehrlichiose granulocytique humaine

GMQ: Gain moyen quotidien

IgG : Immunoglobuline G

IgM : Immunoglobuline M

IFA: Imminofluorescence assay

IFI: Immunofluorescence indirecte

IFN : interféron

K : 103

LB : Lymphocyte B

LDA : Laboratoire départementale d’analyse

LT : Lymphocyte T

M : 106

PCR : Réaction de polymérisation en chaîne

PNE : Polynucléaire éosinophile

PNN : Polynucléaire neutrophile

Msp2(p44) : Protéine majeure de surface (p44)

SNGTV : Société Nationale des Groupements Techniques Vétérinaires

Virus RS : Virus respiratoire syncitial

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INTRODUCTION

Les pathologies transmises par les tiques sont nombreuses. La plus fréquente d’entre

elles, est la piroplasmose. Un parasite, Babesia est transmis lors des morsures de tiques

contaminées. Cependant une autre pathologie causant une clinique généralement frustre est

moins connue des praticiens. Elle entraîne pourtant des pertes économiques pouvant être

importantes surtout en élevage laitier. Décrite et mise en évidence pour la première fois en

1951 [36] en Bretagne, Anaplasma phagocytophilum est une bactérie intracytoplasmique

entraînant ce qui est également appelé « la fièvre des pâtures » chez les bovins. Cette maladie

est aussi connue sous le nom de « Tik-borne fever » soit « fièvre à tiques » ou « maladie des

gros paturons ». Elle a été observée dans de nombreux pays notamment d’Europe. En France,

elle a été principalement localisée dans l’ouest du pays depuis 1992 [3]. Cependant des cas

cliniques ont été observés sur tout le territoire , elle a ainsi été diagnostiqué pour la première

fois en Rhône-Alpes au cours de l’année 2001 [96].

Afin d’éclaircir nos propos nous allons faire le point des connaissances sur A.

phagocytophilum de manière générale. Nous verrons tout d'abord sa classification qui a été

modifiée récemment et est encore incertaine, son épidémiologie, sa pathogénie, sa clinique, son

diagnostic, son traitement et enfin sa prophylaxie.

L’ehrlichiose granulocytique bovine semble émerger dans des régions encore indemnes

il y a quelques années. De plus certains médecins la considèrent comme une zoonose. Cette

affection est épidémiologiquement à haut risque. C’est la raison pour laquelle nous avons

étudié la situation épidémiologique et clinique des cas d’ehrlichiose rencontrés dans les Monts

du Lyonnais. Nous nous sommes intéressés à identifier les animaux atteints, les périodes de

survenues des cas, les symptômes exprimés mais aussi à localiser ces cas. Nous nous sommes

aussi interrogés sur les conduites de troupeau et sur les méthodes de diagnostic de ces cas.

Dans la seconde partie de l’étude, nous ferons d’ailleurs le point sur deux analyses

diagnostiques, la cyto-hématologie et la PCR (réaction de plymérisation en chaine).

17

PREMIERE PARTIE :

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

18

19

I Anaplasma phagocytophilum (Ehrlichia phagocytophila )

I.A Etude bactériologique

Anaplasma phagocytophilum est une bactérie de la famille des Rickettsiaceae. Cette

famille a été profondément remaniée récemment, ce qui justifie de préciser ces modifications.

Par ailleurs nous décrirons le cycle biologique de cette bactérie et de son vecteur qui

conditionne l’épidémiologie de l’injustement dénommée ehrlichiose bovine.

I.A.1) Taxonomie

La première édition du Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology était jusqu’en

1993 la référence de la classification de l’ordre des Rickettsiales [52]. Il y avait trois familles,

celle des Rickettsiaceae subdivisée en trois tribus ; celle des Rickettsiaeae, celle des

Ehrlichieae et celle des Wolbachieae. Les deux autres familles sont celles des

Anaplasmataceae et celle des Bartonellaceae.

Tribus : Genres : Rickettsia

Rickettsiaeae Rochalimaea

Coxiella Ehrlichia (canis, phagocytophila...)

Famille des Rickettsiaceae Ehrlichieae Cowdria Neorickettsia Wolbachia

Wolbachieae

Rickettsiella

20

Anaplasma (marginal…) Aegyptianella

Famille des Anaplasmataceae Haemobartonella

Eperythrozoon Bartonella

Famille des Bartonellaceae Grahamella

Cette classification est modifiée en 1993 par les travaux de Brenner et al [14]. La

famille des Bartonella est alors exclue de cet ordre.

Par ailleurs, lors de l’étude de l’ARNr 16S, Ehrlichia phagocytophila, Ehrlichia equi

et l'agent de l'ehrlichiose granulocytique humaine (EGH) apparaissent phylogénétiquement plus

proches de Anaplasma marginale que de Ehrlichia canis, avec 99,1% de similitude (espèce

type du genre Anaplasma) contre 92,5% de similitude (espèce type du genre Ehrlichia) [20 ,

30].

Une nouvelle classification devient donc nécessaire.

Ce n’est cependant qu’en novembre 2001, que Dumler et al [30] ont modifié la

description de l'ordre des Rickettsiales. Ils se sont basés sur les travaux sur l’ARNr 16S [20] et

sur l'analyse des gènes des opérons groESL et des gènes codant pour des protéines de surface.

Anaplasma phagocytophila est donc une nouvelle combinaison validement publiée et

dont l'épithète spécifique a été corrigé en 2002 en phagocytophilum. Ce taxon rassemble non

seulement Ehrlichia phagocytophila agent de l’ehrlichiose granulocytique des bovins mais

encore Ehrlichia equi agent de l’ehrlichiose granulocytique des équidés et l'agent de

l'ehrlichiose granulocytique humaine (agent EGH). [30]

21

Leurs ARNr 16S présentent plus de 99,7% d'homologie et leur forte parenté

phylogénétique est confirmée par l'analyse des séquences des gènes groEL, gltA et ankA. Ces

bactéries partagent également de nombreuses communautés antigéniques, elles infectent les

cellules de la lignée myéloblastique et elles sont transmises par des tiques du genre Ixodes [20].

Ces trois agents présentent tout de même des différences et sont définis comme des

variants [30]. Ehrlichia phagocytophila devient Anaplasma phagocytophilum biovar

phagocytophilum, Ehrlichia equi devient Anaplasma phagocytophilum biovar Equi et l'agent

de l'EGH devient Anaplasma phagocytophilum biovar EGH.

En 2001, pourtant, l'analyse des séquences des gènes gltA (codant pour le citrate

synthétase), effectuée par Inokuma et al. [45] , montre que Ehrlichia phagocytophila,

Ehrlichia equi et l'agent de l'EGH pourraient constituer un groupe proche mais différent du

genre Anaplasma. Cette différence génétique s’accompagne d’une différence biologique :

Anaplasma infecte les globules rouges alors qu' Ehrlichia phagocytophila, Ehrlichia equi et

l'agent de l'EGH infectent principalement les granulocytes. Inokuma et al estiment que ces

différences génétiques et biologiques pourraient justifier la création d'un nouveau genre destiné

à accueillir Ehrlichia phagocytophila, Ehrlichia equi et l'agent de l'EGH. Mais aucune

proposition formelle concernant la nomenclature n'a été faite [43].

La classification la plus récente inscrite dans le Bergey’s manual of Systemic

Bacteriology , validée depuis 2004 est la suivante [38] :

Rickettsia

Famille des Rickettsiaceae

Orienta

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Anaplasma (marginale,

phagocytophilum biovar

phagocytophilum, equi, l’agent de

l’EGH)

Aegyptianella

Famille des Anaplasmataceae Ehrlichia (canis…)

Wolbachia

Xenohaliotis

Holospora

Famille des Holosporaceae

Caedibacter

Anaplasma phagocytophilum est dorénavant classé parmi les Anaplasmataceae, restent à

voir sa morphologie et son cycle de développement.

I.A.2) Morphologie et cycle de développement

Anaplasma phagocytophilum présente les caractéristiques du genre Anaplasma. Ce

sont des bactéries à gram négatif, de petite taille, souvent polymorphes (forme coccoïde ou

ellipsoïdale). Elles sont obligatoirement intracellulaires. Leur cycle de développement nécessite

un hôte vertébré (bovin, ovin, équin, homme…) et un vecteur (tique).

23

A. phagocytophilum est détecté dans les vacuoles intracytoplasmiques des cellules de la

lignée myéloblastique des mammifères, notamment les granulocytes neutrophiles et, dans une

moindre mesure, les granulocytes éosinophiles, les monocytes et les lymphocytes [85]. A.

phagocytophilum existe sous deux formes de particules simples et deux formes agglomérées.

Ces distinctions se font en fonction de la taille et du nombre de particules [36]. La morula est

le stade final, mesurant 1,5 à 2,5 µm mais pouvant atteindre 6 µm de diamètre.

Des études de microscopie électronique mises en place par Woldehiwet et al en 1982

[106], présentent les différents stades morphologiques d’A. phagocytophilum. Les

observations sont faites sur des frottis réalisés à partir de sang frais et de sang mis en culture à

37°C pendant 24 heures et cela tous les jours pendant 8 jours de bactériémie. Dans la

circulation sanguine, les polynucléaires neutrophiles matures ne restent que quelques heures,

aussi les PNN infectés quittent la circulation sanguine rapidement et de nouveaux PNN non-

infectés arrivent. Il est alors difficile d’observer l’évolution morphologique d’A.

phagocytophilum. La culture in vitro permet de le faire.

Anaplasma phagocytophilum se cultive in vitro dans des cellules IDE8=ATCC CRL

11973 (cellules embryonnaires de Ixodes scapularis) ainsi que dans les cellules de la lignée

HL-60 (lignée de promyélocytes leucémiques d'origine humaine) non différenciées ou

différenciées en granulocytes neutrophiles [43].

Ainsi, en culture, le nombre de cellules à particules simples diminue alors que le nombre

de cellules à particules agglomérées augmente au cours du temps (p<0,001) [106]. Ceci

suggère qu’ A. phagocytophilum évolue d’une particule simple à un agglomérat de particules

(figure n°1).

Woldehiwet et Scott observent aussi des images de division binaire des bactéries. Les

particules simples sont les premiers stades des bactéries, et les agglomérats résultent de ces

divisions binaires dans les vacuoles intracytoplasmiques.

24

Figure n°1 :Schématisation du cycle de développement d’A. phagocytophilum [106].

Ces formes sont retrouvées strictement dans les leucocytes. On les trouve quasi

exclusivement dans les granulocytes, parfois dans les éosinophiles, ou les monocytes et les

lymphocytes [103]. Cette bactérie a un habitat assez étonnant car les PNN sont la première

ligne de défense de l'organisme par leur pouvoir cytotoxique et par leur courte demi-vie. Ils ont

une demi-vie de 6 à 12h dans la circulation sanguine. Dans les tissus, ils ne persistent que 1 ou

2 jours avant de disparaître [73]. La phase exponentielle de la multiplication d'A.

phagocytophilum ne débute que 48 à 72 heures après la pénétration des germes dans la cellule

hôte, les leucocytes semblent donc être des hôtes peu appropriés. Le nombre maximal de

bactéries n'est obtenu qu'après 5 à 7 jours de culture soit après les délais de disparition des

granulocytes dans les tissus [107]. A. phagocytophilum ne devrait donc pas pouvoir se

multiplier dans les granulocytes.

SCAIFE H. et al [86] montre pour la première fois en 2003 qu' A. phagocytophilum

induit un retard de l'apoptose des neutrophiles ovins in vivo. A. phagocytophilum a donc le

temps de se multiplier dans ces cellules.

Corps élémentaire

Corps initial

Corps réticulé

morula

Fusion binaire

25

A. phagocytophilum est une bactérie intracellulaire existant sous forme de particules

simples et agglomérées, infectant les cellules granulocytaires de l’hôte. Elle infecte les cellules

de défense de l’organisme. L’immunité non-spécifique avec l’apoptose apparaît donc inefficace

contre cette infection. Nous allons maintenant nous intéresser plus précisément aux moyens de

défense de l’hôte. Nous verrons si l’immunité non-spécifique est totalement inefficace et si

l’immunité spécifique intervient en étudiant le pouvoir immunologique et antigénique d’ A.

phagocytophilum.

I.A.3) Pouvoir immunologique, antigénique

Woldehiwet et Scott [105] étudient en 1982 l’immunité induite chez les moutons infectés

par Anaplasma phagocytophilum. Ils utilisent des moutons adultes d’élevages, de sexes et

d’âges variés, provenant de zones indemnes de tiques et donc d’ehrlichiose.

Dans un premier temps ils infectent deux lots de moutons et en traitent un avec des

corticoïdes. Ensuite, ils dosent les antigènes (A. phagocytophilum) dans les deux lots. La

concentration en antigènes chez les moutons traités aux corticoïdes est plus importante

(p<0,01). Les anti-inflammatoires stéroïdiens ont diminué l’immunité non spécifique des

animaux. Cette dernière intervient donc probablement pour réduire le nombre de bactéries lors

de contamination par A. phagocytophilum.

Dans un deuxième temps, ils inoculent 35 moutons et notent l’évolution des signes

cliniques, de la température, des signes hématologiques, le titre en anticorps (utilisation du

complément de fixation) et en antigènes.

Les IgG et les IgM apparaissent quelques semaines après l’inoculation : 2,7 semaines pour les

IgM et 4,6 pour les IgG. Le taux IgG devient supérieur à celui des IgM en six semaines. Puis

ces taux diminuent après sept semaines. L’apparition d’immunoglobulines chez les hôtes

indique la mise en place d’une immunité spécifique. Les auteurs trouvent encore des IgM 12

mois après l’inoculation des moutons. Cette concentration durable en immunoglobulines

suggère la présence d’une immunité mémoire.

Après avoir été séparés en trois lots, selon leur taux d’anticorps suite à la première

infection, les moutons sont contaminés une seconde fois. L’intervalle de temps entre la

première et la seconde infection n’est pas fourni. Les auteurs remarquent alors que les moutons

26

aux taux d’anticorps les plus importants réagissent peu voire pas à la seconde infection.

Lorsqu’ils réagissent, la période prépatente est plus longue, le pic et la durée de l’hyperthermie

diminuent, le pic et la durée de la bactériémie sont moins importants et la neutropénie est plus

faible. Ils remarquent aussi que les anticorps apparaissent plus rapidement. La réponse

immunitaire est plus rapide et semble plus efficace lors de cette seconde infection. La seconde

infection induit une réponse anamnestique qui protège les animaux. Cependant nous ne

possédons aucune information quant à sa durée. Par ailleurs, Levin et al [53] le démontrent

chez des souris BALB/c. La réponse immunitaire développée par ces souris lors de morsures

de tiques infectées par A. phagocytophilum est partiellement protectrice lors de réinfections

(16 semaines après la première) par le même variant ou un variant différent. Cette immunité

n’empêche pas les bactéries d’entrer dans les granulocytes et de s’y développer ( PCR positive

et Xénodiagnostic). Toutefois la clinique est plus courte et moins grave.

Lors d’une étude sur les variations de la séroconversion vis à vis d’A. phagocytophilum

chez les bovins au cours d’une année, Pusterla et al [80] mettent en évidence une immunité de

prémunition chez les bovins. Ils placent 34 vaches, 22 primipares sur un pré endémique

(présence de tiques I. ricinus contaminées par A. phagocytophilum) de mi-mai à septembre.

Des prélèvements sanguins sont réalisés tous les mois afin de réaliser des sérologies, des frottis

et des PCR. Ils remarquent que la première exposition à A. phagocytophilum augmente les

risques d’ehrlichiose clinique et qu’une immunité est acquise d’une année sur l’autre lorsque

les bovins pâturent sur des prés endémiques. En effet des signes cliniques ne sont observés que

sur les vaches et les primipares dont c’est la première saison de pâture sur pré endémique.

Celles qui ont déjà été sur des prés endémiques n’expriment aucun signe clinique. Cependant

cette immunité n’empêche pas la contamination des bovins, leur PCR sont positives, mais

aucun signe clinique n’est observé.

Des études ont été réalisées sur les antigènes d’A. phagocytophylum, notamment celle

de Dumler et al [31] en 1995. Ils montrent qu’A. phagocytophilum biovar Equi,

Phagocytophilum et EGH ont des antigènes communs en analysant les sérums de vaches, de

chevaux et d’humains atteints d’ehrlichiose. Ils mettent en évidence ces antigènes par

immunoblot.

27

Par ailleurs, Murphy et al [69] et Zhi et al [108] étudient les protéines majeures de

surface. L’une d’elle est très proche de la protéine majeure de surface msp2 d’A. marginale. Ils

la nomment msp2(p44). Toutes les bactéries A. phagocytophilum possèdent cet antigène.

Barbet et al [6] analysent plus particulièrement le gène codant pour la protéine msp2(p44) in

vitro. Celui-ci contient une zone hypervariable (CVR), qui implique qu’un seul site

d’expression génomique est capable d’exprimer une multitude d’ARNm msp2(p44) et donc

d’antigènes. A priori ces variations d’expression sont influencées à la fois par le milieu de

culture des cellules hôtes (pH, température, substrat) et par la durée de l’infection mais toutes

les populations d’ A. phagocytophilum examinées sont polymorphiques.

En utilisant successivement différentes PCR Barbet et al schématisent le gène

msp2(p44) (Figure n°2).

Figure n°2 : Schématisation du gène de la protéine majeure de surface msp2(p44) [6] .

28

L’antigène msp2(p44) intervient à différents niveaux de l’immunité de l’hôte. Tout

d’abord, msp2(p44) est impliqué dans l’adhésion de la bactérie à la surface de la cellule hôte

[71]. Or cette étape est une étape clef de l’infection de l’hôte, appelée en immunologie « la

présentation de l’antigène ». C’est la première étape de l’immunité.

D’autre part cet antigène msp2(p44) intervient dans l’immunité humorale. En effet,

Inokuma et al [46] montrent par western blot qu’après plusieurs inoculations d’A.

phagocytophilum à des souris, celles-ci fabriquent des anticorps anti-msp2(p44). Ils ne se

fixent qu’à A. phagocytophilum lors d’immunofluorescence assay (IFA), ils sont spécifiques.

Cependant comme les antigènes msp2(p44) sont polymorphes, les réponses humorale et

cellulaire induites peuvent ne pas être totalement efficaces [13].

De plus, il n’est pas évident que les anticorps aient accès directement aux bactéries

intracellulaires. On suppose que le contact avec les antigènes peut être réalisé dans le milieu

extracellulaire, peut être lors du passage intercellulaire d’A. phagocytophilum, comme Li et

Winslow [55] l’ont montré pour E. chaffeensi.

Anaplasma phagocytophilum entraîne la mise en place chez l’hôte d’une immunité non

spécifique et spécifique. Cette immunité peut être humorale avec la synthèse d’anticorps

comme nous l’avons vu ou cellulaire.

Brown et al [17] et Whist et al [101] montrent ainsi que les lymphocytes B et T de

l’immunité cellulaire interviennent aussi.

Ils mettent en évidence des lymphocytes CD4+ et des interférons IFNγ chez des vaches

immunisées par des antigènes msp2(p44).

Or les interférons IFNγ sont produits par une catégorie de lymphocytes T (LT) quand ceux-ci

reconnaissent un antigène. Les interférons IFNγ activent alors les lymphocytes, les monocytes

et les macrophages. Ils orientent l’immunité vers une immunité cellulaire.

Les LTCD4+ sont une catégorie d’effecteurs de l’immunité cellulaire. Ils reconnaissent

l’épitope T sur le CMH II des cellules immunocompétentes apprêtées comme les neutrophiles

infectés présentant l’antigène d’ A. phagocytophilum.

Cependant Brown et al montrent que ce sont les zones hypervariables des antigènes msp2(p44)

qui contiennent l’épitope reconnu par LTCD4+. Cet épitope est variable et entraîne des échecs

de l’immunité cellulaire.

29

D’autres protéines immunoréactives d’A. phagocytophilum ont été identifiées par

western blot en 1998 par Storey et al [88] lors d’études sur les trois biovar, Equi,

Phagocytophilum et HGE. Ils ont identifié trois protéines de haut poids moléculaire communes

aux trois biovars. Les gènes correspondants ont été identifiés. Ces trois protéines ont

essentiellement servi pour la classification des Anaplasma. Cependant, contrairement au

msp2(p44) elles ne possèdent pas de régions centrales hypervariables. Elles sont stables. Il

serait intéressant d’étudier leur rôle dans la mise en place de l’immunité chez l’hôte et voir si

elles peuvent conduire à la création d’un vaccin.

I.A.4) Pouvoir pathogène

Stuen et al [93] montrent en 2002 que la pathogénicité est modifiée en fonction du

variant mis en cause. En effet, ils mettent en évidence 4 variants d’ A. phagocytophilum chez

40 moutons infectés âgés de 1 mois à 2 ans. Par des techniques, PCR, reverse line blot

hybridization et le séquençage de gène ARNr 16S d’ A. phagocytophilum, Stuen et al [93]

mettent en évidence la souche de référence d’ A. phagocytophilum et trois autres variants

différant de quelques nucléotides. Les variants les plus rencontrés chez les moutons étudiés

sont les variants 1 et 2. La majorité des troupeaux est infectée par le variant 2. Plusieurs

variants peuvent être rencontrés chez un même mouton.

Tous les variants entraînent une neutropénie cependant le nombre de neutrophiles et celui de

neutrophiles infectés sont moins important lors d’infections par le variant 1.

L’immunosuppression dépend donc du variant incriminé.

Dans une autre étude Stuen et al [89] confirment ces travaux et les complètent en

montrant qu’il y a des différences cliniques et hématologiques lors d’infections par des variants

différents. Ils s’intéressent aux variants 1 et 2. Le variant 1 entraîne une période d’incubation

plus courte, une température maximale supérieure, une période fébrile plus longue, une

neutropénie et une perte de poids plus importantes. La pathogénicité du variant 1 est donc plus

importante.

30

Le pouvoir pathogène d’ A. phagocytophilum dépend du variant incriminé mais aussi

de la coexistence d’un autre germe lors de la morsure de l’hôte par la tique. Les tiques

porteuses de plusieurs agents pathogènes sont suspectées de pouvoir transmettre des co-

infections lors d’une seule et unique morsure. Levin et Fish [54] l’ont prouvé aux Etat-Unis

pour Ixodes scapularis avec la transmission simultanée de Borrelia burgdorferi et Anaplasma

phagocytophilum à des hôtes réceptifs.

Il est très vraisemblable qu’Ixodes ricinus soit doté des mêmes aptitudes d’autant plus que

Cinco et al [21] ont montré en 1997 la coexistence d’Anaplasma phagocytophilum et Borrelia

burgdorferi sensu lato dans une Ixodes ricinus.

L’hôte réagit à l’infection par A. phagocytophilum . Elle entraîne la mise en place d’une

immunité non-spécifique et spécifique. L’immunité humorale et cellulaire interviennent grâce à

différents antigènes dont la protéine majeure de surface msp2(p44). Celle ci étant

hypervariable, l’immunité n’est pas totale. Cependant une immunité de prémunition semble se

mettre en place. La pathogénie est moins importante lors de réinfections. Elle est aussi

modifiée en fonction du variant incriminé. Après cette mise au point bactériologique, nous

allons étudier l’épidémiologie d’A. phagocytophilum.

I.B Epidémiologie

Nous allons maintenant voir les éléments connus de l’épidémiologie de l’ehrlichiose

bovine avec notamment la transmission par le vecteur Ixodes ricinus.

I.B.1) Epidémiologie descriptive

I.B.1) a) Population affectée

L’ehrlichiose touche essentiellement les adultes sans distinction de sexe. On la

rencontre chez les bovins [3, 96], les chevaux [26], les petits ruminants [15], les chiens [32],

les chats, la faune sauvage [90] et l’homme [30].

31

Les premiers cas d’ehrlichiose humaine ont été diagnostiqués aux USA en 1994 [20], et

en Europe en 1997 [74]. En Slovénie, une femme âgée de 70 ans a été hospitalisée à cause de

migraines, nausées, vomissement, malaise, arthralgie et hyperthermie (40°C). Elle avait été

mordue par une tique 12 jours auparavant. La numération formule a révélé une leucopénie et

une thrombopénie. Petrovec et al [74] ont identifié le germe incriminé par PCR et sérologie. Ils

ont utilisé une IFA pour détecter les anticorps anti Ehrlichia, dirigés contre Anaplasma

phagocytophilum biovar equi notamment. Le germe mis en cause chez cette patiente était très

proche de l’agent de l’ehrlichiose granulocytique équine. Il a alors été nommé Ehrlichia

granulocytique humain, EGH. Lors de la reclassification par Dumler et al [30], en 2001, il a

été renommé Anaplasma phagocytophilum comme E. equi et E. phagocytophila. Une autre

étude sur l’ehrlichiose humaine a mis en évidence E. equi et E. phagocytophila chez des

individus malades [4].

Ces trois espèces sont très proches, leur ARNr16S présente comme nous l’avons dit,

99,7% de similitudes [30]. Les mêmes vecteurs transmettent l’ehrlichiose aux bovins, aux

chevaux, aux ovins, à l’homme [72]. L’ehrlichiose apparaît donc comme une zoonose [72, 16]

ce qui nécessite qu’elle soit connue et surtout reconnue.

I.B.1) b) Répartition

• Géographique

L’ehrlichiose bovine a été décrite en Europe puis en Amérique du Nord. Elle a été pour la

première fois mise en évidence en Ecosse par McLeod [65]. Les cas d’ehrlichiose sont liés à la

présence de tiques, ils sont toujours mis en évidence dans les régions bocagères, landes, forêts

de zone tempérées et humides [27].

En France, elle est diagnostiquée depuis 1992 [3]. Une cartographie de distribution des cas

a été établie à partir des résultats du laboratoire d’Analyses et de Développement des Côtes

d’Armor LDA22 [49] (Figure n°3).

On dénombre 27 départements dans lesquels au moins un cas d’ehrlichiose bovine a été

diagnostiqué au LDA22.

Le document montre à l’évidence une répartition nationale de l’ehrlichiose bovine.

32

Figure n°3 : Répartiton nationale de l’Ehrlichiose bovine à Anaplasma phagocytophilum (juin

2002) [49].

Actuellement (septembre 2004 à juillet 2005), une étude nationale sur les cas cliniques aigus

d’ehrlichiose granulocytaire bovine, zoonose à Anaplasma phagocytophilum est en

développement, en collaboration avec la SNGTV. Des résultats plus précis seront alors publiés

sur la situation en France.

33

• Temporelle

L’ehrlichiose bovine est connue depuis de nombreuses années dans le monde, le premier cas

identifié en Ecosse par Hudson remonte à 1950 [42].

Le premier cas d’ehrlichiose bovine en France a été diagnostiqué en Bretagne au printemps

1991 par E. Collin [3].

Puis au printemps 1998, G. Joncour et al [47], identifient un deuxième foyer en Bretagne.

Enfin, une dizaine de foyers « actifs » sont identifiés entre les deux premiers aux printemps et

automne 1999 [49].

En automne 2001, le premier cas d’ehrlichiose bovine est diagnostiqué dans le Rhône

par E. Voldoire [96]. Depuis, d’autres cas ont été répertoriés dans le Rhône, comme cela sera

évoqué dans la deuxième partie.

L’ehrlichiose évolue essentiellement sur le printemps puis l’automne [47]. Pusterla et al

[80] sont d’ailleurs les premiers à montrer que la séroprévalence vis à vis A. phagocytophilum

des bovins varie au cours de l’année. En effet, dans leur étude, elle a évolué de 16% avant la

mise au pâture, mi-mai à 43% après deux semaines de pâture jusqu’à son maximum de 63% au

mois de septembre. Lors de l’hiver, en stabulation, elle a ensuite diminué pour atteindre 23%

au mois de mars. La séroconversion se faisant en 6 à 11 jours, l’infection est maximale en

automne et au printemps.

L’ehrlichiose bovine est une arborickettsiose qui se rencontre dans toute la France dans

les régions boisées et humides. Sa répartition temporelle est saisonnière avec un pic en

automne et au printemps. Comme nous allons le voir maintenant sa répartition géographique

mais aussi temporelle est expliquée par le mode de vie du vecteur qui la transmet.

I.B.2) Epidémiologie analytique

Le cycle de développement d’A. phagocytophilum nécessite une transmission par un (ou

des) vecteur et des réservoirs.

34

I.B.2) a) Vecteur : Ixodes ricinus

Le cycle de développement de l’ehrlichiose fait intervenir un vecteur. C’est à dire un être

vivant qui acquiert un agent pathogène sur un hôte et le transmet ensuite à un autre hôte [94].

� Présentation des vecteurs

Celui-ci est variable d’un pays à l’autre voire d’une région à l’autre. A. phagocytophilum est

transmis aux bovins par la tique Ixodes ricinus dans les régions bocagères française [27] alors

qu’il est transmise par Ixodes scapularis et Ixodes pacificus aux Etat-Unis [34] Cependant, des

cas d’ehrlichiose ont été découverts dans des zones où aucune tique n’a pu être mise en

évidence. Woldehiwet et Ristic [104] supposent que d’autres vecteurs hématophages

pourraient transmettre A. phagocytophilum. Certains suggèrent que les diptères piqueurs sont

ainsi des vecteurs mécaniques potentiels [22].

Les tiques sont des acariens, arthropodes ectoparasites hématophages.

Nous nous concentrerons sur I. ricinus (Figure n°4) qui est le vecteur le plus fréquemment

mis en évidence en France.

Ixode ricinus est une tique de haies, bosquets, landes (genêts, bruyères), de lisières de bois

et de forêts de feuillus (charme, hêtre, chêne) de zones tempérées humides d’Europe [11]. Son

activité est conditionnée par les heures chaudes de la journée, par des températures comprises

entre 7 et 25°C. Elle est quasiment inactive pour les températures inférieures, et elle entre dans

une sorte de diapose lorsque la chaleur est intense et l’hygrométrie basse. L’humidité, par

ailleurs, doit être d’au moins 90% pour assurer la survie d’I. ricinus. Ainsi la période d’activité

s’étend de mai à octobre, avec une « accalmie » en juillet-août, variable selon les régions et les

années [41].

La transmission d’Anaplasma phagocytophilum par les tiques est directement liée à

l’incidence saisonnière biphasique de la maladie.

35

� Cycle évolutif des Ixodes

I . ricinus est une tique pholéo-exophile. Les larves sont pholéophiles, c’est à dire qu’elles

vivent dans des habitats très spécialisés (micro-climat adapté) et se déplacent peu. Quant aux

nymphes et aux adultes, ils sont plutôt exophiles. Ils n’ont pas d’habitat spécialisé et sont à

l’affût sur la végétation.

Le cycle de I. ricinus est triphasique : la recherche de l’hôte intervient par trois fois au

cours de la vie du parasite. Ces tiques sont télotropes, les hôtes choisis par les différents stades

d’Ixodes ricinus peuvent appartenir à des espèces différentes [11] (Annexe n°1 : cycle

biologique d’Ixodes ricinus).

Les quatre stades du parasite sont les suivants :

♣ De l’œuf naît une larve hexapode, inframillimétrique. Après s’être fixée pendant quelques

jours sur un vertébré (pour 90% d’entre elles sur des micromammifères ou des oiseaux) pour

se gorger lentement de sang, elle tombe sur le sol, digère, puis mue pour se transformer…

♣ En une nymphe octopode mesurant environ un millimètre à jeun, et deux repue. Le deuxième

repas de sang sera pris dans les même conditions de durée pour se gorger (sur des petits ou

grands mammifères) puis se détacher..

♣ Il permettra la mue en adulte de 3 à 4 mm. La femelle, après copulation, devra se gorger

pleinement de sang, jusqu’à prendre la taille d’un petit pois (pour 90% sur des ruminants

sauvages ou domestiques). Ce qui lui permettra de pondre 1000 à 15000 œufs avant de se

dessécher et de mourir. Dans le milieu extérieur, la résistance au jeûne des adultes est estimée à

quelques mois (environ 50% de mortalité en trois mois). Le mâle n’est pas hématophage.

La durée du cycle, d’œuf à œuf est de 2 (soit deux saisons par stade) à 4 ans, pouvant

aller à 7 ans si les conditions climatiques ne sont pas favorables. C’est le cas en Finlande où le

froid hivernal est très long, la période d’activité est alors limitée à juin et juillet, ce qui ne

permet pas l’évolution complète d’un stade [11].

(Annexe n°2 : Durée des différentes phases du cycle)

36

Chez Ixodes ricinus, Anaplasma phagocytophilum n’est pas transmis par passage

transovarien. En effet, Webster et Mitchell [100], ont examiné tous les stades d’I. ricinus de

champs contaminés. Ils ont montré que les adultes et les nymphes étaient contaminés mais pas

les larves ! Cette bactérie n’a jamais été isolée au stade larvaire en l’absence de repas. Il n’y

aurait donc pas de passage trans-ovarien d’A. phagocytophilum, contrairement à ce qui arrive

pour Babesia divergens. Pour cette dernière, Donnelly et Pierce [29] ont montré que les larves

issues d’œufs d’adultes contaminés contenaient des Babesia. Il y a bien un passage trans-

ovarien pour Babesia. De plus ils ont montré que ce passage pouvait se faire durant plusieurs

générations de tiques. De la même manière, Poncet et al [75] montrent qu’Anaplasma

marginale se transmet aux larves de Boophilus par passage trans-ovarien. Cependant aucune

étude à notre connaissance n’est réalisée sur le passage de A. marginale chez Ixodes ricinus.

Un réservoir est donc nécessaire à la persistance d’Anaplasma phagocytophilum dans

le milieu.

I.B.2) b) Réservoir

C’est une espèce qui permet la survie d’un agent pathogène considéré [94].

A. phagocytophilum est une bactérie intracellulaire : ses réservoirs sont donc des êtres

vivants.

Le premier réservoir est le vecteur, Ixodes ricinus, uniquement sur une génération étant

donné qu’il n’y a pas de passage trans-ovarien. A. phagocytophilum reste durant toute la vie de

la tique dans ses glandes salivaires [1].

Les autres réservoirs potentiels sont des animaux domestiques et des espèces de la

faune sauvage telles que les mammifères de grande taille, les micromammifères et les oiseaux.

37

� Les mammifères domestiques

Des recherches à l'école vétérinaire de Toulouse sont actuellement en cours concernant

les moutons et les chèvres. Aucune donnée n’est encore disponible.

Cependant Stuen et al [92] ont montré en 1998 que les moutons sont porteurs d’A.

phagocytophilum pendant six mois au moins. Après injection de corticoïdes à cinq moutons

isolés, contaminés six mois auparavant, ils ont obtenu un épisode clinique d’ehrlichiose et des

morulas dans les neutrophiles. Chez ces animaux, il y a donc eu portage au moins pendant six

mois. Ceci suggère qu’ils sont réservoirs et peuvent transmettre la maladie pendant six mois au

moins. Aucune donnée n’a été trouvée quant au portage chez les bovins.

� Les mammifères de grande taille

Le rôle des cervidés a été étudié par Alberdi et al [1] en Ecosse. Sur 84 échantillons de

sang de chevreuils collectés, 38% étaient positifs par PCR. Environ 70% des chevreuils étaient

infestés de tiques Ixodes ricinus. Seulement 5% des nymphes étaient infectées par A.

phagocytophilum. Ces résultats montrent que le chevreuil est un hôte d’A. phagocytophilum et

qu’il est susceptible d’être un réservoir.

Liz et al [58] ont fait le même constat en Suisse où 46% des chevreuils étudiés étaient infestés

de tiques I. ricinus. L’examen microscopique des frottis sanguins provenant d’échantillons

sanguins de chevreuils n’a jamais permis de détecter des morulas mais 77,8% des chevreuils

étaient séropositifs et 18,4% étaient positifs à la PCR. Le chevreuil apparaît impliqué dans le

cycle d’ A. phagocytophilum mais il est faiblement contaminé.

Stuen et al. [90] ont infecté expérimentalement trois cerfs. A. phagocytophilum a

entraîné une légère hyperthermie chez un des trois cerfs alors qu’elle a entraîné des signes

cliniques typiques chez des moutons. Les cerfs sembleraient résistants à l’ehrlichiose. Des

inclusions dans les polynucléaires neutrophiles ont été trouvées chez les trois cerfs à plus ou

moins long terme et deux des trois cerfs sont devenus séropositifs à 14 et 21 jours post

infection. Cette étude a montré qu’A. phagocytophilum pouvait entraîner une infection

subclinique chez le cerf.

38

Un réseau de vétérinaires a été constitué en Bretagne, puis en France à partir de 1999,

afin d'effectuer des observations épidémiologiques sur l'ehrlichiose bovine. Plus de quinze

clientèles vétérinaires du Grand-Ouest ont participé à cette étude sérologique [44]. De

nombreux examens sérologiques ont été réalisés sur divers animaux capturés ou chassés :

chevreuils, cerfs, renards, pour établir la contamination possible de ces espèces.

Il ressort de cette étude que :

- les renards sont peu porteurs, un seul renard était séropositif entre1999 et 2002.

- le chevreuil serait un bon animal sentinelle pour les cheptels puisque 75% des

chevreuils capturés étaient séropositifs [44].

Pour résumer , il semble que les cervidés peuvent être infectés par A. phagocytophilum,

qu’ils séroconvertissent et qu’ils peuvent contaminer les tiques. Ils expriment la maladie

faiblement et nous ignorons la durée du portage et donc s’ils constituent des réservoir

potentiels.

� Les micromammifères

Liz a étudié le rôle des micro mammifères [57] de la faune sauvage. C’est la première

fois que l’on décrit des infections à A. phagocytophilum chez des micro mammifères, à savoir

le campagnol roussâtre ( Clethrionomys glareolus), le mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus),

le mulot à collier (A. flavicolis) et la musaraigne carrelet (Sorex araneus). D’une part Liz a

montré que ces micro mammifères étaient contaminés par PCR positive sur du sang. D’autre

part il a mis en évidence sur des micro mammifères des larves d’I. ricinus porteuses d’A.

phagocytophilum. Or, comme on n’a jamais démontré qu’il existait un passage transovarien de

l’ehrlichiose, les larves de tiques se sont contaminées lors de leur repas sur les

micromammifères [56]. Les micrommamifères apparaissent donc comme des réservoirs.

39

� Les oiseaux

Les oiseaux migrateurs, souvent porteurs de tiques, sont aussi suspects. Le changement

climatique, avec la modification des mouvements migratoires est mis en cause dans la

progression du nombre de cas d'ehrlichiose en Europe du Nord [10].

I.B.2) c) Mode de transmission

Chaque stade nécessite un repas sanguin pour muer. Durant chaque repas la tique a la

possibilité d’échanger des germes avec son hôte, c’est à dire de s’infecter, de transmettre un

agent infectieux, ou les deux à la fois. La transmission d’A. phagocytophilum se fait par la

salive ; il y est présent en grande quantité [100]. Le temps de fixation nécessaire à cette

transmission est de 30 à 36 heures [67] sachant qu’ un repas dure en moyenne huit jours [11].

Le nombre maximal de bactéries dans les cellules des glandes salivaires est obtenu en 5

à 7 jours [67].

Deux stades, la nymphe et l’adulte, permettent l’infection chez les bovins [92].

I.B.3) Facteur de réceptivité

L’ehrlichiose bovine est une arborickettsiose transmise en Europe par I. ricinus. Elle est

ainsi présente dans nos régions dans les zones et lors des saisons favorables à la présence de

tiques. Cependant tous les animaux en pâture dans ces régions infestées de tiques ne sont pas

atteints. Comme nous allons le voir dans la suite de l’exposé, la réceptivité des animaux varient

en fonction de facteurs intrinsèques tel que leur âge et extrinsèques tel que leur statut

immunitaire.

Les facteurs intrinsèques ne sont pas essentiels. L’ehrlichiose bovine concerne le bétail

quel que soit son sexe et son état physiologique.

Cependant les jeunes semblent posséder un certain degré de résistance [104]. McEwen [64]

montre dès 1947 que l’ehrlichiose est une maladie bénigne chez le jeune. Il place environ 60

agneaux de moins de 5 jours avec leur mère, dans deux pâtures contaminés, pendant trois

mois. Il suit alors la température des agneaux et réalise des frottis pour observer les inclusions

40

d’A. phagocytophilum dans les granulocytes. Les signes cliniques remarqués chez les agneaux

sont uniquement des phases d’hyperthermie de 4 à 5 jours. Ils semblent moins sensibles à

l’ehrlichiose. Cependant les signes cliniques observés chez les adultes ne sont pas fournis. Or,

dans certains cas diagnostiqués d’ehrlichiose chez l’adulte, l’hyperthermie est le seul signe

clinique. En 1992, Stuen et al [91] comparent la température, les frottis et la prise de poids de

deux lots d’agneaux âgés d’environ 2 et 6 semaines. Les signes cliniques sont plus graves chez

les agneaux de 6 semaines. Les plus jeunes apparaissent plus résistants. Pusterla et al [80] le

démontrent également lors de leur étude sur les variations de la séroconversion vis à vis d’A.

phagocytophilum chez les bovins au cours d’une année. Contrairement aux vaches et aux

primipares, aucun signe clinique n’est observé chez les veaux lors de leur première saison de

pâture sur des prés endémiques.

De plus, McEwen [64] a observé des inclusions sur les frottis d’agneaux n’ayant pas eu

de signes cliniques. Il suggère la mise en place d’une immunité colostrale. Cependant aucune

étude mesurant les taux d’anticorps n’est connue.

Les jeunes bovins, génisses laitières de moins de 15 mois et allaitantes de moins de 21

mois semblent posséder un certains degré de résistance [49].

Les facteurs extrinsèques sont bien plus importants. L’ehrlichiose peut s’exprimer de

manière beaucoup plus marquée et même être, à elle seule, cause de mortalité chez des

animaux vivant dans un environnement difficile et par conséquent stressant (froid, vent,

humidité) [15]. Un épisode clinique d’ehrlichiose chez des moutons contaminés 6 mois

auparavant, a été entraîné par une injection de corticoïdes [105]. Les facteurs de stress et de

baisse de l’immunité favorisent l’expression de l’ehrlichiose.

Le cycle de développement d’A. phagocytophilum nécessite un vecteur, des réservoirs

et un hôte. A. phagocytophilum est transmis aux bovins par les tiques Ixodes ricinus. Le

passage transovarien n’existant pas, des réservoirs sont indispensables à la persistance de

l’ehrlichiose au cours du temps. Nous avons vu comment A. phagocytophilum pouvait être

présente chez I. ricinus adulte. Voyons maintenant comment cette bactérie contamine, se

dissémine et persiste chez les bovins.

41

I.C Pathogénie

C’est l’étude du mécanisme causal de la maladie. Elle se décompose en plusieurs

phases, la contamination, la dissémination, la persistance et l’expression clinique.

I.C.1) Contamination

L’ehrlichiose est une arborickettsiose, elle est transmise par des tiques. Munderloh et al.

[67] décrivent en 1999 le mode d’invasion et de développement intracellulaire d’A.

phagocytophilum (agent de l’ehrlichiose granulocytique humaine) dans des cellules de tiques

(I. ricinus) (Annexe n° 3). La contamination de l’hôte se fait par morsure de tique. Les

bactéries se trouvent ainsi soit dans la circulation sanguine soit dans les tissus périphériques.

Dans ce cas, Munderloh et al [68] considèrent que l’endothélium des vaisseaux, en relation

étroite avec les cellules sanguines circulantes in vivo, pourrait intervenir dans la pathogénie et

la dissémination d’A. phagocytophilum. Après contamination de cellules endothéliales de

bovins et de primates, ils ont montré par microscopie optique, électronique et PCR qu’A.

phagocytophilum infectent ces cellules endothéliales, les envahissent rapidement et peuvent s’y

développer. Lors de la morsure de tique, A. phagocytophilum pourrait ainsi envahir

l’endothélium des vaisseaux. Puis lors de l’inflammation quand les cellules endothéliales et les

PNN s’accolent, ils pourraient envahir les cellules sanguines circulantes comme c’est le cas

pour Bartonella henselae [37].

Deux autres modes de contamination des hôtes sont possibles mais anecdotiques :

- La voie transplacentaire [77]

Après infection d’une vache en fin de gestation (270j) par voie intraveineuse, un veau viable

est né prématurément, à 287j. Séparé de sa mère, isolé, sans contact possible avec des tiques,

nourri à l’aide de colustrum sain d’abord, puis de lait sain ensuite, les premiers signes cliniques

d’ehrlichiose sont apparus 13j après sa naissance.

- La voie orale ou gastro-intestinale chez les nouveaux nés [79]

Des veaux nouveaux nés isolés ont exprimé cliniquement l’ehrlichiose après avoir été nourri à

l’aide de lait reconstitué contaminé par A. phagocytophilum. La transmission per os d’ A.

phagocytophilum est possible, ces bactéries sont alors capables de passer la barrière gastro-

42

intestinale. Cependant la transmission orale ne joue apparemment aucun rôle dans la

transmission naturelle de l’ehrlichiose chez les bovins.

I.C.2) Dissémination

La contamination des granulocytes se fait par phagocytose. A. phagocytophilum s’accole

aux granulocytes grâce aux protéines majeures de surface msp2(p44) [71] puis il est internalisé

et entouré de l’endosome [85].

Il semble que la contamination des granulocytes ne s’effectue pas avant leur arrivée dans le

sang circulant [104].

Les bactéries se multiplient dans l’endosome par division binaire. Woldehiwet et Scott ont

observé cette division au microscope électronique [106].

Enfin, A. phagocytophilum est éjecté des granulocytes par leur lyse. Néanmoins, une autre

possibilité a été décrite, elle consisterait en une simple exocytose [106].

I.C.3) Persistance

A. phagocytophilum se développe dans les polynucléaires neutrophiles, or ce sont des

cellules de défense de l’organisme, avec un haut pouvoir cytotoxique.

Scaife H. et al [86] montrent en 2003 qu’A. phagocytophilum induit un retard de

l’apoptose des neutrophiles ovins in vivo. Le contact bactérie-neutrophile, préliminaire

obligatoire de la phagocytose, empêche l'activation de la NADPH oxydase qui, combinée à la

myéloperoxidase, est un moyen de défense des granulocytes [86]. Cette inhibition des oxydases

serait due à l'induction de l'expression d'une protéine qui inhiberait la NADPH oxydase.

A. phagocytophilum entre par phagocytose dans les granulocytes, il est bien internalisé

dans des vacuoles mais il inhibe la fusion phagosome-lysosome si bien qu'il est capable de se

multiplier au sein de la vacuole d'endocytose [39].

43

A. phagocytophilum échappe à la phagocytose des granulocytes et il s’y multiplie au lieu

d’y être détruit.

I.C.4) Expression clinique

Un des principaux signes cliniques est l’hyperthermie [96]. C’est un des aspects de

l’immunité non-spécifique. Généralement, elle est induite par des agents pyrogènes, mais

aucune étude ne met ces agents en évidence lors d’ehrlichiose.

La leucopénie est un autre signe clinique. A. phagocytophilum induit une

immunosuppression secondaire par réduction de la phagocytose des neutrophiles infectés

[103], une déplétion des lymphocytes B [7] et une diminution de l’efficacité de l’immunité

humorale [8].

Batungbacal et Scott [7] ont inoculé huit moutons adultes et dénombré les lymphocytes

B (LB), marqué avec des immunoglobulines et de la fluorescéine et les lymphocytes T (LT),

marqué avec une pectine (Peanut agglutinin) durant la phase clinique. Le taux de LB chute

alors que le taux de LT reste stable. Cependant 14 à 21 jours après l’inoculation, le nombre de

lymphocytes réaugmente.

Dans une seconde étude [8], ils ont vacciné deux lots de dix moutons adultes contre

Clostridium chauvei et contaminé un avec A. phagocytophilum. Un rappel de vaccination est

réalisé 21 jours après. Ils ont mesuré l’efficacité de la vaccination par un test d’agglutination

des anticorps anti C. chauvei une semaine après la vaccination et trois semaines après le rappel.

Le taux d’anticorps est significativement inférieur chez les animaux infectés par A.

phagocytophilum (p<0,01). L’immunité humorale est donc moins efficace. Néanmoins, les

tests d’intradermoréaction avec des antigènes de C. chauvei ont entraîné des résultats

similaires dans les deux lots, laissant supposer un maintien de l’immunité cellulaire.

Quant aux avortements observés lors d’ehrlichiose, aucune étude ne permet d’en

expliquer le mécanisme. Cependant l’hyperthermie supérieure à 40°C provoquée par A.

44

phagocytophilum pourrait suffire à expliquer les avortements. Elle entraîne la mise en jeu

réflexe de l’excitabilité utérine [66].

Nous avons ainsi étudié le mode de contamination, de dissémination et de persistance

d’A. phagocytophilum. Nous allons dans la suite voir les modifications cliniques engendrées

chez l’individu contaminé.

I D Etude clinique

A. phagocytophilum est une infection qui entraîne un certain nombres de symptômes, de

modifications paracliniques, de lésions et de complications.

I.D.1) Symptômes

La période d’incubation de l’ehrlichiose est de 1 à 3 semaines [85] et les symptômes les

plus fréquemment rencontrés sont [47, 96] :

♠ un syndrome fébrile avec

- un appétit capricieux

- une température rectale comprise entre 39,5 et 41°C

- de l’abattement, une asthénie

- une agalactie plus ou moins complète

♠ une démarche ébrieuse (parfois).

♠ un engorgement des pâturons, caractéristique mais présent dans moins de 10 % des cas [43].

♠ un syndrome respiratoire inconstant :

- un jetage nasal muco-purulent très épais évoquant une rhinite, une toux grasse et une

forte dyspnée,

- à l’auscultation, des râles bronchiques sont alors bien nets.

45

♠ des retours en chaleur et des avortements

Déjà en 1964, Wilson et al [102] montraient une relation entre l’ehrlichiose et des

avortements chez les bovins durant les deux derniers mois de gestation. Ils ne savaient alors

pas si ceux-ci étaient dus à l’hyperthermie ou si d’autres facteurs intervenaient. Des

vétérinaires praticiens l’ont aussi noté, notamment Kaufmann [51]. En Mayenne, trois vaches

d’un troupeau issu d’un regroupement ont avorté dans la seconde moitié de gestation. Dans ce

troupeau, des problèmes respiratoires (toux), de l’hyperthermie et des engorgements des

pâturons ont été décrits. L’hypothèse de l’ehrlichiose pour expliquer les avortements a été

évoquée. Suite à des sérologies par IFI réalisées par le LDA22, les vaches avortées étaient

positives à l’ehrlichiose et négatives à la fièvre Q, la néosporose, la brucellose, la leptospirose

et la chlamydiose. L’ehrlichiose a été rendue responsable des problèmes de reproduction

constatés dans cette exploitation.

I.D.2) Modifications paracliniques

Celles-ci sont essentiellement des modifications de la numération formule [23]. La

formule leucocytaire est modifiée, il y a une sévère leucopénie caractérisée par, tout d’abord

une lymphopénie puis une neutropénie et une éosinopénie. Pendant que le nombre de

lymphocytes commence à augmenter quelques jours après la phase aiguë, le nombre de

neutrophiles et d’éosinophiles continue à diminuer et ne revient aux valeurs usuelles qu’à la fin

de l’infection. Le nombre de monocytes diminuent quant à lui très peu [78].

La lymphopénie correspond à une diminution importante du nombre de lymphocytes B

et à une légère diminution des lymphocytes T. Elle est transitoire, et survient uniquement

durant l’épisode clinique [92].

La neutropénie, à moins de 0,7.109 neutrophiles/litre, dure moins de 14 jours [92]. Le

pic de température apparaît lorsque 95% des neutrophiles sont infectés [85].

Cette leucopénie est attribuée à un possible arrêt de la production de la moelle osseuse

ou à la destruction des cellules infectées [78].

On observe aussi une thrombocytopénie sévère mais transitoire qui n’entraîne aucun

signe clinique particulier tel que des hémorragies spontanées [78].

46

Les données concernant les modifications biochimiques sanguines de l’anaplasmose

granulocytique sont peu nombreuses. Gocke et Woldehiwet [40], ont constaté une baisse

d’activité de la phosphate alcaline sérique et une diminution des concentrations en zinc et fer

plasmatique sur des moutons et des chèvres après inoculation expérimentale. La concentration

en zinc chute 3 jours après l’inoculation et retrouve sa concentration usuelle en 15 jours. La

concentration en fer chute 3 à 5 jours après l’inoculation et se prolonge jusqu’à 18 jours.

Les concentrations sanguines en bilirubine totale, en urée et en créatinine sont

également modifiées. Une augmentation de la concentration en bilirubine apparaît au bout de 4

jours et reste présente environ 4 jours. L’urémie peut atteindre une valeur supérieure à 13

mmol/L 4 à 5 jours après inoculation et persister durant 4 jours. La créatinémie augmente 3 à 4

jours après l’inoculation et peut se maintenir à des concentrations élevées pendant 3 jours.

D’autre part, chez l’homme, plusieurs auteurs ont mis en évidence une augmentation du

taux d’enzymes hépatiques dont l’aspartate aminotransférase (>100 U/L) [83, 5]. Cette

augmentation a aussi été rencontrée chez la chèvre [98]. Par contre aucune donnée sur la

modification des concentrations en enzymes hépatiques chez les bovins n’est disponible.

I.D.3) Lésions

Aucune lésion spécifique n’a été mise en évidence, il y a seulement un épuisement des

lymphocytes et une histiocytose dans les nœuds lymphatiques locaux durant l’infection [85].

Les lésions nécropsiques ont été décrites en 1994 par Campbell et al. [18]. Ils ont

contaminé 12 moutons qui ont ensuite été observés tous les jours jusqu’à leur euthanasie. Deux

moutons choisis au hasard étaient tués les 2, 4, 7, 12, 15 et 21ème jours post inoculation.

Macroscopiquement, une hyperplasie des tissus lymphoïdes et de la rate a été observée

au cours de l’expérimentation. Un seul mouton tué le 21ème jour n’a pas présenté ces réactions

des nœuds lymphatique et de la rate.

47

Microscopiquement, des inclusions intracellulaires ont été observées dans différents

organes, rate, nœuds lymphatiques, poumons, foie, reins et cerveau avec une réaction

inflammatoire plus ou moins spécifique associée dans la rate, les nœuds lymphatiques, les

poumons, les reins et le cerveau.

Les deux types d’inclusions intracellulaires rencontrées correspondent à des :

- Corps élémentaires : particules granulaires, sphériques et basophiles de moins de 1 µm

de diamètre

- Morulas : corps intravacuolaires pléomorphiques basophiles de 3 à 5 µm de diamètre

On retrouve les corps élémentaires dans les macrophages, les neutrophiles et les

lymphocytes de la rate et des nœuds lymphatiques.

Les formes plus évoluées sont retrouvées dans les macrophages, les neutrophiles et les

lymphocytes des poumons, du foie et du cerveau.

La lésion caractéristique est le développement d’inclusions intracytoplasmiques des deux

types lors de l’évolution de la maladie.

I.D.4) Evolution

Normalement, les moutons récupèrent sans traitement, deux semaines après les

premiers signes de la maladie [36, 92]. Mais des rechutes sont possibles, ainsi que des

complications. Chez l’homme le même constat est fait [74]. Quant aux chevaux, les signes

cliniques, à savoir une léthargie et de l’hyperthermie, disparaissent en une semaine [84].

I.D.5) Complication

Il existe de nombreuses complications. Les plus décrites sont [82] : � « fièvre récurrente » � « pyohémie à tiques » liée au développement d’abcès à S. aureus

48

� pneumonies par surinfection pulmonaire par le virus syncitial « RS », le syndrome

respiratoire d’été à Coxiella burnetti, ou les pasteurelles � « listérioses oculaires » � mammites cliniques � entérotoxémies � coxiellose / fièvre Q, forme abortive et pulmonaire

Elles sont cependant plus fréquemment rencontrées chez les ovins.

I.E diagnostic

L’ehrlichiose bovine est une affection sous-diagnostiquée. Il existe de nombreuses

formes chroniques pouvant passer inaperçues. Même en présence de symptômes, le diagnostic

clinique reste difficile. D’autant plus que la symptomatologie est passagère. De plus les

symptômes peuvent ne pas être détectés si les animaux sont en pâture. C’est une des raisons

qui explique sans doute que l’ehrlichiose est moins souvent mise en évidence chez les bovins

allaitants.

Le diagnostic de l’ehrlichiose repose sur la connaissance des conditions

épidémiologiques ainsi que sur l’observation des signes cliniques. Cependant les analyses de

laboratoires seront nécessaires pour le confirmer.

I.E.1) Clinique

I.E.1) a) Epidémiologie

L’ehrlichiose est une maladie transmise par les tiques, elle est donc liée à certains

biotopes.

C’est une maladie de modification des écosystèmes comme les achats, les

recompositions, les translocations d’animaux non protégés dans des biotopes réservoirs. Ainsi

49

la présence antérieure dans le troupeau d’autres maladies liées aux tiques comme la babésiose à

Babesia divergens, la fièvre Q, permet de suspecter la présence d’Anaplasma.

Les périodes d’occurrence de la maladie sont bien sûr en rapport avec la biologie des

tiques : d’avril à septembre, les cas observés sont liés à l’activité des nymphes d’Ixodes ricinus,

en octobre et novembre, à celle des adultes.

I.E.1) b) Clinique et lésionnel

En phase aiguë, le diagnostic clinique de l’ehrlichiose bovine est possible.

Le signe d’appel est souvent une chute de la production laitière, brutale et massive

[25]. On observe également une hyperthermie forte (>40°C) [96], un appétit sélectif, parfois un

syndrome pseudo-grippal, un essoufflement, une toux sèche ou, au contraire, grasse très

productive et aussi des gros paturons, en raison de la présence d’un œdème froid et non

productif caractéristique, entraînant des troubles de la locomotion. Cet œdème est présent chez

0 à 10% des vaches malades, selon les études. On peut également noter un amaigrissement, un

retour en chaleur, des avortements, des modifications hématologiques.

En phase suraiguë, on note surtout une immunodépression, pouvant conduire à une

diminution du statut sanitaire du troupeau.

La phase chronique est essentiellement décrite chez les ovins où on peut trouver un

portage durant six mois [92].

I.E.1) c) Différentiel

Comme nous l’avons vu précédemment les signes cliniques peuvent être une toux sèche

et quinteuse apparaissant de la fin du printemps à la mi-été accompagnés ou non

d’hyperthermie. C’est le syndrome toux d’été. Trois hypothèses sont à privilégier : une

dictyocaulose, des lésions localisées et chroniques de broncho-pneumonie infectieuse,

principalement bactérienne à ce stade ou une ehrlichiose. Les signes cliniques respiratoires se

ressemblent mais les caractéristiques épidémiologiques sont différentes [87]. De plus les

examens complémentaires sont assez simples à mettre en œuvre (Tableau n°I).

50

Néanmoins, l’ehrlichiose est une maladie transmise par les tiques et pouvant entraîner

de l’hyperthermie et des avortements en fin de gestation. Il faudra donc la différencier des

autres arbo-rickettsioses que sont la babésiose (Babesia divergens), l’anaplasmose (Anaplasma

marginale) [12] et la fièvre Q (Coxiella burnetti) [66] (Tableau n°ii).

51

Tableau n°I : Caractères différentiels épidémio-cliniques du diagnostic de la toux d’été [87].

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52

Tableau n°II : Caractéristiques épidémiologiques et diagnostiques d’autres arbo-rickettsioses

[11, 66].

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53

I.E.2) Expérimental

I.E.2) a) Frottis et numération formule

Anaplasma phagocytophilum est une bactérie intracellulaire, on la trouve dans les

neutrophiles, les éosinophiles et occasionnellement dans les monocytes, lors de la phase aiguë

de la maladie. Lors de l’examen cytologique, il faut identifier les morulas d’A.

phagocytophilum, situées dans les leucocytes. Les inclusions sont observables dans les

neutrophiles, les éosinophiles, les monocytes et parfois les lymphocytes, sous formes

d’inclusions basophiles ponctuées, petits corps arrondis ou en bâtonnets de 0,5 µm de diamètre

environ, ou sous forme de groupes de corps nommés morulas, de 2 à 4 µm. (Figure n°4). Les

cellules parasitées sont préférentiellement réparties sur le bord du frottis [23].

Figure n°4 : Anaplasma phagocytophilum dans un PNN chez une vache atteinte

uniquement d’hyperthermie. ENVL, pathologie du bétail. (*100)

54

Pour cet examen de cytologie, le prélèvement sur tube EDTA est préférable. La lecture

de l’étalement demande de l’habitude : elle peut être délicate à interpréter. D’autant plus qu’il

existe de nombreux artéfacts, comme la présence de chromatine sexuelle dans les cellules

nuclées ou de plaquettes superposées à un polynucléaire. De plus sur des prélèvements

dégradés, on peut observer des polynucléaires lysés.

Cet examen est aisé à mettre en place, on trouve assez facilement les inclusions dans les

leucocytes durant la phase aiguë de la maladie avec un peu d’expérience [78]. Cependant le

nombre d’A. phagocytophilum est plus faible au début et à la fin de la phase clinique, le

diagnostic par cytologie est alors plus difficile, il devient peu sensible.

La bactérie peut être détectée dans les leucocytes 5 à 8 jours après l’infection et durant

6 à 14 jours. Dans la majorité des cas chez les bovins, les inclusions sont trouvées

simultanément à l’apparition des signes cliniques. L’hyperthermie est associée à la présence

d’inclusions (le même jour ou un à deux jours avant). Néanmoins, la disparition de

l’hyperthermie n’est pas accompagnée de celle des inclusions. L’hyperthermie disparaît en 8

jours environ [78]. L’apparition d’A phagocytophilum dans les leucocytes coïncide ou précède

de quelques jours l’apparition de modifications hématologiques.

La numération formule est modifiée mais c’est un examen non spécifique. La formule

leucocytaire se caractérise par une lymphopénie, suivie d’une neutropénie et d’une éosinopénie

fortement évocatrices. Alors que le nombre de lymphocytes redevient normal quelques jours

après la phase clinique, le nombre d’éosinophiles et de neutrophiles continue de diminuer

jusqu’ au 21ème jour post-infection (en moyenne sur 10 vaches infectées). C’est alors la fin de

l’infection, A. phagocytophilum n’est plus détecté même par PCR [78].

Le nombre de thrombocytes est aussi modifié. La thrombopénie débute avant l’identification

microscopique d’inclusions mais disparaît avant le 21ème jour post-infection [78].

I.E.2) b) sérologie

La sérologie est essentiellement réalisée par Immuno-Fluorescence Indirecte (IFI), bien

que d’autres méthodes soient possibles (Western Blot notamment). L’IFI est une technique

fiable et facile à mettre en œuvre. Le prélèvement se fait sur tube sec. Il n’existe a priori pas de

réactions croisées avec des bactéries taxonomiquement proches comme Coxiella burnetii,

Ehrlichia chaffensis ou Chlamydia bovis. On utilise des lames à puits sur lesquelles sont fixés

55

des granulocytes infectés par A. phagocytophilum. Les sérums à tester sont déposés, et les

anticorps spécifiques fixés seront révélés par l’adjonction d’un conjugué anti-IgG de Bovin

couplé à de la fluorescéine [95].

Il permet un diagnostic a posteriori, après la phase aiguë, de j + 30 jours à j + 120 jours

et sans recontamination hypothétique.

Pusterla et al [78] démontrent que la concentration 1/20 en anticorps apparaît 6 à 11

jours après l’infection. Elle augmente progressivement jusqu’à un maximum de 1/320 à 1/5120

du 14 au 23ème jour. Elle se maintient pendant 30 à 60 jours puis commence à diminuer. Toutes

les vaches de leur étude deviennent négatives (inférieur à 1/20) à 210 jours.

Par contre, il existe une différence de sensibilité en fonction du variant incriminé.

Seulement 43% de A. phagocytophilum variant 2 sont mis en évidence par une réaction

d’immunofluorescence alors que 93% des variants 1 le sont [93].

Une technique utilisant l’immuno-électrophorèse pour détecter les anticorps d’A.

phagocytophilum a été décrite par Webster et Mitchell [98] en 1988. Elle utilise un gel

d’agarose, les conditions de température, de pH sont choisies pour que les antigènes migrent

vers l’anode et les anticorps vers la cathode. L’interaction entre les antigènes solubles et les

anticorps homologues, à mi-chemin du gel d’agarose, donne lieu à l’observation d’un précipité

dû à la formation d’un complexe antigène/anticorps. Une ligne opaque est observée.

I.E.2) c) PCR

En 1996, Olsson Engvall et al [70], montrent que la PCR est la méthode la plus sûre et

la plus utile dans les laboratoires pour faire un diagnostic rapide et spécifique de l’ehrlichiose.

Par contre il faut veiller à bien standardiser la réalisation de l’échantillon testé.

Massung et al [62] comparent 13 techniques de PCR. La sensibilité est mesurée en

utilisant diverses dilutions d’ADN d’A. phagocytophilum. La spécificité est comparée en

utilisant de l’ADN d’Ehrlichia chaffensis, de Rickettsia rickettsi et de Bartonella henselae.

Les trois meilleures méthodes en spécificité et en sensibilité sont la nested-PCR amplifiant le

gène de l’ARNr 16S, la PCR directe amplifiant le gène de la msp2 (protéine majeur de surface)

et la PCR directe amplifiant le gène de l’ARNr 16S. Cependant ces résultats sont

56

complètement dépendants du kit PCR utilisé, des enzymes ainsi que des conditions de

réalisation (température, humidité…). L’auteur suggère à chaque laboratoire de tester lui-

même les techniques utilisées.

Actuellement le kit utilisé au LDA22 consiste en la détection du gène ARNr 16S par

nested-PCR, avec amplification d’un fragment de 913 paires de base. Il a fallu vérifier

l’absence de reconnaissances croisées et développer un témoin interne d’amplification pour

permettre d’utiliser le kit en routine. Le protocole permet une utilisation sur sang total (1ml),

sérum ou plasma (200µl), et sur les tiques.

La PCR est plus sensible que la détection microscopique d’inclusions dans les

leucocytes [80]. L’ADN d' A. phagocytophilum est détecté dans un échantillon de sang par

nested-PCR 1 à 2 jours avant et 2 à 12 jours après que la bactérie ne soit identifiée

microscopiquement dans les leucocytes [78].

Tableau n°III : Le diagnostic de l’ehrlichiose bovine et ses limites

(Etude Régionale URGTV Bretagne 1999-2003) [48]

Méthodes Support

biologoque

sensibilité spécificité Plages

d’efficacité

En jours par rapport

à l’apparition des

signes cliniques

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hématologie

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Sérologie Eaph

par IFI

Sérum, plasma + ou - +++ J21-J100

PCR sonde EAph Lame fixée,

sérum/plasma,

tiques

++++ ++++ J0-J4

57

Ces différents examens permettent des diagnostics à divers moments de la maladie

(Tableau n°iii). La numération formule ne permet pas d’établir un diagnostic de certitude mais

il permet de l’orienter. Le frottis quant à lui permet un diagnostic de certitude mais la

sensibilité de cet examen dépend de l’expérience du lecteur contrairement à la PCR. Cependant

ces deux examens peuvent être réalisés durant la phase clinique. La sérologie, quant à elle

permet d’établir le diagnostic en différé par rapport à la clinique.

Maintenant que le diagnostic est confirmé, voyons comment traiter cette maladie.

I.F Traitement

Le traitement est à base d’oxytrétracycline [81] à la dose de 10mg/Kg par voie

intraveineuse le premier jour puis par voie intramusculaire pendant les quatre jours

suivants[96].

C’est une tétracycline naturelle synthétisée par des bactéries de l’ordre des

Actinomycétales, les Streptomyces rimosus.

Leur résorption est bien meilleure par voie intra-veineuse que par voie orale ou intra-

musculaire (douloureuse) du fait de leurs propriétés chélatrices. Elles peuvent fixer un ou deux

cations divalents de calcium ou de magnésium par molécule.

On utilise souvent la forme retard qui est en fait de l’oxytétracycline additionnée d’excipients

organiques hydromiscibles à base de propylène glycol. L’antibiotique est alors utilisé sous sa

forme de base et non de chlorhydrate.

La distribution est large et complète dans tous les tissus du fait de la liposolubilité. Leur

caractère amphotère leur confère par ailleurs une distribution homogène dans les tissus aussi

bien extracellulaires qu’intracellulaires. Ce qui est très intéressant dans notre cas

puisqu’Anaplasma phagocytophilum est une bactérie intracellulaire.

Les oxytétracyclines sont principalement éliminées par voie urinaire, secondairement

par la bile.

58

Elles possèdent un spectre d’activité large qui s’étend aussi bien aux bactéries Gram

positif qu’à celles Gram négatif, mais elles sont également actives sur les bactéries anaérobies,

les mycoplasmes, les rickettsies, les Chlamydiae et les leptospires.

Ce sont des antibiotiques bactériostatiques qui bloquent la biosynthèse des protéines

bactériennes. Elles pénètrent à l’intérieur de la bactérie principalement par un mécanisme actif

grâce à des transporteurs spécifiques. Leur action antibactérienne résulte de leur fixation sur la

sous-unité 30 S des ribosomes par liaisons chélates établies avec les groupes phosphates des

ARN messagers . Elles empêchent ainsi la fixation des ARN de transfert sur l’ARN messager.

Des tests montrant l’activité de plusieurs antibiotiques ont été menés en utilisant des

cellules HL60 infectées par A. phagocytophilum [63]. Ceux-ci ont bien entendu confirmé que

la tétracycline est l’antibiotique de choix à utiliser (Tableau n°IV).

Tableau n°IV: Activité de divers antibiotiques sur A. phagocytophilum [63].

Résistant Β lactamide : Ampicilline, Ceftriaxone

Aminoglycoside : Amikacine

Macrolide : Erythromycine

Azalide : Azithromycine

Sensible à haute concentration Sulfamethoxazole + trimethoprime

Sensible (bactériostatique) Doxycycline

Rifampin

Levofloxacine

Chloramphénicol

Le traitement contre l’ehrlichiose est donc aisé à mettre en place, cependant les pertes

économiques étant importantes, une bonne prévention dans les zones à risques est

indispensable.

59

I.G Prophylaxie

La prophylaxie consiste essentiellement à séparer le vecteur, I. ricinus de l’hôte. Pour cela

des méthodes hygiéniques pourront être utilisées dans un premier temps. Si ces techniques

échouent l’utilisation d’antiparasitaires pourra être envisagée.

I.G.1) Sanitaire et hygiénique

L’ehrlichiose, comme nous l’avons précédemment vu est une maladie vectorielle (Ixodes

ricinus). On la rencontre de ce fait dans les biotopes où les tiques vivent. Ainsi la gestion des

biotopes sera la meilleure prévention.

Des mesures zootechniques sont à mettre en place. Il faut notamment proscrire l’usage

de désherbants et débroussaillants même sous les fils de clôture car la fougère aigle et la

morelle noire y résistes. Elles se développeront plus facilement avec ce traitement. Or elles

favorisent la présence de tiques.

L’infestation par les Ixodes peut être réduite par une bonne gestion des limites

naturelles des prés. On peut notamment débroussailler les bordures de prairies ou reculer les

clôtures électriques pour éviter que les animaux ne soient en contact avec les taillis.

D’autre part l’abandon ou le labour-réfection des pâtures incriminés peut être une

solution. Cependant c’est très onéreux.

Les surfaces suspectes peuvent être interdites aux animaux et exploitées pour faire de la

culture [49].

D’autre part, les animaux infectés acquièrent une immunité de prémunition, celle ci

n’est pas totalement efficace mais réduit significativement l’expression de la maladie [105, 53].

De plus les jeunes sont plus résistants à l’ehrlichiose [91]. La mise en pâture des génisses, non

productives de lait ou d’embryons doit se faire prioritairement dans les zones à risque. Ce sont

les génisses de moins de 15 mois en race laitière et de moins de 21 mois en cheptel allaitant.

Cela permettrait de mettre à profit l’immunisation de prémunition lors de primo-infection [49].

Il faut également être vigilant lors des achats et des recompositions de troupeaux : il

peut être utile de réaliser une sérologie pour être sûr que l’animal importé ne puise pas être

réservoir.

60

Enfin, si la pression d’infestation par les tiques est trop importante et que la prophylaxie

hygiénique échoue, un traitement antiparasitaire peut être mis en place. Cependant la résistance

des tiques est de plus en plus problématique [50].

L’élimination des tiques triphasiques est difficile car elles changent d’hôte à chaque

repas. De plus elles sont très résistantes, elles peuvent jeûner durant 18 mois. La lutte contre

Ixodes ricinus sera toujours partielle, seuls les parasites présents sur l’hôte seront atteints [19].

Lors de traitement préventif (Tableau n°V), il faut l’appliquer à la mise au pré, donc

au printemps. Il existe différents produits (action, rémanence), avec différentes présentations

(pour-on, pulvérisation, injection) [60].

61

Tableau n°V : Traitement préventif antiparasitaire [60, 28]

Délai (jours) Principe actif Nom

déposé

Modalités

d’application

Observations

Lait Viande

Formamidine Amitraze Taktic Bain

Pulvérisation

1L pour 500Ld’eau 1 14

Organochlorés Lindane Véticide /

lindactone

B P Action durant 8 à15

jours

Int 60

Diazinon Sogigal /

Gifagal

B

Diazinon +

Malathion

Ectigal 30 B P 8 15

Phoxim Sébacil

solution

B P Int 28

Organophosphorés

Propétamphos Gardecto

/Blotic

B P

1 traitement / 3

semaines :

infestation diminuée

1 traitement / 5 à 7

jours : élimination

totale

2 14

Fenvalérate Acadrex B P Nul Nul Pyréthrinoïdes

Deltaméthrine Butox 50 B P

Pour on

Action 4 à 5

semaines, 1

traitement par mois

Protection : 6

semaines

Nul 3

Int : interdit

L’utilisation des pyréthrinoïdes et autres doit être contrôlée, leur très bonne efficacité

les rend dangereux pour l’environnement. Leur utilisation exagérée peut entraîner l’apparition

de résistance. Dans un second temps, ils peuvent entraîner la disparition d’autres invertébrés

[33].

L’éradication totale des tiques est irréalisable dans la majorité des cas [50], une bonne

gestion du biotope permettra tout de même de diminuer la pression d’infestation des tiques et

ainsi d’éviter l’apparition de cas d’ehrlichiose. On peut toutefois agir sur les bovins pour leur

permettre de résister à la bactérie.

62

I.G.2) Médicale

Cranwell [24] a montré en 1990, que l’oxytétracycline longue action était efficace dans le

traitement mais aussi la prévention de l’ehrlichiose. Deux lots identiques d’animaux, dont un

seulement subissait un traitement à base d’oxytétracycline. ont été placés dans des champs

infestés de tiques porteuses d’Anaplasma phagocytophilum. Le nombre d’animaux

séroconvertis était bien inférieur dans le lot traité. De plus le lot traité avait un GMQ plus

important et aucun pic de température n’a été relevé. Quatre injections de 1ml/ 10 kg avaient

été pratiquées les 7, 14, 21 et 28ème jours. Cependant l’auteur affirme que les effets seraient les

mêmes si on pratiquait seulement deux injections le 10ème et le 20ème jour.

D’autre part un vaccin pourrait, peut-être, être réalisé à partir des protéines majeures de

surface. Cependant elles sont très variables [13] et de nombreux échecs de vaccinations

pourront apparaître. Les trois protéines immunoréactives et beaucoup plus stables découvertes

par Storey et al, seraient a priori de bons candidats antigéniques pour réaliser un vaccin [88].

I.H Conclusion

L’ehrlichiose bovine est une arborickettsiose due à A. phagocytophilum transmise par I.

ricinus. Cette bactérie intracellulaire se développe dans les polynucléaires neutrophiles, les

éosinophiles et dans une moindre mesure les lymphocytes et les monocytes. Elle touche

principalement les bovins adultes qui développent une immunité de prémunition.

L’hyperthermie, une chute brutale de la production et un syndrome respiratoire en sont les

symptômes majeurs. Le traitement repose sur l’utilisation d’antibiotique dont la tétracycline.

La répartition temporelle et géographique de l’ehrlichiose dépend de l’activité des tiques, I.

ricinus.

Dans la deuxième partie, nous présenterons les résultats de l’enquête que nous avons

menée dans les Monts du Lyonnais. Nous nous sommes attachés à préciser les conditions

épidémiologiques autour des cas identifiés et nous avons tenté de définir l’intérêt de la PCR

pour le diagnostic.

63

DEUXIEME PARTIE :

ENQUETE EPIDEMIOLOGIQUE

64

65

II Etude épidémiologique et clinique

L’ehrlichiose est une arborickettsiose. Elle est transmise par le même vecteur aux

bovins et aux hommes. De plus, différentes études montrent qu’Anaplasma phagocytophilum

et l’agent de l’ehrlichiose granulocytique humaine sont très proches voire qu’il s’agirait de la

même espèce[31]. Il est donc très important de la détecter chez les animaux de rente. Présente

dans les troupeaux, on pourra alors la soupçonner en cas de pathologies respiratoires chez

l’homme. En 2001, le premier cas bovin des Monts du Lyonnais a été mis en évidence [96].

Depuis d’autres cas sont apparus. N’ayant pas encore bénéficié de recherches consacrées à

Anaplasma phagocytophilum, cette région paraît propice à la conduite d’études précises sur ce

point.

Nous avons limité cette étude à la clientèle de l’Arbresle, dans les Monts du Lyonnais,

où le premier cas régional d’ehrlichiose a été mis en évidence.

Cette étude s’est donnée pour objectif principal de localiser les cas d’ehrlichiose bovine

au sein de la clientèle et de pouvoir ainsi déterminer les conditions épidémiologiques

d’apparitions.

Cette étude avait aussi pour objectifs secondaires de : � Préciser la clinique exprimée � Caractériser ces élevages sur le plan de l’environnement et de la conduite d’élevage � Mettre en évidence l’intérêt du diagnostic par PCR par rapport au diagnostic

cytologique.

66

II.A Matériel et méthode

II.A.1) Epidémiologie

II.A.1) a) Population d’éleveurs

L’étude a été réalisée dans la clientèle du cabinet vétérinaire de l’Arbresle. Tous les

éleveurs de cette clientèle ont été contactés par téléphone (Annexe n°4). Les éleveurs ayant

déjà rencontré des cas d’ehrlichiose ont été sélectionnés.

D’autre part, les vétérinaires de la clinique de l’Arbresle ont été prévenus de l’étude.

S’ils rencontraient des cas d’ehrlichiose de septembre 2004 à juin 2005, ils nous prévenaient et

les éleveurs étaient contactés pour intégrer l’étude.

II.A.1) b) Enquête

� Questionnaire aux éleveurs

Le questionnaire pour l’entretien a été réalisé en septembre 2004 (Annexe n°5). Il avait

pour but d’identifier quels types d’animaux étaient atteints d’ehrlichiose, à quelles périodes et

dans quelles circonstances environnementales. Il rappelait aussi comment le diagnostic avait été

fait. Enfin, il s’attachait à hiérarchiser les signes cliniques exprimés par les animaux et reconnus

par l’éleveur.

Il s’articulait en divers points :

• Présentation de l’élevage : type et niveau de production, effectifs

• Environnement où les cas sont apparus et interaction avec la faune

sauvage

• Conduite du troupeau et des pâtures en précisant les méthodes de

prophylaxie

• Cas clinique : type d’animaux atteints, signes cliniques

• Traitement

67

� Déroulement de l’enquête

Tous les éleveurs sélectionnés ont été rencontrés afin de répondre aux questionnaires et

les visites ont été réalisées entre mi-novembre et mi-décembre.

II.A.2) Définition des cas

II.A.2) a) Cas suspect

Un cas suspect est un animal présentant les signes cliniques caractéristiques de

l’ehrlichiose dans un environnement où des tiques sont présentes. Les cas suspects ont été

répertoriés par le vétérinaire qui a précisé les signes cliniques dans un tableau (annexe n°6).

Les cas suspects rassemblent aussi les cas d’avortement durant le derniers tiers de

gestation chez des vaches infestées de tiques.

De plus nous avons rencontré des cas suspectés et traités par les éleveurs, seuls, sans

visite du vétérinaire ni confirmation par le laboratoire. Ce sont les cas éleveurs, la clinique et

l’épidémiologie correspondaient à la présence d’Anaplasma phagocytophilum, des cas

d’ehrlichiose avaient précédemment été diagnostiqués dans l’élevage mais le diagnostic n’a été

confirmé que par l’amélioration sous injection de tétracyclines.

II.A.2) b) Cas clinique

Un cas clinique est un cas suspect pour lequel le diagnostic a été confirmé par cyto-

hématologie. Des morulas ont été observées dans les leucocytes, surtout les PNN. Le

diagnostic était confirmé par le laboratoire suite à la suspicion du vétérinaire. Seuls les cas

cliniques ont été pris en compte pour la réalisation de l’enquête.

Les cas cliniques diagnostiqués préalablement à l’année 2004/2005, ont permis de

sélectionner les premiers élevages pour réaliser l’enquête épidémiologique. Les cas cliniques

diagnostiqués cette année ont permis d’une part de réaliser l’enquête et d’autre part de réaliser

des analyses cyto-hématologiques et des PCR en vu de comparer ces deux techniques.

68

II.A.2) c) Cas témoins

Ce sont des cas contemporains des cas de l’année 2004-2005, prélevés trois jours après

le diagnostic du cas clinique, dans le même élevage. Ce sont des animaux du même lot ne

présentant pas de signes cliniques prélevés lors d’une seconde visite.

II.A.3) Les prélèvements sanguins et analyses sérologiques

II.A.3) a) Les prélèvements et leur traitement

Sur tous les cas suspects d’ehrlichiose de l’année 2004/2005 deux prélèvements

sanguins étaient faits à la veine jugulaire le jour de la suspicion (J0), sur un tube EDTA et un

tube sec.

Trois jours après, J0+3, les mêmes prélèvements étaient réalisés sur les cas cliniques et

1 à 4 animaux. Tous les prélèvements étaient identifiés et accompagnés d’une fiche (Annexe

n°7).

Le tube avec EDTA servait à réaliser une numération et des frottis dans la journée. Une

coloration rapide RAL (Elvetec, Genas) et une coloration May-Grünwald-Giemsa (Elvetec,

Genas) de deux frottis étaient faites. Puis les échantillons pour la PCR étaient préparés comme

suit :

Après centrifugation 10 minutes à 5000 tr/min, 200µl de la limite supérieure de la partie

cellulaire, contenant les globules blancs, était prélevés. Le prélèvement «buffy-coat»

comportait un peu de plasma, un peu de globules rouges et la majorité des globules blancs. Ces

buffy-coats étaient congelés à –20°C dans le but de réaliser les PCR.

Les sérums issus des prélèvements sanguins sur tube sec ont été congelés pour des

sérologies ultérieures.

69

II.A.3) b) Les analyses cyto-hématologiques

� Numération formule

La numération a été réalisée à J0, sur un compteur globulaire (Hycel diagnostics,

Pouilly en Auxois). La formulation sanguine a été réalisée sur le frottis coloré au RAL observé

au microscope à immersion à un grossissement fois 1000.

� Cytologie

Une observation des leucocytes a également été faite pour affirmer la présence

d’Anaplasma phagocytophilum et estimer le pourcentage de leucocytes contaminés par des

morulas.

II.A.3) c) PCR

Deux types de PCR ont été réalisés au service de bactériologie de l’ENVA sur les

quarante quatre échantillons (cas suspects, cas d’avortement et cas cliniques) : une PCR nichée

spécifique d’Anaplasma phagocytophilum, et une PCR à Ehrlichia non spécifique. � Extraction d’ADN : réalisée sur colonne du kit NucleoSpin®Tissue

(MACHEREY-NAGEL, Hoerdt, France) en suivant les indications du fabricant. � Réalisation des PCR.

La PCR nichée [61] a nécessité deux couples d’amorces : Ge3a et Ge10r (EUROBIO,

Courtaboeuf, France) pour la première partie et Ge9f et Ge2r (EUROBIO, Courtaboeuf,

France) pour la seconde. La PCR non spécifique a nécessité les amorces, EHR 16SD et EHR

16SR (EUROBIO). L’amplification a été réalisée sur un Eppendorf MasterCycler personnal

avec la Taq polymérase Takara (Cambrex, Verviers, Belgique). Les MIX ont été préparés pour

un échantillon de 25 µl. Ils contenaient 4 µl de chaque amorce, 0,2µl de Takara, 4µl de dNTP,

2,5µl de tampon, 5,3µl d’eau et 5µl d’extrait pour la PCR niché. Pour la PCR simple, non

spécifique, seulement 2µl de chaque amorce, 2µl de dNTP et donc 11,3µl d’eau ont été

utilisés. Les cycles utilisés ont été résumés dans le Tableau n°VI . Un témoin d’ADN positif a

été utilisé pour contrôler la PCR, il s’agissait d’un broyat de tiques infestées par Anaplasma

phagocytophilum appartenant à l’ENVA. � La migration de l’ADN a été réalisée sur un gel d’agarose à 2% pendant 40 min

à 100V/min, observée sous rayons ultra violets.

70

Tableau n°VI : Modalités de réalisation des PCR nichées et simples utilisées pour le

diagnostic de l’ehrlichiose bovine

Type de PCR Amorces

EUROBIO (Courtaboeuf, France)

Cycles

Eppendorf MasterCycler

personnal avec Takara

Cambrex (Verviers,

Belgique)

Nombre

de cycles

95°C 8min 1

94°C 1min

50°C 1min

72°C 1min

40

Eta

pe 1

Ge3a

(CACATGCAAGTCGAACGGATTATTC)

Ge10r

(TTCCGTTAAGAAGGATCTAATCTCC) 72°C 10min

10°C jusqu’à l’arrêt

1

95°C 2min 1

94°C 30s

55°C 30s

72°c 1min

30

PCR nichée

Eta

pe 2

Ge9f

(AACGGATTATTCTTTATAGCTTGCT)

Ge2r

(GGCAGTATTAAAAGCAGCTCCAGG) 72°C 5min

4°C jusqu’à l’arrêt

1

94°C 8min 1

94°C 40s

52°C 40s

72°c 1min

34

PCR non

spécifique

EHR 16SD

(GGTACCTACAGAAGAAGTCC)

EHR 16SR ou Oligo 6

(TAGCACTCATCGTTTACAGC) 72°c 10min

11°C jusqu’à l’arrêt

1

71

II B Résultats

II.B.1) Etude épidémiologique

Ces résultats concernent la sélection des éleveurs et l’enquête réalisée grâce aux

questionnaires.

II.B.1) a) Population d’éleveur

Nous avons contacté 270 éleveurs. 104 ont répondu au questionnaire téléphonique soit

environ 38,5%. Ils ont été classés en quatre catégories. Les élevages sans tique et donc sans

cas ni d’ehrlichiose ni de piroplasmose, les élevages avec tiques et sans cas ni d’ehrlichiose ni

de piroplasmose, les élevages avec tiques et avec d’anciens cas de piroplasmose (plus de 5 ans)

et enfin les élevages avec tiques et avec des cas récents d’ehrlichiose et/ou de piroplasmose

(figure n°5).

22%

18%

31%

29%

Pésence de tiques avec descas de piroplasmose etd'ehrlichiose

Présence de tiques et decas anciens ( plus de 5 ans)de piroplasmose etd'ehrlichiosePrésence de tiques sanscas clinique

Absence de tique

Figure n°5: Répartition des élevages contactés

72

23 élevages présentaient ou avaient présenté des cas d’ehrlichiose ou de babésiose dans

les cinq dernières années (Figure n°5) dont sept ont eu des cas d’ehrlichiose confirmés. Sur

ces sept élevages, deux ont présenté leur premier cas cette année, de septembre 2004 à juin

2005. Les cas cliniques dans les cinq autres élevages sont survenus de 2001 à 2004. La suite

des résultats ne concernera que ces sept élevages. L’incidence et la prévalence annuelles sont

de 1 à 3 élevages par an.

II.B.1) b) Enquête

� Population affectée

• Les élevages

Sept élevages (A à G) ont eu des cas cliniques d’ehrlichiose ces cinq dernières années.

Le nombre de cas cliniques d’un élevage à l’autre est très variable (Tableau n°VII ). De

septembre 2004 à juin 2005, cinq cas cliniques d’ehrlichiose ont été diagnostiqués dans deux

élevages différents.

Au total il y a eu 9 cas « éleveurs », chez deux éleveurs (A et E) : ce sont des cas

suspectés et traités avec amélioration sans visite du vétérinaire.

Tableau n°VII : Répartition du nombre de cas clinique et de cas éleveur par élevage et par

année

Elevage A B C D E F G

2001 16 6

2002 2 4

2003 1 1

2004 1 6 et 6 2

Nom

bre

de c

as

l’ann

ée

2005 1 3

NB : gras : cas cliniques italique : cas éleveurs

73

• Présentation des élevages

Ces sept élevages sont des élevages de vaches laitières. Cinq d’entre eux possèdent un

troupeau de Prim’holstein, un possède un troupeau de Montbéliardes et un est mixte.

La production laitière annuelle moyenne par vache dans ces élevages est de 6850 L. Ce

sont tous des élevages de plus de 21 animaux avec en moyenne 53 animaux. Le nombre de

vaches est naturellement plus important que le nombre de génisses (figure n 6).

Génisses moins 1 an

Génisses plus 1 an

vache

taureau

Figure n°6 : Répartition moyenne des animaux dans les élevages

• Animaux affectés

Les cas cliniques étaient majoritairement des laitières primipares de deux ans et demi,

représentant 21 cas sur les 40 diagnostiqués. Cependant des vaches de sept ou huit ans sont

aussi atteintes. Dans l’élevage A, toutes les vaches laitières ont été touchées avec des

symptômes plus ou moins importants en huit mois.

Dans l’élevage F, les deux cas cliniques étaient des animaux achetés un mois

auparavant. Il s’agissait de génisses gestantes qui ont vêlé dans l’élevage. Aucune des autres

vaches du troupeau, parquées au même endroit, n’a exprimé la maladie.

74

� Période d’apparition des cas

• Répartition sur une année

Les cas d’ehrlichiose ont été rencontrés essentiellement aux mois de juin et de

septembre (figure n°7).

0

5

10

15

20

25

30

J F M A M J Jlt A S O N D

Figure n°7 : Répartition des cas d'ehrlichiose au cours d'une année

• Répartition durant les cinq dernières années

Tous les cas cliniques d’ehrlichiose ont été identifiés récemment, le plus ancien a été

diagnostiqué en 2001. Neuf l’ont été au cours de l’année 2004 et trois au premier semestre

2005. Trois éleveurs ont rencontré plusieurs cas par an ces cinq dernières années. Ces éleveurs

ont d’ailleurs remarqué que la fréquence des cas avait diminué régulièrement d’une année sur

l’autre en 4 ans (Tableau n°VII ).

� Circonstance et lieux d’apparition des cas

• Cartographie

Les éleveurs ont localisé sur une carte IGN (Institut Géographique National) les prés

sur lesquels les cas cliniques étaient en pâturage (Figure n°8). Les cas cliniques ont été

75

observés sur les mêmes parcelles dans 6 cas sur 7. Le pré infesté de tiques contaminées n’a pas

été identifié dans l’élevage B.

Figure n°8 : Répartition géographique de cas cliniques d’ehrlichiose

• Conduite de troupeaux et pâtures

Dans l’ensemble, tous les éleveurs travaillent de la même manière. Les vaches et les

génisses sont sorties de début avril à fin novembre suivant les années. Des rotations de pâtures

sont réalisées dans les sept élevages entre des prairies permanentes et temporaires. Les vaches

pâturent sur des repousses en automne dans 4 cas sur 7. L’éleveur F continue à sortir ses

76

vaches laitières au moins une heure entre deux traites en hiver. Les génisses restent dans 4 cas

sur 7 dans le même parc. Toutes les parcelles suspectes d’être à l’origine des infections sont

des prairies permanentes.

• Description des pâtures

Dans 6 élevages sur 7, un pré était connu pour être infesté de tiques (Figure n°8). Ces

pâtures sont à moins de 250 m d’un bois. Les arbres composants ces bois sont essentiellement

des chênes, des frênes et des charmilles (figure n°9). Ces prés sont aussi limités par des haies

discontinues et sont dans 6 cas sur 7 traversés par un ruisseau ou une mare.

0

1

2

3

4

5

6

char

mille

chata

ignier

ceris

ier

noise

tier

peup

lier

sorb

ier tailli

Figure n°9 : type de végétation des bois

Dans un cas (E), la pâture suspecte était un achat récent. Toutes les vaches malades

l’ont été sur cette parcelle. Les cas d’ehrlichiose sont apparus durant la première saison

d’utilisation de ce parc.

• Prophylaxie

Quatre des éleveurs (B, D,E et G) broient les haies bordant les prés infestés de tiques

tous les ans. Trois (B, E et F) traitent leur troupeau au Butox® à la mise à l’herbe depuis qu’ils

ont eu des cas cliniques d’ehrlichiose. Les autres (A, C et D) les traitent à la Versatrine®. Dans

l’élevage G de l’Arkofly® a été utilisé ponctuellement sur les animaux infestés de tiques.

L’éleveur E qui a eu des cas cliniques suite à l’achat d’un nouveau pré, met depuis, en pâture

sur ce pré suspect, des génisses et les traite au Butox®. Aucun cas n’a alors été observé.

77

• Faune sauvage

Trois éleveurs voient régulièrement des chevreuils sur leur terre. Un d’entre eux en a

retrouvé un mort dans son pré, certainement tué par un des nombreux chasseurs de la région.

Ce chevreuil était couvert de tiques d’après l’éleveur.

Bien entendu de nombreux rongeurs sont rencontrés dans cette région.

� Symptômes

• Signes d’appel

Une liste des signes cliniques rencontrés lors d’ehrlichiose a été réalisée et les éleveurs

ont hiérarchisé ceux qui leur faisaient suspecter une ehrlichiose. C’est l’hyperthermie et la

baisse de production qui attirent en premier leur attention (figure n°10).

0123456

Bai

sse

d'ap

pétit

Aba

ttem

ent

Hyp

erth

erm

ie

engo

rgem

ent

des

pâtu

ron

synd

rom

egr

ippa

l

Bai

sse

depr

oduc

tion

Avo

rtem

ent

Figure n°10 : premiers signes cliniques constatés par les éleveurs.

• Perte économique

Les pertes économiques directes de l’éleveur ne sont pas très importantes. Le

traitement à base de tétracycline longue action est d’environ 13 cts d’euros le ml soit 16 Є

pour le traitement d’une vache de 600 Kg. Tous les éleveurs ont atteint leur quota malgré les

chutes de production laitière. Pendant, en moyenne, trois jours les vaches atteintes ne

produisaient plus de lait. De plus, suite au traitement le délai d’attente est de 6 traites.

78

L’éleveur perd donc en moyenne 4 jours de traite complète si on considère qu’il traite le jour

où les signes cliniques apparaissent. La perte financière est d’environ 23 Є. Dans l’élevage A

où tout le troupeau de vaches laitières a été atteint, le problème majeur a été l’infécondité et

donc le retard de gestation.

II.B.2) Les résultats des prélèvements sanguins

Les premiers examens réalisés le jour de la suspicion sont la numération formule et le

frottis. Puis dans un second temps les PCR ont été réalisées à l’ENVA sur les buffy-coats.

II.B.2) a) Numération formule et frottis

Tous les résultats cyto-hématologiques des cas cliniques, des cas suspects et des cas

témoins sont détaillés en Annexe n°8.

Cas clinique à J0 :

Une leucopénie, une thrombocytopénie et une neutropénie étaient présentes. La

concentration moyenne en leucocytes est de 3,98 K/µl [2,4-5,5]. La concentration moyenne en

thrombocytes est 165 K/µl [120-198], celle en PNN est de 1585/µl [378-2145]. Le cas clinique

n°6 n’a pas été pris en compte dans cette moyenne, la vache ayant subi une épisiotomie qui

s’est infectée. De ce fait, sa numération formule est potentiellement modifiée.

Cas clinique à J0+3 :

La concentration moyenne en leucocytes est de 9,43 K/µl [7,5-12,3], celle en

thrombocytes est de 385 K/µl [275-532], celle en PNN est de 3835/µl de[1824-6397].

Cas suspects :

La concentration moyenne en leucocytes est de 7,85 K/µl [5,7-10,8], celle en

thrombocytes est de 386K/µl [266-651], celle en PNN est de 3664/µl [1968-6489]. Deux cas,

n°2 et n°24 ne sont pas compris dans cette moyenne, ils étaient en leucopénie, anémie et

thrombocytopénie.

79

Les cas d’avortements sont des cas suspects avec un fort taux de faux positifs attendu,

les résultats sont rassemblés dans le tableau n°VIII et présentés individuellement.

Cas témoins :

La concentration moyenne en leucocytes est de 8,1 K/µl [4,4-12,7], celle en

thrombocytes est de 291K/µl [142-462], celle en PNN est de 2850/µl [2349-6624]. Seul le cas

témoin n°14 présente une leucopénie, une thrombocytopénie et une neutropénie.

Tableau n°VIII : Résultats cyto-hématlogiques des cas d’avortements tardifs

Date 16/09/04 20/09/04 04/10/04 29/05/05 31/05/05 Âge (ans) 4 6,5 3 5 9

Globules blancs (N :5 à 10 K/µl)

9,8 6,8 8,8 2,2 6,5

Globules rouges (N :5 à 9 M/µl)

9,27 6,89 8,09 7,3 7,26

Plaquette (N :200 à 550

K/µl)

433 354 283 263 484

Protéines totales (g/l)

72 68 90 70 68

Eosinophiles (/µl)

5% (490)

13% (884)

0% 16% (352)

0%

Neutrophiles (/µl)

33% (3234)

17% (1156)

63% (5544)

27% (594)

28% (1820)

Lymphocytes (/µl)

60% (5880)

68% (4624)

36% (3168)

52% (1144)

69% (4420)

Monocytes (/µl)

2% (196)

2% (136)

1% (88)

5% (110)

3% (195)

Frottis (% PNN infecté

par morula)

N (Négatif)

N N N N

N : valeurs usuelles.

II.B.2) b) PCR

80

Toutes les PCR nichées réalisées au laboratoire de bactériologie de l’école vétérinaire

de Maison Alfort étaient négatives. Même les témoins positifs leur appartenant étaient négatifs

(Figure n°11). Par contre la PCR Ehrlichia large a révélé trois échantillons positifs.

Figure n°11.: Migration des PCR nichées

II.C discussion

Lors de notre étude, nous avons confirmé que la piroplasmose était plus fréquente que

l’ehrlichiose 18 cas contre 5 de septembre 2004 à juin 2005 (A. Rebaud, communication

personelle). Cependant, trois nouveaux cas cliniques d’ehrlichiose ont été diagnostiqués en

2005 dans un élevage jusqu’alors indemne et 14 dans trois élevages en 2004. Sept élevages ont

été atteints ces cinq dernières années. Ce sont tous des élevages laitiers. Les animaux touchés

sont essentiellement des animaux de trois ans. La majorité des cas survient en juin et en

septembre chez des animaux en pâture, infestés de tiques. Aucun éleveur n’avait encore mis de

prophylaxie ni chimique ni mécanique en place. L’hyperthermie et la baisse brutale de la

production ont été les signes cliniques qui ont alerté les éleveurs. Cependant le diagnostic a

toujours été confirmé par cyto-hématologie. Les numérations et formules ont révélé une

leucopénie caractérisée par une neutropénie et des morulas ont été identifiées dans les

leucocytes. Cependant la PCR nichée n’a pas confirmé ces diagnostics.

81

Cette étude nous a d’abord permis de noter que les cas cliniques d’ehrlichiose

survenaient au printemps et en automne, essentiellement en juin et en septembre. Les

conditions d’hygrométrie et de température étaient alors en moyenne de 75% et de 22°C

d’après Météo France ce qui correspond aux conditions optimales de vie des tiques Ixodes

ricinus [11, 41]. Cela confirme que la transmission de A. phagocytophilum est liée aux tiques

et à leur présence [82].

En comparant nos résultats avec ceux de la répartition temporelle des cas de

piroplasmose sur une année (A. Rebaud, communication personelle), les cas d’ehrlichiose

apparaissent plus tardivement au printemps. La majorité des cas de piroplasmose a été

diagnostiquée en avril, soit 2 mois avant ceux d’ehrlichiose. Ce décalage pourrait être expliqué

par l’absence de passage transovarien de Anaplasma phagocytophilum chez les tiques [100].

Les larves, actives dès le début du printemps peuvent être porteuses de la piroplasmose et

transmettre la piroplasmose dès avril. Par contre les cas d’ehrlichiose apparaîtront lorsque les

nymphes seront contaminées[29].

Les cas d’ehrlichiose ont été diagnostiqués durant la période d’activité des tiques I.

ricinus mais aussi, comme nous allons le voir dans des biotopes à tiques. Les tiques I. ricinus

sont des acariens vivant dans les haies, les bosquets, les landes, les lisières de bois et de forêts

de feuillus [11, 41]. Tous les cas cliniques ont été découverts chez des animaux pâturant sur

des prés correspondant à cette description. Une relation directe existe donc entre l’apparition

des cas cliniques et la présence de prés au biotope caractéristique des tiques. Ce constat est

renforcé par l’analyse de l’élevage E. L’éleveur n’avait jamais eu de cas d’ehrlichiose jusqu’à

l’acquisition d’un nouveau pré en 2004. Le biotope de ce pré correspondait à celui des tiques

et il n’avait pas été débroussaillé depuis plusieurs années. Tous les cas ont été diagnostiqués 1

à 2 semaines après la mise en pâture sur ce pré. L’apparition des cas cliniques a été directement

liée à la présence des animaux sur ce pré au printemps. D’ailleurs, ces biotopes sont très

localisés [49] : dans l’élevage E, sur deux prés voisins infestés, les tiques ne transmettaient

l’ehrlichiose que dans un seul. Dans certains cas (A et B), l’ehrlichiose était même présente sur

la même parcelle d’une année sur l’autre, or il n’existe pas de passage d’Anaplasma

phagocytophilum trans-ovarien chez I. ricinus [100]. Ces constatations laissent supposer deux

choses. D’une part nous pouvons penser à l’implication de la faune sauvage dans la présence et

la répartition de l’ehrlichiose. Les tiques présentent se contamineraient lors de repas sanguins

sur les animaux sauvages puis infecteraient les bovins. L’ehrlichiose serait présente sur les

pâtures où des animaux sauvages sont passés. Cependant notre travail ne fait que le suggérer.

82

Des chevreuils, couverts de tiques, ont été retrouvés sur certains prés incriminés mais aucune

analyse, ni des tiques ni des chevreuils n’a pu être réalisée. Cependant, cette hypothèse,

désignant la faune sauvage comme réservoir a été étudiée et confirmée par divers auteurs [2,

49, 57, 58]. D’autre part nous pouvons penser que des tiques adultes contaminés ont passé

l’hiver. Pourtant les tiques adultes ne devraient pas résister au climat hivernal de la région des

Monts du Lyonnais [11].

Notre étude met en évidence des cas d’ehrlichiose tous les ans depuis 2001. Cependant

même si des cas ont été présents d’une année à l’autre dans un élevage (A et B) l’incidence

annuelle dans les élevages a diminué. Elle semble être stable en nombre d’élevages.

L’élevage A a rencontré 16 cas en 2001, l’année suivante seulement deux cas ont été

rapportés puis un au printemps 2005. Cependant ces trois derniers cas ont été rapportés par

l’éleveur, aucune confirmation n’a été demandée au laboratoire. L’éleveur a traité ces cas sur

présomption clinique avec succès. L’élevage B a rencontré 6 cas en 2001 et 4 cas en 2002,

depuis aucun cas n’a été diagnostiqué. Diverses raisons peuvent expliquer cette diminution

régulière de l’incidence : la prophylaxie hygiénique, la prophylaxie médicale et l’immunité de

prémunition.

Tout d’abord les éleveurs ont broyé les haies des prés incriminés. Ces mesures de

prophylaxie hygiénique ont diminué l’infestation des prés par les tiques. Cependant seuls les

élevages B, D, E et G ont mis cette prophylaxie en place. Par contre tous les troupeaux ont été

traités contre les tiques. Les élevages B, E et F ont mis en place une prophylaxie médicale avec

le Butox® alors que les autres ont utilisé la Versatrine® ou l’Arkofly®. Ces deux spécialités

n’ont pas d’AMM contre les tiques [28]. Ces produits sont spécialisés dans le traitement des

infestations par les mouches. L’incidence de l’ehrlichiose diminuant dans l’élevage C suite à la

seule utilisation de Versatrine® suggère que les mouches piqueuses pourraient intervenir dans

la transmission de cette maladie. Cette hypothèse a déjà été déjà évoquée dans la littérature

[104, 22].

Enfin une immunité de prémunition se met en place lors d’infections répétées par A.

phagocytophilum ce qui expliquerait aussi la diminution de l’incidence dans les élevages [53,

80, 105]. Nous l’avons d’ailleurs constaté lors de notre étude. Dans l’élevage F, seulement

deux animaux récemment achetés, naïfs, pâturant avec le reste du troupeau ont exprimé la

maladie. Aucun signe clinique n’ayant été observé sur les autres animaux du troupeau, ceux-ci

83

apparaissent résistants. Des sérologies de ces animaux auraient sans doute permis de confirmer

cette résistance acquise.

Dans notre étude, la diminution d’incidence semblerait liée à la mise en place d’une

prophylaxie sanitaire et hygiénique ainsi qu’à l’immunité de prémunition. Divers auteurs ont

montré que les jeunes bovins, de moins de 15 mois en race laitière étaient plus résistants à A.

phagocytophilum [49] : des signes cliniques ont très rarement été observés. Il paraît donc utile

de conseiller aux éleveurs de faire pâturer les génisses sur les prés incriminés pour diminuer

l’incidence. L’éleveur E a mis en place cette conduite d’élevage, depuis aucun cas d’ehrlichiose

n’a été rencontré. Les cas cliniques de l’élevage F suggèrent aussi d’être vigilant lors d’achats

et de recomposition de troupeaux. La réalisation de sérologies paraît utile pour éviter

d’incorporer un animal naïf dans un troupeau contaminé comme ça a été le cas. De plus il

faudrait éviter d’incorporer un animal infesté de tiques contaminées par A. phagocytophilum

dans un troupeau naïf.

Les vaches laitières de 3 ans ont été principalement affectées. Par contre aucune génisse

n’a été atteinte. Ceci est expliqué par l’immunité de prémunition et la résistance des jeunes de

moins de 15 mois [49]. Les animaux de 3 ans, nés dans un élevage contaminé, sembleraient

plus sensibles, ils ne bénéficieraient plus de la résistance des jeunes et pas encore de l’immunité

de prémunition. Pour les animaux naïfs, la première rencontre avec A. phagocytophilum définit

l’âge de contamination.

Bien que l’incidence au sein des élevages ait diminué, la prévalence globale sur la

clientèle augmente, de plus en plus d’élevages décrivent des cas d’ehrlichiose. Cette

augmentation de la prévalence globale pourrait être liée à trois choses. Premièrement, la

modification du climat entraînerait une modification de la répartition géographique des tiques

[49]. Deuxièmement, les vétérinaires praticiens ont été sensibilisés à cette maladie. Les

symptômes de l’ehrlichiose ainsi que son épidémiologie sont dorénavant connus. Le diagnostic

est plus aisé. Troisièmement, la faune sauvage contaminée par A. phagocytophilum pourrait

l’étendre aux bovins des prairies voisines de manière centrifuge, ce qui n’est pas démontré dans

notre étude où les prés contaminés sont identiques d’une année sur l’autre.

Les signes cliniques, les plus fréquemment rencontrés lors de notre étude,

correspondent à la bibliographie [85]. L’hyperthermie (>40°C) et une chute brutale de la

production laitière sont les signes d’appel des éleveurs. Dans les élevages A, B et F un

84

syndrome grippal a été décrit, cependant des analyses laboratoires ont mis en évidence la

présence du virus RS dans les élevages A et B et de la bronchite vermineuse était suspectée

dans l’élevage F. Un syndrome grippal est classiquement décrit lors d’ehrlichiose [76]. Une

augmentation de la fréquence et de l’intensité des bruits respiratoires est souvent présente au

moment de l’hyperthermie et jusqu’à 2 à 14 jours après [76]. Cependant ces symptômes

peuvent être expliqués uniquement par la présence d’hyperthermie, ils ne sont pas

caractéristiques de l’ehrlichiose. Par contre, des bruits respiratoires surajoutés (sifflements et

crépitations) et une toux discrète caractéristiques d’une affection de l’appareil respiratoire sont

aussi décrits [76]. Ils apparaissent plus tardivement, 4 à 9 jours après l’apparition des premiers

signes cliniques [76]. Cependant l’ehrlichiose entraînant une diminution de l’immunité, une

surinfection pourrait être à l’origine de ces signes cliniques [76]. Lors de notre étude le

syndrome respiratoire n’a pas pu être observé fréquemment puisque tous les animaux ont été

traités dans les 48h suivant l’apparition des premiers signes cliniques excepté dans les élevages

A et B, où des analyses laboratoires ont mis en évidence le virus RS. Une atteinte de l’appareil

respiratoire est classiquement décrite lors d’ehrlichiose cependant lors de notre étude, ce

syndrome respiratoire n’a pas pu être relié uniquement à A. phagocytophilum.

Dans un seul des cas diagnostiqués, un engorgement des paturons a été observé. La

fréquence d’apparition de ce signe considéré comme caractéristique [43] est donc faible dans

notre étude. Le surnom de « Fièvre des pâtures » apparaît plus approprié que « maladie des

gros paturons ». Quant aux avortements, aucun n’a pu être rattaché à l’ehrlichiose lors de

notre étude. Une vache, âgée de 5 ans, avait une leucopénie dont une neutropénie importante

mais les examens complémentaires n’ont pas confirmé l’infection par l’ehrlichiose. De plus cet

animal était issu d’un élevage dans lequel de la fièvre Q avait été diagnostiquée et confirmée

par le laboratoire. Les avortements sont vraisemblablement liés à l’hyperthermie, lorsque

l’avortement est signalé le pic d’hyperthermie et donc d’infestation est passé. A.

phagocytophilum est difficilement observable dans les leucocytes, la PCR aurait alors été très

utile. Cependant dans la littérature des cas d’avortements dus à A. phagocytophilum ont été

décrits [51].

Les animaux touchés étaient des vaches laitières de 3 ans en moyenne en pâture où des

tiques étaient présentes. Toutefois notre étude a été menée dans une clientèle exclusivement

laitière. Malgré tout dans une clientèle mixte on constate que cette maladie est plus

fréquemment rencontrée chez les bovins laitiers, sans doute parce qu’ils sont plus surveillés. Ils

sont vus régulièrement lors de la traite et leur production est très contrôlée. Aussi, en cas de

85

chute brutale de cette dernière, l’animal atteint est vite détecté. Quant aux bovins allaitants,

élevés de manière plus extensive et donc moins surveillée qu’en élevage laitier, leurs

symptômes pourraient passer souvent inaperçus. Quelques cas sévères ont été toutefois

diagnostiqués [9].

Les pertes économiques engendrées n’ont pas été trop importantes. Le traitement à

base de tétracycline longue action était de 13 cts d’euro le ml. De plus la lactation est

redevenue normale 3 jours après l’épisode clinique et les éleveurs ont tous atteint leur quota

malgré la baisse de production. Par contre l’élevage A a rencontré des problèmes de fécondité

liés à l’hyperthermie.

L’ehrlichiose peut donc être suspectée chez les vaches laitières en herbage lors de pic

d’hyperthermie et de chute brutale de la production, lorsque des tiques sont présentes. Pour

confirmer le diagnostic, des examens complémentaires sont à notre disposition, la cyto-

hématologie et la PCR. Aucune sérologie n’a été réalisée dans notre étude, elle aurait

cependant eu son intérêt (cf supra), notamment dans les cas d’avortement. Une leucopénie

avec une neutropénie a été observée chez tous les animaux diagnostiqués positifs par la

cytologie. Dans 3 cas sur 4 une thrombocytopénie et une lymphopénie les accompagnaient.

Pour un seul cas suspect, où le pourcentage de polynucléaires neutrophiles infectés est faible

(fin de bactériémie), une leucocytose est alors présente. Cependant elle pourrait être expliquée

par une épisiotomie faite au vêlage 15 jours auparavant, et qui s’est infectée. Lors

d’ehrlichiose, la leucopénie se caractérise par une lymphopénie, suivie d’une neutropénie et

d’une éosinopénie. Alors que le nombre de lymphocytes redevient normal quelques jours après

le début de la phase clinique, le nombre d’éosinophiles et de neutrophiles continue de diminuer

jusqu’ au 21ème jour post-infection [78]. Le nombre de thrombocytes est aussi modifié. La

thrombopénie débute avant l’identification microscopique d’inclusions mais disparaît avant le

21ème jour post-infection [78].

Des cas suspects avec une leucopénie et une thrombocytopénie ont été répertoriés,

mais le diagnostic cytologique était négatif. La numération formule n’est pas un examen

spécifique, elle oriente le diagnostic lors de suspicion clinique mais le frottis ou la PCR sont

indispensables.

86

Dans la majorité des cas (3 sur 4) à J0+3, 3 jours après le traitement, la clinique, la

numération formule et le frottis ne présentaient plus d’anomalie. Seul un cas présentait encore

2% de PNN infectés par des morulas alors que les signes cliniques avaient disparu. Les

inclusions sont trouvées simultanément à l’apparition des signes cliniques, néanmoins elles

peuvent persister 6 jours après leur disparition [78].

Le frottis est une technique aisée à mettre en place, peu onéreuse, avec un résultat

immédiat. Avec un peu de pratique, les morulas se reconnaissent facilement, par contre

l’observation des corps élémentaires est plus difficile, de nombreux artéfacts cytoplasmiques

existant limitent la spécificité de leur analyse [23]. De plus en début et en fin d’infection, le

nombre de neutrophiles infectés diminuent, la lecture du frottis devient plus délicate. Cette

technique est alors moins sensible [78].

Quant aux résultats par PCR nichée, tous les échantillons diagnostiqués positifs par

cytologie ont été négatifs. Les témoins positifs étaient également négatifs. Il s’agissait

vraisemblablement d’un échec de la technique. Pourtant cette technique de PCR nichée avait

déjà été utilisée au laboratoire de l’ENVA dans l’année et est la technique de référence [61,

62]. L’échec pouvait être dû à un défaut ou une mauvaise conservation des amorces ou de la

Taq polymérase ou à la présence d’un inhibiteur. Bien que cette technique soit plus sensible

que la cytologie, elle est délicate à réaliser. La PCR non-spécifique a confirmé 3 cas cliniques

seulement. Un problème de dilution serait potentiellement à l’origine des non résultats (H.J.

Boulouis comm. Pers.). Cependant, la même Taq polymérase a été utilisée pour les deux PCR.

Les amorces et les inhibiteurs ont donc été mis en cause dans l’échec de la PCR nichée.

Les non résultats des PCR nous empêchent de discuter des cas d’avortements, des cas suspects

et du cas témoin dont la numération formule était douteuse et la cytologie négative.

La PCR est une technique plus sensible que la cytologie mais elle doit être réalisée dans

un laboratoire la pratiquant en routine. De plus les résultats ont été obtenus en 2 jours. La

cyto-hématologie nous semble donc plus adaptée au diagnostic de l’ehrlichiose que la PCR

nichée. Elle est rapidement mise en place et à moindres frais.

87

88

89

ANNEXES

90

91

Annexe n°1

CY

CLE

BIO

LOG

IQU

E D

’ IX

OD

ES

R

ICIN

US

92

Annexe n°2

DUREE DES DIFFERENTES PHASES DU CYCLE.

93

Annexe n°3

MODE D’INVASION ET DE DEVELOPPEMENT INTRACELLULAIRE D’A. PHAGOCYTOPHILUM

1- Séquence de l’adhésion et de l’invasion d’une culture de cellules de tiques par l’agent de

HGE

Bars, 0,2 µm

A : t0 + 1 heure (t0 = ajout des bactéries dans la culture cellulaire) ; on peut voir Anaplasma phagocytophilum condensé avec une membrane ondulante, attaché à la cellule de la tique. On remarque l’étroit contact avec la membrane cellulaire (cellule de la tique) indiqué par les flèches. B : t0 + 2 heures : la membrane cellulaire de l’ Anaplasma phagocytophilum attachée s’est étalée sur celle de la tique hôte (flèches). C : t0 + 4 heures ; l’ Anaplasma phagocytophilum rentre dans la cellule hôte par un processus ressemblant à la phagocytose. On remarque la présence d’une lèvre cytoplasmique en prévision de l’internalisation de l’Anaplasma phagocytophilum. Les flèches et les pointes indiquent les points d’adhésion entre la cellule et l’Anaplasma. D : l’Anaplasma est complètement internalisée. Les flèches indiquent les points d’attachement initiaux qui ont apparemment été préservés dans l’endosome.

94

2- Réplication de l’agent de l’HGE dans des cellules de tiques (in vitro)

A : t0 + 4 heures ; Anaplasma phagocytophilum seul est enfermé dans l’endosome, Bar, 0,4 µm B : t0 + 8 heures ; sa membrane cellulaire paraît repliée, il se peut que ce soit les premières marques de la division Bar, 0,4 µm. C : t0 + 12 heures ; la division a commencé, conduisant à l’apparition de petites morula (flèches). Bar, 1 µm. D : t0 + 48 heures ; l’endosome est distendu, il contient un grand nombre de bactéries. Bar, 2 µm.

95

3-Dernière forme de développement de l’agent de l’HGE dans une culture de cellules de tiques

A : t0 = 72 heures ; les cellules de tiques contiennent de larges endosomes plus ou moins remplis d’ Anaplasma phagocytophilum pléomorphiques. Bar, 1 µm. B : Agrandissement de la fenêtre présente sur l’image A Les Anaplasma phagocytophilum proches de la périphérie des endosomes semblent avoir des contacts étroits avec ceux-ci. Bar, 0,2 µm. C : t0 + 96 heures, sur les cultures les plus anciennes, on peut voir des zones plus sombres, celles-ci correspondent à des organismes condensés. Il y a donc coexistence de formes non-condensées et condensées d’Anaplasma phagocytophilum dans les colonies. Bar, 1 µm. D : Dans certaines cellules de tiques, ces colonies deviennent compactes, les bactéries ne peuvent plus être individuellement délimitées. Bar, 0,2 µm.

96

Annexe n°4

QUESTIONNAIRE DE SELLECTION DES ELEVEURS

Nom : Adresse : Tel : Possédez-vous des prés en lisière de bois ou des prés infestés de tiques ?

Traitez-vouz contre les tiques ?

Si oui, de quelles manières ? Produits et fréquence :

Parcelles traitées : Avez-vous déjà fait des injections de carbésia en prévention ou en traitement ? Avez-vous déjà rencontré des cas de syndromes grippaux et/ou d’hyperthermie réfractaires aux traitements antibiotiques de base et récidivant ? Si oui, a-t-il été diagnostiqué une maladie ? Avez-vous déjà rencontré des cas de Piroplasmose ou d’Ehrlichiose ? Me permettez-vous de vous contacter pour plus d’informations (dans l’éventualité de réalisation de prélèvements) ? Nous vous remercions d’avance de votre participation dans la réalisation de nos thèses de doctorat vétérinaire.

97

Annexe n°5

QUESTIONNAIRE DE L’ENQUETE EPIDEMIO-CLINIQUE

Date : Nom de l’éleveur : Adresse :

Présentation de l’élevage : Type de production Pourcentage (ou proportions) Lait □ Viande □ Mixte □ Races Proportions Holstein □ Montbéliarde □ Charolaise □ Limousine □ Autre □ ……….. Niveau de production : quota ou production moyenne par vache laitière et par an : ……. Effectifs Génisses de moins d’1 an : … Génisses de plus d’1 an : … Vaches : … Taureaux : … Taurillons : … Nombre total d’animaux : …

A propos de l’ehrlichiose et de la piroplasmose Avez-vous déjà eu des cas de piroplasmose ? oui □ non □ d'ehrlichiose ? oui □ non □ Si oui, à quelles périodes de l’année ? J F M A M J J A S O N D Avez-vous eu des cas… cette année □ depuis moins de 5 ans □ il y a plus de 5 ans □ Par rapport à 2003, les cas sont : plus fréquents □ moins fréquents □ aussi fréquents □. En 2003 les cas sont survenus aux mêmes périodes que d’habitude ? oui □ non □ Si non, à quelles périodes ? J F M A M J J A S O N D

98

Environnement dans lequel sont apparus les cas : Pâtures Effectuez-vous une rotation des pâturages pour les vaches ? oui □ non □ pour les génisses ? oui □ non □ Avez-vous un (des)pré (s) infesté(s) de tiques (poux de bois, plombs) ? oui □ non □ Les animaux malades ont-ils souvent pâturé sur la même parcelle ? oui □ non □ Les pâtures sur lesquelles apparaissent les cas sont-elles permanentes ? □ temporaires ? □ Proximité d’un bois/forêt (<250 m) oui □ non □ Type de végétation en bordure de parcelle : chêne □ frêne □ noisetiers □ hêtres □ ronces □ arbustes, buissons □ autre □: …………. Epaisseur de la végétation en bordure de parcelle : rien □ discontinu □ >2m □ Présence d’eau sur la parcelle oui □ non □ Pâture achetée récemment oui □ non □ Si oui, à qui l’avez-vous achetée ? Effectuez-vous des échanges ou des prêts de pâtures ? oui □ non □ Comment sont ces pâtures ? Quels animaux vont dessus ? Chasse Chassez-vous ? oui □ non □ Si vous avez des chiens, les achetez-vous ? oui □ non □ Où ? Prêtez-vous ou louez-vous des prés pour le passage des chasseurs ? oui □ non □ Faune sauvage Voyez-vous des animaux sauvages dans vos pâtures ? oui □ non □ Si oui, lesquels ? chevreuils □ cerfs □ rongeurs □ autres □: ……..

Conduite du troupeau Date de mise en pâture selon les lots Prairie permanente Prairie cultivée Génisses de 1ère saison : ……. □ □ Génisses de 2ème saison : ……. □ □ Vaches : ……. □ □

Prophylaxie : -Entretien des pâtures -Traitement contre les tiques oui □ non □ Quand et sur quels animaux ? -Traitement contre les mouches oui □ non □ Quand et sur quels animaux ? -Carbésia en préventif oui □ non □ Quand et sur quels animaux ?

99

Cas cliniques Nombre de cas en 2004 : … Type d’animaux atteints (génisse, VL, vache tarie) et âge : Nombre de cas en 2003 : Type d’animaux/âge : Nombre de cas les années précédentes si pas de cas ces dernières années : Y a-t-il des mouvements d’animaux entre votre exploitation et d’autres ? oui □ non □ Si oui, de quel type ? entrée d’animaux sortie d’animaux Mise en pâture (pension) □ □ Concours □ □ Prêt □ □ Achat □ Les cas cliniques surviennent-ils plutôt sur ces animaux ? oui □ non □ Dans le cas d’animaux qui sortent d’une exploitation et qui sont atteints, de chez quel éleveur proviennent-ils ?

Pour vous quels sont les signes d’appel ? (symptômes numérotés par ordre d’importance)

Piroplasmose Ehrlichiose Anorexie Appétit capricieux Abattement Abattement Hyperthermie Hyperthermie Urines rouges Mousse

Engorgement des pâturons

Anémie Syndrome grippal : Ictère Toux sèche en été Constipation Toux sèche en hiver Diarrhée en jet avec anus serré (en trou de serrure)

Polypnée (Respiration rapide)

Inrumination Jetage nasal Météorisation Baisse de production Baisse de production Troubles nerveux et locomoteurs

Démarche ébrieuse

Autres symptômes :

Traitement :

100

Annexe n°6

LES SYMPTOMES DE L’EHRLICHIOSE

SYMPTOMES CAS 1 CAS 2 …

Appétit capricieux

Hyperthermie

39,5/41°C

Abattement/Asthénie

Agalaxie Partielle /Baisse de

production

Démarche ébrieuse

Engorgement des paturons

Syndrome grippal :

-Toux sèche

(facilement déclenchée par

palpation)

-Polypnée

- Râle sifflant expiratoire

- Jetage nasal

101

Annexe n°7

DOCUMENT ACCOMPAGNANT LES PRELEVEMENTS FAIRE UNE PRISE DE SANG A LA JUGULAIRE SUR UN TUBE EDTA ET UN TUBE

SEC

Coordonnées de l’éleveur

Nom Prénom : Adresse :

Identification de l’animal

Numéro : Age : Statut physiologique :

Symptômes :

Mettre une croix si le symptôme est présent.

Piroplasmose

Ehrlichiose

Anorexie Appétit capricieux Abattement Abattement/asthénie Hyperthermie Hyperthermie Hémoglobinurie Urine avec mousse

Engorgement des pâturons

Anémie Syndrome grippal : Ictère Toux sèche Constipation Polypnée Diarrhée en jet avec anus spasmé Bruits pulmonaires préciser si possible

Inrumination Jetage Météorisation Baisse de la production Baisse de la production Troubles nerveux et locomoteurs Démarche ébrieuse Avortement Avortement Autres symptômes :

Nom ou initiales du praticien :

102

Annexe n°8

103

104

105

BIBLIOGRAPHIE

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NOM PRENOM : CARLONE MARYLINE TITRE : Etude épidémiologique de l’ehrlichiose granulocytique bovine dans une clientèle des Monts du Lyonnais Thèse Vétérinaire : Lyon , 18 Octobre 2005

RESUME : Classiquement rencontrée en Bretagne, l’ehrlichiose granulocytique bovine est une maladie émergente dans les Monts du Lyonnais. Elle est due à une arborickettsie récemment reclassée, Anaplasma phagocytophilum biovar phagocytophilum. Nous avons réalisé dans les Monts du Lyonnais une étude épidémio-clinique sur cette affection. À cette occasion, nous avons pu observé les différentes caractéristiques suivantes, qui sont habituellement décrites :Transmise par les tiques telles que Ixodes ricinus, cette affection atteint les bovins adultes en pâtures boisées et humides, durant les périodes d’automne et de printemps. Les signes cliniques sont généralement frustres avec une hyperthermie (40°C), de l’apathie, une baisse de la production laitière, et parfois, un syndrome respiratoire et un engorgement des pâturons. Bien que cette bactérie présente de nombreuses similitudes avec l’agent de l’ehrlichiose granulocytique humaine, l’hypothèse d’une zoonose n’est pour l’instant pas validée. Nous avons également tenté de préciser les examens complémentaires nécessaires à privilégier pour le diagnostic. la cytologie, appuyée par une analyse de numération-formule sanguine, et la PCR ont été confrontées quant à leur intérêt respectif pour le diagnostic de l’ehrlichiose. La cytologie semble plus adaptée en permettant un diagnostic rapide et peu onéreux en dépit d’une sensibilité inférieure. MOTS CLES : - Bovin

- Ehrlichiose - Anaplasma phagocytophilum - Tiques

JURY :

Président : Monsieur le Professeur PEYRAMOND 1er Assesseur : Madame le Professeur ARCIANGIOLI 2ème Assesseur : Madame le Professeur CALLAIT CARDINAL

DATE DE SOUTENANCE :

18 Octobre 2005

ADRESSE DE L’AUTEUR : 4 rue de la Galerie

71670 LE BREUIL