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VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON

Année 2014 - Thèse n°

ETUDE DU SYSTEME IMMUNITAIRE DE LA TORTUE

CAOUANNE (CARETTA CARETTA) : UTILISATION COMME

OUTIL DIAGNOSTIQUE ET INDICATEUR DE TOXICITE

DES POLYCHLOROBIPHENYLES (PCBs)

THESE

Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I

(Médecine - Pharmacie)

et soutenue publiquement le 28 Novembre 2014

pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire

par

ROUSSELET-RUSSO Estelle

Née le 8 Février 1981

à Grenoble

5

REMERCIEMENTS

À Monsieur le Professeur Frédéric BERARD De la Faculté de Médecine de Lyon,

Qui m’a fait l’honneur d’accepter la Présidence de ce jury de thèse, Mes hommages respectueux.

À Monsieur le Professeur Michel PEPIN De VetAgro Sup,

Pour avoir accepté d’encadrer ce sujet de thèse, Qu’il voit ici le témoignage de ma sincère reconnaissance et de mon

respect le plus profond.

À Monsieur le Professeur Philippe BERNY De VetAgro Sup,

Qui a eu la gentillesse d’accepter de participer à ce jury de thèse Qu’il trouve ici l’expression de ma gratitude.

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REMERCIEMENTS

Je tiens à remercier mes co-auteurs :

Aux docteurs Joseph Flanagan, Maryanne Tocidlowski,

Mmes Erika Ghebard, Kara LaVictoire, le personnel de NOAA Fisheries à

Galveston

Au Docteur Céline Godard-Codding pour avoir initier le projet à mes côtés et

m’avoir accorder sa confiance,

A Mr Benjamin Higgins, pour m’avoir accueilli à bras ouvert, et sans qui ce

projet n’aurait jamais vu le jour,

Aux Docteurs Sylvain DeGuise et Milton Levin, pour leur aide tant logistique

que morale, pour leur confiance, leurs conseils avisés et nos longues

discussions,

Au Docteur Nicole Stacy, mon mentor, mon guide, mon amie, sans qui la

compréhension de l’interprétation de la pathologie clinique des reptiles aurait

été complexe,

Au Docteur Terry Norton, pour sa patience, sa confiance, pour son partage, ce

qu’il m’a transmis et me transmet.

Au Docteur Nancy Mettee, qui sans me connaître a accepté de faire partie du

projet.

Pour toutes les personnes merveilleuses qui m’ont aidé de près ou de loin dans ce projet.

9

TABLE DES MATIERES

TABLE DES ILLUSTRATIONS………………………………………………………………………………...13

INDEX DES ABREVIATIONS…………………………………………………………………………………..15

INTRODUCTION…………………………………………………………………………………………………...17

PARTIE 1 : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

I. Histoire naturelle de la tortue caouanne………………………….22

A. Diagnose d’espèce……………………………………………………....22

B. Répartition et habitat…………………………………………………….25

1. Répartition………………………………………………………….25

2. Habitat……………………………………………………………...27

C. Biologie………………………………………………………………….30

1. Les femelles sexuellement matures………………………………...30

2. Les nouveau-nés……………………………………………………31

3. Les juvéniles………………………………………………………..31

4. Adultes néritiques ou océaniques…………………………………..32

II. Menaces et protections……………………………………………32

A. Menaces anthropiques…………………………………………………..33

1. Menaces terrestres………………………………………………….33

2. Menaces marines…………………………………………………...34

B. Statut et protection ……………………………………………………...36

III. Le système immunitaire………………………………………….37

A. Le système hématopoïétique des reptiles……………………………….37

B. Les organes lymphoïdes des reptiles……………………………………38

1. La moelle osseuse…………………………………………………..38

2. Le thymus…………………………………………………………..39

a. Anatomie………………………………………………………...39

b. L’involution thymique……………….…………………………..41

3. La rate……………………………...……………………………….41

a. Anatomie…………………………………….…………………..41

b. Fonction de la rate……………………………………………….43

4. Agrégations lymphoïdes et structures lymphoïdes accessoires…….43

a. Le tissu lymphoïde associé aux intestins………………………...44

b. Les nœuds lymphatiques et autres structures lymphoïdes………44

C. Le système immunitaire…………………………………………………44

1. Les mécanismes de défense innée………………………………….46

a. Revêtements cutanés et muqueux……………………………….46

b. Les facteurs humoraux non spécifiques…………….…...………46

10

c. Les facteurs cellulaires non spécifiques………………………...48

2. Les mécanismes de défense spécifique…….……………...……….54

a. Les lymphocytes………………………………………….……..54

b. Les lymphocytes B et T des reptiles……………………….……58

c. Les immunoglobulines……………………….………………….61

d. La réponse immunitaire à médiation cellulaire…………...……..63

3. Récapitulatif des tests pouvant être utilisés………………………...65

4. La mémoire immunitaire chez les reptiles…………………………66

5. Facteurs de variation de la réponse immune……………………….66

a. La température…………………………………………………..66

b. La saison et les hormones……….………………………………67

IV. Toxicité des Polychlorobiphényles chez la tortue marine………..70

A. Les polychlorobiphényles (PCBs)…………………………………….70

1. Histoire naturelle des polychlorobiphényles……………………….70

2. Toxicité des PCBs : généralités…………………………………….72

3. Effets biologiques des PCBs chez les tortues………………………73

a. Les voies d’entrée……………………………………………….73

b. Excrétion du sel : les glandes à sel……………………………...74

c. Toxicité sur les embryons……………………………………….76

d. Contamination et marqueurs d’exposition………………………77

4. Effets des PCBs sur le système immunitaire……………………….79

a. Généralités………………………………………………………79

b. Les tortues marines……………………………………………...80

B. Les outils d’étude………………………………………………………..82

1. L’hématologie et la biochimie……………………………………...82

2. L’immunité innée…………………………………………………..82

3. L’immunité acquise………………………………………………...83

V. Conclusion partielle…………………………………………………84

PARTIE 2 : ETUDE EXPERIMENTALE

I. Matériel et méthodes………………………………………………86

A. Sujets d’étude et conditions de captivité………………………………..86

B. Prélèvement de sang chez les tortues marines………………………….88

C. Analyse sanguine hématologique et biochimique……………………….89

D. Fonctionnalité du système immunitaire…………………………………91

1. Isolement des cellules sanguines mononuclées…………………….91

2. Prolifération lymphocytaire………………………………………...91

3. Activité NK cellule tueuse naturelle avec et sans PCBs…………...92

4. Isolement des sous populations de cellules leucocytaires………….93

5. Tri cellulaire et caractérisation morphologique……………………94

11

6. Phagocytose avec et sans PCBs……………………………………94

7. Explosion respiratoire……………………………………………...95

8. Préparation des PCBs………………………………………………95

E. Analyse statistique………………………………………………………96

1. Etude des paramètres hématologiques et biochimiques……………96

2. Etude du système immunitaire avec et sans PCBs…………………96

II. Paramètres hématologiques et biochimiques……………………..97

A. Résultats…………………………………………………………………97

1. Morphométrie et hématologie……………………………………....97

2. Biochimie plasmatique…………………………………………....102

B. Discussion……………………………………………………………...111

1. Hématologie………………………………………………………111

2. Biochimie plasmatique……………………………………………117

III. Evaluation du système immunitaire d’un point de vue

fonctionnel…………………………………………………….....123

A. Résultats………………………………………………………………123

1. Profils obtenus en cytomètre de flux et caractérisation

morphologique des leucocytes du sang périphérique……………..123

2. Le système immunitaire inné des tortues caouannes……………..126

a. La phagocytose…………………………………………………126

b. L’explosion respiratoire…………………………………….......127

c. L’activité des cellules tueuses naturelles……………………….128

3. Réponse des lymphocytes de tortue caouanne à une stimulation…129

B. Discussion……………………………………………………………...130

1. Fonctions du système immunitaire inné chez les tortues

caouannes………………………………………………………….131

2. La prolifération lymphocytaire……………………………………133

C. Conclusion……………………………………………………………...134

IV. Modulation du système immunitaire inné par les PCBs………...136

A. Résultats………………………………………………………………..136

1. Effets des PCBs 105 et 138 sur la phagocytose…………………...136

2. Effets des PCBs 105, 138 et 169 sur l’activité NK………………..138

B. Discussion………………………………………………………………139

CONCLUSION……………………………………………………………………………………………………….143

BIBLIOGRAPHIE…………………………………………………………………………………………………..145

ANNEXES…………………………………………………………………………………………………………….163

Annexe 1 : Nomenclature IUPAC des PCBs…………………………………………………163

Annexe 2 : Article 1 : J. Zoo. Wild.Med. 2013. 44(4), 859-874………………………164

12

Annexe 3 : Article 2 : Vet. Immunol. Immunupathol. 2013. 56 (1-2) 43-53

………………………………………………………………………..…………………………….165

Annexe 4 : Article 3 : Short communication (non publiée)…………………………..166

Annexe 5 : Poster Morris animal Foundation, Vet Student scholar Combined

hematology and immunology : a breakthrough to understand immune

functions of stranded sea turtles……………………………………………………..171

13

TABLE DES ILLUSTRATIONS

LISTE DES FIGURES

Figure 1. Identification des espèces de tortue marine (D'après NMFS/SEFSC)……..23

Figure 2. Mesures de la carapace…………………………………………………….24

Figure 3. Répartition mondiale de la population de tortue caouanne. 2009………….26

Figure 4. Répartition mondiale des sites de nidification de la tortue caouane. 2008...26

Figure 5. Cycle de vie de la tortue caouanne………………………………………...28

Figure 6. Tortue luth adulte prise dans les filets et échouée

(Crédit Aquarium La Rochelle)……………………………………………...35

Figure 7. Turtle Excluder Device, filet permettant la fuite des tortues………………37

Figure 8. Thymus de tortue verte (Chelonia mydas) en position anatomique……….40

Figure 9. Coupes histologiques de thymus de tortue caouanne (Caretta caretta) riche

ou non en tissu lymphoïde……………………….……………...……………40

Figure 10. Structure histologique de splénopancréas de crotale (Crotalus viridis)….41

Figure 11. Structure histologique de rate de tortue caouanne (Caretta caretta)……..43

Figure 12. Photomicrographies des monocytes de testudinidae, réactifs ou non…….49

Figure 13. Photomicrographies d’hétérophiles de reptiles, réactifs ou non………….52

Figure 14. Photomicrographies d’éosinophiles de reptiles, réactifs ou non………….54

Figure 15. Immunité adaptative…………………...…………….…………………...58

Figure 16. Réponse immunitaire en réponse à une infection virale………………….58

Figure 17. Photomicrographie de lymphocyte de boa constrictor…………………...59

Figure 18. Structure générale des polychlorobiphényles…………………………….71

Figure 19. Voies d’entrée et conséquance d’exposition aux toxiques……………….74

Figure 20. Glandes à sel de tortue caouanne (Caretta caretta)………………………75

Figure 21. Prise de sang réalisée dans le sinus cervical dorsal sur une tortue caouanne

juvénile……………………………………………………………………….88

Figure 22. Lecture du PCV (Packed cell volume) comme estimation de l’hématocrite.

……………………………………………………………………………….90

Figure 23. Corrélation entre le poids et la longueur de carapace (SCL) pour les 5

classes d’âge de tortues caouannes…………………………………………...97

Figure 24. Représentation sous forme de boxplots de certains paramètres

hématologiques et biochimiques de la tortue caouanne…………………….101

14

Figure 25. Photomicrographies de cellules sanguines de tortue caouanne

juvénile.……………………………………………………………………...102

Figure 26. Profils de cytométrie de flux et examen cytologique du gradient de

Ficoll….……………………………………………………………………..123

Figure 27. Gradients de Percoll discontinus obtenus après centrifugation………….125

Figure 28. Profils de cytométrie de flux et examen cytologique des gradients de

Percoll……………………………………………………………………….125

Figure 29. Profils de cytométrie de flux et phagocytose associée…………………..127

Figure 30. Explosion respiratoire des leucocytes de tortues caouannes…………….128

Figure 31. Activité cellules tueuses naturelles (NK) des tortues caouannes………..129

Figure 32. Prolifération lymphocytaire consécutive à l’exposition aux mitogènes....130

Figure 33. Profils de cytométrie de flux et activité phagocytaire en présence

du PCB-105………………………………………………………………….137

Figure 34. Activité phagocytaire et effets du PCB-138……………………………..137

Figure 35. Effets des concentrations croissantes du PCBs-105 et PCB-138 sur l’activité

cellules tueuses naturelles (NK)…………………………………...138

LISTE DES TABLEAUX

Tableau I : Concordance entre stade physiologique, localisation et taille de carapace…

……………………………………………………………………………..…25

Tableau II : Valeurs hématologiques publiées chez les reptiles……………………...60

Tableau III : Divers tests des fonctions du système immunitaire utilisés chez les

reptiles ainsi que leurs limites………………………………………………...65

Tableau IV: Paramètres hématologiques et morphométriques obtenus dans notre

étude…………………………………………………………………………..98

Tableau V: Analytes biochimiques obtenus dans notre étude……………………….105

Tableau VI: Synthèse des paramètres hématologiques et morphométriques de la

littérature…………………………………………………………………….113

Tableau VII: Synthèse des analytes biochimiques de la littérature………………….119

15

INDEX DES ABREVIATIONS

2-ME: 2-mercaptoéthanol

Ac: Anticorps

ANOVA: Analysis of Variance: Analyse de variance

BALT: Bronchus-associated lymphoïd tissue : tissu lymphoïde associé aux bronches

BrdU: 5-bromo-2'-deoxyuridine

CBC: Complete Blood Count ou hémogramme

CCL: Curved Carapace length= longueur courbe de la dossière

CITES ou Convention de Washington: Convention sur le commerce international des

espèces de faune et de flore sauvages menacées d'extinction

ConA : Concanavalin A : lectine extraite du haricot

CPA: Cellules Présentatrices d’Antigène

CR: CRitically endangered : espèce critique d’extinction

DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium : Milieu de culture pour cellules

mammifères

DMSO: Diméthylsulfoxide

DPS: Distinct Population Segments: Segment de population disctincte

ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay

EN: ENdangered : Espèce en Danger

FSC: Forward Scatter

FWS: Fish and Wildlife Service

GALT: Gut-associated lymphoïd tissue : tissu lymphoïde associé aux intestins

HEPES: acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique

HBSS: Hank's Balanced Salt Solution

Hct: Hématocrite

IUCN: Union internationale pour la conservation de la nature

K-562: lignée érythroleucémique humaine

LPS : Lipopolysaccharide

NMFS: National Marine Fisheries Service

NPS: Newborn Piglet serum: Sérum de porcelet

NOAA: National Oceanic and Atmospheric Administration

PALS: Periarteriolar lymphoid sheath: Gaines ou manchons lymphoïdes

périartériolaires

PAS: Periodic Acid Schiff

PBMC: Peripheral blood mononuclear cells: leucocytes mononuclés du sang

périphérique

PBS: Phosphate Buffered Saline: tampon phosphate salin

PCV: Packed cell Volume

16

PDB: phorbol 12,13-dibutyrate

PELS: manchon lymphoïde péri-ellipsoïdal

PFC: hemolysin plaque forming cell: plage de lyse

PHA : Phytohémagglutinine : lectine de haricot

PI: iodure de propidium

PMA: phorbol myristate-2 acétate-3

ppt: Part per trillion

PWM: pokeweed: Phytolacca Americana ou raisin d’Amérique

RPMI: Roswell Park Memorial Institute : Milieu de culture pour cellules mammifères

RRBC: Rat red blood cells: erythrocytes de rat

SCL: Straight carapace length: longueur en ligne droite de la carapace

SRBC: Sheep red blood cells: erythrocytes de mouton

SSC: Side scatter

STH: anti-Saitohin

TED: Turtle Excluder Device

TEF: Toxic Equivalent Factor

TEWG: Turtle Expert Working Group

Thy-1: THYmocyte differentiation antigen 1

TWBC: total white blood cell: Numération des leucocytes

VU: VUlnérable risque élevé d’extinction à l’état sauvage

YAC-1: lignée de lymphome murin

17

Introduction

Bien qu’animaux fascinants et chéris de l’opinion publique, empreints d’une forte

symbolique, les tortues marines n’en demeurent pas moins, plus que jamais, menacées

d’extinction. Il existe deux familles, les Dermochelyidae et les Cheloniidae (ordre des

Testudines). Les Cheloniidae sont des tortues à carapace dure, incluant la tortue

caouanne (Caretta caretta), la tortue verte (Chelonia mydas), la tortue imbriquée

(Eretmochelys imbricata), la tortue de Kemp (Lepidochelys kempii), la tortue olivâtre

(Lepidochelys olivacea) et la tortue à dos plat (Natator depressus) que l’on trouve

exclusivement dans les eaux australiennes. L’autre famille des Dermochelyidae est

constituée de la seule tortue luth (Dermochelys coriacea). Mis à part la tortue à dos

plat dont le statut n’est pas connu à ce jour, ces tortues marines figurent toutes sur la

liste rouge de l’IUCN où elles sont menacées d’extinction à des degrés variables.

Ainsi, par ordre croissant de gravité se trouvent la tortue olivâtre (VU), les tortues

vertes et caouannes (EN) et enfin les tortues de Kemp, imbriquées et luth (CR).

Parmi les dangers responsables de cette inéluctable déclin figurent la pêche, le

braconnage, la destruction des habitats et sites de ponte, la pollution qu’elle soit

chimique, biologique ou physique et le changement climatique (Hamman et al.,

2010). Des groupes d’experts (IUCN’s Marine Turtle Specialist Group) se réunissent

régulièrement pour établir les priorités de conservation et de recherche afin d’aboutir

à l’élaboration de stratégies d’action en vue de la préservation de ces espèces.

Décrié depuis de nombreuses années, voire des décennies, l’impact direct de la

pollution anthropogénique sur la santé et le déclin des populations n’est pas trivial. En

2010, un groupe d’étude s’est réuni afin de faire le point sur les connaissances

actuelles ; de toutes les formes de pollutions existantes, la pollution chimique et les

effets physiologiques provoqués par les contaminants sont les moins bien connus. La

difficulté est multiple : d’une part il est difficile d’identifier le toxique mis en cause

car ces animaux ont une longévité importante, parcourent les océans du globe et ce à

différents stades de leur vie ; par conséquent ils sont exposés à un vaste mélange de

polluants. D’autre part, les tortues marines sont protégées par la convention de

Washington (CITES) et figurent sur la liste rouge de l’IUCN ce qui exclut toute

18

possibilité d’expérimentation animale et nécessite l’utilisation de modèles cellulaires

soumise à l’obtention de permis fédéraux, notamment aux Etats-Unis.

Les concentrations de toxiques chimiques sont généralement mesurées à partir

de carcasses d’animaux échoués, d’échantillons de sang lors de campagnes

d’évaluation de la santé des animaux ou directement dans les œufs pondus saccagés.

Le lien entre le toxique chimique et son effet sur la santé de l’animal peut être

matérialisé grâce à l’étude du système immunitaire qui se révèle être à l’interface

entre l’environnement et l’animal. De façon très simplifiée et schématique, tout

dysfonctionnement ou défaillance du système immunitaire aura des répercussions sur

la santé de l’animal. L’étude du système immunitaire chez les reptiles en général et,

plus particulièrement les tortues marines, en est à ses prémices. De plus, face à

l’importance croissante de la conservation des espèces menacées associée à

l’implication des vétérinaires travaillant dans des centres de réhabilitation ou

aquariums, la recherche concernant la pathologie variée des tortues marines est

devenue nécessaire. Les animaux échoués requièrent une prise en charge médicale

spécifique afin d’aboutir à leur rétablissement. Actuellement les paramètres

hématologiques et biochimiques constituent des indicateurs pronostiques de premier

choix afin d’évaluer l’état de santé des animaux y compris lors d’exposition à des

polluants environnementaux (Deem et al. 2009, Casal et al. 2009). Cependant ils ne

permettent pas d’évaluer l’aspect fonctionnel du système immunitaire, ce qui

constituerait un outil diagnostique supplémentaire afin d’aboutir à la compréhension

de son fonctionnement chez les animaux affectés, et à plus long terme aboutir à

l’élaboration d’un traitement médical mieux adapté pour réhabiliter les animaux

échoués.

Ainsi, ce travail résulte d’une volonté d’allier plusieurs disciplines que sont la

toxicologie, l’immunologie et la pathologie de la tortue. Il se situe donc à l’interface

d’une problématique extrêmement complexe et a pour but le développement d’outils

et méthodes permettant l’évaluation de diverses fonctions du système immunitaire et

leur utilisation comme outils indispensables afin de mesurer l’impact des polluants

chimiques tels que les polychlorobiphényles.

Pour la réalisation de ce travail j’ai bénéficié d’une bourse de postdoctorat de

un an de la Fondation Rotary. Ce travail a été effectué aux Etats-Unis, à plusieurs

endroits et avec l’aide de nombreux collaborateurs : Dr Céline Godard-Codding (The

Institute of Environmental and Human Health, Texas Tech University, Lubbock, TX),

19

Drs Joseph Flanagan et Maryanne Tocidlowski (Houston Zoo), Dr Nicole Stacy

(University of Florida, College of Veterinary Medicine, Gainesville, FL), Drs Milton

Levin et Sylvain DeGuise (University of Connecticut, Storrs, CT), Mr Benjamain

Higgins (NMFS, NOAA, Galveston, TX).

Les tortues caouannes incluses dans l’étude sont des animaux du Sea Turtle

Facility, National Oceanic and Atmospheric Administration (NOAA) (Galveston, TX).

Ces animaux font partie de programmes de recherche, arrivent au centre alors qu’ils

ne sont encore qu’au stade d'embryons et sont relâchés lorsqu’ils atteignent une taille

convenable (généralement au bout de 5 ans).

Dans un premier temps, nous nous familiariserons avec la tortue caouanne,

son habitat et sa biologie, puis nous aborderons les menances auxquelles elles sont

soumises. Ensuite nous rentrerons dans le cœur du sujet en nous intéressant au

système immunitaire des reptiles en général et des chéloniens en particulier. Dans le

dernier chapitre dans cette partie bibliographique, nous traiterons des aspects

toxicologiques et des effets des polychlorobiphényles, polluants organiques

largements répandus et toujours d’actualité malgré son interdiction aux Eetats-Unis

en 1979.

En seconde partie nous nous intéresserons spécifiquement à la tortue caouanne

comme modèle d’étude. Cette partie se déclinera en trois volets :

1/ L’étude de la comparaison des paramètres hématologiques et biochimiques

de cinq classes d’âge de tortues juvéniles captives, afin de mieux appréhender l’état

de santé des animaux sur lesquels nous avons entrepris les études suivantes,

2/ L’étude des fonctions du système immunitaire de la tortue caouanne

juvénile et enfin,

3/ Les effets de PCBs sélectionnés sur certaines des fonctionnalités

précédemment décrites.

21

PARTIE 1

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

22

Partie 1: Etude Bibliographique

I. Histoire naturelle de la tortue caouanne

A. Diagnose d'espèce

Décrite par Linné en 1758 sous le nom de Testudo caretta, la tortue caouanne

(Caretta caretta) ou Loggerhead sea turtle en anglais est l’une des six espèces de

tortues de mer à carapace dure, formant la famille des Cheloniidés (Ordre des

Testudines). D’après les analyses génétiques il y aurait deux populations distinctes ;

celle d’Atlantique et celle de l’Indopacifique (Conant et al., 2009).

La tortue caouanne possède un bec et une tête plus grands que les autres

espèces de tortues marines. Sa tête est non rétractile. Chez l’adulte, la tête et la

dossière sont brun rougeâtre, les nageoires sont marron. Le dimorphisme sexuel est

apparent chez les individus adultes dont la longueur de la dossière dépasse 67 cm de

longueur mesurée en ligne droite (Dodd, 1988). Les mâles ont une queue très longue,

qui dépasse nettement le bord postérieur de la dossière ainsi que la présence d’une

griffe plus longue et plus courbée sur les nageoires. La carapace de l’adulte est

épaisse et fortement kératinisée. Elle est longue et cordiforme. Caractère important de

diagnose d’espèce, elle comprend 5 plaques osseuses vertébrales, habituellement 5

paires de plaques costales, 12 ou 13 paires de plaques marginales et une large plaque

nucale qui rejoint de part et d’autre les deux premières plaques costales (Fig. 1).

23

Figure 1. Identification des espèces de tortue marine (D'après NMFS/SEFSC)

24

Les mesures de la dossière s’effectuent de diverses manières. Ces considérations

seront utiles pour la suite de l’exposé (Fig. 2).

- Mesure curviligne de la dossière : CCL: Curve carapace length

- Mesure en ligne droite de la dossière : SCL: Straight carapace length

- SCL min

- SCL max

- SCL notch to tip : de l’encoche nucale à l’extrémité postérieure

Figure 2. Mesures de la carapace (SCL en bas à gauche et CCL en bas à droite, NMFS)

25

Les mesures de longueur de la dossière correspondent à chacun des cinq stades de

développement de la tortue caouanne telles que décrit par le Turtle Expert Working

Group (TEWG, 2009) et présentées dans le tableau ci-contre :

Tableau I : Concordance entre stade physiologique, localisation et taille de carapace.

Stade Stade

physiologique Localisation SCL

1 <1 an Terrestre à océanique 4,5 à 15 cm

2 Juvénile Océanique 15 à 63 cm

3 Juvénile Océaniques ou Néritiques,

petits juvéniles benthiques

41 à 82 cm, max 63 cm

dans l’Atlantique

4 Juvénile Océaniques ou Néritiques,

grands juvéniles benthiques 63 à 100 cm

5 Adulte Océaniques ou Néritiques 82 à 100 cm et plus

B. Répartition et habitat

1. Répartition

Les tortues caouannes sont largement répandues dans les eaux tempérées et

tropicales des océans Atlantique, Pacifique et Indien (Fig. 3). La plupart des tortues

caouannes nichent sur les côtes occidentales des océans Atlantique et Indien (Fig. 4),

les sites de nidification les plus importants se trouvant au sud de la Floride, Etats-Unis,

et dans l’île de Masirah, Oman, (Witherington et al., 2009). La limite nord de l’aire de

nidification de l’Atlantique en Amérique du Nord se trouve en Virginie ; la plus

grosse colonie nicheuse se trouve en Floride et regroupe 80% des activités de

nidification des populations de l’Atlantique (NMFS and USFWS 2007). Les tortues

caouannes du Pacifique Nord nichent presque exclusivement au Japon, dans l’est de

26

l’Australie et en Nouvelle-Calédonie (NMFS and USFWS, 2007). Il a été signalé

l’existence d’une aire de nidification de faible importance sur l’archipel Xisha, dans la

mer de Chine méridionale (Chan et al., 2007). Les trois principaux sites de ponte se

trouvent sur l’île Yakushima et sur les plages de Miyazaki et de Minabe, sur les îles

principales du Japon (Conant et al., 2009).

Figure 3. Répartition mondiale de la population de tortue caouanne. 2009 (D’après NMFS)

Figure 4. Répartition mondiale annuelle des sites de nidification (nesting females) de la tortue caouane.

2008 (D’après NMFS).

27

La tortue caouanne compte deux lignées qui ont divergé il y a environ trois

millions d’années. L’une vit dans les océans Pacifique et Indien et l’autre dans

l’Atlantique et la Méditerranée (Conant et al., 2009). Deux transferts matrilinéaires

sont survenus successivement il y a 250 000 et 12 000 ans ce qui a permis le maintien

des deux lignées au sein d’une espèce commune. Des études d’ADN mitochondrial

ont confirmé l’existence d’une forte structure de population au sein des colonies

nicheuses (Conant et al., 2009). Les populations du Pacifique et de l’Atlantique sont

génétiquement et géographiquement distinctes. Il existe à l’échelle mondiale neuf

DPS (Distinct Population Segments) représentant chacun une vaste portion de l’aire

de répartition de l’espèce et un écosystème unique (Conant et al., 2009). Cela tend à

appauvrir considérablement la diversité génétique de l’espèce. Les DPS sont répartis

par le Biological Review Team (BRT) dépêché par le biais du NMFS et FWS (Fish

and Wildlife Service) des Etats-Unis: Pacifique Nord, Pacifique Sud, Nord de l’océan

Indien, Sud-est de la région indo-Pacifique, Sud-ouest de l’océan indien, nord-ouest

de l’Atlantique, mer Méditerranée et Atlantique Sud.

2. Habitat

La tortue caouanne a besoin d’un habitat mixte à la fois terrestre, nécessaire à

la ponte, et marin. Toutefois elle passe la plus grande partie de sa vie en mer. Dès leur

éclosion, les petites tortues quittent les nids creusés sur des plages sableuses pour se

réfugier dans la mer. Les mâles ne reviendront plus jamais sur la terre ferme,

contrairement aux femelles qui y reviendront pour pondre leurs œufs. Les nids sont

habituellement creusés entre la ligne de marée haute et le front dunaire (Witherington

et al., 1986). Les œufs ont besoin d’un substrat très humide permettant un échange de

gaz suffisant ainsi qu'un maintien des températures propices à leur développement

(Miller et al., 2003). Les sites de nidification aus Etats-Unis s'étendent des côtes du

sud de la Virginie, Caroline du Sud, Caroline du Nord, Géorgie jusqu'en Floride. Il en

existe également de la côte mexicaine des Caraïbes, jusqu’en Guyane française, aux

Bahamas, dans les Petites Antilles et dans les Grandes Antilles (NMFS et USFWS,

2007 ; Conant et al., 2009 ; TEWG, 2009).

A chaque étape de son cycle correspond un habitat marin différent. Toutefois,

les changements d’habitat ne seraient pas permanents (Bolten et al., 2003 ; Conant et

28

al., 2009). Les tortues choisiraient individuellement leur habitat, épipélagique,

benthique ou les deux, en fonction de leurs besoins alimentaires (Fig. 5).

Figure 5. Cycle de vie de la tortue caouanne (Foley communication personnelle). Chaque étape

importante est associée à changement d’habitat lui-même lié à un besoin alimentaire spécifique. (1) La

femelle pond puis repart tout en restant près des côtes où la nourriture est abondante. Elle migre ensuite

en vue d’entamer sa migration de reproduction (5) puis son accouplement afin qu’un nouveau cycle

recommence. Elle restera environ 2 semaines près des côtes (6). Une fois les œufs éclos (2), les

nouveaux-nés entament leurs nages frénétiques, puis s’éloignent afin d’atteindre les eaux océaniques

(3). De nombreux aller-retour entre les eaux océaniques et néritiques se succèderont (4) jusqu’à

maturité sexuelle. Le devenir des mâles est peu connu.

Les tortues du nord-ouest de l’Atlantique fraîchement écloses se déplacent

vers le large et s’associent aux colonies dérivantes de sargasses (Witherington et al.,

2002). Elles se réfugient dans les eaux néritiques de la zone peu profonde située sur le

plateau continental ou sur le bord de ce plateau, où la profondeur de l’eau est

inférieure à 200m (Bolten et al., 2003), et gagnent ensuite les eaux océaniques plus

profondes. Dans les zones néritiques, les individus se situent dans des zones de 22 à

49 m de profondeur (Hopkins-Murphy et al., 2003). Les juvéniles restent fidèles à

leurs aires d’alimentation. Dans les zones océaniques, les tortues caouannes passent

75% de leur temps dans la couche supérieure à 5 m de la colonne d’eau (Bolten et al.,

29

2003). Ainsi, quatre-vingts pour cent de leurs plongées ne dépassent pas 5 m, les

autres s’échelonnant dans les 100 premiers mètres avec quelques rares incursions à

des profondeurs supérieurs à 200 m (Bolten et al., 2003). Les juvéniles migrent à

travers les océans, utilisant le tourbillon de l’Atlantique Nord pour se déplacer vers le

nord-est de l’Atlantique et de la Méditerranée, particulièrement Madère et les Açores

puis reviennent en zones néritiques. Les juvéniles de ces zones s’observent de la baie

de Cape Cod (MA, USA) jusqu’au Golf du Mexique.

Les tortues caouannes adultes non pondeuses de la zone néritique sont moins

nombreuses à fréquenter les milieux estuariens fermés et peu profonds qui offrent un

accès à la mer plus limité (Conant et al., 2009). Les eaux estuariennes plus ouvertes

sur la mer (à l’exemple de la baie de Chesapeake) sont fréquentées à la fois par les

juvéniles et adultes (Conant et al., 2009). Les eaux peu profondes débouchant sur de

vastes milieux marins (baie de Floride) offrent l’année durant des aires d’alimentation

importantes pour les mâles et femelles adultes (Conant et al., 2009). Les adultes

vivent principalement dans les eaux du plateau continental, de l’Etat de New York

jusqu’au Golf du Mexique. Il semblerait que les tortues caouannes se déplacent entre

les zones océaniques et néritiques (Bolten et al., 2003 ; Conant et al., 2009 ). A

mesure qu’elles parviennent à maturité, les femelles recherchent la plage où elles sont

nées.

Les aires d’alimentation cruciales pour les individus du Pacifique

comprennent les eaux du centre du Pacifique Nord, y compris les eaux de bifurcation

du courant de Kuroshio (Polovina et al., 2006) et les eaux côtières de la Basse-

Californie du Sud, au Mexique (Peckham et al., 2007). La mer de Chine orientale

constitue un habitat important pour les femelles adultes après la nidification qui

effectuent les migrations saisonnières de reproduction entre les aires d’alimentation et

les plages de nidification (Conant et al., 2009).

Ces considérations sont importantes à connaître dans la mesure où cela va

nous aider à comprendre les tenants et les aboutissants des effets de la pollution à

chaque étape de la vie de l’animal. Le trajet migratoire et l’habitat des adultes matures

et des mâles sont encore très mal connus.

30

C. Biologie

Le cycle de vie biologique des tortues marines est complexe et peut se décliner

en trois schémas (Bolten et al., 2003) en fonction des espèces de tortues marines:

Le premier comprend un développement et une maturation complète au sein

de la zone néritique. Cela concerne uniquement la tortue à dos plat (Natator

depressus).

Le second schéma est caractérisé par un développement initial en zone

océanique suivit d’un changement en zone néritique. Ce changement d’habitat

tendrait à favoriser une croissance maximale alliée à un risque de prédation minimal.

Ce schéma est commun et typique des tortues C. caretta, C. mydas, E. imbricata, L.

kempi, et sporadiquement L. olivacea. Ces changements sont complexes et

réversibles; la taille et l’âge des individus en zone néritique varie en fonction des

espèces. On sait maintenant que le stade océanique est le plus long pour la tortue

caouanne d’Atlantique qui retourne au stade néritique après 7 à 11,5 ans pour une

taille (CCL) variant entre 46 et 64 cm (Bjorndal et al., 2003).

Enfin, le troisième schéma est illustré par D. coriacea et L. olivacea de l’est

Pacifique qui effectuent leur développement au sein de la zone océanique

exclusivement.

Plusieurs stades peuvent être distingués :

1. Les femelles sexuellement matures

Elles ne retournent sur la terre que pour pondre, généralement sur leur plage

natale (Conant et al., 2009), tous les deux à trois ans. Seules deux plages de

nidification de tortues caouannes ont plus de 10 000 femelles par an qui viennent

pondre ; il s’agit de la Floride du Sud (Etats-Unis) et de l’île de Masirah (Oman). Les

estimations aux Etats Unis sont d’environ 68 000 à 90 000 nids par an. Cependant,

des analyses démographiques récentes ont montré que le nombre de nids sur la côte

sud-est de la Floride était en déclin (Index Nesting Beach Survey program). Il en va

de même en Caroline du Nord, du Sud et Georgie. Les îles du Cap-Vert abritent un

nombre de nids plus modeste. En 2000, les chercheurs ont pucé plus de 1000 femelles

31

en nidification sur 5 km de plage de l'île de Boa Vista. Les aires de nidification aux

Caraïbes sont rares. Il y a environ 4000 nids par an au Brésil. En Méditerranée, les

nids sont confinés à la portion est : Chypre, la Grèce et la Turquie. Il a été enregistré

entre 3300 et 7000 nids par saison de ponte (Conant et al., 2009).

La ponte se déroule en général la nuit. Chacune des pontes comprend environ

110 œufs. Les tortues pondent trois à quatre fois et ce à 14 jours d’intervalle (Miller et

al., 1997). Les œufs éclosent au bout de 49 à 90 jours, selon la température du nid

(Miller et al., 1997). Plus le sable entourant le nid est chaud, plus rapide sera le

développement des embryons. La longueur de la période d’incubation, le taux

d’éclosion et la taille des nichées dépendent des conditions d’humidité qui règnent

dans le nid (Conant et al., 2009). La détermination du sexe est également fonction de

la température d’incubation : ainsi les femelles seront majoritaires voir exclusives si

la température dépasse 29°C. Une température inférieure engendrera des mâles

(Miller et al., 2003).

2. Les nouveau-nés

L’éclosion survient pendant la nuit et se déroule sur 1 à 3 jours ; les nouveau-

nés remontent à l’air libre et émergent du nid sur une période de 2 à 4 jours. Les petits

utilisent la lumière ambiante pour trouver le chemin de l’océan (Witherington et al.,

1997) dans lequel ils entament une période de nage frénétique d’environ une

vingtaine d’heures. Ils s’orientent en fonction de la direction des vagues et du champ

magnétique terrestre (Conant et al., 2009). Ils restent en zone néritique (sur le plateau

continental) pendant plusieurs semaines à plusieurs mois (Bolten et al., 2003) puis se

dispersent en zone océanique en suivant les courants marins. Les individus de la zone

océanique d’Atlantique Nord sont retrouvés près des Açores, les îles Canaries et de

Madère où ils arrivent via le Gulf Stream (Conant et al., 2009).

3. Les juvéniles

Les jeunes tortues caouannes deviennent ensuite largement inactives, les périodes de

nage devenant peu fréquentes et moins énergiques. Elles se nourrissent d’une large

variété de proies flottantes comme les hydroïdes et les copépodes associés aux

sargasses (Witherington et al., 2002). Le stade océanique débute lorsque les juvéniles

32

arrivent pour la première fois dans cette zone. Ils se déplacent en suivant les courants

dominants et y passent plusieurs années avant de retourner aux zones d’alimentation

néritiques et à l’habitat de reproduction (Bolten et al., 2003). La durée du stade

juvénile océanique est variable, et la taille des tortues qui quittent la zone océanique

varie largement (SCL entre 15 à 63 cm ; TEWG, 2009). Lors de leur recrutement en

zones néritiques, les tortues caouannes passent à un régime composé principalement

d’invertébrés benthiques à carapace dure (Conant et al., 2009) : ils deviennent ainsi

des carnivores généralistes. Les individus reviennent dans un habitat proche de leur

plage natale afin d’établir une structure de population. Juvéniles et adultes peuvent

aller et venir entre les zones néritiques et océaniques, et seule la disponibilité de

nourriture déterminera leur habitat (Conant et al., 2009).

4. Adultes néritiques ou océaniques

Les tortues caouannes deviennent adultes à partir d’un SCL de 82 cm et le

sont toutes dès 100 cm (TEWG, 2009). La maturité sexuelle est atteinte tardivement

après 16 ans, cela pouvant aller jusqu’à une trentaine d’années (NMFS and SWFSC,

2008). Carnivores, les adultes se nourrissent de divers crustacés, poissons, calmars,

méduses. Les mâles ne reviennent jamais sur la terre ferme après leur éclosion, et les

connaissances sur leur cycle vital sont incertaines (Conant et al., 2009). Grâce à

l’analyse de l’ADN nucléaire, il semblerait que cette espèce ait une structure de

population complexe caractérisée par un flux génétique sous contrôle mâle (Conant et

al., 2009). Cela s'expliquerait par le fait que les mâles ne reviennent pas à leur plage

natale ou que l’accouplement se déroule dans des aires d’alimentation ou des

corridors migratoires où diverses populations se côtoient.

II. Menaces et protections

La capacité de survie de la tortue caouanne est dépendante de plusieurs

facteurs ; en effet cette espèce est limitée par son faible taux de recrutement dû à une

maturité sexuelle tardive, à une nidification ne survenant que tous les 2 à 3 ans, au

taux élevé de mortalité des œufs et des nouveau-nés et à une sensibilité important des

adultes aux changements chroniques de capacité de survie.

33

A. Menaces anthropiques

1. Menace terrestre

Les menaces pesant sur l’habitat terrestre de la tortue caouanne sont

nombreuses ; parmi les principales nous retiendrons :

- L’aménagement des côtes et la construction modifiant l’habitat des tortues nicheuses

et participant à l’augmentation du nombre de personnes et de véhicules sur les plages

de nidification, entraînant le compactage du sable et le piétinement des nids (Conant

et al., 2009). Le remblayage des plages peut rendre impropre la nidification et

l’incubation des œufs.

- Les ouvrages de défense des côtes qui bloquent l’accès à la zone supérieure des

plages, obligeant les tortues à nicher près de la mer.

- Les sources de lumière artificielle associées aux côtes aménagées qui désorientent

les nouveau-nés et les empêchent de trouver la mer (Witherington et al., 1997).

- Les changements climatiques pouvant entraîner un taux d’érosion plus important en

provoquant une élévation du niveau de la mer ce qui a pour conséquence un risque

d’inondation accru des nids, ainsi qu’une réduction de superficie de l’habitat de

nidification disponible (Baker et al., 2006), et une augmentation de la fréquence des

tempêtes ou une modification des courant dominants (Baker et al., 2006). Les

changements climatiques pourraient enfin influer sur le rapport des sexes de la tortue

caouanne, puisque le sexe des nouveau-nés dépend de la température d’incubation

des œufs (Miller et al., 2003). Ainsi une hausse de température à l’échelle mondiale

pourrait participer à une augmentation de la proportion de femelles (Miller et al.,

2003).

- La récolte des œufs ne constitue plus un problème au Japon (Conant et al., 2009).

Toutefois, il n’en est pas de même dans le nord-ouest du Mexique où les tortues sont

toujours prélevées à visée alimentaire et ce malgré l’interdiction de la chasse et du

commerce de ces animaux par les autorités fédérales (Conant et al., 2009). La récolte

des œufs des tortues vertes et imbriquées constitue la première cause de mortalité

34

dans le monde. Les tortues vertes sont exploitées pour leur chair et cartilage tandis

que les tortues imbriquées sont prisées pour leur magnifique carapace.

2. Menaces marines

Concernant la qualité de l’habitat marin, les points suivants sont les principaux

retenus et ne sont en aucun cas exhaustifs.

- La principale menace est la pêche pélagique à la palangre (Fig. 6) dans les eaux nord

océanique où le nombre d’individus tués annuellement est estimé entre 2600 et 6000

(Lewison et al., 2004). Le dragage des chenaux et l’extraction de sable (Conant et al.,

2009) constituent également de sérieuses menaces. La pêche commerciale constitue la

menace anthropique la plus importante pour la population du Pacifique Nord,

touchant juvéniles et adultes en zone néritique (Conant et al., 2009).

- Prises accessoires lors de la pêche au chalut dans les eaux côtières qui sont des aires

d’alimentation et de reproduction de ces animaux, notamment dans l’ouest du

Pacifique. Le braconnage aux Bahamas, Cuba et Mexique est également un facteur de

déclin.

- Perturbations indirectes de l’habitat par la pollution marine, comprenant les

herbicides, les pesticides, les déversements de divers produits chimiques, le pétrole et

des eaux usées (Lutcavage et al., 1995 ; Conant et al., 2009). L’effet direct des

fertilisants et pesticides est peu connu, toutefois leurs effets indirects tels que la

dégradation de l’habitat via la prolifération d’algues à cause d’un excès de nutriments

semblent plus évidents. Ainsi, les proliférations de Prorocentrum, une espèce de

dinoflagellés sont dangereuses car l’acide okadaïque produit est toxique et peut

induire des tumeurs. L’acide okadaïque a été retrouvée dans divers tissus de tortues

vertes Hawaiiennes souffrant de fibropapilloma (Arthur et al., 2006).

Les tortues marines sont particulièrement vulnérables aux maréees noires à

tous les stades de leur développement. Il existe des effets sur la peau, le sang, les

glandes à sel et les systèmes digestifs et immunitaires (Milton and Lutz., 2003). Il

semble également que les activités liées à la production pétrolière et gazière

extracôtière tels que les rejets opérationnels aient un impact sur les tortues caouannes

(Conant et al., 2009). Les recherches dans ce domaine restent toutefois limitées.

35

- Ingestion de débris marins tels que des morceaux de plastique ou de polystyrène

extrudé (Lutcavage et al., 1997) ; confusion entre ces débris et les proies ayant des

effets létaux (Witherington et al., 2002). Les effets secondaires surviennent dans le

cas où des débris secondaires remplacent les aliments ingérés, diluent l’apport en

nutriments et réduisent de ce fait la croissance somatique et la reproduction (Conant et

al., 2009). Le contenu digestif est tout aussi surprenant qu’écœurant : sacs plastiques,

billes, cordes, fils de pêches, hameçons, charbon, verre, aluminium, cartons, papiers,

ballons, polystyrène, …

Figure 6. Tortue luth adulte prise dans les filets de palangre et échouée (Crédit Aquarium La Rochelle)

- Les changements climatiques modifiant les trajets migratoires et l’augmentation de

la température de la surface des océans qui les accompagne ayant des répercussions

sur l’abondance et la répartition des proies (Conant et al., 2009). L'élévation du

niveau de la mer risque de perturber les individus dans leur milieu marin et

d’entraîner des changements du niveau trophique qui modifierait l'abondance ou la

répartition de leurs proies (Conant et al., 2009). Les femelles ont besoin d'au moins un

an pour constituer leurs réserves de graisses nécessaires à la reproduction ainsi qu’à la

production de l’énergie requise pour la migration. Les milieux océaniques plus froids

sont en général plus productifs ; une baisse de la productivité due à un réchauffement

de température de l’eau pourrait conduire à une diminution des pontes et du

recrutement (Conant et al., 2009).

36

B. Statut et protection

Les efforts de conservation des populations de tortues caouannes au sein d’un

pays peuvent être totalement ruinés par les activités d’un autre. La protection de cette

espèce sur les plages de nidification aux Etats-Unis et dans les eaux territoriales

américaines n’est pas suffisante. C’est pourquoi sa protection requière une

collaboration internationale. La tortue caouanne bénéficie de la protection de la

Endangered Species Act des Etats-Unis (USFWS and NMFS, 1978), de la Convention

interaméricaine pour la protection et la conservation des tortues marines (Inter-

American Convention for the Protection and Conservation of Sea Turtles), du

protocole relatif aux zones et à la vie sauvage spécialement protégées (Protocol

Concerning Specially Protected Areas and Wildlife), de l’annexe I de la Convention

sur le commerce international des espèces de faune et de flore sauvages menacées

d’extinction et de la Convention sur la conservation des espèces migratrices (CITES)

qui interdit le commerce international de ces espèces et de leurs produits dérivés. Elle

est considérée « espèce en danger » par l’Union internationale pour la convention de

la nature (IUCN, 1996) et figure donc sur la liste rouge. Aux Etats-Unis, NOAA

Fisheries et USFWS possèdent une juridiction conjointe afin de régler les

problématiques relatives aux tortues marines. La NOAA est responsable de

l’environnement marin et USFWS régule la politique inhérente aux aires de

nidification. Ces deux agences fédérales ont promulgué des régulations visant à

éliminer ou réduire les menaces dont souffrent les tortues marines. Ainsi, des mesures

concernent les prises accidentelles dans les palangres pélagiques ou de fonds, les filets

maillants d’Atlantique, les filets de la Baie de Chesapeake et les chaluts de crevettes

et de limandes sur la côte sud-est. En étroite collaboration avec l’industrie de la pêche

chalutière à la crevette, NOAA Fisheries a développé des filets permettant d’exclure

les tortues des prises, les dispositifs d’exclusion des tortues ou Turtle Excluder

Devices ou TEDs (Fig. 7). Ceux-ci visent à réduire la mortalité des tortues de mer

capturées incidemment. Les TEDs sont suffisamment grands pour exclure les plus

gros individus, ils sont maintenant rendus obligatoires sur tous les chalutiers de pêche

à la crevette. Toute importation de crevettes pêchée de manière délétère aux tortues

marines est interdite et ce depuis 1989.

37

Figure 7. Turtle Excluder Device, dispositif d’exclusion des tortues leur permettant de fuir. Crédit

NOAA

III. Le système immunitaire

A. Le système hématopoïétique des reptiles

Le sang des reptiles comprend des éléments cellulaires et acellulaires. Le

volume de sang total est variable en fonction des espèces avec par exemple 7,3 ml

pour 100 g de poids vif pour l'alligator et 9,1 ml pour 100 g poids vif pour la tortue à

tempe rouge (Trachemys scripta elegans) (Strik et al., 2007). Les composants

cellulaires comprennent l'hématocrite variant entre 20 et 40% qui est composé

d’érythrocytes, puis de granulocytes, lymphocytes, monocytes, cellules plasmatiques

et thrombocytes. La fraction acellulaire du sang, le plasma, formant entre 60 et 80 %

du volume de sang est soit incolore, ou jaune très pale, ou encore très fortement

pigmenté comprenant des caroténoïdes en fonction des espèces. Au sein du plasma se

trouvent des électrolytes inorganiques ainsi qu’une grande diversité de composés

organiques.

Il existe des variations des centres hématopoïétiques en fonction des espèces

de reptiles et de l’âge de l’animal au sein d’une même espèce. Les organes principaux

responsables de l’hématopoïèse sont la moelle osseuse, le foie et la rate. Bien que les

lignées erythropoïétiques et granulopoïétiques soient produites spécifiquement au sein

de la moelle osseuse, la rate participe également au maintien de cette activité. Les

38

cellules souches myéloïdes sont multipotentes et donnent naissance à tous les types

cellulaires ayant pour origine la moelle osseuse.

Les érythrocytes matures sont nucléés et ovales, les immatures sont ronds avec

un cytoplasme basophile. Les globules rouges séniles sont plus grands que les

érythrocytes matures avec un cytoplasme plus pâle et un noyau pycnotique. Les

dimensions des globules rouges varient à la fois entre espèces et au sein de la même

espèce. Par exemple, pour le lézard arc-en-ciel (Ameiva ameiva), le diamètre moyen

des érythrocytes est de 7,6 µm alors que pour le sphénodon ponctué (Sphenodon

punctatus) le diamètre est de 23,3 µm. De manière analogue, le nombre des

érythrocytes varie de manière intra et interspécifique, en fonction de l’âge, du sexe, de

la saison, de l’altitude, de l’alimentation et des maladies potentielles (Stacy et al.,

2011). Le groupe des globules blancs comprend une variété de cellules ayant une

homologie avec les lignées cellulaires des vertébrés supérieurs. Nous reviendrons sur

ces lignées cellulaires ultérieurement.

B. Les organes lymphoïdes des reptiles

Le système lymphoïde est composé d’organes majeurs et structures

anatomiques tels que la moelle osseuse, le thymus et la rate. Les autres organes

lymphoïdes secondaires incluent les tissus lympoïdes associés aux intestins (GALT)

et aux bronches (BALT).

1. La moelle osseuse

Elle constitue l’un des organes lymphopoïétiques et hématopoïétiques majeurs.

Chez les mammifères, la moelle osseuse est le siège de la lympho-, hémato- et

myélopoïèse. Pour la majorité d’entre eux, elle est également le siège de la maturation

des lymphocytes B. Chez les reptiles, la moelle osseuse est localisée dans les cavités :

1/ de certains os du crâne, 2/ des os longs chez les lézards, chéloniens et crocodiliens,

3/ des côtes et vertèbres des serpents, 4/ du plastron, carapace et pelvis chez les

chéloniens (Origgi et al., 2007). L’activité hématopoïétique de la moelle osseuse des

reptiles en fait un groupe intermédiaire situé entre les amphibiens pour lesquels la rate

est l’organe érythropoïétique majeur et les oiseaux où la moelle osseuse joue ce rôle

39

(Cooper et al., 1985). Chez les tortues, la rate et la moelle osseuse constituent les

organes érythropoïétiques (Origgi et al., 2007).

Chez la tortue du désert (Gopherus agassizii), les prélèvements de moelle

osseuse sont effectués à partir de diverses écailles (nucales, anales, marginales et

supercordes) de la carapace ainsi que des écailles (gulaires, inframarginales,

fémorales, et anales) du plastron (Origgi et al., 2007). La moelle osseuse peut être

prélevée à partir du fémur, de l’humérus et du pelvis. Le stroma est composé d’un

réseau fibreux de cellules réticulées, de graisse, d’artérioles, de veinules, de nerfs

ainsi que de nombreux sinus veineux, à parois fines, bordés de cellules endothéliales.

Au sein des cavités extravasculaires se trouvent également des mélanophores et

mélanocytes ainsi que des granulocytes remplis de granules éosinophiles (hétérophiles

et éosinophiles ne peuvent être distingués), des précurseurs des granulocytes et des

cellules mononuclées. Les précurseurs des érythrocytes peuvent être visualisés dans

les sinus veineux. Les granulocytes contenant des granules éosinophiles forment les

leucocytes majoritaires de la moelle osseuse tandis que les cellules plasmatiques ne

représentent que moins de 1% des cellules.

2. Le thymus

C’est un organe propre aux vertébrés où s’effectue la maturation des

lymphocytes T. Les cellules du thymus joue un rôle critique dans la maturation

fonctionnelle des lymphocytes T chez les mammifères. Chez les reptiles, l'existence

d'un processus similaire est incertain, toutefois, les évidences fonctionnelles de

l’existence du complexe majeur d'histocompatibilité chez les reptiles (Farag and El

Ridi, 1985, 1990) analogue à celui des mammifères suggère qu’une chaîne

d’événements similaires existe.

a. Anatomie

Des différences à la fois embryologiques (Cooper et al., 1985) et

morphologiques ont été objectivées chez les différents groupes de reptiles. Chez les

chéloniens, le thymus est localisé crânialement au cœur, à côté de la bifurcation entre

l’artère sous-clavière et la carotide (Fig. 8).

40

Figure 8. Thymus de tortue verte (Chelonia mydas) en position anatomique. Le thymus est

cranial au coeur. D'après Origgi et al., 2007 (Crédit Bobby Collins).

Le thymus des reptiles est entouré d’une capsule formée de tissu conjonctif

dense. Des septa partent de la capsule et subdivise le thymus des chéloniens en

lobules distincts. Certaines espèces de chéloniens ont des lobules consistant en une

corticale externe et une médullaire interne, tandis que chez d’autres cette subdivision

n’est pas apparente ou varie de manière saisonnière (Cooper et al., 1985). Les

thymocytes et cellules épithéliales sont les types cellulaires les plus courants dans le

thymus des reptiles (Fig. 9). Les cellules épithéliales sont distribuées à la fois dans le

cortex et la médullaire. Les cellules myoïdes forment un autre type cellulaire présent

dans le parenchyme thymique.

Figure 9 Coupe histologique de thymus chez la tortue caouanne (Caretta caretta), coloration Hémalun

& Eosine. Une capsule de tissu conjonctif (CT) entoure le thymus. A gauche, le tissu est normal,

chaque lobule comprend une médullaire (ME) et une corticale (CO). Par comparaison, à droite, le

thymus est en phase d’involution et la distinction corticale / médullaire n'est plus possible. D'après

Origgi et al., 2007.

41

Les kystes épithéliaux forment une structure supplémentaire du thymus

(Cooper et al. 1985). Leurs origines et fonctions ne sont pas très claires. Les kystes

sont toujours associés aux cellules épithéliales et peuvent être intra- ou

extracellulaires.

b. L’involution thymique

L’involution thymique est saisonnière, réversible, cyclique et est associée à

une réduction sévère des cellules lymphoïdes et une augmentation du tissu conjonctif

(Fig. 9 à droite). Cette involution progresse avec l’âge. En effet les populations

lymphoïdes régressent continuellement saison après saison (Origgi et al., 2007). Cette

involution a été décrite chez les animaux malades ou affamés ; elle est réversible

lorsque le facteur de stress est ôté (Cooper et al., 1985).

3. La rate

a. Anatomie

Cet organe a été étudié chez moins de 30 espèces de reptiles sur les 7500

recensées actuellement (Origgi et al., 2007). Elle peut être ovale, sphérique ou

allongée. Elle est localisée dans la cavité abdominale proche du pancréas. Chez

certaines espèces, ces deux organes sont pratiquement indiscernables au point qu’ils

ne forment qu’une unique entité anatomique que l’on nomme le splénopancréas (Fig.

10).

Figure 10. Coupe histologique de splénopancréas (Crotalus viridis), coloration Hémalun & Eosine. Sur

cette coupe, le pancréas exocrine (EX) ainsi que les îlots de Langerhans (IS) sont en continuité avec la

rate. (SP) D'après Origgi et al., 2007.

42

La structure histologique de la rate montre qu’elle est formée d’une capsule de

tissu conjonctif, de travées plongeant dans la pulpe rouge et de la pulpe blanche (Fig.

11). Cette dernière représente la composante immunologique de la rate. Elle est bien

développée et subit les variations saisonnières. La structure générale est similaire chez

les chéloniens, crocodiliens et lézards, avec des différences chez les serpents. Les

rates de plusieurs espèces de chéloniens ont été étudiées (Origgi et al., 2007) incluant

les Trionyx de Chine (Pelodiscus sinensis), les tortues Emydes du Japon (Mauremys

japonica), les tortues alligator, les tortues à tempes rouges, la tortue caspienne et les

tortues-boîte de Chine (Cistoclemmys flavomarginata). Les travées de la capsule se

projettant vers le parenchyme peuvent ou non être présentes. La pulpe blanche est

composée de deux types d’agrégats lymphoïdes entourant les éléments vasculaires.

Les artérioles de la pulpe blanche sont entourées d’un manchon de lymphocytes

appelé manchon lymphoïde péri-artériolaire (PALS). Ils contiennent des cellules

lymphoïdes, des cellules plasmatiques matures et immatures et des cellules

interdigitées. Les artérioles centrales donnent naissance aux capillaires qui sont

entourés d’un tissu de fibres réticulés (ellipsoïde) qui est lui même entouré d’un tissu

lymphoïde, le manchon lymphoïde péri-ellipsoïdal (PELS). La délimitation entre la

pulpe blanche et rouge est difficile à définir car beaucoup de lymphocytes et

granulocytes se situent également dans la pulpe rouge. Aucun centre de germination

n’a été observé dans les rates de chéloniens et ce même après stimulation antigénique

(Origgi et al., 2007). La pulpe rouge entoure la pulpe blanche et est composée de

sinus et de cordons. Les cordons de la pulpe comprennent le tissu intervasculaire et

contiennent des cellules inflammatoires telles que les lymphocytes, macrophages,

cellules plasmatiques, granulocytes et des éléments structuraux tels que les cellules

interstitielles. L’activité érythropoïétique de la rate est toujours controversée. Très peu

d’informations sont disponibles concernant la distribution des lymphocytes B et T

dans la rate des reptiles.

43

Figure 11. Coupe histologique de rate (Caretta caretta), coloration Hémalun & Eosine. Sur cette coupe,

les pulpes rouge et blanche sont entrelacées. La pulpe blanche consiste en des vaisseaux entourés de

tissu lymphoïde. D'après Origgi et al., 2007

b. Fonction de la rate

Il existe très peu d’études portant sur la fonction de la rate chez les reptiles

consécutive à une stimulation antigénique (Origgi et al., 2007). Chez la tortue

hargneuse, une forte réponse proliférative entraînant une augmentation de la masse de

la pulpe blanche a été obtenue suite à une stimulation antigénique avec de

l’hémocyanine de Megathura crenulata. Cette prolifération active a tout d’abord été

observée dans la pulpe blanche (8 à 10 jours après immunisation) puis dans la pulpe

rouge (15 à 20 jours après immunisation). Aucun changement histologique n’a pu être

observé dans la rate des tortues alligator ni des agames après une seconde

immunisation. La pulpe rouge de la couleuvre de Forsskal est soumise aux variations

saisonnières; elle est bien développée en hiver avec un très faible nombre d’agrégats

lymphoïdes dans la pulpe blanche. Au printemps, les agrégats lymphoïdes augmentent

en taille et nombre, pour devenir plus denses et presque coalescents. La réponse

humorale vis à vis de divers antigènes est forte à ce moment là. De fin juin à juillet le

tissu splénique lymphoïde régresse à nouveau, entraînant une réaction humorale plus

faible.

4. Tissus lymphoïdes associés et structures lymphoïdes accessoires.

Les structures lymphoïdes ne faisant pas partie des organes lymphoïdes

majeurs (rate, thymus, moelle osseuse) sont regroupées. Chez les mammifères, ces

structures forment le GALT (gut-associated lymphoïd tissue) et incluent les

44

amygdales, les végétations, et les plaques de Peyer, le BALT (bronchial-associated

lymphoïd tissue) et les nœuds lymphatiques. Ces structures se situent où les cellules

du système immunitaires ont la plus forte probabilité de rencontrer un antigène. Ces

structures ont également été décrites chez les reptiles.

a. Le GALT : Tissu lymphoïde associé aux intestins

Le GALT composé de nombreuses structures lymphoïdes disséminées est

distribué le long du tractus digestif et forme l’organe lymphoïde le plus important du

corps. Les structures constituant le GALT sont situées en majorité dans l’œsophage,

la jonction iléo-caecale, le colon et le cloaque. Elles sont petites, non encapsulées et

s’étendent de la lamina propria (ou lame basale) jusqu’à la sous-muqueuse (Cooper et

al., 1985). Contrairement aux composants lymphoïdes de la rate et du thymus, le

GALT ne semblent pas subir de variations saisonnières (Cooper et al., 1985).

b. Les nœuds lymphatiques et autres structures lymphoïdes

Il n’existe pas de nœuds lymphatiques sensus stricto chez les reptiles

contrairement aux mammifères. Par contre des structures similaires assimilées à un

tissu lymphatique ectopique ont été décrites dans divers organes tels que les poumons,

les reins, la vessie, le pancréas et les testicules (Cooper et al., 1985). Ces structures

ont également été décrites dans les régions péri-vasculaires chez divers reptiles

(Cooper et al., 1985), suggérant une homologie fonctionnelle potentielle avec les

nœuds lymphatiques des mammifères.

C. Le système immunitaire

Le système immunitaire des vertébrés possède une composante innée et une

composante acquise. L’immunité acquise et une partie de l’immunité innée sont

basées sur la reconnaissance du « non soi ». L’immunité innée entre en action en

premier lieu car elle ne requière aucune activation que celle fournit par l’agent

pathogène lui-même. Cette première ligne de défense est composée de cellules

phagocytaires dont le but va être de détruire et d’éliminer l’envahisseur. Les divers

acteurs du système immunitaire inné reconnaissent des motifs structuraux très

conservés au cours de l’évolution de nombreux pathogènes. Ces motifs « clés »

représentent le signal nécessaire et suffisant à l’activation des effecteurs du système

45

immunitaire inné. Cependant, les agents pathogènes plus virulents vont pouvoir

échapper à ce contrôle. Ainsi entre en jeu le système immunitaire acquis qui va être

activé via une série d’interactions cellulaires complexes afin de déployer les défenses

nécessaires.

Le système immunitaire acquis est lui-même subdivisé en deux réponses

possibles : une réponse cellulaire et une autre humorale. La réponse cellulaire est

principalement basée sur l’activité cytotoxique de deux groupes de cellules

spécialisées que sont les lymphocytes T cytotoxiques (CD8+) et les cellules tueuses

naturelles ou natural killer (NK). Ces cellules effectrices peuvent cibler et détruire les

cellules infectées grâce à des signaux spécifiques que les cellules infectées par un

agent pathogène exposent sur leur membrane. Les cellules T effectrices reconnaissent

la présence du pathogène dans une cellule hôte grâce au récepteur cellulaire T (TCR).

Ces récepteurs engagent également une molécule du complexe majeur

d’histocompatibilité ou CMH de classe 1 dans le cas des cellules T CD8+, exprimé

sur la membrane cellulaire de la cellule hôte. Ces antigènes d’histocompatibilité sont

impliqués dans la présentation de petits fragments peptidiques spécifiques du

pathogène aux cellules T.

La fonction la plus importante de la réponse humorale du système immunitaire

est la production d’immunoglobulines qui sont des molécules solubles, synthétisées et

sécrétées par les lymphocytes B et qui font fonction d’anticorps (Ac). Ces Ac se lient

à un antigène spécifique de l’agent pathogène. La stimulation par l’agent pathogène

déclenche la synthèse d’anticorps ainsi que leur libération dans la circulation sanguine

jusqu’à ce qu’ils rencontrent puis se lient à un agent pathogène spécifique.

Ainsi, les réponses cellulaires et humorales s’interpénètrent lors de la réponse

immunitaire. Il en est de même pour la réponse immunitaire innée. Une première

exposition et réponse à un nouveau pathogène, vont induire la formation d’un groupe

spécifique de lymphocytes. Celles-ci constituent les cellules mémoire latentes en

attente d’une ré-exposition ultérieure. Ces cellules patrouillent dans la circulation

sanguine de l’hôte à l’affût du pathogène ayant déjà déclenché une première réponse.

Ce groupe de cellules mémoire va se réactiver chaque fois que le pathogène initial se

représentera.

46

La réponse immune est un processus complexe impliquant de nombreux

acteurs : cellules et molécules effectrices. Il est possible qu’un grand nombre de ces

fonctions effectrices et des interactions décrites chez les mammifères, existent

également chez les reptiles. Toutefois, le système immunitaire des reptiles a été très

peu étudié, principalement entre les années 1970 et 1980 puis tout intérêt dans ce

domaine a disparu. Un fossé énorme en terme de connaissances s’est formé et celles

ci sont désormais limitées et parcellaires. Ce qui est connu va être développé dans les

sections suivantes.

1. Les mécanismes de défense innée

Ces mécanismes peuvent être actifs via des facteurs humoraux et cellulaires

non spécifiques ou passifs tels que jouer un rôle de barrière (revêtements cutanés ou

muqueux).

a. Revêtements cutanés et muqueux

La peau est la première barrière physique du reptile. La couche externe

kératinisée est très spécifique chez le reptile. Elle est très épaisse ce qui offre une

résistance mécanique et biologique importante ainsi que l’exuviation. L’exfoliation de

la région du cou a également été rapportée chez les tortues marines ainsi que la mue

de certaines écailles. La capacité à remplacer la peau de manière régulière est une

stratégie de défense contre les pathogènes cutanés. La muqueuse au contraire est

souvent déficiente en kératine au sein de sa couche externe ce qui tend à rendre ces

structures plus délicates et vulnérables aux sollicitations mécaniques et aux agents

microbiologiques. Une exception est l’œsophage des tortues marines qui est composé

de papilles kératinisées. Il a été montré que les salmonelles ne peuvent envahir et

traverser la muqueuse intestinale des tortues à tempes rouges lorsque celles-ci sont

maintenues à 26°C (Pasmans et al., 2001, 2002). Par contre cela est tout à fait

possible lorsqu’elles sont maintenues à 37°C. Ainsi la température semble être un

facteur important de l’intégrité des muqueuses chez les reptiles.

b. Les facteurs humoraux non spécifiques

Les sécrétions, la surface des muqueuses et autres fluides corporels

contiennent des composés ayant pour rôle la protection de l’organisme et limitant

47

l’invasion par des micro-organismes pathogènes. Ces composés sont les interférons,

les transferrines, le lysosyme ainsi que le complément.

Les interférons font partie de la grande famille des cytokines et sont connus

pour leur activité antivirale. Chez les mammifères, les interférons de type I (alpha et

béta) possèdent une activité antivirale et permettent d’augmenter l’expression du

CMH-1 à la surface des cellules et d’activer les cellules NK. L’augmentation de

l’expression du CMH-1 renforce la réponse cellulaire à l’encontre des virus grâce à

une présentation exacerbée des peptides viraux aux cellules T cytotoxiques. Les

interférons de type II (gamma) sont impliqués dans la réponse immunitaire de lutte

contre les pathogènes intracellulaires et dans l’activation des macrophages ainsi que

dans la maturation des lymphocytes T CD4+. Ce sont des protéines clé de la

modulation des réponses immunitaires innées et acquises lors d’infections et

d’inflammations. L’existence d’un facteur soluble ayant une activité antivirale

similaire à l’interféron (Origgi et al., 2007) a été rapportée dans les reins de tortues

grecques à la suite de diverses infections virales (West Nile, Newcastle, Sendai). Ce

facteur a permis aux cellules de résister à la charge infectieuse. Il a également été

décrit la production d’un facteur similaire par les cellules du tissu cardiaque des

terrapines infectées avec par le virus de l’encéphalite de Saint Louis.

Les transferrines sont présentes dans le plasma de tous les vertébrés, y compris

les reptiles. Ces protéines ont une très forte capacité à fixer le fer. En séquestrant le

fer disponible, les transferrines ont une activité à la fois bactériostatique et fongicide.

Le taux de fer plasmatique diminue chez des lézards préalablement infectés avec des

bactéries. Ainsi, la combinaison de faible taux de fer plasmatique associée à des

températures corporelles élevées possèdent des effets délétères sur la croissance

bactérienne (Origgi et al., 2007).

Le lysozyme est un facteur antimicrobien qui est produit principalement par

les lignées lymphocytaires/macrophagiques. Après inoculation avec Leishmania

agamae, les taux de lysozyme sérique augmentent de deux à cinq fois chez le lézard

vert (Lacerta viridis), et de trois fois chez l’agame (Agama caudospinosum, Origgi et

al., 2007). Chez les tortues caouannes, l’activité du lysozyme a été corrélée

positivement avec les concentrations plasmatiques de brevetoxine, une neurotoxine

produite par un dinoflagellé Karenia brevis (Walsh et al., 2010

48

Le complément est un complexe de 30 facteurs solubles et de molécules qui

faisant partie d’une cascade inflammatoire. Le système du complément des reptiles

comprend de multiple isoformes de la fraction C3. Cela participerait à étendre leur

capacité de reconnaissance immunitaire (Sunyer and Lambris, 1998). Les effets

inhibiteurs du sérum d’alligator (Alligator mississippiensis) contre E. coli et

Naegleria gruberi sont très probablement médiés par le complément (Merchant et al.,

2004). Une activité antivirale du complément a également été évoquée (Merchant et

al., 2005a). Kuo et al., (2000) ont montré comment la voie alterne du complément

était responsable de la destruction des spirochètes (Borrelia burgdorferi) chez le

lézard des palissades (Sceloporus occidentalis) et le lézard alligator (Elgaria

multicarinata). L’identification de la voie alterne de l’activation du complément a

relativement récemment été mise en évidence chez l’alligator (Merchant et al., 2005b).

c. Les facteurs cellulaires non spécifiques

La phagocytose

Il s’agit de la capture et de l’ingestion de particules telles que des bactéries et

des débris cellulaires par des cellules spécialisées. Ces cellules incluent les

macrophages, les hétérophiles et les cellules dendritiques. La membrane cellulaire des

phagocytes englobe les pathogènes afin de former une vésicule de phagocytose qui va

ensuite fusionner avec les lysosomes afin de former un phagolysosome. Le matériel

ingéré est ensuite dégradé par des enzymes ainsi qu'un pH acide. L’activation de la

production de composés toxiques pour le pathogène comme le peroxyde d’hydrogène

et les radicaux libres est appelée explosion respiratoire.

Les monocytes - macrophages

Les leucocytes les plus grands (8 à 25 µm) dans la cirulation sanguine des

reptiles sont les monocytes. Ils sont similaires à ceux des mammifères en fonction et

en morphologie (Sypek and Borysenko, 1988). Ils sont ronds avec un cytoplasme gris,

pâle à modérément basophile (Fig. 12). En fonction de leur stade de réaction, les

monocytes peuvent contenir des vacuoles cytoplasmiques de taille et forme variables

(Fig. 12). En quantité, les monocytes peuvent constituer 10% des leucocytes (Sypek

and Borysenko, 1988). Leur nombre varie peu en fonction des saisons et leur

49

pourcentage reste constant (Duguy et al., 1970). Toutefois, leur nombre augmente lors

de l'hibernation de la tortue du désert et en cas de dystocies chez les caméléons (Stacy

et al., 2011). Leur nombre augmente également lors de stimulation antigénique ce qui

est fortement évocateur d'un processus infectieux chronique. Ils sont présents dans les

granulomes et la formation des cellules géantes en cas d'infection bactériennes ou en

présence d'oeufs de trématodes (Campbell, 1996).

Figure 12. Photomicrographie de monocyte de tortue Gopherus agassizii, normal à gauche et de

monocytes réactifs de tortue Geochelone sulcata. Coloration Wright-Giemsa. D'après Strik et al., 2007

Les macrophages sont des phagocytes spécifiques des organes dérivant des

monocytes circulants. Ils font partie à la fois de l’immunité innée et acquise. Les

macrophages phagocytent activement bactéries, parasites, débris cellulaires et autres

matériaux. Après phagocytose les micro-organismes sont digérés et leurs

déterminants structuraux sont présentés sur le CMH aux cellules T circulantes afin

d’activer la réponse acquise. Chez les reptiles, l’activité phagocytaire des

macrophages a été étudiée par plusieurs auteurs. Roy et Rai (2004) ont montré que de

faibles niveaux de catécholamines pouvaient augmenter l’activité phagocytaire des

macrophages spléniques chez le gecko (Hemidactylus flaviviridis). A forts taux

cependant, les catécholamines agissent comme immunosuppresseurs. Mondal and Rai

(2002), ont montré que le temps d’exposition et la dose de glucocorticoïdes

affectaient l’activité phagocytaire et la libération des nitrites issus des macrophages

spléniques activés par le liposacharide (LPS). Les hormones sexuelles (mâles et

femelles) possèdent également un rôle inhibiteur de l’activité phagocytaire, de la

libération de nitrites avec pour conséquence une perturbation importante de l’activité

cytotoxique des macrophages (Mondal and Rai, 1999). La température est aussi un

facteur affectant la phagocytose des macrophages spléniques du gecko. En effet, la

phagocytose et l’activité cytotoxique des macrophages sont plus importantes à 25°C

50

qu’à de plus hautes ou de plus basses températures (Mondal et Rai, 2001). Une autre

étude réalisée en 2002 (Pasmans et al., 2002) a montré que les macrophages de tortues

à tempes rouges ne phagocytaient aisément Salmonella enterica (ser Muenchen)

qu’entre 30˚C et 37˚C.

Les mélanomacrophages sont des macrophages caractérisés par la présence de

mélanosomes intracellulaires. Une autre étude menée sur les mélanomacrophages a

montré qu’à basses températures les mélanophages des tortues avaient une activité

phagocytaire plus importante vis à vis de E. coli que leur homologue de mammifères

(Stacy et al., 2011).

Les cellules dendritiques

Les cellules dendritiques sont des cellules présentatrices d’antigène (CPA)

spécialisées, capables de présenter via le CMH, les antigènes aux lymphocytes-T.

Contrairement aux cellules dendritiques immatures, les cellules matures perdent toute

activité phagocytaire pour ne conserver que leur rôle de CPA. Chez les reptiles, il

semble que les cellules dendritiques se situent dans la zone marginale de la rate

(Origgi et al., 2007). Chez la tortue caspienne, l’injection de billes de carbone ne

semble pas induire la phagocytose de celles-ci par les cellules dendritiques matures.

Les hétérophiles

Ces cellules sont grandes, rondes, avec un cytoplasme clair qui contient de

nombreux granules cytoplasmiques allongés, pouvant recouvrir le noyau. La forme du

noyau dépend de l'espèce étudiée varie de rond à ovale, est excentré (chez la plupart

des serpents, chéloniens et crocodiliens) ou encore posséde deux ou plusieurs lobes

(lézards). La taille de ces cellules varie de 10 à 23 µm. Les granules cytoplasmiques

des chéloniens et crocodiliens sont éosinophiles et fusiformes (Fig. 13). Une

morphologie anormale peut être observée lors de réponse à un processus

inflammatoire et particulièrement lors de maladies infectieuses. Des hétérophiles dits

"toxiques" se forment dans la moelle osseuse avant leur libération dans le sang

périphérique. Les changements les plus sévères, aussi bien morphologiques que

numériques des hétérophiles, sont provoqués par des toxines bactériennes et sont

souvent témoins d'entérite ou autres infections bactériennes sévères à gram négatif

(Stacy et al., 2011). La toxicité est caractérisée par l'intensification de la basophilie du

51

cytoplasme, la dégranulation, la vacuolisation, une granulation excessive du

cytoplasme et un noyau excessivement lobulé (Fig. 13). Ces changements toxiques

varient en intensité avec la sévérité de la maladie. Une toxicité modérée est associée à

une augmentation de la composante basophile du cytoplasme, avec des granules

hétérophiles normaux en nombre et morphologie. La dégranulation peut résulter d'un

artéfact lors de la préparation du frottis sanguin ou d'une conservation excessive du

sang dans l'anticoagulant. Une modification des granules, qui deviennent violet très

foncé ou moins nombreux et de taille augmentée, accompagne une toxicité sévère.

Une lobation du noyau chez des espèces n'en ayant habituellement pas peut également

témoigner d'une toxicité (Campbell, 1996). Un déplacement vers la gauche est

visualisable par la présence de myélocytes et métamyélocytes. Les hétérophiles

immatures possèdent un noyau plus grand, des granules pléiomorphes, un cytoplasme

plus basophile contenant des granules primaires (Fig. 13). Cela se produit en cas

d'infection très sévère avec une demande de mobilisation accrue. Les bactéries

intracytoplasmiques dans le sang périphérique chez les animaux septicémiques sont

très rarement observées. Leurs fonctions consistent en la phagocytose et l'activité

microbicide lors de maladies inflammatoires (Stacy et al., 2011). Les hétérophiles

représentent entre 30 et 45% des leucocytes lors du comptage cellulaire chez les

reptiles sains (Frye, 1991). Une hétérophilie est décrite lors de réponses

inflammatoires chez les reptiles au cours de infections microbiennes, des maladies

parasitaires, et des processus inflammatoires non spécifiques ou de processus

nécrotiques (Campbell, 1996). La gestation, l'administration de glucocorticoides, le

stress, les processus néoplasiques, les leucémies granulocytiques entrainent également

une hétérophilie (Stacy et al., 2011). L'hétéropénie est décrite en cas d'infection

extrèmement sevère, résultant d'une demande excessive de cellules dans les tissus

atteints. Des anomalies hématologiques telles que les modifications toxiques peuvent

se produire de manière concomittante.

52

Figure 13. Photomicrographie d'hétérophiles. A gauche, il s'agit d'un hétérophile d'alligator, qui est

normal ; on remarque un petit lymphocyte bien différencié (tête de la flèche) et un autre plus grand

(flèche). A droite par contre, il s'agit d'hétérophiles de Physignathus, ceux-ci sont modérément toxiques

avec une dégranulation et un cytoplasme basophile. Coloration Wright-Giemsa. D'après Strik et al.,

2007

Il y a très peu d’informations concernant les mécanismes cellulaires

conduisant à la phagocytose des micro-organismes par les hétérophiles.

Activation de la phagocytose

La phagocytose réalisée par les macrophages et hétérophiles peut également

être influencée par des molécules telles que les opsonines ou interférons gamma.

Pasmans et al., 2001, ont décrit chez la tortue à temps rouge l’osponisation de

Salmonella enterica, entraînant une augmentation de l’explosion respiratoire des

macrophages et ce par comparaison aux bactéries non préalablement opsonisées.

Les cellules tueuses cytotoxiques (NK cells)

Elles forment un sous groupe de lymphocytes et sont caractérisées par leur

capacité innée à détruire les cellules infectées sans avoir été préalablement ni

recrutées ni activées par les cellules présentatrices d’antigènes. Les cellules tueuses

naturelles prennent en charge les cellules infectées via leur récepteur Fc, qui se lie aux

anticorps recouvrant les cellules infectées. Ce processus est nommé cytotoxicité à

médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC). Les cellules tueuses naturelles

ont été mises en évidence et caractérisées par Sherif and El Ridi (1992) chez les

couleuvres sifflantes des sables (Psammophis sibilans) et par Munoz et al., (2000)

chez la tortue Caspienne. Pour cette espèces, l’activité NK était plus importante en

hiver et été (hiver et printemps pour les cellules thymique des mâles) qu’en automne

et printemps. Une activité plus importante a été détectée chez la couleuvre africaine

53

(Psammophis sibilans) au printemps et en automne (Sherif and El Ridi, 1992). Cela

suggère une variation saisonnière quant au nombre de sous populations ayant une

activité NK chez ces deux espèces avec très probablement une panoplie de cellules

NK différente. Sherif and El Ridi (1992) suggère que l’activité NK chez Psammophis

sibilans est corrélée aux lymphocytes B et T car leur variation saisonnière en nombre

était directement proportionnelle à l’activité NK chez cette espèce. Au contraire,

Munoz et al., (2000) suggèrent que l'augmentation d'activité des cellules NK, qui se

produit au même moment que l’involution des tissus lymphatiques chez la tortue

caspienne, pourrait être une adaptation d'évolution à cette immunosuppression

physiologique saisonnière.

Les éosinophiles

Les éosinophiles sont de grandes cellules (9 à 20 m), rondes, de même taille

que les hétérophiles. Elles possèdent un cytoplasme clair rempli de granules

éosinophiles et sphériques ainsi qu'un noyau bilobé, qui peut être centré ou non (Fig.

14). Chez les tortues vertes, deux types d'éosinophiles ont été décrits (Work et al.,

1998). Une morphologie anormale est extrèmement rare ; les éosinophiles immatures

contiennent des granules intracytoplasmiques pâles, modérément basophiles, ronds ou

allongés (Fig. 14). Chez les reptiles sains, leur nombre varie entre 7 et 20% des

leucocytes (Frye, 1991) avec les valeurs les plus élevées chez les tortues et les valeurs

faibles chez les lézards (Sypek and Borysenko, 1988). Leur nombre varie en fonction

de facteurs saisonniers, avec des valeurs plus faibles rapportées en été et élevées au

cours de l'hibernation (Duguy, 1970). Une éosinophilie peut être associée au

parasitisme ou à une stimulation immunitaire non spécifique. Les éosinophiles

participent à la réponse immunitaire des tortues hargneuses (Chelydra serpentina) en

phagocytant des complexes immuns lors d’infections, ainsi que chez les jeunes

alligators Américains sains dont les cellules sanguines périphériques sont mises en

présence de Staphylococcus aureus (Stacy et al., 2011).

54

Figure 14. Photomicrographie d'éosinophiles. A gauche, il s'agit d'un éosinophile normal (tête de la

flèche) d'alligator ; on remarque un hétérophile toxique (flèche). A droite, il s'agit de 2 éosinophiles de

Cuora galbinifrons, tortue indonésienne très rare. L'un est normal (flèche) et l'autre plus large est

toxique avec des granules basophiles primaires et éosinophiles secondaires (Coloration Wright-

Giemsa ; D'après Strik et al., 2007). Les cellules dites toxiques subissent un changement

morphologique tel que dans les cas modérés une dégranulation, un cytoplasme basophilique, et dans les

cas sévères, une vacuolisation cytoplasmique et la présence de granules cytoplasmiques

pléiomorphiques. Ces cellules « toxiques » ont été activées et libèrent par phase des médiateurs

inflammatoires et de molécules toxiques.

2. Les mécanismes de défense spécifique

a. Les Lymphocytes : présentation générale (Abbas et al., 2015)

Les lymphocytes sont des cellules intervenant dans l’immunité acquise. Ils

sont traditionnellement divisés en deux groupes, les B pour Bourse de Fabricius (chez

les oiseaux) et Bone marrow (moelle osseuse pour les mammifères) ainsi que les

lymphocytes T (Thymus chez les mammifères). Les deux sous-populations

proviennent de la moelle osseuse ; les lymphocytes migrent progressivement vers leur

organe de différenciation où ils se divisent, puis subissent un processus de maturation

par étapes. Le processus de maturation des lymphocytes B s’effectue dans la moelle

osseuse; le lymphocyte B immature exprimant une IgM complète à sa surface subira

une sélection envers les antigènes du soi. Les cellules B qui survivront à cette

sélection se retrouveront dans les organes lymphoïdes secondaires, où elles

deviendront des lymphocytes B matures, exprimant en plus une IgD à sa surface et

pouvant être activées par des antigènes exogènes.

Le processus de maturation des lymphocytes T permet de conserver une

grande diversité de reconnaissance des antigènes par les récepteurs des lymphocytes T

et des anticorps tout en prévenant d’une action contre les antigènes du soi. Les

55

lymphocytes sélectionnés positivement permettent la défense contre les antigènes

étrangers reconnus dans un contexte CMH, tandis que la sélection négative est

essentielle pour éviter les réactions auto-immunitaires. À leur arrivée dans le cortex

thymique, les progéniteurs lymphoïdes vont interagir avec un réseau de cellules

épithéliales, afin d’acquérir certaines molécules de surface dont le Thy-1. Les cellules

deviennent ainsi thymocytes « doubles négatifs ». Lorsque les thymocytes expriment

les molécules CD44 (molécule d’adhésion) et CD25 (récepteur de l’interleukine 2),

les gènes codant pour la chaîne β du récepteur T se réarrangent pour être exprimée.

Les cellules qui échouent meurent, alors que les cellules qui réussissent et produisent

une chaîne β fonctionnelle, survivent et perdent l’expression de CD25. La chaîne β

s’assemble ensuite avec une chaîne α pour former le pré-récepteur T (pré-RcT),

accompagné du CD3. L’assemblage CD3/pré-RcT engendre une prolifération et

l’expression des molécules CD4 et CD8, appelés thymocytes « doubles positifs ».

Lorsque la prolifération s’arrête, les gènes codant pour la chaîne α se réarrangent.

Lorsque la chaîne α et la chaîne β sont exprimées à la surface cela forme le récepteur

T fonctionnel. Par la suite, les cellules « doubles positives » passent un processus de

sélection positive avant de migrer vers la médulla pour subir une sélection négative.

La sélection positive permet la survie des thymocytes qui possèdent une bonne

affinité avec les CMH de classe I et II exprimés sur les cellules épithéliales du cortex

thymique. Cette sélection est nécessaire pour induire une réponse immunitaire

restreinte spécifique du soi. Les thymocytes « doubles positifs » interagissent avec les

CMH I et II par leur RcT et les molécules CD8 et CD4 respectivement. Les

thymocytes qui ne se lieront pas aux CMH mourront par apoptose. La sélection

négative permet d’éliminer les thymocytes qui réagissent fortement aux interactions

entre le CMH de classe I et II des cellules dendritiques et macrophages, présentant un

peptide du soi. Le but étant de développer une tolérance au soi.

Une fois matures, les lymphocytes B et T, en état de repos, se retrouvent dans

la circulation sanguine afin d’atteindre les organes et tissus lymphoïdes (nœuds

lymphatiques, tissu lymphoïde associée aux intestins et aux bronches, rate, …) où ils

rencontreront des antigènes étrangers. L'activation des lymphocytes T nécessite la

présentation des antigènes étrangers par une cellule présentatrice d’antigène ou CPA

(macrophage, cellule dendritique ou lymphocyte B). Le premier signal d'activation du

lymphocyte T présentant un marqueur de surface CD4+ est constitué par l'engagement

56

d'un récepteur T avec un CMH de classe II, présentant un peptide immunogène sur

une CPA. L’activation complète des lymphocytes nécessite un second signal, appelé

co-stimulation, qui doit être reçu au moment de la reconnaissance de l’antigène par le

RcT. Les lymphocytes activés synthétisent des cytokines et entrent en division

cellulaire. Les lymphocytes CD4+

libèrent l’interleukine 2 (IL-2) et expriment la

chaîne α du récepteur de l’IL-2 (CD25), permettant ainsi à cette cytokine d’agir de

manière autocrine pour activer leur prolifération. Les lymphocytes T CD4+

reconnaissent également les peptides antigéniques exposés en association avec le

CMH de type 1. La libération d'IL-2 par les cellules CD4+ peut aussi activer les

lymphocytes CD8+ reconnaissant un antigène étranger présenté par un CMH de classe

I. Les lymphocytes T CD4+ sont impliqués dans la régulation de la réponse

immunitaire acquise.

La différenciation des lymphocytes T CD4+ naïf peut se produire en deux

directions : lymphocyte T helper TH1 ou TH2. La production de cellules TH1 mène à

une immunité cellulaire, tandis que la production de cellules TH2 mène à une

immunité humorale. La différence entre les cellules TH1 et TH2 réside dans les

patrons de cytokines produites. Les cellules TH1 sécrètent principalement l’intéféron

INF-γ, l’IL-2, les TNF-α et TNF-β, tandis que les cellules TH2 sécrètent

principalement les interleukines IL-4, IL-5, IL-10 et le TGF-β.

La stimulation des lymphocytes T CD8+ ou cellules T cytotoxiques requiert un

signal généré par la liaison du CMH de classe I présentant un peptide étranger, des

signaux de co-stimulation et un signal généré par la liaison de L'IL-2 à son récepteur.

Une cellule dendritique activée, possédant des molécules de co-stimulation, peut

directement activer un lymphocyte T CD8+. La cellule T CD8

+ peut alors sécréter

l’IL-2 et induire sa propre activation et différenciation. Les protéines virales produites

par les cellules infectées, sont dégradées par un complexe de protéases catalytiques

appelé le protéasome. Les peptides de l’agent viral qui en résultent sont ensuite

transportés au sein du réticulum endoplasmique où ils sont chargés avec le CMH-1

pour être exprimés à la surface cellulaire. Ces peptides présentés avec le CMH-1 sont

détectés par les récepteurs des lymphocytes T CD8+. Lors de la rencontre entre un

lymphocyte T CD8+ activé et sa cible spécifique, celui-ci s’attache à la cible et sécrète

un grand nombre de facteurs (perforines et granzymes principalement) qui forment

57

ainsi des « trous » dans la membrane cellulaire conduisant à la mort cellulaire. Les

cellules T cytotoxiques sont efficaces pour éliminer les cellules infectées par des virus

ou des parasites, inaccessibles par les anticorps et interviennent dans le rejet de

greffes allogéniques.

Les lymphocytes B forment une population responsable du bon

fonctionnement de la réponse immunitaire humorale. Ces cellules peuvent détecter les

antigènes via les immunoglobulines ancrées dans leur membrane. Elles forment le

récepteur des lymphocytes B. Il a été montré qu’elles existent chez les reptiles (Sherif

and El Ridi, 1992). Lorsqu’un lymphocyte B rencontre un antigène donné, il est en

général nécessaire qu’apparaisse un second signal en provenance des lymphocytes Th

CD4+ afin que les lymphocytes B s’activent et soient en mesure de produire des

anticorps. Suite à la captation de protéines solubles par leur récepteur, les

lymphocytes B internalisent ce complexe où l’antigène sera dégradé et présenté par

les CMH de classe II. Les récepteurs des cellules T CD4+ reconnaissent le peptide

étranger présenté par les CMH II sur le lymphocyte B, puis les cellules CD4+

sécrètent les interleukines IL-4 et IL-5, qui sont nécessaires à l'activation complète

des lymphocytes B. Cette activation conduit à une expansion clonale de la cellule B

spécifique de l’antigène donné. Ces cellules B actives et en grand nombre vont

ensuite subir une maturation afin de devenir des plasmocytes capables de produire et

libérer des anticorps dans l’environnement dans lequel se trouve l’antigène. Une fois

l’infection résolue, les cellules B et T activées, spécifiques de l’antigène forment un

pool de cellules mémoires circulantes qui seront réactivées lorsqu’elles rencontreront

le même pathogène.

58

Figure 15. Immunité adaptative. D’après Abbas

et al, 2015.

Immunité humorale impliquant les lymphocytes B. Secretion d’anticorps pour éliminer les

microbes extracellulaires. Immunité à médiation

cellulaire. Les lymphocytes Th activent les

macrophages afin qu’ils tuent les microbes

phagocytés. Les lymphocytes Tc éliminent

directement les cellules infectées par des virus.

Figure 16. Réponse immunitaire en réponse à une

infection virale. D’après Lambotin et al., 2010.

CPA activées présentant l’antigène aux lymphocytes T

CD4+et CD8+ naïfs qui sont activés via la reconnaissance

du CMH par le TCR. Les CPA produisent aussi des

cytokines: interféron-α (IFNα), interleukine-12 (IL-12) et IL-15 qui vont influencées la survie et différenciation des

lymphocytes et cellules NK. Les lymphocytes T CD4+

vont se différencier en TH1 ou TH2. L’interféron-γ (IFN-

γ) sécrété par les TH1 va stimuler l’activation des

lymphocytes cytotoxiques ainsi que la production d’IgG1

par les lymphocytes B tout en inhibant l’activation des

TH1. Les anticorps sont dans ce cas neutralisants. Les

cellules cytotoxiques et les NK sécrètent de l’IFN-γ ou

lyse directement les cellules infectées via la libération de

médiateurs de lyse.

b. Les lymphocytes B et T des reptiles

Les lymphocytes des reptiles ressemblent à ceux des mammifères, variant en

taille avec un diamètre de 5 à 10 m pour les petits et de 15 m pour les grands. La

distinction avec les thrombocytes n'est pas évidente (Fig. 17). Comparé aux

thrombocytes, les lymphocytes sont plus grands et possèdent une bordure plus

distincte. Le noyau du lymphocyte est plus grand, rond ou légèrement oval et

positionné au centre ou légèrement excentré. Les lymphocytes possèdent un rapport

nucléo-cytoplasmique très élevé. Les immatures, présents en faible nombre chez les

animaux sains, sont plus grands, avec un cytoplasme fortement basophile et réduit et

un noyau qui contient de la chromatine très violette et pouvant contenir un nucléole.

59

Figure 17. Photomicrographie de lymphocyte de boa constrictor (tête de flèche) à côté d'un

thrombocyte. Coloration Wright-Giemsa. D'après Strik et al., 2007

Les lymphocytes réactifs sont indicatifs de stimulation antigénique. Ils sont

typiquement plus grands, bien différenciés et possèdent un cytoplasme abondant,

modérément à intensément basophile pouvant contenir de discrètes vacuoles. Certains

lymphocytes réactifs sont plasmacytoïdes en apparence ; ils possèdent un cytoplasme

basophile étendu, avec un noyau excentré ce qui les fait ressembler à des plasmocytes.

Les lymphoblastes, en très faible quantité apparaissent chez des animaux malades

dont le système immunitaire a été très fortement stimulé. Les lymphocytes sont les

leucocytes prédominants du sang périphérique et des tissus hématopoïétiques de la

plupart des reptiles avec un pourcentage pouvant atteindre 80% (Stacy et al., 2011).

Le tableau II illustre les valeurs hématologiques les plus communément obtenues chez

les reptiles. Les valeurs concernant les tortues marines sont décrites dans le chapitre 1

de la partie expérimentale. Leur nombre est influencé par les saisons ainsi que des

facteurs individuels (Stacy et al., 2011). Ils sont en plus faible quantité en hiver ou au

cours des périodes d'hibernation et en quantité élevée l'été ainsi qu'au cours de la mue.

Une lymphocytose est souvent associée à un processus de cicatrisation, une maladie

infectieuse ou inflammatoire, représentant un processus chronique. Les maladies

virales, parasitaires telles que l'anisakiase ou la spirorchidiase ou les maladies dues

aux hématozoaires peuvent induire une lymphocytose (Stacy et al., 2011). Chez les

boidés une lymphocytose peut être provoquée par une leucémie lymphoïde ou la

maladie des corps d'inclusion (Inclusion body disease, IBD) (Stacy et al., 2011). Une

lymphopénie peut également être le témoin de malnutrition ainsi que consécutive à

l'utilisation de corticostéroïdes (Stacy et al., 2011).

60

Tableau II. Valeurs hématologiques publiées chez les reptiles. D’après Campbell.,

2012.

Leucocyt

es

x 1000/µl

Hétérophiles %

Lymphocytes %

Monocytes %

Eosinophiles %

Basophiles %

Lézard 3,9-22,4 16 - 58 2 - 40 0 - 6 0 - 18 4 - 26

Boa

constrict

or

4-10 20 - 65 10 - 60 0 - 6 0 - 3 0 - 20

Python

royal 7,9 – 16,4 56 - 67 7 - 121 2 - 22 – 0 - 2

Tortue

géante

des

Séychell

es

1-8,3 32 - 79 2 - 40 0 – 8 0 – 7 0 - 4

Tortue

du désert 6,6 – 8,9 35 – 60 25 - 50 0 - 4 0 - 4 2 - 15

L’existence de diverses populations de lymphocytes a été indirectement

documentée dans plusieurs études mais n’a jamais été mise en évidence directement.

Ces études suggèrent que l’organisation des lymphocytes circulants chez les reptiles

serait similaire à celle des mammifères et des oiseaux. Ceci a été mis en évidence

chez l’alligator Américain grâce à l’utilisation de mitogènes spécifiques des

lymphocytes B et T afin de distinguer fonctionnellement ces deux populations

(Cuchens and Clem, 1979). De plus, des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre

les immunoglobulines d’alligators ont été utilisés afin d’identifier et de distinguer les

lymphocytes B des autres. L’évidence de l’existence des sous-populations de

lymphocytes T chez les reptiles a été rapportée. El Masri et al., 1995, suggère

l’existence de quatre sous-populations de lymphocytes T chez le scinque (Chalcides

ocellatus) qui sont distinctes phénotypiquement soit par la présence ou l’absence de

deux antigènes de surface (antigène thêta) et le récepteur pour l'agglutinine de

cacahuète. D’autres études suggèrent l’existence d’une sous-population de cellules T-

helper (Origgi et al., 2007). Chez la couleuvre de Forsskal (Psammophis schokari),

les éléments lymphoïdes de la rate, thymus, et une partie du GALT sont bien

développés en automne et au printemps alors qu’ils en sont dépourvus en été et hiver.

61

La réponse humorale aux divers antigènes tels que les érythrocytes de rat (RRBC), le

sérum d’albumine humaine (HSA), ou de polyvidone (PVP) était forte durant le

printemps et l’automne. Au contraire, cette réponse dirigée contre les RRBC et HSA

était faible en été alors qu'elle demeurait forte vis-à-vis de la PVP, un antigène thymo-

indépendant chez les mammifères. Ainsi, ces résultats montrent l’existence de

l’activité des lymphocytes T-helper en automne et printemps qui est absente pendant

les autres saisons à cause de la disparition ou réduction des sous-populations de

lymphocytes T. Plus récemment, la prolifération des lymphocytes T a été mise en

évidence chez le sphénodon ponctué (Sphenodon punctatus) (Burnham et al., 2005)

consécutive à une stimulation par des mitogènes spécifiques des lymphocytes T (PHA

et ConA). Les sous-populations de lymphocytes B ont également été explorées

(Munoz et al., 2000). Il a été observé une saisonnalité concernant l’adhérence des

lymphocytes B et la prolifération cellulaire au mitogène constitué par la phytolaque

chez la tortue caspienne, contrairement à l’exposition au lipopolysaccharide où la

prolifération cellulaire a été détectée tout au long de l’année, suggérant une sous-

population différente.

c. Les immunoglobulines

Les immunoglobulines sont des glycoprotéines sécrétées par les lymphocytes

B en réponse à une stimulation antigénique. Elles possèdent une structure conservée

en « Y ». Les immunoglobulines sont en général composées de deux paires de chaînes

légères et lourdes reliées par des forces non covalentes et des ponts di-sulfure. Les

chaînes lourdes et légères sont composées de domaines variables et constants. Les

domaines variables interagissent avec l’antigène alors que les domaines constants sont

structuraux. L’activation des lymphocytes B conduit à leur expansion clonale afin de

créer un groupe de lymphocytes spécifiques de cet antigène. Ces cellules activées

vont subir une maturation afin de devenir des cellules productrices d’anticorps dirigés

contre l’antigène initial qui pourront être libérés dans l’organisme.

Chez les reptiles, les immunoglobulines ont été peu étudiées. La plupart des

informations proviennent d’extrapolations par comparaison aux autres espèces. Il

existerait des différences de maturation des anticorps entre les divers groupes de

reptiles (Origgi et al., 2007) comme les tortues des steppes (Agrionemys horsfieldii)

par comparaison au serpent de verre (Ophisaurus sp.). Il y a peu d’information

62

concernant la structure des immunoglobulines chez les reptiles. L’immunoglobuline

IgY est considérée comme l’homologue des IgG et IgE chez les mammifères.

Contrairement aux IgG des mammifères, les IgY ne possèdent pas de jonction ce qui

confère à la molécule une moindre flexibilité. Considérant l’ensemble des reptiles, au

moins deux isotypes distincts ont été détectés : IgM et IgY (Cooper et al., 1985). Plus

récemment, la cinétique de production des anticorps a été suivie chez la tortue verte

en utilisant des anticorps monoclonaux dirigés contre les fractions 19S, 7S et 5,7S des

immunoglobulines (Herbst and Klein, 1995) de tortue verte. La réponse des IgY (7S)

est précoce, suivie par celle des IgY tronquées (5,7S) pour laquelle 3 mois à plus de 8

mois sont nécessaires pour être détectée. Les cinétiques de production des IgM sont

plus délicates à évaluer (Herbst and Klein, 1995).

L’étude de la réponse immunitaire humorale des reptiles a bénéficié du

développement de tests sérologiques. Des tests ELISA ont été développés afin

d’évaluer la production d’anticorps chez la tortue du désert (Gopherus polyphemus),

l’alligator d’Amérique, le caïman à museau large (Caïman latirostris), le crocodile du

Siam (Crocodylus siamensis) (Origgi et al., 2007), la tortue marine verte (Herbst and

Klein, 1995 ; Work et al., 2000), les tortues grecque et d’Hermann (Origgi et al.,

2001) et le boa constrictor (Boa constrictor) (Origgi et al., 2007). Une séroconversion

vis à vis de l’antigène sélectionné pourrait être détectée dès 4 semaines post-injection

chez la tortue grecque (Origgi et al., 2001), chez la tortue gaufrée du désert et le boa

constrictor (Origgi et al., 2007), et dès 6 semaines chez l’alligator, le caïman, le

crocodile du Siam et la tortue verte (Work et al., 2000).

Les fonctions des Igs comprennent la neutralisation, l’agglutination, la

précipitation et la fixation du complément. Les deux dernières fonctions ne seront pas

développées puisqu’il n’existe pas de travaux probants à ce jour.

La neutralisation est la capacité à bloquer l’interaction entre un virus ou une

toxine avec les récepteurs exposés à la membrane de la cellule cible. La neutralisation

par des anticorps reptiliens est utilisée dans les tests de séroneutralisation afin de

déterminer l’exposition éventuelle des chéloniens aux herpès virus (Origgi et al.,

2001). La neutralisation des anticorps sériques requièrent sept à neuf semaines afin

d’obtenir un seuil de détection suffisant pour déterminer l’exposition aux herpès virus.

Pour détecter les anticorps IgY, deux à cinq semaines supplémentaires sont

63

nécessaires (Origgi et al., 2001). En effet, l’activité neutralisante nécessite une

maturation des anticorps, ce qui requière plusieurs semaines. Le test ELISA détecte la

production de tous les anticorps anti-herpèsvirus, ce qui commence peu après

l’infection tandis que la présence d’anticorps capables de neutraliser le virus demande

plus de temps.

L’agglutination se produit lorsque les anticorps se lient aux antigènes qui se

regroupent et par conséquent ne peuvent plus diffuser dans l’organisme. Cette étape

induit l’activation de la phagocytose. La précipitation se produit lors de la liaison

entre anticorps et antigènes solubles qui précipitent et deviennent ainsi inactifs. Ces

deux mécanismes ont été décrits chez les tortues hargneuses, les tortues grecques et

les tortues d’Hermann et des Steppes (Origgi et al., 2007). L’inhibition de

l’hémagglutination a été utilisée pour évaluer l’exposition des serpents au

paramyxovirus (Jacobson et al., 1981).

d. La réponse immunitaire à médiation cellulaire.

L’évaluation de ce type de réponse immune a été réalisée en grande partie

grâce à des études fonctionnelles. Celles-ci sont en effet basées sur la détection et la

mesure de trois réactions fondées sur la médiation cellulaire : le rejet de greffes, le

rejet du greffon contre l’hôte et la réaction lymphocytaire mixte. Ces trois

composantes ont toutes été observées chez les reptiles, indirectement, suggérant

l’existence de lymphocytes T allo-réactifs et d’homologues reptiliens de déterminants

de base et d’acteurs de la réponse immunitaire cellulaire comme chez les vertébrés

supérieurs (Origgi et al., 2007).

Allogreffes et xénogreffes

Des organes de tortues peintes (Chrysemys picta) transplantés au sein

d’embryons de tortues hargneuses ont été soit acceptés soit rejetés partiellement

tandis que des xénogreffes provenant de tortues à carapace molle de Floride (Apalone

ferox) ont toujours été rejetées. La distance phylogénétique faible existant entre les

deux premières espèces peut expliquer le rejet partiel par comparaison à la distance

phylogénétique plus imporatante existant entre les deux espèces de tortutes suivantes

(Cooper et al., 1985). Les allogreffes ont été rejetées de très nombreuses fois et ce

pour diverses espèces de reptiles.

64

La réaction du greffon contre l’hôte

La réaction du greffon contre l’hôte a été objectivée in vitro en mélangeant des

splénocytes de tortues hargneuses adultes (hôte) avec des fragments de rate de

juvéniles (greffon) afin d’obtenir des splénocytes allogéniques (donneur et receveur

différents). La réaction du greffon contre l’hôte a été observée uniquement lorsque les

individus avaient moins de trois mois.

Réaction lymphocytaire mixte : MLR

Des injections intrapéritonéales de splénocytes administrées à des nouveaux

nés, receveurs allogènes ont induit une splénomégalie, un retard de croissance et

aboutit à la mort. Farag and el Ridi (1985) ont étudié la réaction lymphocytaire mixte

chez la couleuvre africaine (Psammophis sibilans) en utilisant des splénocytes

provenant d’autres races de serpents. La prolifération observée lors des cultures de

réactions lymphocytaires mixtes a mis en évidence la présence de sous-populations

lymphocytaires capables de reconnaître et de répondre aux allo-antigènes. Les

analyses plus poussées de greffes de peau, réaction lymphocytaire mixte et de

lympholyse à médiation cellulaire ont permis de suggérer l’existence d’un CMH chez

les reptiles (Farag and El Ridi, 1990)

65

3. Récapitulatif des tests pouvant être utilisés

Tableau III : Divers tests des fonctions du système immunitaire utilisés chez les

reptiles ainsi que leurs limites. (Adapté d'après Keller et al., 2005b).

Test Catégorie Captivité

requise?

Euthanasie

requise?a

Réactif spé

d'espèce?

Référence

Biochimie

Numération formule

Général

Général

Non

Non

Non

Non

Non

Non

Keller et al.,

Bolten et al.,

Histologie Général Non Oui Non Leceta et al.,

Activité NK Inné Non Oui/Non Non Munoz et al.,

Phagocytose Inné Non Oui/Non Non Mondal et al.,

Production nitrate Inné Non Oui/Non Non Mondal et al.,

Activité lysozyme Inné Non Non Non Walsh et al.,

Explosion

respiratoire

Inné Non Oui/Non Non Pasmans et al.,

Lymphocyte

Immuno-marquage

IMC Non Oui/Non Oui El Masri et al.,

Munoz et al.,

Réaction

lymphocytaire mixte

IMC Non Oui/Non Non Saad and El Ridi

Hypersensibilité IMC Oui Non Non Coope et al.,

Rejet d'allogreffe IMC Oui Non Non Saad and El Ridi

Activité cytotoxique IMC Non Oui/Non Non Farag and El Ridi

Prolifération

lymphocytaire

Lymphocyte T

IMC Non Oui/Non Non Keller et al; Ulsh

et al; Mc Kinney

and Bentley;

Cuchens et al.,

Lymphocyte B IMH Non Oui/Non Non idem

Titrage IgY IgM IMH Non Non Oui/Nonb Herbst and Klein

Titrage anticorps

suite à épreuve

IMH Oui Non Oui/Nonb Herbst and Klein

Lyse formant des

plages

IMH Oui Oui Non Leceta and Zapata

IMC: immunité à médiation cellulaire

IMH: immunité à médiation humorale a Oui/Non : Euthanasie requise pour collecter les lymphocytes de la rate et du thymus ou les

macrophage de la cavité péritonéale. b Réactif spécifique d'espèce requis sauf si le test utilisé est l'hémagglutination.

66

4. La mémoire immunitaire chez les reptiles

La caractéristique la plus importante de l’immunité adaptative est

probablement la capacité du système immunitaire de l’hôte à réagir contre un antigène

précédemment rencontré de manière plus rapide, plus forte (titre d’anticorps plus

important) et plus longue qu’au cours de la réponse primitive. La mémoire

immunitaire est permise par l’existence de lymphocytes B et T produits au cours de la

réponse primaire.

L’existence d’une mémoire immunitaire chez les reptiles est encore

controversée. Le stress a un effet immunosuppresseur important pouvant biaiser les

études. La température est également un facteur important : de faibles variations

peuvent conduire à des déductions erronées. L’étude la plus récente de l’existence

d’une mémoire immunitaire humorale chez les reptiles a été apportée par Origgi et al.,

(2004). Lors d’une étude expérimentale de transmission d’herpès virus chez la tortue

grecque, une courte phase de décalage et des titres de neutralisation plus élevés ont

été enregistrés lors d’une seconde exposition à l’antigène. Cependant il était

impossible de détecter une quantité plus importante d’anticorps totaux (non

neutralisants) dirigés contre le virus. La durée du pic de la réponse secondaire n’a pas

pu être déterminée.

5. Facteurs de variation de la réponse immune

De nombreux facteurs peuvent influencer les processus complexes de la

réponse immunitaire tels que l’âge, le statut nutritionnel, la reproduction, la génétique,

les antigènes utilisés, les voies de pénétration des antigènes, la température, la saison,

le stress, et beaucoup d’autres pouvant être regroupés en facteurs intrinsèques (relatif

à l’hôte) et extrinsèques. Les reptiles sont des vertébrés ectothermes donc

particulièrement sensibles aux facteurs extrinsèques. Nous n’aborderons que les deux

principaux que sont la température et la saisonnalité.

a. La température

Le système immunitaire inné et acquis des reptiles est très fortement influencé

par la température (Cooper et al., 1985 ; Origgi et al., 2007). Les tortues d’Hermann

immunisées avec du sérum de porc (NPS) ont montré une production d’anticorps

67

retardée lorsqu’elles étaient maintenues à 20°C comparativement à 28°C. Le système

immunitaire humoral des tortues grecques vis à vis de Brucella abortus était réprimé

lorsque celles-ci étaient maintenues en dessous de 10°C par comparaison à 15 ou

30°C. Chez les iguanes du désert, les températures au delà de 40°C et en deçà de 25°C

étaient associées à une production d’anticorps plus faible contre l’antigène anti-

Saitohin. Chez Emerias véloce (Eremias velox) et l’iguane de l’île d’Andros aux

Bahamas (Cyclura cychlura), la réponse anticorps contre l’encéphalite à tique n’était

pas détectable lorsque les lézards étaient maintenus à 4°C mais l’était à 37°C. De

manière identique, aucune réponse anticorps n’a été détectée chez le saurien Egernia

cunninghami immunisé avec des SRBC, lorsque les individus sont maintenus à 20°C,

tandis qu’une réponse mesurable était présente à des températures plus élevées avec

une réponse maximale à 30°C. Les allogreffes et xénogreffes sont dépendantes de la

température chez la tortue hargneuse, ainsi que la réaction du greffon contre l’hôte

chez les très jeunes individus de cette même espèce.

b. La saison et les hormones

L’influence des saisons a été décrite très largement chez les reptiles (Origgi et

al., 2007). Chez la tortue de Hermann immunisée à diverses périodes de l’année, la

réponse immunitaire varie grandement. La plus forte réponse immunitaire est obtenue

chez les individus immunisés au printemps (avril), tandis que les animaux immunisés

début octobre réagissaient faiblement. De manière intéressante, les tortues

immunisées tardivement en automne (novembre) possèdent une réponse humorale

légèrement plus faible qu’une immunisation de printemps, mais plus forte qu’en

automne. Leceta and Zapata (1986) ont évalué les réponses anticorps primaires et

secondaires ainsi que les réponses PFC (« hemolysin plaque-forming cell ») chez la

tortue caspienne en été et automne. Les réponses PFC sont obtenues en injectant des

globules rouges de mouton, comme antigènes, aux animaux. Après prélèvement de la

rate, la production d'anticorps anti-globules rouges de mouton est estimée par le

nombre de PFC, c'est-à-dire par le nombre de plages de lyse obtenues. La première

immunisation déclenche la production d’anticorps sensibles au mercaptoéthanol (2-

ME) ainsi que de réponses PFC en automne, contrairement à l’été. Au cours de la

seconde réponse, des anticorps résistants au 2-ME ont été détectés en automne et en

été, tandis que le nombre de PFC était significativement réduit en été.

68

Concernant la réponse cellulaire, chez la couleuvre des sables africaine, la

réaction lymphocytaire mixte est observable uniquement au printemps et en automne

(Farag and El Ridi, 1985). Chez le scinque ocellé, la réaction lymphocytaire mixte et

le rejet de greffe étaient non fonctionnels en hiver, et plus faibles au printemps qu’en

automne (Saad and El Ridi, 1984). Munoz and De la Fuente (2001) ont étudié les

fonctionnalités (adhérence au substrat, chimiotaxie, réponse de prolifération

lymphocytaire, cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps et cytotoxicité des

cellules tueuses naturelles) des splénocytes chez la tortue caspienne à divers moments

de l’année. En hiver, il a été observé une faible adhérence au substrat, une forte

chimiotaxie et une forte activité cytotoxique, tandis qu’en automne, seule l’adhérence

au substrat était importante. Enfin, au printemps, de fortes activités ont été

enregistrées uniquement pour les réponses lymphocytaires prolifératives. Les mêmes

auteurs ont étudié l’influence des saisons sur les thymocytes de la tortue caspienne

(Munoz and De la Fuente, 2001). De manière générale, les plus faibles réponses

(chimiotaxie, cytotoxicité et prolifération lymphocytaire après exposition aux

mitogènes) étaient observées en automne et ce pour les deux sexes. La prolifération

lymphocytaire était à son maximum au printemps. Chez les femelles, les thymocytes

possèdent la plus forte cytotoxicité et activité chimiotaxique durant l’été. Enfin, les

mêmes tests fonctionnels ont été utilisés pour étudier l’influence de la saison sur les

lymphocytes du sang périphérique. La chimiotaxie, réponse lymphocytaire aux

mitogènes et la cytotoxicité étaient élevées en hiver. La prolifération lymphocytaire

était élevée jusqu’au printemps avant de diminuer en été, alors que l’adhérence, la

chimiotaxie et la cytotoxicté augmentaient en été.

Les saisons influencent également la structure et le remaniement des tissus

lymphoïdes. Chez la tortue caspienne, la rate et le thymus présentent des variations

saisonnières : la corticale et médullaire du thymus ainsi que les manchons

lymphocytaires péri-artériolaires et la pulpe blanche péri-ellipsoïdale sont affectés

différemment (Leceta and Zapata, 1985). L’involution thymique se produit

généralement en été. Au début du printemps la corticale n’est pas bien développée et

ce malgré une augmentation de volume du thymus. Toutefois en fin de printemps, la

corticale et la médullaire sont à nouveau bien développées, dès lors que le thymus

prend un volume plus conséquent. A cette même période, la pulpe blanche de la rate

69

se développe également de manière conséquente avant d’involuer en été. Les

structures non lymphoïdes du thymus, subissent aussi une variation saisonnière.

Les changements saisonniers des fonctions immunitaires des reptiles semblent

être corrélés aux variations hormonales et aux changements structuraux des tissus

lymphoïdes. Chez le scinque ocellé, quatre populations de lymphocytes T

(PNA+Thy1-, PNA+ Thy1+, PNA-Thy1-, PNAThy1+) étaient affectées

indépendemment des saisons en présence de niveau de stéroïdes endogènes (El Masri

et al., 1995). Les cellules PNA+ démontrent une capacité à lier une lectine particulière,

la peanut agglutinine (PNA). Chacune des populations lymphocytaires T (moelle

osseuse, rate, thymus et autres populations lymphocytaires) était modulée

différemment par des taux de stéroïdes endogènes. L’étude des effets des variations

saisonnières des corticoïdes endogènes sur les fonctions du système immunitaire du

scinque ocellé ont montré que le développement optimum de la pulpe blanche associé

à une forte réponse immunitaire se produisait du printemps à début d’automne et été

correlé avec un faible niveau de corticoïdes (Origgi et al., 2007). A l’inverse, une

involution marquée des tissus lymphoïdes était observée en automne et hiver et

associée à de forts niveaux de corticoïdes endogènes ou exogènes (acétate

d’hydrocortisone). Un traitement des lézards à l’acétate d’hydrocortisone montraient

une élévation de corticoïdes sanguins forte et durable associée à une involution des

tissus lymphoïdes et un dysfonctionnement de la réactivité immunitaire, mimant ainsi

le statut physiologique de celui-ci d’automne à hiver. De plus, un traitement avec un

antagoniste synthétique du cortisol (metyrapone) en début d’automne interférait avec

l’immunosuppression dépendante des saisons.

La corticostérone est également impliquée dans l’apoptose des thymocytes

comme rapportée chez le gecko d’Inde (Hemidactylus leschenaultii). La

fragmentation de l’ADN induite par la corticostérone semble être dose-dépendante et

requière 48h (Origgi et al., 2007). Le thymus de ce gecko subit de profonds

changements structuraux saisonniers, telle qu'une involution en hiver lorsque les

niveaux d’androgènes sont au maximum. Le thymus se régénère au printemps afin de

devenir pleinement compétent en été, lorsque le niveau de testostérone est à son

minimum. Au cours de ce travail, les auteurs ont pu castrer les animaux et ajouter des

concentrations de testostérone exogène. Il a été décrit ultérieurement un effet

70

inhibiteur direct de la dihydrotestostérone sur la prolifération des thymocytes ainsi

que ses effets indirects sur l’augmentation du processus d’apoptose de thymocytes

dépendant des caspases, le tout médié par les cellules réticulo-épithéliales de la

corticale (Origgi et al., 2007). Chez deux espèces de lézards (Psammodromus algirus

et Acanthodactylus erythrurus), il semble que la stimulation des lymphocytes par la

phytohémagglutinine (PHA) soit fortement diminuée chez les mâles traités à la

testostérone. Une corrélation significativement négative entre la variabilité

individuelle de la réponse médiée par les lymphocytes T et la concentration

plasmatique en testostérone a été observée. Des résultats identiques ont été rapportés

chez le scinque ocellé (Origgi et al., 2007). Cela est à considérer lors d’exposition de

ces reptiles à des polluants organiques mimant les effets des hormones sexuelles

(Bergeron et al., 1994).

IV. Toxicité des polychlorobiphényles chez la tortue marine

Les aspects toxicologiques sont souvent initialement abordés à l’aide de

dosage de la concentration d’un toxique au sein d'un tissu qu’il s’agisse de muscle,

graisse ou divers organes clés entrant dans des processus de détoxification de

l’organisme comme le foie ou les reins. Alors que les tortues marines sont

relativement résistantes aux dommages physiques, tels que les attaques de requins ou

les collisions avec les bateaux, elles sont extrêmement sensibles aux polluants

chimiques (Keller et al., 2005b). Nous nous restreindrons aux polychlorobiphényles

pour ce travail, bien que la même approche pourrait s'appliquer à d'autres composés

chimiques.

A. Les polychlorobiphényles (PCB)

1. Histoire naturelle des polychlorobiphényles

Les polychlorobiphényles (PCB) sont des hydrocarbures halogénés qui

forment un groupe de 209 congénères (Annexe 1) possédant entre 1 et 10 substituts

chlorés sur le cycle biphényle (Fig. 18). Ils possèdent une nomenclature IUPAC

(International Union of Pure and Applied Chemistry). Leur formule empirique est

C12H10-nCln avec n entier nombre d'atomes de chlore.

71

La nomenclature utilisée pour le positionnement des atomes de chlore est la suivante :

- Ortho : substitution au niveau des positions 2, 2’, 6 et 6’

- Meta : substitution au niveau des positions 3, 3’, 5 et 5’

- Para : substitution au niveau des positions 4 et 4’

Figure 18: Structure générale des Polychlorobiphényles

En France, ils ont été synthétisés par l’industrie de 1930 à 1980. Leur

utilisation était alors extrêmement variée : isolants électriques dans les

transformateurs et condensateurs de puissance, additifs dans certaines formulations de

pétrole, agents plastifiants dans les peintures, colles, encres, plastiques, huile de coupe

ou encore lubrifiants (Environmental Protection Agency, 2013), etc … Ces composés

sont des ignifugeants, possèdent une grande stabilité chimique et thermique, d’où leur

intérêt pour l’industrie.

Les propriétés physico-chimiques suivantes sont les points clés à retenir:

Les PCB ont une répartition étendue du fait de leur transport lors du lessivage des

sols ou par le courant, la pluie et le vent (décharges à ciel ouvert) (Safe, 1992).

Faible solubilité aqueuse, ils s’adsorbent aisément sur le sédiment ou les

particules organiques.

Faible dégradation dans l'environnement. Fonction du nombre et de la répartition

des atomes de chlore.

Molécules très stables avec des demi-vies très longues (Safe, 1992).

Lipophiles: concentrent dans les tissus et organes riches en graisse (Safe, 1992).

Bioamplifiables le long de la chaîne trophique, surtout dans les écosystèmes

aquatiques car les chaînes trophiques y sont plus longues (Safe, 1992).

Bioaccumulables.

72

2. Toxicité des PCBs: généralités

En France, leur utilisation a été interdite en 1979 dans quelques produits tels

que les encres, les huiles, les adhésifs ainsi que leur application dans les espaces

ouverts. Puis, en 1987, il a été interdit de vendre ou d’acheter tout matériel contenant

des PCBs. Finalement, en 2003 un plan de décontamination a été mis en place pour

éliminer tout appareil contenant des PCB. Aux Etats Unis, la production de PCBs a

été interdite en 1977. Détectés initialement dans l’environnement en 1966, ces

polluants sont toujours d'actualité malgré les régulations internationales, et se

retouvent dans l’environnement et en particulier dans le milieu aquatique.

Il existe une littérature abondante concernant les PCBs et leurs effets

reprotoxiques, neurotoxiques, immunotoxiques et sur le système endocrinien des

mammifères (Safe, 1994). De nombreuses études ont montré que certains congénères

des PCBs avaient un potentiel cancérigène avéré (US Environmental Protection

Agency et The International Agency for Research on Cancer). La première évaluation

des PCBs en tant que substances cancérigènes effectuée par l’EPA date de 1987. Les

études portaient sur l’Aroclor 1260 uniquement. Ultérieurement, d’autres mélanges

comme l’Aroclor 1016, 1242 et 1254 ont été évalués. Il existe 9 types d'Aroclor (1221,

1232, 1016, 1242, 1248, 1254, 1260, 1262 et 1268), tous commercialisés par

Monsanto Corporation. Les congénères capables d’accumulation dans les poissons et

se liant fortement aux sédiments sont les composées ayant le plus fort potentiel

cancérigène. Des études épidémiologiques rétrospectives effectuées chez des ouvriers

travaillant chez Monsanto exposés aux PCBs en 1936 ont montré que ceux-ci

souffraient plus fréquemment d’acné chlorique ainsi que de cancers hépatiques (EPA,

accessed 2013).

Bien que nous ne rentrerons pas dans les détails, il est important de

comprendre que tous les congénères ne possèdent pas tous la même toxicité. Cela est

dû au nombre d'atomes de chlore ainsi que leur position sur le cycle (Safe, 2001).

Certains congénères dits PCB "dioxin-like", partagent une similarité de structure ainsi

que la coplanarité de la dioxine. Les autres PCB (non "dioxin-like") présentent une

toxicité liée au nombre de substitutions. La 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine

(TCDD) possède une forte affinité pour le récepteur Aryl hydrocarbon (AhR) ainsi

qu'une toxicité élevée. Ainsi un facteur d'équivalence toxique (TEF) a été mis en

place afin d'évaluer la toxicité des PCBs par rapport à celle de la dioxine. Les

73

congénères de PCB sans substitution en position ortho (non-orthosubstitués) ou avec

une substitution en position ortho (mono-orthosubstitués) et ayant des chlores en

position para et au moins deux chlores en position meta sont appelés "dioxin-like"

(PCB-126, voir Annexe 1). Ainsi les congénères "dioxin-like" non-orthosubstitués

(comme les PCB-77, PCB-81, PCB-126 et PCB-169) sont coplanaires et les "dioxin-

like" mono-orthosubstitués sont non coplanaires (PCB-105). Chez les vertébrés, les

enzymes de phase 1 des processus de détoxification comme les cytochromes P450-

isoforme A1 sont induites par les hydrocarbures aromatiques polycycliques via leur

liaison au récépteur AhR (Safe, 2001). Les PCB di-,tri- ou trétra-orthosubstitués sont

plus encombrants ce qui leur confère une toxicité différente de celle des "dioxin-like",

faisant intervenir des mécanismes de toxicité indépendante de l’activation du

récepteur AhR (Safe, 2001).

3. Effets biologiques des PCBs chez les tortues

a. Les voies d'entrée

Dans l’environnement, les PCBs sont toujours sous forme de mélanges

complexes, associés à d’autres contaminants, et il est ainsi souvent impossible

d’assigner un lien de causalité à un composé en particulier. A cause du faible nombre

d’études expérimentales, les voies d’entrées des contaminants et les mécanismes

conduisant à leur toxicité sont relativement peu connus chez les reptiles. Comme tout

vertébré, les voies d’entrées principales sont le derme, les tractus respiratoire et

digestif. L'importance du rôle du derme est souvent sous-estimé. La pérméabilité de la

peau des reptiles varie considérablement d'une espèce à l'autre et ce en fonction de

l'hypoderme et de la kératinisation. Les espèces aquatiques possèdent une peau

relativement perméable afin de faciliter la respiration, ce qui va les rendre plus

susceptibles aux atteintes chimiques. Les études ayant montré la susceptibilité du

derme des tortues marines aux polluants concerne les effets du pétrole (Lutcavage et

al., 1995). Les tortues caouannes ayant une alimentation carnée donc se situant assez

haut dans le réseau trophique encourent un risque accru d’exposition aux polluants

permis par une bioaccumulation importante. Les ingestions accidentelles de déchets,

notamment plastiques concourrent à l'absorption de toxiques (organiques ou

inorganiques). Le comportement de plongée des tortues marines n'est pas dépourvu

74

de risque. En effet, les tortues inspirent un large volume d’air, à l’interface air-eau,

avant de plonger et remontent à la surface. Tous les produits émettant des vapeurs

toxiques à la surface de l’eau, comme par exemple le pétrole, sont dangereux et

arrivent directement aux poumons (Milton and Lutz, 2003). Les nouveaux-nés sont

les plus affectés par cette voie d’entrée car passent plus de temps à la surface que les

juvéniles et adultes. Les voies d'entrées principales de toxiques ainsi que leurs

conséquences majeures chez la tortue marine sont schématisées sur la Fig. 19.

Figure 19. Voies d'entrées et conséquence d'exposition aux toxiques (adapté d'après Lutz, 1990).

b. Excrétion du sel : les glandes à sel

Les reptiles ne peuvent pas concentrer leurs urines qui sont hyperosmotiques

par rapport au sang ; ainsi de nombreuses espèces possèdent des sites extra-rénaux

d’excrétion du sel (sel de l’eau de mer et de l’alimentation) constituant un mécanisme

d’homéostasie. Cela est particulièrement vrai pour les espèces marines, telles que les

tortues marines, les serpents de mer, les crocodiles de mer ainsi que les espèces

désertiques telles que le chuckwalla (Sauromalus spp.) et l’iguane du désert

(Dipsosaurus dorsalis). Chez les tortues marines et les terrapins à dos de diamant

(Malaclemys terrapin), les glandes lacrymales situées dans la partie postérieure de

Peau •Carcinogène

• Parasitisme

•Dermatite

Poumon

• Capacité aérobie réduite

•Temps de plongée réduit

Intestin

•Diminution de l'assimilation

•Effets internes: hormone et dysfonction organique

Organes des sens

• Interférence (glande à sel)

Oeufs •Développement

anormal

75

l’orbite ont été modifiées en glandes à sel (Fig. 20). Contrairement aux Malaclemys

où de nombreux canaux drainent la glande et s’ouvrent individuellement le long de la

paupière inférieure, chez la tortue marine, tous les canaux lobulés se rejoignent en un

seul canal.

Figure 20. Glandes à sel de tortue caouanne (Caretta caretta). Elles se situent derrière chaque oeil

(flèches) et latéralement au cerveau (BR) (d'après Jacobson et al., 2007).

Comme tous les vertébrés, les tortues marines ont une concentration en

chlorure de sodium dans leur corps d’environ 1/3 de celle de l’eau salée. Leur

nourriture (crabes, oursins ou autres invertébrés) a la même teneur en chlorure de

sodium que l’eau de mer. L’œsophage des tortues marines est constitué de longues

papilles coniques alignées et réparties de manière très dense qui sont orientées vers

l’estomac. Les contractions de l’œsophage pendant la prise de nourriture

permettraient d’expulser l’eau de mer à travers la bouche ou les naseaux et donc de

limiter la consommation excessive d’eau de mer pendant leur repas. Stimulées par

d’importantes quantités de chlorure de sodium dans le sang, les glandes à sel peuvent

excréter une solution saline deux fois plus concentrée que l’eau de mer.

Récemment, une étude a montré une association négative entre les électrolytes

plasmatiques (sodium et potassium) mesurés chez la tortue caouanne et le

76

dichlorodiphényldichloroéthylène suggérant une altération des reins et ou glandes à

sel, les deux étant sensibles aux polluants organiques (Camacho et al., 2013).

c. Toxicité sur les embryons

Plusieurs études, effectuées sur des résidus d’œufs retrouvés lors de

patrouilles côtières, ont rapporté que les œufs de tortues caouannes contenaient divers

polluants chimiques tels que les PCBs, le chlorane, la dieldrine, les hydrocarbures

polyaromatiques, et les dérivés du naphtalène (Alava et al. 2011). En Malaisie, la

consommation d’œufs représente un problème de santé publique tant les

concentrations en PCBs sont élevées (van de Merwe et al. 2009). La concentration de

PCBs dans les œufs est la plus importante dans la membrane chorio-allantoïdienne

(Cobb and Wood 1997). Bien que la voie d’exposition ne soit pas déterminée avec

exactitude, le transfert maternel est probablement la voie la plus importante. Les

tortues marines sont ovipares et à ce titre, les contaminants lipophiles sont transmis

par la mère lors de la vitellogenèse qui requière la synthèse de lipoprotéines, cruciales

pour fournir des nutriments et des hormones à l’embryon. Ces lipoprotéines sont

également des transporteurs de contaminants environnementaux de la mère vers le

jeune. Tout composé lipophile ou s’associant aux lipoprotéines va pouvoir être

transmis au jeune. Ainsi, ce transfert maternel de composés organiques a été rapporté

chez les tortues marines (Stewart et al., 2011) et est corrélé avec le taux d’éclosion

prématuré et des déformations des nouveau-nés (Bishop et al. 1998). Tous PCBs

(mélange, congénères individuels ou métabolites hydroxylés) ayant une pertinence

environnementale peuvent entraîner une augmentation de la féminisation chez la

tortue à tempe rouge (Trachemys scripta elegans) (Bergeron et al. 1994). Ainsi par

extrapolation, le transfert maternel des PCBs peut éventuellement compromettre le

succès reproducteur des tortues marines.

Beaucoup de reptiles produisent une seule couvée et la concentration de

contaminants est relativement similaire dans tous les œufs de la couvée (Alava et al.,

2011). La structure et le processus de calcification de la coquille varient en fonction

de l’espèce de reptile et ces paramètres ont une importance en terme de transfert

potentiel des contaminants. Les crocodiliens, geckos ainsi que les tortues possèdent

des coquilles dures et relativement imperméables. Ainsi, l’utilisation de l’œuf de

77

reptile comme indicateur biologique de la contamination à un endroit donné est

maintenant très repandue. Cela n’est pas envisageable chez les espèces menacées dont

le prélèvement d’œufs impacterait sur le taux de renouvellement de la génération

suivante et donc réduirait le nombre d’animaux attaignant l’âge adulte. Cependant

devant les anomalies constatées chez ces espèces, quelques prélèvements ponctuels

d’œufs non éclos (après éclosion générale) ont été autorisés (Keller et al., 2013). Dans

le cas d’espèces non menacées, il est possible d’incuber les œufs artificiellement afin

de déterminer le succès d’éclosion et le cas échéant la fréquence des malformations

(Bishop et al., 1998). Les nouveau-nés sont ensuite relâchés dans leur site naturel. Le

dosage concomitant de contaminants chez les adultes doit si possible être réalisé afin

de pouvoir tirer des conclusions quant à la possibilité de transmission verticale (Keller

et al., 2013). Les diverses études ont montré que la distribution des contaminants au

sein des organes chez les reptiles est similaire à celle des autres vertébrés.

d. Contamination et marqueurs d’exposition

La contamination environnementale en PCBs a été démontrée chez de

nombreuses espèces de reptiles incluant les tortues marines (Camacho et al., 2013,

2014; Gardner et al., 2003; Lake et al.1994; Miao et al. 2001; Keller et al. 2004b;

Keller et al. 2004c; Oros et al., 2009; Storelli et al. 2007; Swarthout et al., 2010). Les

marqueurs d'exposition nous renseignent sur la présence de substances exogènes ou

de leurs métabolites ou encore sur les interactions entre la cellule ou molécule cible et

le contaminant. Il n’existe pas de seuil de toxicité des PCBs chez les tortues marines

ou les reptiles plus généralement. Les congénères possédant le plus d'atomes de

chlore 138>153>180, et 118 sont les plus communément retrouvés chez les tortues

caouannes (Camacho et al., 2013, 2014; Keller et al., 2004b; Lazar et al., 2011; Oros

et al;, 2009; Storelli et al. 2007). Ces composés ont le potentiel d’affaiblir le système

immunitaire de ces animaux (Keller et al. 2006) et d’affecter leur régulation

métabolique (Keller et al. 2005b). Une étude récente a mesuré la concentration en

PCBs dans le foie chez trois espèces de tortues marines (tortues vertes, caouannes et

olivâtre). Les PCBs majoritaires étaient les biphényl penta et hexa chlorés (PCB-138

et -153). Plus de 70% des PCBs mesurés étaient constitués de congénères ne

possédant pas de chlore en positon ortho (PCB-77, -126, -169) et constituant la

famille des "dioxine-like". Les enzymes CYP2K1 et CYP3A27 ont été détectées

78

(Western Blot) dans les microsomes hépatiques, au contraire du cytochrome CYP1A.

Le cytochrome P450 2K1 est constitutif chez les poissons et permet la catalyse de

l’hydroxylation des stéroïdes (catalyse l’hydroxylation du 17β-estradiol, de la

testotérone (16β-hydroxylation) et progestérone (16α-hydroxylation)). Il catalyse

également l’oxydation de l’acide laurique. Concernant la transformation des

xénobiotiques, il active l’aflatoxine B1 en sa forme époxyde carcinogène (Uno et al.,

2012). Le CYP3A27 permet la catalyse de l’hydroxylation 6β de la testostérone et

progesterone (Uno et al., 2012). L’enzyme CYP1A contribue chez les mammifères à

la biotransformation des PCBs. En se basant sur les relations structure-activité des

PCBs existant pour les isoenzymes du cytochrome P450, il a été conclu que chez ces

3 espèces de tortues marines existait une activité limitée de l’enzyme CYP1A. Cela

implique une accumulation hépatique possible des PCBs qui sont usuellement

substrats des CYP1A ainsi qu’une capacité de biotransformation qui diffère des

mammifères (Richardson et al., 2009). Une autre étude récente (Oros et al., 2013) a

mis en évidence un cas de panstéatite chez une tortue caouanne adulte échouée qui

contenait des taux très élevés en PCB-138, -153, -180 et -209. Même si une cause

nutritionnelle ne peut pas être écartée, les nombreux dépôts de céroïdes et la réponse

inflammatoire présente dans la cavité coelomique ne peuvent exclure un phénomène

de peroxidation lipidique ayant pour orgine une forte concentration de PCBs

hépatiques.

Une bioaccumulation hépatique a été suggérée mais non corrélée aux PCBs

résiduels chez les tortues vertes, caouannes et de Kemp (Gardner et al. 2003; Milton

and Lutz 2003). Il est important de mentionner que l’ingestion accidentelle de débris

et particulièrement de plastiques à la surface desquels les PCBs sont adsorbés

concourent à une accumulation des PCBs à un niveau d’environ cent fois plus élevé

que l’eau environnante (Mato et al. 2001). Les débris plastifiés sont donc une source

importante de PCBs lors de leur ingestion accidentelle. Cela est particulièrement vrai

pour les juvéniles qui naviguent les océans. Les tissus les plus communément utilisés

pour la détection de PCBs sont le foie et le tissu adipeux où les hexachlorobiphényles

sont majoritaires (Miao et al. 2001). Les quantités de PCBs mesurés chez les tortues

de Kemp sont beaucoup plus importantes que chez les autres espèces (Lake et al.

1994). Puis viennent ensuite la tortue caouanne, la tortue luth et la tortue verte. La

position des espèces au sein du réseau trophique, l’âge et l’habitat semblent être des

79

critères qui contribuent très probablement à la bioaccumulation de plusieurs

organochlorés (Keller et al. 2005b).

4. Effets des PCBs sur le système immunitaire

a. Généralités

De nombreuses études illustrent la capacité des PCBs à moduler le

système immunitaire des mammifères entraînant des effets néfastes. Ils semblent

jouer un rôle dans la susceptibilité accrue vis à vis d’agents pathogènes. Ainsi, chez

les singes Rhésus il a été observé une diminution significative de la taille du thymus

chez les jeunes, une diminution de la capacité de réponse suite à une épreuve aux

globules rouges de mouton (évaluation de la capacité d’une réponse anticorps afin de

développer une immunité protectrice), ainsi qu’une diminution de la résistance au

virus d’Epstein-Barr (Strauss and Heiger-Bernays, 2012). En 1988, plus de 20 000

phoques communs (Phoca vitulina) sont morts en Europe lors de l'épidémie de

maladie de Carré due à un morbillivirus, le « phocid distemper virus-1 » (Aguilar et

al., 1994). Les individus morts avaient des taux de contaminants organochlorés plus

élevés que ceux qui ont survécu. Une étude a ensuite montré que les individus nourris

avec du hareng contenant des PCBs possédaient une activité NK fortement diminuée

(Ross et al. 1996). Le même résultat a été objectivé chez le dauphin bleu blanc

(Stenella coeruleoalba) à la suite d’une épizootie de morbillivirus en mer

Méditerranée (Aguilar et al., 1994).

Les PCBs sont également impliqués comme facteur de risque d’apparition de

lymphomes non Hodgkinien (Strauss and Heiger-Bernays, 2012) ainsi que dans

l’augmentation de la prévalence de néoplasmes chez les bélugas du Saint Laurent

(DeGuise et al., 1995b). Plusieurs études réalisées sur les mammifères marins, ont

montré que 5 µg/ml de chacun des congénères PCB-138, -153, -180 (15 µg/ml total

de PCBs), diminuait la prolifération des splénocytes de béluga (De Guise et al., 1998).

Enfin, une étude récente et intégrée a mis en évidence les effets des PCBs sur la santé

de populations de grands dauphins (Tursiops truncatus) sauvages résidents en

Géorgie (USA). Les concentrations de PCBs étaient associées à une hypothyroidie,

une suppression des fonctions de l'immunité aquise et innée ainsi qu'une anémie

80

sévère (Schwacke et al., 2011).

Ces études, prises dans leur ensemble, suggèrent fortement que l'exposition

aux PCBs, aux concentrations environnementales, peuvent moduler les fonctions du

système immunitaire. Il est plausible que cela conduise à une diminution de la

résistance de l'hôte vis à vis d’agents pathogènes et à l’induction de cancers pouvant

conduire à la mortalité dans des cas extrêmes. Toutefois aucun lien de causalité direct

n’a été mis en évidence.

b. Les tortues marines

Chez les tortues caouannes juvéniles de la côte sud-est des Etats-Unis

les concentrations de PCBs mesurées dans le sang et le tissu adipeux corrélaient

positivement avec le nombre total de leucocytes entraînant une augmentation de ceux-

ci. Une augmentation du rapport hétérophile/lymphocyte, utilisé comme indicateur de

stress, corrélait positivement avec les concentrations de PCBs "dioxine-like"

mesurées dans la graisse des individus (Keller et al., 2004b). La prolifération

lymphocytaire était augmentée lors d’exposition aux PCBs in vitro et ex vivo (Keller

et al. 2005b; Keller et al. 2006). Ainsi, une corrélation positive significative a été

établie entre la concentration plasmatique de l'Aroclor 1254 (0,1 à 50 ng/g masse

humide) et la prolifération lymphocytaire des lymphocytes B et T (Keller et al., 2006).

La majorité des corrélations mises en évidence pour les concentrations de PCBs

plasmatiques ont également été mises en évidence pour les concentrations mesurées

dans les graisses. Ces résultats concordent avec d'autres publiés chez les oiseaux et

rongeurs (Keller et al., 2005b). En effet, une augmentation de la réponse cutanée au

PHA a été mise en évidence chez les faucons crécerelles d'Amérique adultes (Falco

sparverius) nourris avec un mélange de trois Aroclor (1248, 1254, 1260). Les

goélands argentés juvéniles vivant dans des sites très fortement contaminés des

Grands Lacs d'Amérique, possèdaient une lymphoprolifération plus importante que

les oiseaux des sites de référence. Les souris à pattes blanches (Peromyscus leucopus)

exposées in utero à l'Aroclor 1254, montraient une prolifération accrue des

thymocytes et splénocytes.

81

Au contraire, chez les tortues caouannes juvéniles de Caroline du Nord,

l'activité du lysozyme plasmatique, un indicateur de l'immunité innée, diminuait

significativement avec les concentrations croissantes de PCBs mesurées dans le sang

(Keller et al., 2006). Une diminution de la prolifération lymphocytaire a été mise en

évidence chez les tortues vertes atteintes de fibropapillomes (Cray et al. 2001; Aguirre

and Lutz 2004) et vivant dans des zones très polluées.

Enfin, les leucocytes de 16 tortues caouannes ont été exposées in vitro à

l’Aroclor 1254 (1 ng/ml à 13500 ng/ml) sans qu’aucune différence significative de

prolifération des lymphocytes T n'ait été mesurée, bien qu’une augmentation générale

par comparaison au contrôle ait été rapportée (Keller et al., 2005b). Une courbe dose-

réponse biphasique a été obtenue pour la prolifération des lymphocytes B. En effet,

une concentration de 5 ng/ml d'Aroclor 1254 augmentait la prolifération tandis que

celle de 498 ng/ml la diminuait. Les concentrations plasmatiques de PCBs mesurées

chez les tortues caouannes variaient de 0,121 ng/g à 23,9 ng/g, ce qui correspond à la

première phase de la courbe (ascendante). Les tendances observées lors d'exposition

in vitro ont également été observées lors d'exposition ex vivo. Les concentrations de

PCBs mesurées chez les tortues marines sont généralement bien inférieures à celles

mesurées chez les phoques ou les sternes (Keller et al., 2004a, 2004b).

Il semblerait que les PCBs aient un effet immunostimulant sur la prolifération

des lymphocytes de tortues aux faibles concentrations (concentrations mesurées dans

l’organisme) tandis qu’ils entraînent une immunodépression aux concentrations plus

fortes. Alors que la diminution des fonctions du système immunitaire est souvent

néfaste, une réaction immunitaire exacerbée n'est pas nécessairement une chose

profitable. En effet, cela s’illustre dans le cas des réponses d'hypersensibilité et

maladies autoimmunes. Certains PCBs mesurés dans divers tissus de tortues marines

possèdent des activités oestrogènes et anti-androgènes chez les reptiles (Bergeron et

al., 1994). Des concentrations légèrement plus élevées que le niveau d'oestrogènes

endogènes peuvent décupler la prolifération lymphocytaire, alors que des taux encore

plus importants inhibent cette fonction (Keller et al., 2005b). Il est ainsi purement

spéculatif mais non impossible de penser que les PCBs ayant un effet activateur de la

prolifération lymphocytaire chez les tortues caouannes implique un mécanisme reliant

82

les perturbations du système endocrine (via des mécanismes dépendant des

oestrogènes) à une immunomodulation.

B. Les outils d'étude

Comme décrit dans le tableau III, les tests principaux permettant l'évaluation des

fonctions du système immunitaire ont été utilisés chez les reptiles.

1. L'hématologie et biochimie

Les paramètres hématologiques tels que la numération formule sangine fournit

des informations importantes quant au stress que subit l'animal. Un rapport

hétérophile/lymphocyte augmenté a été associé à une exposition aux PCBs chez la

tortue caouanne (Keller et al., 2004b). Dans cette même étude, Keller et al., ont

montré qu'il existait une corrélation négative entre la numération de leucocytes

sanguins et la somme des PCB mesurés. Une corrélation négative a été décrite entre la

somme des congénères PCBs-138 et -180, mesurés dans le sang et le taux

d'hématocrites des tortues caouannes adultes. Il a également été montré que pour cette

même population d'individus, le congénère -52 était associé à une diminution des

leucocytes sanguins (Camacho et al., 2013). Le comptage des diverses populations de

lymphocytes T (CD4 et CD8) utilisant des marqueurs de surface pourrait être plus

précis et prédictif quand à la réponse immunitaire enclenchée.

2. L'immunité innée

Les outils à notre disposition sont la mesure de l'activité lysosyme (Walsh et

al., 2010), les propriétées bactéricides du sérum et la production d'ions superoxyde

(Merchant et al., 2009), la phagocytose des macrophages spléniques (Mondal and Rai,

2002) sans que cela ait été mis à profit pour des études de toxicité. L'activité des

cellules tueuses naturelles a été étudiée chez la tortue caspienne ainsi que la

cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) chez la tortue verte afin

d'objectiver les modifications saisonnières (Munoz and De la Fuente., 2001 ;

McKinney and Bentley., 1985).

83

3. L'immunité acquise

Cette immunité comprend les réponses humorale et cellulaire. L'évaluation de

l'immunité cellulaire a été relativement bien étudiée à travers la prolifération

lymphocytaire grâce à l'utilisation d'agents mitogènes. Si les tests de prolifération

lymphocytaire peuvent sembler un peu désuets chez les mammifères, ils n'en

demeurent pas moins très indicatifs chez les reptiles. En effet, chez les tortues marines

échouées et émaciées, la capacité de prolifération lymphocytaire est annhilée pour les

animaux ayant des concentrations significatives de mercure (Day et al., 2007). Les

conditions optimales de fonctionnement des tests requièrent de nombreux

ajustements; en effet, les reptiles sont ectothermes et la température adéquate doit être

déterminée. Les études mesurant les fonctions du système immunitaire ex vivo

montrent que la température optimale varie entre 27°C et 37°C (Cray et al., 2001;

Keller et al., 2005a; McKinney et al., 1985; Munoz and De la Fuente, 2001). Une

étude offre une explication détaillée pour optimiser les méthodes de prolifération

lymphocytaire chez la tortue à tempe rouge (Ulsh et al., 2001) ainsi que la tortue

caouanne (Keller et al., 2005a), l'alligator (Cuchens et al., 1979) et la tortue verte

(McKinney and Bentley, 1985). Comme précédemment décrit, une immunisation a

été réalisée puis les titrages en anticorps ont été mesurés grâce à l'utilisation de

l'hémagglutination qui ne requière pas de réactifs spécifiques d'espèce (Keller et al.,

2005b). Le facteur limitant est la durée nécessaire après l'immunisation avant que la

production d'anticorps soit détectable. Chez les mammifères, la production d’Ac est

relativement rapide avec la détection d'IgM variant entre 4 et 7 jours après

l’immunisation. Chez les reptiles l’apparition est plus lente allant de 4 semaines pour

les alligators à 5 et 9 mois pour les tortues vertes (Herbst et al., 1995). Enfin,

l'immunité humorale a déjà été explorée grâce à l'utilisation du test de cellules

formant des plages de lyse. Ce test prend en compte la réponse humorale dépendante

des lymphocytes T dans son intégralité. En effet, les macrophages sont requis lors de

la présentation des antigènes aux cellules Th, qui permettent aux cellules B d'initier la

production d'anticorps. Ce test a également été utilisé par Munoz and De la Fuente

(2001), nécessite toutefois l'euthanasie de l'animal afin de récolter les splénocytes,

ainsi qu'une immunisation préalable.

84

V. Conclusion partielle

Au terme de cette étude bibliographique, il ressort que les tortues marines,

animaux à la fois terrestres mais surtout marins constituent des espèces sentinelles de

l’environnement aquatique. En effet, elles parcourent les eaux du globe, vivent

longtemps, atteignant une maturité sexuelle tardive, et sont exposées de manière

chronique à de nombreux polluants chimiques. Ces composés constituent les menaces

les moins bien documentées et par lesquelles ces animaux semblent être très affectés.

Parmi tous les composés chimiques, les polychlorobiphényles, composés dont la

fabrication remonte au siècle dernier mais dont l’impact environmental se fait encore

sentir, ont été relativement bien étudiés. Ces polluants organiques s’accumulent et

persistent au sein des tissus biologiques des tortues caouannes. Des études

relativement récentes montrent leurs effets délétères chez ces reptiles en induisant une

prédisposition aux maladies, via un affaiblissement de l’animal. Le système

immunitaire constitue ainsi une interface entre l’état de santé de l’animal et son

environnement. La littérature dans ce domaine est ancienne et plutôt rare chez les

reptiles. Après avoir fait l’état des lieux des connaissances actuelles, nous nous

proposons d’étudier certaines fonctionnalités du système immunitaire inné et acquis,

consécutif à une étude préalable d’investigation des paramètres hématologiques et

biochimiques des individus étudiés ultérieurement. Puis nous montrerons l’effet de

quelques PCBs sur les fonctionnalités du système immunitaire inné.

85

PARTIE 2:

ETUDE EXPERIMENTALE

86

Partie 2: Etude expérimentale

Ce travail propose de déterminer les paramètres hématologiques et biochimiques chez

5 classes d’âge de tortues caouannes juvéniles, puis d’étudier certaines fonctions du

système immunitaire inné et acquis avant de se pencher sur les effets de PCBs

sélectionnés sur les fonctionnalités du système immunitaire inné. Dans cette section,

nous nous attacherons à décrire les conditions de zootechnie, de prélèvement sanguins

ainsi que les méthodes de biologie cellulaire utilisées.

I. Matériels et méthodes

A. Sujets d’étude et conditions de captivité

Pour l’étude portant sur les paramètres hématologiques et biochimiques, 85

individus répartis dans 5 groupes d’âge consécutif de 8, 20, 32 44 et 56 mois ont été

étudiés. Chaque groupe comportait respectivement 21, 21, 22, 14 et 7 animaux.

Toutes les tortues ont été collectées après leur éclosion sur les sites de ponte en

Floride entre 2005 et 2009. Cette collecte faisait partie intégrante du programme

d’élevage d’animaux captifs du centre d’étude et réhabilitation des tortues marines de

Galveston (National Oceanic and Atmospheric Administration (NOAA) Sea Turtle

Facility (Galveston, TX, USA)).

Chaque groupe d’âge consécutif était de 12 mois plus âgé que le précédent.

Toutes les tortues étaient élevées et maintenues au Sea Turtle Facility dans des

conditions d’environnement identiques (Higgins, 2003). Les individus captifs sont

maintenus dans des bassins d’élevage séparés contenant de l’eau de mer provenant

directement du Golf du Mexique. L’eau pompée est filtrée et l’eau du bassin est

renouvelée tous les deux jours. La température de l’eau (27–29 ºC), son acidité

(pH=7.5–7.8) et sa salinité (25–26 ppt) ont très peu varié entre chaque bassin et au

cours de l’étude. La durée de la photopériode est en adéquation avec la durée naturelle

du jour.

87

L’alimentation des tortues caouannes est principalement composée de

croquettes industrielles produites par PMI International Inc. Les individus âgés de 8 et

20 mois recevaient respectivement de l’AquaMax™ 400 et 500, tandis que les

individus de 32, 44 et 56 mois étaient nourris avec un aliment pour crocodile (Small

Mazuri® Crocodilian Diet). Leur ration étaient également complétée avec des calmars

jusqu’à satiété, et ce une fois par semaine, afin d’augmenter le taux d’humidité. Le

calcul de la quantité de nourriture est basé sur le poids vif de l’animal. Une formule a

été développée lors de calculs de rations chez des tortues de Kemp captives âgées de 0

à 18 mois (Fontaine and Shaver, 2005), au cours du projet Kemp's ridley Headstart

(1978–1992). Passé 18 mois, la ration est ajustée afin de permettre une croissance

optimale suivant des critères de recherche. Les individus de 8 à 20 mois sont nourris

le matin et l’après-midi tandis que les individus plus âgés sont nourris le matin

uniquement. Les apports alimentaires quotidiens sont les suivants pour les cinq

groupes d’individus (de 8 à 56 mois): 1% (1g de nourriture pour 100g de poids vif),

0,94% (9,4g de nourriture pour 1 kg de poids vif), 0,36%, 0,24%, et 0,34% du poids

vif (kg) de chacun des animaux respectivement.

Pour l’étude portant sur le système immunitaire de la tortue caouanne, les

échantillons de sang ont été collectés à partir de 65 tortues caouannes immatures

maintenues en captivité au NOAA Fisheries Sea Turtle Facility (Galveston, TX). Les

conditions de prélèvements sont décrites dans les permis1. Toutes les recherches

étaient conformes aux recommandations institutionnelles sur le bien-être animal. La

NMFS n’avait pas requis d’approbation d’IACUC mais respectait intégralement les

conditions requises par l’USFWS et par l’état de Floride sur la détention de tortues

marines et leur prise en charge lors d’échouage. Les animaux des deux sexes étaient

inclus dans cette étude. Ils étaient âgés entre 20 et 56 mois avec une longueur de

carapace (SCL moyenne ± SD) de 45,5 cm ± 7,4 et un poids moyen de 12,2 kg ± 5,3.

Tous les animaux inclus ont été préalablement examinés par un vétérinaire et étaient

en bonne santé. De plus, leurs paramètres biochimiques et hématologiques étaient

connus. (Rousselet et al., 2013a).

1 Les permis ont été délivrés par l’U.S. Fish and Wildlife Service (USFWS) Endangered

Species Act Section 10a(1)a (Scientific Research Permits # TE-676379-4 and TE#676379-5),

ainsi que par le Florida Fish and Wildlife Conservation Commission Marine Turtle (Permit

#MTP-015)

88

Pour l'étude portant sur les effets des PCBs sur l'immunité innée, les

échantillons sanguins de 19 tortues caouannes immatures captives ont été utilisés. Les

animaux de cette étude étaient âgés de 32 et 44 mois et possédaient une moyenne

pondérale de 12,6 kg ± 2,3. Tous les animaux de cette étude étaient en bonne santé

(Rousselet et al., 2013a). Pour cette étude un IACUC (Institutional Animal Care and

Use Committee) était requis et a été délivré par l'Université du Connecticut.

B. Prélèvement de sang chez les tortues marines

Au moment des prises de sang, un examen physique de chaque individu a été

réalisé afin de s’assurer du score corporel de l’animal et de son état de santé. Les

animaux ont ensuite été pesés, et les mesures de carapace en ligne droite (SCL) ont

été effectuées. Les prises de sang ont été effectuées sur animaux vigiles bénéficiant

d’une contention manuelle.

Chez les tortues marines, le sinus cervical dorsal prenant son origine au niveau

du plexus veineux post-occipital est utilisé comme site de prélèvement préférentiel

(Owens and Ruiz, 1980). L'aiguille est insérée perpendiculairement à la face dorsal du

cou, craniale à la carapace et légèrement latérale à une ligne centrale. La tête de

l'animal doit être maintenue plus basse que son corps afin de gorger le sinus (Fig. 21).

A cet endroit une hémodilution par la lymphe peut survenir.

Figure 21. Prise sang réalisée sur un juvénile (Photo de Mr Higgins).

89

C. Analyse sanguine hématologique et biochimique

Les individus de cette étude ont été mis à jeun 24h avant la prise de sang. Tous

les échantillons ont été prélevés pendant 3 jours consécutifs en mars 2010. La quantité

de sang maximale prélevée est basée sur le poids de l’animal et a variée entre 300 µl

et 12 ml pour cette étude (National Marine Fisheries Service Southeast Fisheries

Science Center, 2008). Une seringue jetable de 1 ml montée d’une aiguille de 25-

gauge, 5/8 inch a été utilisée pour les animaux pesant moins de 500g. Pour les

individus plus lourds, des seringues de 3, 6 ou 12 ml montées d’une aiguille de 21-

gauge, 1-inch (unités américaines) ont été utilisées. Pour l’étude fonctionnelle du

système immunitaire, les échantillons sanguins sont obtenus en utilisant un système

de tube hépariné sous vide (Vacutainer, Becton Dickinson). Tous les échantillons de

sang ont été conservés au frais et acheminés pendant la nuit jusqu’au laboratoire afin

d’être analysés en moins de 24h. Concernant l’étude hématologique et biochimique, le

sang a été transféré dans des tubes héparinés (lithium-heparin BD Microtainer®). Les

échantillons de sang contaminés par de la lymphe ont été écartés de l’analyse.

Immédiatement après le transfert du sang dans le tube approprié, ceux-ci ont

été maintenus dans une glacière à une température de 10°C puis les échantillons ont

été traités dans les 4h suivant la prise de sang. Une fraction d’échantillon a été utilisé

afin d’effectuer le comptage manuel des leucocytes. Le reste de l’échantillon a été

centrifugé à 6000g pendant 10 min, et le plasma incolore a immédiatement transféré

dans des cryotubes (cryotubes™ Corning Incorporated). Le plasma ainsi collecté a

ensuite été stocké à -80°C pour un maximum de trois semaines avant d’effectuer les

analyses biochimiques.

Deux frottis sanguins ont été préparés pour chaque échantillon de sang

collecté, séchés à l’air libre, puis colorés avec du Diff-Quik® (Dip Quick Stain Kit,

Jorgensen Laboratories) en suivant les recommandations du fabricant. Les frottis ont

été évalués au niveau des aires représentatives de distribution homogène des

leucocytes sous microscope. Deux cents leucocytes ont été comptés et répartis entre

lymphocytes, hétérophiles, monocytes, éosinophiles, et basophiles comme

précédemment décrit (Campbell, 2006).

La numération formule des reptiles s’effectue manuellement et à l’aide de

deux méthodes qui doivent toujours être confrontées pour permettre l’obtention d’un

résulatat le plus précis possible. Ainsi, deux paramètres sont obtenues : l’estimation

90

des leucocytes ou TWB estimate à partir du comptage des leukocytes au microscope

et la concentration leucocytaire absolue ou TWBC absolute à partir du nombre de

granulocytes. L’estimation des leucocytes a été obtenue en multipliant le nombre

moyen de leucocytes observés dans 10 champs du microscope à l’objectif 40x par

2000 (Campbell, 1995). Le paramètre mesuré est appelé TWBC (Total White blood

cell) estimate dans la suite du manuscrit. Il s’agit en effet d’une estimation à

confronter avec la mesure absolue décrite ultérieurement. Le degré de polychromasie

ainsi que les thrombocytes ont été évalués de manière qualitative (Stacy et al., 2011).

Concernant le nombre absolu de leucocytes, le comptage des éosinophiles et

hétérophiles a été réalisé en utilisant le système Avian Leukopet® system (Vetlab).

La concentration en leucocytes (TWBC/µl) a été obtenue suite à au comptage

différentiel (comptage de chaque type cellulaire pour 200 leucocytes) et au résultat du

Leukopet® en utilisant l’équation suivante (Campbell, 1995):

(Nombre de cellules totales obtenues avec AvianLeukopet® x 1.1 x 16 x100)/(%

Hétérophiles + % Eosinophiles obtenus lors du différentiel).

Deux tubes capillaires ont été remplis puis centrifugés à 12,000g pendant 5

minutes. Le PCV a été évalué comme sur la Fig. 22. Par abus de language nous

appelerons PCV, hématocrite. A noter que le PCV (Packed cell Volume) n'est pas un

paramètre calculé comme l'est l'hématocrite mais bien mesuré (Fig. 22). Les protéines

totales ont été mesurées grâce à l’utilisation du refractomètre (TS : total solid). Les

échantillons plasmatiques précédemment récoltés pour les animaux âgés de 20 à 56

mois ont été analysés par l’analyseur Modular-P Analytics® (Roche Diagnostics) au

Texas Veterinary Medical Diagnostic Laboratory (TVMDL), College Station, Texas,

USA. Le volume des échantillons obtenus pour les tortues de 8 mois était trop faible

pour pouvoir effectuer une analyse biochimique.

Figure 22. Lecture du PCV (packed cell volume) après centrifugation d'un microtube. Sur la figure le

PCV est de 22%. Noter la couleur du plasma.

91

Pour les tortues de 20 à 56 mois, les paramètres biochimiques suivants ont été

analysés : albumine, alanine aminotransférase (ALT), alkaline phosphatase (ALP),

amylase, aspartate aminotransférase (AST), Urée (BUN), calcium (Ca), chlore (Cl),

cholestérol, créatine kinase (CK), créatinine (Crea), gamma glutamyltransférase

(GGT), globuline, glucose (Glu), phosphore (P), potassium (K), sodium (Na),

bilirubine totale, protéine totale (TP) et l’acide urique (UA).

D. Fonctionnalité du système immunitaire

1. Isolement des cellules sanguines mononuclées (PBMC)

Les cellules sanguines mononuclées ont été isolées par centrifugation de

gradients de différentes densités. Quatre ml de sang total ont été mélangés à 4 ml de

milieu de culture (RPMI) puis ensuite répartis sur du Ficoll-Paque plus (1.077 g/ml,

Amersham Biosciences). Les échantillons ont été centrifugés pendant 35 min à 600 g.

Le gradient a été collecté et les cellules ont été re-réparties sur du Ficoll-Paque une

seconde fois si de nombreux érythrocytes persistaient. Les cellules mononuclées ont

été re-suspendues dans un milieu complet de RPMI (Mediatech Inc.) supplémenté

avec 2mM de L-glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium (BioWhittaker), 100 mM

d’aminoacide non essentiel (BioWhittaker), 10 mM d’HEPES, un mélange de

pénicilline (50 U/ml) et streptomycine (50 µg/ml, MP Biomedicals) et 10% de sérum

de fœtus bovin (BioWhittaker). Les cellules ont été rincées deux fois, comptées et leur

viabilité a été évaluée par le test d’exclusion au bleu de trypan.

2. Prolifération lymphocytaire

La prolifération lymphocytaire induite par les agents mitogènes a été testée in

vitro comme précédemment décrit avec quelques modifications (Levin et al., 2007a).

Les lymphocytes, maintenus en milieu RPMI complet, ont été distribués sur une

plaque de 96 puits à fond plat à raison de 2 x105

cellules/puits (Falcon, Becton

Dickinson) et ce en triplicata avec et sans (cellules non stimulées) ajout de mitogènes.

Les cellules ont été maintenues dans un incubateur à 28°C, en atmosphère humide

enrichie avec 5% CO2 pendant 96 hr. Deux agents mitogènes ciblant les lymphocytes

T ont été testés: la concanavaline A (ConA, C5275, Sigma, St. Louis, MO) et la

92

phytohemagglutinine (PHA-P, L1668, Sigma, St. Louis, MO) aux concentrations

finales de 1, 2, 5, 10 et 20 μg/ml. Le lipopolysaccharide (LPS E. coli 0127:B8, L4516,

Sigma) a été choisi afin de cibler la croissance des lymphocytes B, aux concentrations

finales de 1, 2, 5, 10 et 20 μg/ml. Le raisin d’Amérique ou « pokeweed mitogen »

(PWM ; Phytolacca Americana, L8777, Sigma, St. Louis, MO) a été testé aux mêmes

concentrations que précédemment afin de stimuler à la fois les lymphocytes B et T.

La prolifération lymphocytaire a été évaluée par l’incorporation de la

bromodéoxyuridine (5-bromo-2'-deoxyuridine, ou BrdU) dans l'ADN nouvellement

synthétisé des cellules en cours de division. Il s’agit d’un nucléoside synthétique

analogue de la thymidine. La BrdU a été ajouté pendant les 18 dernières heures

d’incubation puis a ensuite été détectée grâce à un anticorps monoclonal et une

réaction enzymatique colorimétrique (Cell Proliferation colorimetric ELISA BrdU,

RocheDiagnostics) en suivant les instructions du fabricant. La mesure de la densité

optique a été réalisée avec un lecteur de plaques ELISA (Multiskan EX v.1.0) à la

longueur d’onde de 450 nm et celle de référence à 690 nm.

3. Activité NK cellule tueuse naturelle avec et sans PCBs

L’activité des cellules tueuses naturelles (NK) a été testée contre deux lignées

cellulaires, une lignée érythroleucémique humaine (K-562, CCL-243™, ATCC) et

une lignée de lymphome murin (YAC-1, ATCC, TIB-160™) selon le protocole décrit

par DeGuise et al. (1997), avec de légères modifications. Un ml de suspension de la

lignée cellulaire cible (un million de cellules/ml) a été ajoutée à 10 µl d’une solution

lipophile à 3 mM de carbocyanine permettant la coloration des membranes cellulaires

(perchlorate de 3,3’-dioctadécyloxabocyanine (DiO, Molecular Probes) dissous dans

du diméthylsulfoxide (DMSO, Sigma). Les cellules cibles ont ensuite été incubées

pendant 20 min à 37°C et 5% CO2, suivi de deux lavages dans le milieu de RPMI

complet. Les cellules sanguines mononuclées constituant les cellules effectrices ont

été ajustées à une concentration de un million de cellules/ml et ajoutées afin d’obtenir

les rapports cellules effectrices : cellules cibles de 100 :1. 50 :1, 25:1, 12,5 :1 et

6,25 :1. L’activité des cellules tueuses naturelles a été mesurée après deux heures et

demie d’incubation soit à 28°C ou 37°C. Les cellules ont ensuite été colorées à

l’iodure de propidium (PI, Invitrogen) immédiatement avant l’acquisition de la

fluorescence par un cytomètre de flux (FACScan, Becton Dickinson) et analysées par

93

le logiciel CellQuest Pro software (Becton Dickinson, Immunocytometry System)

afin de mesurer la mort des cellules cibles (cytoléthalité). Les résultats ont été

exprimés en pourcentage de cellules cibles mortes2.

L'activité des cellules NK suite à leur exposition aux PCBs a été mesurée en

utilisant la lignée de lymphome murin (YAC-1) comme cellules cibles (Rousselet et

al., 2013b). La concentration des cellules effectrices (PBMC) a été ajustée à 106

cells/mL puis les cellules ont été incubées dans du RPMI avec ou sans PCB à des

concentrations croissantes de 0,5 à 20 ppm pendant 3h. Les cellules cibles ont ensuite

été ajoutées aux PBMC pour un rapport cellules effectrices/ cibles de 50:1. L'activité

des cellules NK a été mesurée après 2.5 hr d'incubation à 28 C. Le reste du protocole

est identique à ce qui a été décrit ci-dessus.

4. Isolement des sous-populations de cellules leucocytaires

Les monocytes, lymphocytes et granulocytes ont été séparés grâce à

l’utilisation de gradients interrompus de Percoll. Quatre ml de sang total ont été

placés au dessus de 10 ml du gradient de Percoll3 (Percoll, P4937, Sigma). Ce

gradient de faible osmolarité a été préparé selon les recommandations du fabricant et

était constitué de multiples couches de 2 ml de densité différente (la densité la plus

importante se trouvant sous la précédente). Les densités suivantes ont été utilisées :

1,053 g/ml (40%), 1,059 g/ml (45%), 1,064 g/ml (50%), 1,070 g/ml (55%) and 1,076

g/ml (60%). Le sang placé au dessus des gradients de Percoll a ensuite été centrifugé

à 400g pendant 5 min à 4°C, suivi immédiatement par une centrifugation à 800g

pendant 20 min à 4°C, puis arrêté sans utilisation du frein afin de ne pas perturber les

couches ainsi obtenues. Les diverses couches cellulaires obtenues, situées entre deux

gradients, ont ensuite été récoltées à l’aide d’une pipette puis transférées stérilement,

mises en suspension puis lavées deux fois (400g pendant 5 min à 4°C) dans du milieu

RPMI complet. Le comptage et la viabilité cellulaire ont été déterminés par exclusion

du bleu de Trypan et en utilisant un hémocytomètre.

2 Lors des lésions membranaires des cellules cibles induites par les cellules NK, le PI se lie à l’ADN

des cellules cibles, qui deviennent ainsi doublement positives DiO+, PI+. Au contraire, les cellules

cibles non affectées par les cellules NK, vont exclure le PI et restent ainsi DiO+, PI−. 3 Le Percoll est une solution de particules de silice colloïdale revêtue de polyvinylpyrrolidone.

94

5. Tri cellulaire et caractérisation morphologique

Le type cellulaire des sous populations de leucocytes déterminées par

cytomètre de flux en se basant sur leur taille (FSC) ainsi que leur granulosité (SSc

pour Side Scatter) relative, a été confirmé grâce au tri cellulaire (FACSAria II) puis à

l’évaluation morphologique des cellules au microscope. Les leucocytes isolés soit par

utilisation de gradient de Ficoll® ou de Percoll® ont été triés grâce au cytomètre de

flux FACSAria II (BD Biosciences) utilisant une douille filtrante de 70 ou 85 µm.

Des lames de cellules en couche mince ont été préparées à l’aide d’une

cytocentrifugeuse (Cytospin, Shandon Inc., Pittsburgh, Pennsylvania, USA) à 450

rpm pendant 10 min. Les lames de cellules en couche mince ont ensuite été colorées

au Diff Quick (Jorgenson Dip Quick Stain set, Loveland, CO).

6. Phagocytose avec et sans PCBs

La capacité de phagocytose in vitro a été déterminée selon le protocole décrit

par Levin et al. (2005), avec quelques modifications. Brièvement, la concentration des

leucocytes a été ajustée à 2 millions de cellules par ml de HBSS (sans calcium ni

magnésium, BioWhittaker, Walkersville, MD) enrichi avec 1% de sérum de fœtus

bovin (Lonza Bioscience, Rockland, EA). Un million de cellules ont été distribuées

dans des puits à fond arrondi de plaques 96-puits (Falcon, Becton Dickinson, Franklin

Lakes, NJ) puis une suspension de billes de 1 µm en latex fluorescentes (Molecular

Probes, Eµgene, OR) dans du PBS (Mediatech Inc., Manassas, VA) a été ajoutée à la

suspension cellulaire afin d’obtenir un rapport d’environ 100 billes par cellule. Les

cellules ont été incubées pendant 1h à 28°C sous agitation à 300 rpm en utilisant un

Thermomixer R (Eppendorf, Hamburg, Germany). La suspension cellulaire de chaque

puits a été déposée sur du sérum d’albumine bovine à 3% glacial (Sigma, St Louis,

MO) puis le tout a été centrifugé à 150g pendant 8 min à 4°C. Le surnageant

contenant les billes libres a été écarté et les cellules ont été mises en suspension dans

200 µl de PBS contenant 1 % de solution tampon de formol (Decal Corp., Tallman,

NY). La suspension cellulaire ainsi préparée a été stockée à 4°C jusqu’aux analyses

(24h plus tard au maximum). La fluorescence de 10000 évènements environ a été

mesurée à une longueur de 530 mm (FL-1) avec le cytomètre de flux FACScan.

95

L’échelle de lecture est logarithmique et les billes libres servent de référence. Les

diverses populations cellulaires, granulocytes, lymphocytes et monocytes ont été

délimitées électroniquement en fonction de leur taille (FSC) et de leur granulosité

(SCC). Les cellules possèdent ainsi une fluorescence correspondante au nombre de

billes ingérées. La phagocytose a été rapportée comme le pourcentage de cellules

ayant phagocyté une bille ou plus (Burleson et al., 1995; Brousseau et al., 1999, 2000).

Les granulocytes ont été séparés grâce à l'utilisation de gradients discontinus

de Percoll comme décrit précédemment (Rousselet et al., 2013b). Les cellules situées

entre le plasma et 40% de Percoll ainsi que celles situées entre 40-45% de Percoll ont

été combinées. Les granulocytes ont été incubés avec PCBs aux concentrations de 0,5

à 15 ppm, pendant 3 hr à 28 C. Le reste du protocole est identique à ce qui est

mentionné ci-dessus.

7. Explosion respiratoire

L’explosion respiratoire in vitro a été réalisée selon le protocole de Levin et al.,

2007a. Brièvement, la concentration des leucocytes a été ajustée à 2 millions de

cellules par ml de RPMI complet. Les suspentions cellulaires ont été incubées pendant

30 min à 28°C, en présence de 5 mM de diacétate 2,7-dichlorofluorescine (DCFDA,

Molecular Probes), une sonde fluorescente permettant de détecter la production

d’hydroxyde d’oxygène. La suspension cellulaire a été centrifugée pendant 10 min à

220 g puis mise à nouveau en suspension dans du PBS-glucose (1 g/L; PBS-G). Les

cellules ont été distribuées dans des plaques 96-puits à fond rond, en présence ou non

de 10-9

M de phorbol myristate-2 acétate-3 (PMA, Molecular Probes), un activateur

cellulaire. Les plaques ont ensuite été incubées pendant 1 hr à 28°C. Les cellules ont

ensuite été fixées avec 1 % de solution tampon de formol dans du PBS puis stockée à

4°C jusqu’aux analyses (24h plus tard au maximum). L’explosion respiratoire a été

mesurée à la longueur d’onde de 530 nm (FL-1), et exprimée selon le rapport (ou

indice de stimulation) : fluorescence moyenne émise par les cellules stimulées par le

PMA / fluorescence moyenne émise par des cellules non stimulées.

8. Préparation des PCBs

Les PCBs utilisés (PCBs -105, 138 et -169) avaient une pureté >98.4% (Ultra

Scientific, North Kingston, RI, USA). Ils ont été mis en suspension dans du DMSO

96

exempt d’endotoxine, puis dans du DMEM utilisé comme diluant afin de préparer les

solutions-mère. La concentration finale en DMSO ne dépassait pas 0,4%.

E. Analyse statistique

Les analyses statistiques ont été effectuées grâce à l’utilisation de SigmaStat

Windows 1.0 (Jandel Scientific) et du logiciel R; p ≤ 0.05 est considéré comme

statistiquement significatif. La puissance statistique pour chaque expérience était

supérieure à 0,8 qui est considéré comme le euil requis par les logiciels de statistique

afin de s’assurer de la confiance pouvant être accordée à l’interprétation des résultats.

1. Etude des paramètres hématologiques et biochimiques

Le test de normalité de Shapiro-Wilk a été utilisé pour l’analyse de tous les

jeux de données d'analytes hématologiques et biochimiques de chaque groupe d’âge.

La moyenne, déviation standard, et gamme (pour les variables distribuées

normalement) et la médiane, les quartiles à 25-75% et la gamme (pour les variables

non normales) ont été déterminés pour tous les analytes. Trente deux comparaisons

entre les cinq groupes de tortues ont été réalisées en utilisant un test d’analyse des

variances (ANOVA). Le test ANOVA non-paramétrique de Kruskal-Wallis suivi par

le test de Wilcoxon sur données appariées a été utilisé lors de distribution non

normale et le test ANOVA paramétrique de Holm-Sidak suivi par un t-test a été

utilisé dans le cas contraire. Le test de Mann-Whitney a été utilisé pour des

comparaisons deux à deux. Les corrélations de Spearman ont également été réalisées.

2. Etude du système immunitaire avec ou sans PCBs

Les analyses statistiques One-way repeated-measures analysis of

variance (RM ANOVA) suivi d'un test post hoc de Bonferroni (test paramétrique) ou

Holm-Sidak (test non paramétrique) ont été utilisées. Si les données étaient

distribuées normalement pour une comparaison de deux jeux de données, un t-test a

été utilisé; sinon un test des rangs de Mann-Whitney a été utilisé.

97

II. Paramètres hématologiques et biochimiques

A. Résultats

1. Morphométrie et Hématologie

L’évolution du poids des tortues et de la longueur de la carapace est montrée

dans la Figure 23.

Figure 23. Evolution du poids (Weight) et de la longueur de carapace (SCL) pour les 5 classes d'âge

(Age) de tortues juvéniles (8, 20, 32,44 et 56 mois). Ces deux paramètres sont étroitement correlés (p=

0,01)

Les résultats complets d’hématologie sont présentés dans le Tableau IV (p 98).

Plusieurs analytes hématologiques varient de manière significative parmi les groupes

d’âge. La moyenne d’hématocrite était significativement plus basse chez les tortues

de 8 mois (moyenne 20,3%, p < 0,001, Fig. 24A) comparativement aux animaux de

20 mois (moyenne 27,5%), 32 mois (moyenne 25,4%), 44 mois (moyenne 25,5%) et

56 mois (moyenne 29,1%). Le degré de polychromasie (Fig.25) était de 6% chez tous

les individus étudiés, cependant sans différence significative parmi les groupes d’âge.

Les stades érythrocytes immatures (par ex les rubricytes) étaient absents des frottis

chez tous les animaux étudiés.

Les animaux de 8 mois avaient une médiane de numération leucocytaire

significativement plus basse (4800 cellules /μl, p < 0,001) comparée aux individus de

20, 32, 44 et 56 mois. Les animaux de 20 mois avaient une médiane de

numération leucocytaire significativement plus haute (13700 cellules/μl, p < 0,001)

que les animaux âgés de 8, 32, 44 et 56 mois.

98

Tableau IV. Paramètres hématologiques et morphométriques [Moyenne (M) ± SD ou Médiane (Med), 25–75% quartiles (q)] chez les tortues

caouannes immatures (8, 20, 32, 44 et 56 mois). L’asterisque (*) indique une difference statistique significative figurant en détail en bas du

tableau par orde alphabétique.

Age

Nombre échantillon

8 mois

(nés en 2009)

n=21

20 mois

(nés en 2008)

n=21

32 mois

(nés en 2007)

n=22

44 mois

(nés en 2006)

n=14

56 mois

(nés en 2005)

n=7

SCL (cm)

M SD (Gamme)

9,6 0,4

(8,8 –10,2)

32,4 0,7

(31,4 – 33,6)

44,9 1,2

(42,9 – 47,4)

51,0 2,1

(46,0 – 54,5)

55,8 1,1

(54,4 – 56,5)

Poids (kg)

M SD (Gamme)

0,13 0,01

(0,11 – 0,14)

4,25 0,23

(3,72 – 4,62)

10,52 0,67

(9,39 – 11,96)

15,70 0,94

(13,50 – 16,98)

22,11 1,23

(20,3 – 23,39)

Hct (%)

M SD (Gamme) 20,3 1,9 (17 – 23) a* 27,5 ± 2,4 (23 – 30) 25,4 2,5 (20 – 30) 25,5 2,1 (22 – 29) 29,1 2,4 (25 – 32)

Total WBC (x103/µl)

Médiane, q

(Gamme)

4,8, 3,9 – 6,5

(2,1 – 12,3) b*

13,7, 10,8 – 19,4

(6,8 – 27,3) b*

11,4, 7,7 – 13,7

(2,6 – 21,1)

12,5, 7,6 – 18,0

(5 – 24,6)

7,0, 5,1 – 8,2

(4 – 12,3)

WBC Estimate (x103/µl)

Médiane, q

(Gamme)

5,4, 3,8 – 6,4

(1,8 – 10,4) c*

11,4, 9,6 – 14,6

(4,4 – 19,8)c*

8,8, 7,2 – 10,3

(3 – 16,8)

10,0, 7,4 – 11,3

(5,2 – 15,4)

9, 7,8 – 9,6

(6,4 – 17,4)

99

Lymphocytes (%)

Médiane, q

(Gamme)

82,5, 73,3 – 87,8

(41 – 96) d*

92,0, 88,0 – 95,0

(75 – 99)

91,0, 88,0 – 95,0

(77 – 100)

92,0, 88,5 – 95,0

(74 – 99)

92,0, 88,2 – 93,0

(83 – 95)

Lymphocytes (x103/µl)

Médiane, q

(Gamme)

3,8, 2,9 – 5,1

(2 – 11, 2) e*

12,5, 10,4 – 17

(6 – 25,3) e*

9,8, 6,8 – 12,6

(2,6 – 19,9)

11,1, 6,9 – 16,4

(4,2 – 22,9)

6,5, 4,8 – 7,1

(3,7 – 11,2)

Hétérophiles (%)

Médiane, q (Gamme) 11,0, 5,3 – 17,0 (0 – 41) f* 4,0, 3 – 8,0 (0 – 19) 6,0, 2,8 – 8,0 (0 – 20) 7,0, 3,0 – 10,0 (1 – 25) 5,5, 4,0 – 7,0 (1 – 10)

Hétérophiles (103/µl) g*

Médiane, q

(Gamme)

0,46, 0,25 – 1,15

(0 – 2,4)

0,7, 0,4 – 1,3

(0,1 – 2,2)

0,6, 0,4 – 1,1

(0 – 1,6)

0,7, 0,3 – 1,2

(0,1 – 1,7)

0,3, 0,25 – 0,5

(0,2 – 0,9)

Monocytes (%)

Médiane, q (Gamme) 1,5, 1,0 – 3,0 (0 – 9) 1,0, 0 – 2,25 (0 – 10) 2,0, 1,0 – 3,0 (0 – 8) 0,5, 0 – 1,7 (0 – 9) h* 1,0, 1,0 – 4,0 (0 – 7)

Monocytes (x103/µl)

Médiane, q (Gamme) 0,1, 0,02 – 0,2 (0 – 0,9) 0,15, 0 – 0,4 (0 – 2,1) 0,2, 0,07 – 0,3 (0 – 1,2)i* 0, 0 – 0,1 (0 – 0,9)i* 0,1, 0,05 – 0,3 (0 – 0,5)

Eosinophiles (%)

Médiane, q (Gamme) 3, 1 – 5 (0 – 9) j* 1, 0 – 1 (0 – 6) 1, 0 – 1 (0 – 3) 0, 0 – 1 (0 – 2) 1, 0 – 0,2 (0 – 6)

Eosinophiles (103/µl)

Médiane, q (Gamme) 0,1, 0 – 0,2 (0 – 0,6)k* 0,1, 0 – 0,2 (0 – 0,4) 0,07, 0 – 0,14 (0 – 0,3) 0, 0 – 0,1 (0 – 0,2) 0,05, 0 – 0,1 (0 – 0,6)

Basophiles (%)

Médiane, q (Gamme) 1, 0 – 2 (0 – 7) l* 0 (0 – 1) 0 (0 – 1) 0 (0 – 1) 0 (0 – 2)

Basophiles (103/µl)

Médiane, q (Gamme) 0,05, 0 -0,08 (0 - 0,9) m* 0 (0 – 0,2) 0 (0 – 0,1) 0 (0 – 0,1) 0 (0 – 0,2)

100

aKruskal -Wallis test on Wilcoxon Rank-sum test: 8 mois vs 20, 32, 44, 56 mois, Chi-squared=52,01, significatif avec p < 0,001*,

bOne Way ANOVA performed on logarithmic values: 8 mois vs 20, 32, 44, 56 mois et 20 mois vs 8, 32, 44, 56 mois, F=34,6, significatif avec p < 0,001*,

cKruskal -Wallis test on Wilcoxon Rank-sum test: 8 mois vs 20, 32, 44, 56 mois et 20 mois vs 8, 32, 44, 56 mois, Chi-squared =68,2, significatif avec p <

0,001*,

dKruskal -Wallis test on Wilcoxon Rank-sum test: 8 mois vs 20, 32, 44, 56 mois, Chi-squared =41,7, significatif avec p < 0,01,

e One Way ANOVA performed on logarithmic values: 8 mois vs 20, 32, 44, 56 mois et 20 mois vs 8, 32, 56 mois, F=43,7, significatif avec p < 0,001*,

fKruskal -Wallis test on Wilcoxon Rank-sum test: 8 mois vs 20, 32, 44, 56 mois, Chi-squared =18,6, significatif avec p < 0,02*,

gKruskal -Wallis test on Wilcoxon Rank-sum test: Chi-squared =7,2, p = 0,12: not significant,

hMann -Whitney Ranks 44 mois vs 8 mois U=726,5, T=716,5, P = 0,019*, 44 mois vs 32 mois U=731, T=686, P = 0,009*, 44 mois vs 56 mois U=101, T=328,

p = 0,036*,

iMann -Whitney Ranks 8 mois vs 32 mois U=519,5, T=1580,5, P = 0,027*, 20 mois vs 44 mois U=470,5, T=518,5, p = 0,038*, 32 mois vs 44 mois U=580,5,

T=500,5, P = 0,004*,

jKruskal -Wallis test on Wilcoxon Rank-sum test: 8 mois vs 20, 32, 44, 56 mois, H=41,9, significatif avec p < 0,01*,

kMann -Whitney Ranks 8 mois vs 32 mois U=1014, T=1086, P = 0,004*, 8 mois vs 44 mois U=737,5, T=504, significatif avec p < 0,001*,

lKruskal -Wallis test on Wilcoxon Rank-sum test : 8 mois vs 20, 32, 44, 56 mois, H=54,8, significatif avec p < 0,02*,

mMann -Whitney Ranks 8 mois vs 20 mois U=950, T=848, p < 0,001*, 8 mois vs 32 mois U=1161,5, T=938, p < 0,001*, 8 mois vs 44 mois U=760,5, T=481,

P < 0,001*, 8 mois vs 56 mois U=322,5, T=152,5, significatif avec p = 0,007*,

101

Ces résultats ont également été rapportés en ce qui concerne les numérations

leucocytaires estimées. La numération leucocytaire obtenue par estimation corrélait

avec le comptage absolu (Coefficient corrélation Spearman 0,6, p < 0,0001). Cela

nous permet de renforcer la confiance vis à vis des résultats obtenus. Les animaux

âgés de 8 mois avaient un pourcentage (82,5%, p < 0,01) ainsi que des valeurs

absolues (3800 lymphocytes/µl, p < 0,001) du nombre de lymphocytes (Fig.25)

significativement plus bas ainsi qu’un pourcentage d’hétérophiles (11%, p < 0,02),

d’éosinophiles (3%, p < 0,01) et de basophiles (1%, p < 0,02) et des valeurs absolues

(50 basophiles/µl, p < 0,007) significativement plus élevées que chez les tortues plus

âgées.

Figure 24. Boxplot faisant figurer la médiane, les percentiles 25 et 75 (limites basses et hautes de la

boite) et les percentiles 5 et 95 (moustaches du diagramme) pour le paramètre choisi. Chaque classe

d'âge (en mois) des tortues caouannes juvéniles est représentée en abscisse. Les astérisques (*)

indiquent les différences significatives. A : Packed cell volume (PCV) ; B : Comptages leucocytaires

réalisées par estimation (WBC estimates) par microlitre.

Les tortues de 8 mois avaient également un nombre d’éosinophiles (Fig.25)

significativement plus élevé (100 éosinophiles/µl, p < 0,004) comparé aux animaux

âgés de 32 et 44 mois. Les animaux de 20 mois avaient un nombre significativement

plus élevé de lymphocytes (12500 lymphocytes/µl, p < 0,001) que les autres groupes.

Les pourcentages de monocytes (Fig.25) obtenus pour les animaux de 44 mois étaient

significativement plus bas que chez les animaux de 8, 32 et 56 mois (p < 0,036),

tandis que le nombre de monocytes était significativement plus bas chez les animaux

de 44 mois que chez les animaux de 20 et 32 mois (p < 0,038). De plus, les animaux

de 32 mois avaient un nombre de monocytes significativement plus élevé (200

monocytes/µl, p < 0,027) que les animaux de 8 mois.

102

Il n’y avait aucune différence morphologique des leucocytes en fonction de

l’âge. Les thrombocytes semblaient normaux en nombre et morphologie chez tous les

animaux (Fig.25).

A

B

C

D

Figure 25. Photomicrographies de cellules sanguines de tortue caouanne juvénile. Crédit. Estelle

Rousselet. A. >lymphocyte, *thrombocyte. B. >éosinophile. C. > hétérophile, ** polychromatophile ou

érythrocyte immature. D. monocytes. Bar :5µm.

2. Biochimie plasmatique

Les résultats des paramètres plasmatiques et les comparaisons statistiques entre

les groupes d’âge sont présentés dans le Tableau V (p105). Les animaux de 8 mois

avaient des valeurs plasmatiques de protéine totale déterminée par réfractométrie (TS)

significativement plus basses (médiane 1,1 g/dl, p < 0,001) comparées aux animaux

plus âgés. Les valeurs de solide plasmatique corrélaient avec le poids et la longueur

de la carapace des individus (Corrélation de Spearman, r=0,50 et 0,56 respectivement,

p = 2x10–8

et 1,2x10–6

, n=85, tous groupes d’âge). Les taux de protéines plasmatiques

totales étaient significativement plus bas chez les animaux de 20 mois (médiane 2,0

g/dl, p < 0,017) comparés aux animaux de 32, 44 et 56 mois (Fig. 24C). Les taux de

protéines plasmatiques corrélaient faiblement au poids ou longueur de carapace

(Corrélation de Spearman, r=0,32 et 0,34 resp., p = 0,01 et 0,006 resp., n=64, pour les

animaux de 20 à 56 mois). Une corrélation significative a été montrée entre les taux

103

plasmatiques de protéines totales mesurées par réfractométrie et analyseur

(Corrélation de Spearman, r=0,63, p = 2x10–8

; de 20 à 56 mois). Il n’y avait pas de

différence significative concernant l’albumine ainsi que le rapport albumine/globuline

pour les individus âgés de 20 à 56 mois. Les animaux de 20 mois avaient des

concentrations de globuline significativement plus basses (médiane 1,1 g/dl, p <

0,006) que les tortues plus âgées. Les concentrations de glucose (moyenne 153,5

mg/dl ± 21,7 SD, p < 0,001; Fig. 24D), et les activités AST (moyenne 157,7 U/l ± 51

SD, p < 0,001) et ALP (moyenne 73 U/l ± 24,2 SD, p < 0,001) étaient

significativement plus élevées chez les animaux de 20 mois que chez les animaux plus

âgés alors que les concentrations de cholestérol (moyenne 60 mg/dl ± 14,2 SD, p <

0,001, Fig. 24E) étaient significativement plus basses. Pour les tortues de 32 mois, les

activités CK avaient la variabilité la plus importante, allant de 288 à 2829 U/l, et

étaient significativement plus élevées (moyenne 991,5 U/l ± 536,1 SD, p < 0,01) que

pour les tortues de 44 mois. Les animaux de 32 mois avaient des activités amylase

significativement plus basses (médiane 562 U/l, p < 0,001) que pour les tortues de 20

et 44 mois. Les valeurs d’acide urique étaient significativement plus basses pour les

tortues de 32 mois (moyenne 0,5 mg/dl ± 0,14 SD, p < 0,01) que pour celles de 20

mois. Les tortues de 56 mois avaient des concentrations d’urée significativement plus

élevées (moyenne 43,3 mg/dl ± 6,6 SD, p < 0,016) que pour tous les autres groupes

(Fig. 24F). Chez ces mêmes individus, la créatinine était significativement plus élevée

(médiane 0,07 mg/dl, p < 0,04) que pour les animaux de 20 et 32 mois. Les

concentrations de bilirubine totale étaient en dessous de 0,1 mg/dl, les activités

alanine aminotransférase étaient inférieures à 4 U/l et celles des gamma-

glutamyltransférases étaient inférieures à 3 U/l pour tous les groupes d’âge. Il n’y

avait aucune différence significative entre les classes d’âge concernant les

concentrations plasmatiques de calcium, phosphore, rapport phospho-calcique,

sodium, chlore et potassium.

104

Figure 24. Boxplots faisant figurer la médiane, les percentiles 25 et 75 (limites basses et hautes de la

boite) et les percentiles 5 et 95 (moustaches du diagramme) pour chaque paramètre hématologique et

biochimique d'intérêt. Les classes d'âge (mois) des tortues caouannes immatures sont en abscisse. Les

cercles à l'extérieur des moustaches représentent les valeurs extrèmes. Les astérisques (*) indiquent les

différences significatives. C. Protéines totales ; D. Glucose ; E. Cholestérol ; F. Urée (BUN).

105

Tableau V. Analytes biochimiques [Moyenne (M) ± SD ou Médiane (Med), 25–75% quartiles (q)] chez les tortues caouannes immatures (8, 20,

32, 44 et 56 mois). L’asterisque (*) indique une difference statistique significative figurant en détail en bas du tableau par orde alphabétique.

Age

Taille échantillon

8 mois

(2009 hatchlings)

n=21

20 mois

(2008 hatchlings)

n=21

32 mois

(2007 hatchlings)

n=22

44 mois

(2006 hatchlings)

n=14

56 mois

(2005 hatchlings)

n=7

Protéine Totale (réfractométrie) g/dl

M SD or Med, q 1,1, 1 – 1,2 a* 1,6, 1,4 – 1,7 1,6, 1,53 – 1,80 1,55, 1,4 – 1,8 1,8, 1,7 – 1,9

Gamme, g/dl 0,9 - 1,8 1,0 - 2,0 1,2 - 2,0 1,2 - 2,0 1,5 - 2

Protéine Totale (analyseur) g/dl

Médiane, q 2,0, 2 – 2,2 b* 2,2, 2,1 – 2,4 2,25, 2,1 – 2,37 2,3, 2,15 – 2,35

Gamme, g/dl 1,3 - 2,3 1,7 - 2,6 1,3 - 2,7 1,9 - 2,5

Albumine c g/dl

Médiane, q 0,9, 0,9 – 1,10 1, 1,0 – 1,10 0,9, 0,9 – 1,1 1,0, 0,95 – 1,1

Gamme, g/dl 0,5 - 1,1 0,8 - 1,2 0,6 - 1,1 0,8 - 1,1

Globuline g/dl

Médiane, q 1,1, 1,1 – 1,2 d* 1,2, 1,1 – 1,3 1,25, 1,2 – 1,3 1,3, 1,15 – 1,3

Gamme, g/dl 0,7 - 1,3 0,9 - 1,4 0,7 - 1,6 1,1 - 1,4

Albumine: Globuline Ratio

Mean SD 0,8 0,1 0,9 0,1 0,8 0,1 0,8 0,1

106

Créatinine, µmol/l (mg/dl)

Médiane, q 2,64, 2,64 – 3,52

(0,03, 0,03 – 0,04)

3,52, 2,64 – 3,52

(0,04, 0,03 – 0,04)

3,98, 3,52 – 5,08

(0,045, 0,04 – 0,058)

6,19, 3,98 – 6,19 e*

(0,07, 0,045 – 0,07)

Gamme, µmol/l (mg/dl) 0,88 - 5,30

(0,01 - 0,06)

2,65 - 6,19

(0,03 - 0,07)

2,65 - 9,72

(0,03 - 0,11)

3,54 - 6,19

(0,04 - 0,07)

Acide urique, µmol/l (mg/dl)

Médiane, q 41,6, 35,7 – 47,6

(0,70, 0,60 – 0,80)

29,7, 23,8 – 35,7 f*

(0,50, 0,40 – 0,60)

35,7, 29,7 – 35,7

(0,60, 0,50 – 0,60)

35,7, 35,7- 41,6

(0,60, 0,60 – 0,70)

Gamme, µmol/l (mg/dl) 17,6 - 65,4

(0,30 - 1,10)

17,8 - 47,6

(0,30 - 0,80)

23,8 - 41,6

(0,40 - 0,70)

35,7 - 41,6

(0,60 - 0,70)

Urée, mmol/l (mg/dl)

Médiane, q 11,3, 10,1 – 11,6

(31,7, 28,2 – 32,5)

11,0, 9,9 – 12,6

(30,7, 27,63 – 35,25)

10,6, 9,3 – 11,5

(29,6, 26,05 – 32,2)

16,4, 13,7 – 16,9 g*

(46,0, 38,3 – 47,4)

Gamme, mmol/l (mg/dl)

5,9 - 12,7

(16,6 - 35,6)

7,8 - 17,1

(21,9 - 47,9)

6,96 - 13,7

(19,5 - 38,5)

12,2 - 18,3

(34,1 - 51,3)

Glucose, mmol/l (mg/dl)

Moyenne SD 8,5 1,2 h*

(153,5 21,7)

5,2 0,7

(92,8 11,9)

5,0 0,9

(91,0 16,1)

5,2 0,5

(93,9 9,5)


6,6 - 10,5

(119,0 - 189,0)

4,1 - 6,4

(74,0 - 115,0)

3,6 - 6,9

(65,0 - 124,0)

4,6 - 6,0

(83,0 - 108,0)

Bilirubine totale (mg/dl) <0,1

107

Cholestérol, mmol/l (mg/dl)

Moyenne SD 1,55 0,37i*

(60,0 14,2)

2,30 0,53

(89,5 20,4)

2,33 0,53

(90,1 20,6)

2,64 0,69

(102,2 26,6)


0,76 - 2,05

(29,2 - 79,1)

1,36 - 3,30

(52,8 - 127,8)

1,18 - 3,17

(45,6 - 122,4)

2,02 - 3,93

(78,1 - 152,1)

ALP, U/l

Médiane, q 78,0, 66,0 – 82,0 j* 28,5, 25,0 – 35,5 30,0, 25,5 – 34,0 31,0, 27,0 – 40,0

Gamme 22,0 - 118,0 22,0 - 67,0 18,0 - 43,0 25,0 - 50,0

CK, U/l

Moyenne SD

Gamme

699,8 344,9

201,0 - 1464,0

991,5 536,1 k*

288,0- 2829,0

582,4 397,4

83,0 - 1381,0

507,7 243,1

269,0 - 944,0

AST, U/l

Moyenne SD

Gamme

157,7 51,0 l*

75,0 - 298,0

101,8 17,5

57,0 - 128,0

97,1 19,9

56,0 - 147,0

89,0 11,5

75,0 - 104,0

ALT, U/l <4

GGT, U/l <3

Amylase, U/l

Médiane, q 835,0, 694,0 – 1090,0 562,0, 506,0 – 618,75 m* 951,5, 871,0 – 1025,0 790,0, 620,0 – 1136,0

Gamme 582,0 - 1276,0 414,0 - 1003,0 664,0 - 1179,0 439,0 - 1249,0

108

P, n mmol/l (mg/dl)

Médiane, q 2,48, 2,27 – 2,66

(7,68, 7,04 – 8,25)

2,29, 2,22 – 2,48

(7,10, 6,87 – 7,68)

2,09, 2,02 – 2,32

(6,48, 6,25 – 7,19)

2,05, 2,02 – 2,22

(6,36, 6,25 –6,89)


1,66 - 2,86

(5,14 - 8,85)

1,75 - 2,69

(5,41 - 8,33)

1,51 - 2,84

(4,69 - 8,8)

1,88 - 2,45

(5,82 - 7,59)

Ca, o mmol/l (mg/dl)

Médiane, q 1,7, 1,48 – 1,75

(6,80, 5,90 – 7,0)

1,61, 1,53 – 1,65

(6,45, 6,13 – 6,60)

1,66, 1,54 – 1,72

(6,65, 6,18 – 6,90)

1,67, 1,51 – 1,8

(6,7, 6,05 – 7,2)

Gamme, mmol/l (mg/dl) 1,17 - 1,85

(4,70 - 7,40)

1,25 - 1,77

(5,00 - 7,10)

1,25 - 1,825

(5,00 - 7,30)

1,40 - 1,85

(5,60 - 7,40)

Ca:P

Moyenne SD 0,89 0,08 0,89 0,07 0,99 0,10 1,01 0,11

Gamme 0,77 - 1,02 0,74 - 1,04 0,77 - 1,17 0,85 - 1,16

Na, p mmol/l = meq/L

Médiane, q 150,0, 128,0 – 153,0 149, 145,25 – 151 149,5, 146,3 – 150 140, 132 – 148

Gamme, mmol/l 84,0 - 155,0 115,0 - 154,0 102,0 - 154,0 128,0 – 151,0

K, q mmol/l= meq/L

Moyenne SD 3,8 0,7 3,9 0,4 3,8 0,4 3,5 0,2

Gamme, mmol/l 2,1 - 4,7 3,1 - 4,7 2,8 - 4,5 3,3 - 3,7

Cl, r mmol/l= meq/L

Médiane, q 119, 100 – 120 115,5, 114 – 119 117, 115 – 119,25 112, 103,5 – 117,5

Gamme, mmol/l 63,0 - 122,0 90,0 - 122,0 79,0 - 212,0 100,0 -120,0

109

a Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks Dunn’s method: 8 vs 20, 32, 44, 56 mois, H=36,855, significatif avec p < 0,001*,

b Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks Dunn’s method: 20 vs 32, 44, 56 mois, H=10,176, significatif avec p = 0,017*;

Mann-Whitney 20 mois vs 32 mois (p = 0,007), 44 mois (p = 0,021), 56 mois (p = 0,031), c Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks Dunn’s method: H=6,389, p = 0,09,

d Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks Dunn’s method: H=12,5, significatif avec p = 0,006*; Mann-Whitney 20 mois vs 32

mois (p = 0,043), 44 mois (p = 0,002), 56 mois (p = 0,01), e Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks Dunn’s method: H=15,24, significatif avec p = 0,002*; Wilcoxon rank sum test: 56

mois vs 32 mois (p = 0,04), 20 mois (p = 0,01), f Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks Dunn’s method: H=13,78, significatif avec p = 0,003*; Wilcoxon rank sum test: 20

mois vs 32 mois (p = 0,01), g Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks Dunn’s method: H=14,49, significatif avec p = 0,002*; Wilcoxon rank sum test: 56

mois vs 44 mois (p = 0,009), 32 mois (p = 0,016), 20 mois (p = 0,002), h One Way Test with non equal variance (Welsh) and normal distribution, significatif avec p < 0,001*; Pairwise comparisons using

t tests: 20 mois vs 32, 44, 56 mois (p < 0,001), i One Way ANOVA with equal variances and normal distributions, significatif avec p < 0,001*; Pairwise comparisons using t tests

20 mois vs 32, 44, 56 mois, j Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks Dunn’s method: H=30,2, significatif avec p < 0,001*; Wilcoxon rank sum test: 20 mois vs

32 mois (p < 0,001), 44 mois (p < 0,001), 56 mois (p = 0,009), k One Way ANOVA with equal variances and normal distributions after log transformation p = 0,005; Pairwise comparisons using t tests:

32 mois vs 44 mois (significatif avec p < 0,01*), l One Way Test with non equal variance (Welsh) and normal distribution significatif avec p < 0,001*; Pairwise comparisons using t tests:

20 mois vs 32, 44, 56 mois (p < 0,001), m Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks Dunn’s method: H=23,45, significatif avec p < 0,001*; Wilcoxon rank sum test: 32 mois

vs 20, 44 mois (p < 0,001), n, o, p, q

Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks Dunn’s method, resp. H=8,59, p = 0,035; H=3,22, p = 0,359; H=2,006, p = 0,571; H=6,71, p = 0,082.

r Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks Dunn’s method, H=1,89, P = 0,60,

111

B. Discussion

Les tableaux VI et VII présentent une synthèse respectivement des analytes

hématologiques et des paramètres biochimiques référencés dans la littérature pour les

tortues caouannes et vertes. Dans cette étude, nous avons pris pour références ces

données bibliographiques, en rappelant que ces valeurs varient en fonction de la taille

de l’échantillonnage et de la méthodologie utilisée pour obtenir ces résultats, à

l’origine de variations inter-laboratoires.

1. Hématologie

Le volume de sang total d'un reptile varie en fonction des espèces mais de

manière générale est d'environ 5 à 8% du poids total (Strik et al., 2007). Donc le

volume de sang d'un serpent de 100g est de 5-8 mL. Les reptiles sains peuvent

aisément perdre 10% de leur volume de sang total sans conséquences délétères; ainsi

0,7 mL de sang peut être prélevé sans problème chez un animal de 100g.

Pour les animaux de 8 mois, les valeurs d’hématocrite de notre étude sont

incluses dans les gammes précédemment publiées (Bradley et al., 1998; Kakizoe et al.,

2007). Les tortues de 20 à 56 mois ont des valeurs d’hématocrite similaires à celles

rapportées pour des tortues caouannes immatures, captives d’élevage présentes au

Japon ainsi que pour des immatures sauvages de taille/âge similaires (Casal and Oros,

2007; Kakizoe et al., 2007; Keller et al., 2004b; Morpurgo and Gelman, 1991). Dans

notre étude, le taux d’hématocrite varie en fonction de l’âge des individus ce qui

corroborent les corrélations (en fonction de l’âge et de la longueur de la carapace)

précédemment décrites chez diverses espèces de tortues marines (Frair and Shah,

1982; Kakizoe et al., 2007; Wood and Ebanks, 1984). Bien que des reptiles sains

puissent avoir un faible degré de polychromasie (<5%), les jeunes peuvent avoir un

degré plus élevé que les adultes (Duguy, 1970). Les petites inclusions basophiles

ponctiformes observées fréquemment au sein des érythrocytes chez tous les groupes

d’âge sont morphologiquement évocateurs d’organelles dégénérées (Alleman et al.,

1992; Casal and Oros, 2007).

Le nombre de leucocytes totaux de notre étude entre dans la gamme de valeurs

rapportées précédemment chez des tortues caouannes immatures sauvages (Casal et

112

al., 2009; Flint et al., 2010a; Keller et al., 2004b; Stamper et al., 2005) ainsi que chez

les tortues vertes (Flint et al., 2010b; Work et al., 1998). Les variations de

pourcentage de leucocytes observées en fonction des diverses classes d’âge sont en

adéquation avec la relation positive existant entre l’âge et le pourcentage de

lymphocytes ainsi que la relation négative qui existe entre l’âge et le pourcentage

d’hétérophiles ayant été décrite par Kakizoe et al. Dans notre étude, le nombre absolu

total de lymphocytes est similaire aux valeurs précédemment rapportées chez des

tortues caouannes immatures, maintenues en captivité ou sauvages (Keller et al.,

2004b; Stamper et al., 2005). Le type cellulaire le plus fréquent de notre étude chez

toutes les tranches d’âge est le petit lymphocyte bien différencié. Très peu de

lymphocytes larges ou intermédiaires étaient présents sur les frottis de certains

individus. Ils peuvent toutefois être observés en faible nombre dans la circulation

périphérique des reptiles sains (Stacy et al., 2011). En seconde position viennent

ensuite les hétérophiles, ce qui concorde avec les tortues caouannes immatures de

Caroline du Nord (USA, Keller et al., 2004b) et les tortues vertes de Hawaii (Work et

al., 1998). Par contre deux études, l’une réalisée sur des tortues caouannes captives

âgées d’un an en Caroline du Sud (Bradley et al., 1998) et l’autre réalisée sur des

immatures aux Canaries (Casal and Oros., 2007; Casal et al., 2009) ont montré que les

hétérophiles constituaient la population leucocytaire dominante. Les valeurs du

nombre d’hétérophiles rapportées dans notre étude sont inférieures à celles

précédemment rapportées chez des individus captifs immatures (Bradley et al., 1998;

Kakizoe et al., 2007). La population de monocytes représente généralement un faible

pourcentage des leucocytes présents dans le sang périphérique des reptiles sains

(Bradley et al., 1998; Casal and Oros, 2007; Deem et al., 2009; Flint et al., 2010a).

Les pourcentages d’éosinophiles obtenus étaient dans la gamme des valeurs

précédemment publiées chez les tortues caouannes (Bradley et al., 1998; Stamper et

al., 2005; Keller et al., 2004b) ; cependant aucune valeur, qui aurait pu servir de

comparaison, n’est disponible dans l’étude réalisée par Kakizoe et al. (2007). Les

basophiles étaient présents mais en très faible nombre, ce qui a également été

mentionné dans des études ultérieures chez les tortues vertes et caouannes (Work et

al., 1998; Casal and Oros, 2007).

113

Tableau VI. Synthèse des paramètres morphométriques et hématologiques rapportés dans la litérature pour C. caretta et C. mydas

C. mydasa C. mydasb C. mydasc C. mydasd C. carettae C. carettaf C. carettag

Longueur SCL (cm) 41 – 59 38,9 – 107,2 38,9 – 107,2 16,5 – 49,3 45,7 – 77,3 64,55

Poids (kg) >10 0,8 – 26,4 5,5 – 149 5,5 – 149 1,4 – 26 14,4 – 56,6 41

HCT (%) 17 – 35 18 – 56 13,4 – 53,2 13,4 – 53,2 17 – 45 23 – 38 32

Total WBC (103/µl) 5,9 – 23,6 20 – 60 0,8 – 30,1 2,6 – 29,2 2 – 18,9 5,8 – 20,7 15,8

Lymphocytes (%) 72,5 24 – 86 65

Lymphocytes (x103/µl) 3,6 – 18,6 0,6 – 22,3 0,6 – 22,3 0,1 – 1,8 4,6 – 15 9,92

Hétérophiles (%) 10,1 0 –17 27

Hétérophiles (x103/µl) 0,3 – 3,2 0,04 – 6,8 0,4 – 8,3 1,8 – 7,3 1,3 – 8,2 3,48

Monocytes/Azurophils (%) 5,8 0 3

Monocytes/Azurophils (x103/µl) 0,1 – 1,9 0,07 – 3,4 0,07 – 3,4 0 – 0,3 0,17 – 1,5 0,75

Eosinophiles (%) 12,3 8 – 37 6

Eosinophiles (x103/µl) 0,7 – 3,2 0,01 – 1,7 0,01 – 2,9 0 – 1,2 0,14 – 2,7 0,88

Basophiles (%) 0 2 – 45 0

Basophiles (x103/µl) 0 – 1 0 0 0 – 10-6 0 – 0,38 0

114

Tableau V. suite,

C. carettah C. carettai C. carettaj C. carettak C. carettal C. carettam

Longueur SCL (cm) 59,45 4,5 – 58,2 8,46 – 20,6 67,5 – 95,5 67,5 – 95,5 8,8 – 56,5

Poids (kg) 31,8 0,02 – 26,7 0,11 – 14,4 49 – 90 49 – 90 0,11 – 23,4

HCT (%) 28 16 – 26,2 16,4 – 20,3 13,9 – 47,3 17 – 32

Total WBC (103/µl) 14,3 4,7 – 10,2 0,38 – 6,19 2,63 – 31,3 3,67 – 50,9 2,1 – 27,3

Lymphocytes (%) 36 24,6 – 58,6 8,6 – 32,8 41 – 100

Lymphocytes (103/µl) 4,29 1,3 – 5,2 0,55 – 15,5 0,64 – 33,9 2 – 25,3

Hétérophiles (%) 60 35,8 –73,3 55,4 – 85,9 0 – 41

Hétérophiles (x103/µl) 6,33 2,5 – 5,1 0,97 – 8,20 0,18– 48,95 0 – 2,4

Monocytes/Azurophils (%) 4 0 – 2,2 2,3 – 4 0 – 10

Monocytes/Azurophils (x103/µl) 1,52 0,05 – 3,22 0,05 – 3,22 0 – 2,1

Eosinophiles (%) 2 1,9 –7 0 – 9

Eosinophiles (x103/µl) 0,23 0,09 – 3,45 0,09 – 3,45 0 – 0,6

Basophiles (%) 0 0,17 – 0,8 0 – 7

Basophiles (x103/µl) 0 0 – 0,9

115

a D’après Work et al, 1998 (Unopette method, n=26, immatures sauvages, gamme),

b D’après Wood and Ebanks, 1984 (n=20-102, animaux en captivité 6 -18 -30 et 45 mois, gamme),

c D’après Flint et al, 2010 (WBC estimate, n=34-141, mâles immatures sauvages, Intervalle de Reference),

d D’après Flint et al, 2010 (n = 72 -141, femelles immatures sauvages, Intervalle de Reference),

e D’après Casal et al, 2009 (Méthode Natt and Herrick, n=69, juvéniles sauvage suite rehabilitation, gamme),

f Keller et al, 2004b (Natt and Herrick method, n=13, juveniles sauvages, gamme),

g Stamper et al, 2005 (Natt and Herrick method, n=15, juveniles résidents, médiane),

h Stamper et al, 2005 (Natt and Herrick method, n=42, juveniles en migration, médiane),

i D’après Kakizoe et al, 2007 (Méthode Unopette, n=5, animaux captifs 1-36 months of age, gamme de moyennes),

j D’après Bradley et al, 1998 (Méthode Unopette, n=10, animaux captifs 2-12 months of age, gamme de moyennes),

k D’après Flint et al, 2010 (WBC estimate, n=34-55, mâles immatures sauvages de grande taille, Intervalle de Reference),

l D’après Flint et al, 2010 (WBC estimate, n=23-55, femelles immatures sauvages de grande taille, Intervalle de Reference),

m Notre étude (Méthode Unopette, n=85, animaux captifs 8-56 mois, gamme),

117

2. Biochimie plasmatique

Notre étude des paramètres biochimiques plasmatiques a permis de mettre en

évidence plusieurs différences significatives ainsi que les sens de variations telles que

rapportées dans le tableau VI. Les variations des valeurs biochimiques en fonction des

différences d’âge, de poids et de taille des tortues caouannes ont été rapportées dans

plusieurs études antérieures (Bradley et al., 1998; Casal et al., 2009; Deem et al.,

2009; Delgado et al., 2011; Flint et al., 2010a; Gelli et al., 2009; Keller et al., 2004b;

Osborne et al., 2010; Stamper et al., 2005). Les concentrations significativement plus

faibles de protéines totales, mesurées à la fois par réfractométrie et analyseur, chez les

tortues de 8 et 20 mois respectivement sont concordantes avec des études antérieures

qui mentionnent une augmentation relative des protéines totales avec le poids et l’âge

des tortues (Casal et al., 2009; Frair and Shah, 1982; Kakizoe et al., 2007). Une étude

mentionne que la longueur de la carapace (SCL 81 cm) et le poids des tortues

caouannes immatures corrèlent avec les concentrations en protéines totales (Osborne

et al., 2010). Cela n’a pas été objectivé dans notre étude. Les concentrations en

globulines augmentent avec l’âge. Les augmentations relatives à l’âge en

concentration de protéines totales, albumine et globuline chez les animaux captifs

comparées aux individus sauvages peuvent être associées aux disparités

nutritionnelles, à une stimulation du système immunitaire et/ou un stade reproductif

différent.

Kakizoe et al. (2007) ont décrit une glycémie décroissante avec l’âge chez les

tortues caouannes, ce qui correspond à nos observations (Kakizoe et al., 2007). De

manière tout à fait similaire aux observations effectuées sur des crocodiles du Nil, les

concentrations en cholestérol des tortues de notre étude augmentent avec l’âge

(Morpurgo and Gelman, 1991).

Les activités tissulaires des enzymes ALP, AST et CK ne sont pas spécifiques

d’un tissu donné chez les tortues marines et reptiles terrestres mais sont plutôt

présentes dans divers organes (Wagner and Wetzel, 1999). Ainsi, une augmentation

significative de l’activité d’une des enzymes précédemment citées n’est pas spécifique

d’une lésion d’un tissu donné chez les reptiles mais plutôt indicateur, chez les

individus captifs immatures, d’une phase de croissance tissulaire et/ou d’effets

imputés à la captivité tels que la manipulation et les possibles agressions entre

118

congénères (Innis et al., 2009). Le lien avec une croissance tissulaire a été confirmé

dans notre étude grâce à une prise de poids concomitante et non négligeable.

Les concentrations plasmatiques en créatinine et urée de nos individus

augmentaient graduellement avec l’âge, ce qui correspond aux résultats de Kakizoe et

al. (2007). Ce résultat peut être très probablement associé aux différences de nutrition,

et aux rations chez les animaux de 32 mois versus ceux de 56 mois et peut être ainsi

attribué à l’utilisation de deux aliments commerciaux différents chez les animaux de

32 et 56 mois. Les concentrations en bilirubine étaient en dessous du seuil de

détection de l’analyseur (< 0,1mg/dl) dans tous les groupes d’âge et également par

comparaison avec les autres tortues caouannes juvéniles (Keller et al., 2004b). Cet

analyte est rarement rapporté chez les tortues marines et les autres espèces de reptiles

puisque la biliverdine est le principal pigment biliaire chez ces espèces (Campbell,

2006). L’importance clinique de la bilirubine périphérique chez les reptiles n’est pas

encore éclaircie.

Aucune différence significative n’a été décelée pour le calcium, phosphore,

sodium, chlore et potassium entre les différentes classes d’âge. La moyenne de

calcémie et phosphatémie correspondait aux valeurs rapportées pour des tortues

caouannes juvéniles d’Espagne (Casal et al., 2009), de Caroline du Nord (Keller et al.,

2004b) et pour des individus immatures d’Australie (Flint et al., 2010a). La moyenne

des natrémies était légèrement plus basse que celle précédemment décrite chez des

caouannes immatures (Keller et al., 2004b). La moyenne des kaliémies et chlorémies

se situait dans les gammes de valeurs physiologiques connues pour les tortues marines

(Campbell, 2006).

Ainsi notre étude avait pour but de rapporter des gammes de valeurs

hématologiques et biochimiques pour des tortues caouannes immatures, captives et

saines appartenant à diverses catégories d’âge. La prise de sang constitue un outil

diagnostique indispensable pour le vétérinaire, ainsi ce travail a pour but de fournir un

outil supplémentaire d’intérêt médical dans le soin et les traitements mis en place chez

cette espèce.

119

Tableau VII. Synthèse des analytes biochimiques rapportés dans la litérature pour C. caretta et C. mydas et sens de variation des paramètres de

notre étude.

C. mydasa C. mydasb C. mydasc C. carettad C. carettae C. carettaf C. carettag

Protéine Totale, g/dL 3–5 2,08–6,2 2,6–5,5

6,2

1,5– 3,3d* 2,9– 4,1

4,6– 6,1

1,6– 5,6f* 2,9–7,2

Albumine, g/dL 1 – 2,9 0,69 – 1,75 1,0 – 2,5

2,07

0,56 – 1,37d* 0,7– 3,1

1,4–1,9

0,8–1,6g* 0,75 – 1,6

Globuline, g/dL 1,54 – 4,66 1,6 – 3,3

2,7– 5,1

1,0– 4,0f* 2,12– 5,9

Créatinine,

mg/dL 0,28 – 0,54 0,1 – 0,2

0,81

0,44 – 1,13d*

0,10 – 0,60

0,10 – 0,5f* 0,16 – 0,47

Acide urique,

mg/dL 0,7 – 1,4 0,37 – 2,21 0,81 – 2,10

0,46

0,14 – 0,96d* 0,6 – 1,4

0,2 – 0,90

0,20 –1,20f* 0,29 – 2,64

Urée,

mg/dL 4 –35 0 – 77,03 54,06 – 143,98

83,98

41,45– 142,3d* 28 – 74

5,0 – 13,0

1,0 – 107,0f* 60,8 – 135,6

Glucose,

mg/dL 72 –128 66,7 – 178,4 97,3 – 185,6

110,45

122,0 – 165,0d* 73 – 111

73,9 – 113,5

70,3– 136,9f* 77,48 – 160,4

120

Cholestérol,

mg/dL

92 – 207

92,7 – 312,7

409,3

103,5 – 193d*

53 – 228

189,2 –339,8

45,2 – 200f*

ALP, U/L 7–107 8,3–37,9 31–63 7–22 10,5–132,9

CK, U/L 181–3145 326–2728,5 145–1802

544,7

400–2,810,6d* 319–1742

81–1,627

3–1,899f* 157–2,211

AST, U/L 99–343 74,1–244,6 396–3175 149–318 2 – 255f* 78,7–247,6

Amylase, U/L 163–1470 221,7 –1016d* 2–417f*

P, mg/dL 6,1–10,5 4,95 –11,1 6,19 – 13,3 6,1 – 16,8d* 6,0–9,5 4,1 – 7,9f* 4,9 – 9,9

Ca, mg/dL 5,3–11,3 0,8 – 8,8 5,6 – 8,0 5,96 – 8,5d* 4,3–7,7 5,6 – 8,3f* 4,8 – 8,0

Na, mmol/L 147–174 139,2–157,8 148–162 143,2–154,4d* 150–168 135–175f*

K, mmol/L 4,0–5,1 3,0–7,1 3,5–6,7 3,2–4,48d* 3,5–7,9 3,3–13,9f* 3,2–5,7

Cl, mmol/L 94–119 100,7–121,1 116–131 103,0–120,6d* 103–128 107–158f*

121

Tableau VI, suite,

C. carettah C. carettai C. carettaj C. carettak C. carettal Comparaison et sens de variation

Protéine Totale, g/dL 2,4– 5,9

2,6– 6

2– 11i* 2,1– 4 2,9–4,60 1,3 - 2,7

tortues caouannes immatures sauvages

ou réhabilitéesd, f, h, i, j

et tortues vertesa, b, c

tortues caouannes adultes sauvages ou en

réhabilitation d, e, f, g, h, i

Albumine, g/dL <1,0 – 1,5

1,1–2,6

1,0–1,4i* 0,1 – 0,2 1,0 – 1,6 0,5 –1,2

tortues caouannes d, e, f, g, h, i, k

tortues vertes immatures a, b, c

tortues de Kemp immaturesc

Globuline, g/dL 1,5– 4,5 1,5– 3,6

0– 2,6i* 1,7– 3,8 0,7 – 1,6 tortues marines sauvages immatures ou

adultes b, c, i, g, k

Créatinine, mg/dL 0,1 – 0,2 0,3 – 0,8 0,3 – 0,5 0,01 – 0,11

(Gelli et al., 2009),

caouannes sauvages et immatures de

diverses tailles d, g, h, i, j, k

Acide urique, mg/dL 0,3– 3,4 <0,84 – 1,68i* 1– 2,4 0,17 – 1,0 0,30 – 1,10

tortues caouannes immatures e, h, i, j

tortues vertes sauvagesb + tortues de

Kemp convalescents c

tortues vertes immatures en centre de

réhabilitation c

+ tortues vertes de Floride a

Urée, mg/dL 25 – 197 5,0 – 188,5i* 62 – 344,5 42,0 – 93,6 16,6 – 51,3 caouannes juvéniles d, h, i

caouannes adultes immatures g

Glucose, mg/dL 76–143 19,8 – 291,9i* 71 – 197 54,8 – 104,3 65 – 189,0

tortues caouannes immatures sauvagesf,

g, h, i

tortues vertes et Kemp immatures a, b

(Alleman et al., 1992)

tortues femelles adultes en phase de

jeûne pendant la saison de reproductionf, i

Cholestérol 212,3 – 351,3 60 – 200 29,2 – 152,1

tortues caouannes de taille et poids

122

mg/dL 50,2 – 397,7i* analoguesd, f, i

tortues vertes et de Kempa, c

ALP, U/L 9–74 51–562i* 51–120 6,4–17,6 18,0 –118,0

tortues caouannesg, h

(Casal et Oros, 2007)

CK, U/L 281–5,667 83,0 – 2,829,0

AST, U/L 128–355 <10–844i* 13–238 57,0 – 298,0

Amylase, U/L 414 – 1,276,0

P, mg/dL 5,2–9,1 3,3–13,4 4,9 – 7,6 4,7–8,85

Ca, mg/dL 5,5–11,4

8,4 – 17,2

2,8 – 12,4 i* 3,1–7,1 5,4 – 8,2 4,70–7,40

Na, mmol/L 154–164 135,9–166,2 148,0–156,2 84,0–155,0

K, mmol/L 3,1–5,6 3,7–7,3 2,84–3,92 2,1–4,7

Cl, mmol/L 110–125 100,0–136,0 105,4–118,0 63,0–212,0

a D’après Jacobson et al., 2007 (33,5 cm <SCL< 47,3cm, juvéniles, range),

b D’après Flint et al., 2010 (n>190, immature de grande taille, Intervalle de Référence),

c D’après Anderson et al., 2011 (29,4cm<SCL< 47,1cm, gamme),

d D’après Kakizoe et al., 2007 (n=61, femelles adultes, moyenne n=5, juvéniles *, 1-36 mois, gamme des moyennes),

e D’après Jacobson et al., 2007 (SCL>60 cm, gamme),

25

f D’après Deem et al., 2009 (femelles en ponte, juvéniles*, gamme),

g D’après Flint et al., 2010 (n=63, adultes et juvéniles de grande taille, Intervalle de Référence) ,

h D’après Keller et al., 2004b (n=40, juvéniles sauvages, gamme),

i D’après Casal et al., 2009 (n=34, femelles adultes sauvages, n=69, juvéniles réhabilités*, gamme),

j D’après Delgado et al., 2011 (n=21, 19,7 cm, SCL<51,9 cm, juvéniles sauvages, sérum),

k D’après Stamper et al., 2005 (en migration, 10

th et 90

th percentiles),

l Notre étude (n=85, 8-56 mois, gamme)

Valeurs de notre étude dans la gamme, Valeurs de notre étude inférieures vs autres études,Valeurs de notre étude dans la limite inférieure

123

III. Evaluation des fonctions immunitaires de la tortue caouanne

immature et captive (Caretta caretta).

A. Résultats

1. Profils cellulaires obtenus en cytomètre de flux et caractérisation

morphologique des leucocytes du sang périphérique.

La figure 26 représente un nuage de points (Figure 26A) des cellules

collectées sur Ficoll (Fig. 26B). Les cellules ont été circonscrites électroniquement

(Figure 26A) en se basant sur leur taille relative (FSC) et leur granulosité (SCC) puis

triées par cytomètre de flux afin d’être examinées histologiquement (Fig. 26C et D).

La population lymphocytaire constituait 79,5% ±7 (n=20) du gradient de Ficoll (Fig.

26B), le reste étant des débris cellulaires et membranaires. Les lymphocytes sont des

cellules rondes et mononuclées, possédant peu de cytoplasme bleu-violet. Ce

cytoplasme ne contient pas de granules (Campbell, 2006).

Figure 26. A. Profils obtenus par cytomètre de flux et B. Examen cytologique des cellules sanguines de

tortues caouannes (objectif 40x) collectées sur Ficoll. Noter la complexité (SSC) et taille relative (FSC),

qui sont caractéristiques des lymphocytes de Caretta caretta. (C) Lymphocytes. (D) Débris et

membranes cellulaires.

124

Les sous-populations cellulaires obtenues entre chaque gradient de Percoll

(Fig. 27) ont été triées et isolées par cytométrie de flux. La première couche (L1) se

situait entre le plasma et le gradient à 40% de Percoll, la seconde couche (L2) entre

les gradients à 40 et 45% de Percoll et enfin la troisième couche (L3) été située entre

les gradients à 50 et 55% de Percoll.

La figure 28 montre les nuages de points obtenus par cytométrie de flux

représentatifs des cellules présentes dans les premières et secondes couches (Fig. 28A

et B respectivement), ainsi que les morphologies cellulaires des sous-populations

obtenues par cytologie lors de leur séparation par gradient discontinu de Percoll. Les

divers types cellulaires collectés dans chacun des gradients de Percoll ont été triés par

cytométrie de flux afin de pouvoir examiner leur morphologie cellulaire (Fig. 28C, D

et E). Pour chaque couche de Percoll, vingt mille événements totaux ont été

enregistrés par cytométrie de flux. Le nombre de cellules (moyenne, % du nombre

d’évènements totaux) appartenant à un type cellulaire donné pour chaque couche de

Percoll a été mesuré. Quatre populations ayant une morphologie distincte ont été

définies sur la base de la taille et de la granulosité. Les lymphocytes (Fig. 28E) sont

de petites cellules, les moins granuleuses, tout comme les thrombocytes, alors que les

monocytes (Fig. 28D) sont plus des cellules plus grandes et légèrement plus

granuleuses. Les monocytes sont les plus grandes cellules circulant dans le sang

périphérique des reptiles. Ces cellules sont rondes, possèdent un seul noyau ainsi

qu’un cytoplasme bleu-gris abondant (Campbell, 2006). Les éosinophiles sont les

cellules les plus granuleuses (Fig. 28C). Ce sont de grandes cellules rondes, possédant

des granules cytoplasmiques rose vif et sphériques ainsi qu’un noyau basophile et

périphérique. Leur cytoplasme est bleu pâle (Campbell, 2006).

Les éosinophiles constituaient 11,2% des cellules détéctées par cytométrie de

flux (n=20 animaux) se situant entre le plasma et le Percoll à 40%. Les thrombocytes

constituaient 34,5% des cellules détéctées (n=20) de cette même première couche. Les

monocytes constituaient 12% (n=20) des cellules détectées dans les couches formées

des gradients plasma 40 % de Percoll (première couche) et 40-45% de Percoll

(seconde couche). Finalement, les lymphocytes formaient 65% des cellules (n=27) de

la seconde couche ainsi que 87% (n=11) des cellules de la troisième couche (gradients

50-55% de Percoll) dans laquelle ils étaient majoritaires.

125

Figure 27. Gradients de Percoll discontinus obtenus après centrifugation. Le sang total de tortue

caouanne a été déposé au dessus de plusieurs couches de Percoll de différentes densités allant de 1,053

(40%) à 1,076 g/ml (60% solution stock) afin de former un gradient discontinu.

Figure 28. A. Profils obtenus par cytomètrie de flux des leucocytes sanguins de tortues caouannes

isolés entre les gradients de plasma et 40% de Percoll ainsi que 40-45% de Percoll. Les différentes

populations cellulaires ont été distinguées sur la base de leur taille (FSC) et granulosité (SSC). B.

Examination cytologique d’étalement sur lame des cellules sanguines de tortues caouannes

(microscopie avec objectif 40x) préalablement triées par cytométrie de flux. C. Les éosinophiles sont

granuleux avec un cytoplasme abondant ainsi qu’un grand noyau excentré. D. Les monocytes sont de

grandes cellules, peu granuleuses, tandis que les lymphocytes (E) sont de petites cellules peu

granuleuses.

126

2. Le système immunitaire inné des tortues caouannes

Les données d’au moins quatre expériences indépendantes portant sur la

phagocytose (trois individus par expérience), et portant sur l’explosion respiratoire

(de deux à six individus par expérience) ont été regroupés. Pour les tests portant sur la

fonctionnalité des cellules tueuses, une à deux expériences indépendantes (quatre

individus pour chaque expérience) pour chaque température, milieu de culture et

temps d’incubation testés ont été regroupés.

a. La Phagocytose

La Fig. 29A montre les capacités de phagocytose des sous-populations

leucocytaires. Les monocytes ont été principalement isolés à partir des couches 1 et 2

(Fig. 29A and B). Il n’y avait pas de différences significatives de l’activité

phagocytaire des monocytes (Fig. 29B) entre les couches 1 et 2 pour: l’ingestion

d’une bille ou plus (1+ beads, moyenne= 28,8% et 27,8%, respectivement, p=0,445),

l’ingestion de deux billes ou plus (2+ beads, moyenne=12,7% et 11,4%,

respectivement, p=0,250) et l’ingestion de trois billes ou plus (3+ beads,

moyenne=6,7% et 5,6%, respectivement, p>0,05). La phagocytose (1+ et 2+) était

significativement plus importante pour les monocytes que pour les autres types

cellulaires (Fig. 29B) au sein des couches 1 et 2 (p<0,001). Cependant, il n’y avait pas

de différences significatives de phagocytose entre les monocytes et les éosinophiles

lorsque trois billes ou plus étaient phagocytées (Fig. 29B, p>0,05). Il n’y avait pas de

différences significatives de phagocytose entre les thrombocytes, éosinophiles et

lymphocytes lorsque une bille ou plus était impliquée (p>0,05). La phagocytose des

éosinophiles était légèrement plus importante (p<0,025) que celles des thrombocytes

et lymphocytes (isolées dans la troisième couche) pour deux billes ou plus (6,9% vs

5,7% et 1,3% respectivement) et trois billes ou plus (4,8% vs 2,45% et 0,1%

respectivement).

127

Figure 29. A. Profils obtenus par cytomètre de flux des cellules collectées entre le plasma et 40% de

Percoll et les histogrammes d’activité phagocytaire des éosinophiles et monocytes correspondants. B.

Pourcentage de cellules (éosinophiles, monocytes et lymphocytes) phagocytant une bille ou plus

(1+beads), deux billes ou plus (+ beads) ou trois billes ou plus (3+beads). N=22 pour les cellules

(éosinophiles, thrombocytes, monocytes) isolées entre le plasma et 40% Percoll (L1); N=34 pour les

cellules (lymphocytes et monocytes) isolées entre les gradients 40 et 45% de Percoll (L2) et N=22 pour

les lymphocytes isolés entre les gradients 50 et 55% de Percoll (L3). * Différences significatives pour

tous les types cellulaires sauf les monocytes. ** Différences significatives des éosinophiles.

b. L’explosion respiratoire

Les lymphocytes isolés dans les couches 2 ou 3 ont généré une faible

explosion respiratoire (Fig. 30, moyenne du rapport des cellules stimulées par le PMA

/ cellules non stimulées =1,37 dans la couche 2 et 1,09 pour la couche 3). Les

monocytes isolés dans la couche 2 (Percoll 40-45%) ont montré une explosion

respiratoire statistiquement plus importante (rapport = 2,34) que les lymphocytes

isolés dans les couches 2 and 3 (Fig. 27, p<0,001).

128

Figure 30. Explosion respiratoire in vitro (moyenne ± SD) chez les tortues caouannes juvéniles,

exprimée par le rapport cellules stimulées par le PMA/ cellules non stimulées. n = nombre d’individus.

* Différences significatives (p < 0,001, α=0,99). Les monocytes isolés entre les gradients 40 et 45% de

Percoll (L2) figurent en noir. Les lymphocytes isolés entre les gradients 40 et 45% de Percoll (L2) sont

en gris et les lymphocytes isolés entre les gradients 50 et 55% de Percoll (L3) sont en blanc.

c. L’activité des cellules tueuses naturelles (cellules NK)

La figure 31 montre l’activité des cellules tueuses naturelles en utilisant deux

lignées cellulaires cibles avec des conditions d’incubation différentes et des rapports

cellules effectrices/cellules cibles différents. L’activité des cellules tueuses naturelles

était significativement plus importante vis à vis des cellules cibles YAC-1 que des

cellules cibles K-562 (p≤0,02) pour des rapports E:T (Effector =cellules NK:

Target=cellules cibles) de 100:1 à 25:1. Pour les ratios E:T de 100:1 et 50:1, il n’y

avait pas de différences d’activité des cellules NK entre celles incubées dans le

DMEM ou RPMI (p=0,057). Toutefois pour les dilutions supérieures (25:1 à 6:1), le

milieu de culture avait une influence puisque l’activité des cellules NK était

significativement plus importante pour le RPMI que pour le DMEM (p<0,001). Il n’y

avait pas de différence significative concernant l’activité des cellules NK vis à vis des

cellules cibles YAC-1 lorsque le RPMI était utilisé comme milieu de culture, à 28°C

que l’incubation était de 2,5 h ou 3 h et ce pour des rapports E:T de 100:1 à 6:1

(p=0,163). Une activité tueuse plus importante pour des rapports E:T allant de 100:1 à

6:1 a été obtenue à 28°C comparé à 37°C (p<0,04) et ce pour une incubation de 2, 5 h

ou 3 h.

129

Figure 31. Activité des cellules NK in vitro (moyenne ± SD) mesurée en fonction des cellules cibles

tuées (lignée cellulaire sensible au cellules NK) par les cellules NK (cellules effectrices). Divers

paramètres ont été testés (milieu de culture, température, cellules cibles et durée d’incubation)

n=nombre d’individus. *Différences significatives entre les cellules cibles YAC-1 et K562 dans le

DMEM, **Différences significatives entre 28 et 37˚C soit après 2h30 ou 3h d’incubation dans le RPMI.

***Différences significatives entre les DMEM et le RPMI à 28˚C après 2h30 d’incubation. T-tests (p <

0,05, α=0,8).

3. Réponse des lymphocytes de tortue caouanne à une stimulation

Les données de neuf expériences indépendantes portant sur la prolifération

lymphocytaire (trois individus par expérience) ont été regroupés. La figure 32 montre

les résultats des tests de prolifération lymphocytaire obtenus lors de la stimulation par

des agents mitogènes. La phytohémagglutinine PHA-P et la concanavaline A ConA

induisaient une augmentation statistiquement significative de la prolifération des

lymphocytes, comparée aux cellules non stimulées et ce pour des concentrations de 1,

2, 5 et 10 µg/ml (resp. p<0,001 et p<0,02). Toutefois à 20 µg/ml aucune prolifération

significative n’avait été rapportée, pour aucun des deux mitogènes testés stimulant la

prolifération des lymphocytes T. PHA-P a induit un changement plus important de

l’indice de prolifération que ConA. Les concentrations optimales pour le PHA étaient

1 et 2 µg/ml, tandis qu’elles étaient de 5 et 10 g/ml pour ConA.

Les cellules stimulées avec le « pokweed mitogen » (PWM ; Phytolacca

americana) à une concentration de 1, 2, 5, 10 et 20 µg/ml avaient un indice de

130

prolifération significativement plus important que pour les cellules non stimulées

(p<0,01), et l’amplitude de changement était comparable à ce qui a été obtenu lors

d’une stimulation avec ConA pour des concentrations similaires. Enfin, une

concentration de 1 µg/ml de LPS induisait une augmentation modeste mais

significative de la prolifération cellulaire par comparaison aux cellules non stimulées

(p=0,002).

Figure 32. Prolifération lymphocytaire in vitro après stimulation par les agents mitogènes. Moyenne ±

SD de 9 expériences réalisées en triplicat. Différences statistiquement plus élevées que les controles

*p<0,05,**p<0,01, ***p<0,001.

B. Discussion

Notre étude portait sur l’optimisation, la validation et la mesure de fonctions

du système immunitaire inné et acquis chez les tortues caouannes juvéniles. Dans

notre étude, les monocytes possédaient une activité phagocytaire et une explosion

respiratoire plus importantes que les autres leucocytes. Les éosinophiles ont montré

une capacité à phagocyter. Ce travail décrit pour la première fois l’activité des

cellules tueuses (NK) chez les tortues marines. La lignée cellulaire YAC-1 semble

être la cible la plus adéquate. Enfin, nous avons également confirmé que les

leucocytes du sang périphérique des tortues marines pouvaient produire une réponse

131

lympho- proliférative à une diversité d’agents mitogènes, comme cela a été largement

décrit chez les mammifères.

Afin de s’affranchir de l’absence de réactifs disponibles nécessaires à

l’identification des sous-populations de cellules immunitaires chez les reptiles, les

cellules immunitaires circulant dans le sang périphérique ont été identifiées grâce à

l’utilisation conjointe du cytomètre de flux et la caractérisation morphologique. Leurs

fonctions ont ensuite été explorées. Contrairement aux érythrocytes des mammifères

qui peuvent être lysés par choc osmotique avec du chlorure d’ammonium, les

érythrocytes des tortues caouannes sont nucléés et donc osmotiquement plus résistants

(Aldrich et al., 2006). Les sous-populations de leucocytes sanguins ont été isolées,

grâce à l’utilisation d’une superposition de gradients de Percoll discontinus, triées et

analysées. Comme précédemment décrit, la population de granulocytes de faible

densité migrant entre le plasma et 40% de Percoll a été identifiée (Harms et al., 2000).

Les éosinophiles étaient la principale sous-population de granulocytes isolée. Les

monocytes migraient aussi bien entre le plasma et 40% de Percoll qu’entre 40 et 45%

de Percoll, tandis que les lymphocytes ont été retrouvés principalement entre les

gradients de 50-55% de Percoll comme précédemment décrit (Harms et al., 2000).

Les érythrocytes étaient présents au fond du gradient. Chaque population de cellules

identifiée par cytométrie de flux (basé sur la taille et la granulosité) a également été

étudiée par cytologie afin d’identifier le type cellulaire.

1. Fonctions du système immunitaire inné chez les tortues

caouannes

Les mesures de phagocytose de différentes sous-populations de leucocytes ont

été déterminées de façon simultanée grâce au cytomètre de flux. Les monocytes

possédaient l’activité phagocytaire combinée à une explosion respiratoire la plus

importante. Chez les reptiles, les monocytes constituent généralement la première

ligne de défense dans la réponse immune. Tandis que les monocytes ont été rapportés

comme participant aux interactions entre antigènes spécifiques et immunoglobulines,

impliquant particulièrement les IgM et IgY (Campbell, 2006), la phagocytose dans ce

cas s’est avérée être indépendante des immunoglobulines puisque les billes en latex

ne sont pas opsonisées. En effet, les monocytes peuvent phagocyter des particules non

préalablement opsonisées et ce via un processus direct non spécifique, ce qui diffère

132

de la phagocytose médiée par les récepteurs de la fraction Fc des immunoglobulines

(Liao et al., 1994). Bien que les granulocytes les plus nombreux chez les tortues

caouannes soient les hétérophiles (Bradley et al., 1998; Kakizoe et al., 2007;

Rousselet et al., 2013a), nous n’avons pu les isoler correctement malgré l’utilisation

de protocoles spécifiques des hétérophiles aviaires (Andreasen et al., 1989; Latimer et

al., 1989). Il existe plusieurs descriptions montrant que les hétérophiles adhèrent au

verre, nécessitant des traitements préalables (Andreasen et al., 1990, Brooks et al.,

1996) que nous avons effectué sans succès.

Les éosinophiles ont montré une activité phagocytaire plus faible que les

monocytes. L’étude réalisée a montré que les éosinophiles sont capables de

phagocyter les billes de latex, ce qui corrobore avec leur capacité de phagocytose de

complexes immuns (Campbell, 2006). Bien que les éosinophiles des mammifères sont

connus pour jouer un rôle dans les infections parasitaires en produisant des radicaux

peroxyde et superoxyde (Coico et al., 2009), la capacité des éosinophiles des tortues

marines à générer une explosion respiratoire en plus de la phagocytose requière des

études supplémentaires. Chez les tortues caouannes juvéniles en bonne santé, les

éosinophiles constituent la population de granulocytes minoritaires (Rousselet et al.,

2013a), ce qui rend leur évaluation fonctionnelle difficile car un grand nombre

d’éosinophiles est nécessaire pour réaliser le test d’explosion respiratoire.

Dans notre étude, la phagocytose a été mise en évidence à la fois pour les

lymphocytes et les thrombocytes. Les thrombocytes des reptiles possèdent les mêmes

capacités d’hémostase et de cicatrisation que les plaquettes des mammifères (Sypek

and Borysenko, 1988). Ils sont en plus capables de phagocyter les bactéries chez les

oiseaux (Bertram et al., 1998; Wigley et al., 1999) et d’autres espèces de reptiles

(Frye, 1991). Tandis que les lymphocytes sont habituellement impliqués dans le

système immunitaire acquis, une étude a mis en évidence les capacités phagocytaires

des lymphocytes T humains (Wu et al., 2009) de la même manière que les

lymphocytes B chez les téléostéens et Xenopus (Li et al., 2006). Cependant, notre

étude n’exclut pas la possibilité que les billes aient pu s’attacher à la membrane

cellulaire externe, plutôt que d’avoir été internalisées.

L’activité des cellules tueuses constitue un autre mécanisme de défense non

spécifique. Les cellules NK forment une population hétérogène CD3 négative, sans

récepteur T, constitués de grands lymphocytes qui expriment couramment des

133

marqueurs de surface tels CD16 et CD56 chez l’homme (O’Shea and Ortaldo, 1992).

Ces cellules se définissent par leur fonction, i.e. la lyse de cellules infectées par un

virus ou de cellules tumorales. L’activité des cellules NK n’est pas restreinte par le

complexe majeur d’histocompatibilité et ne requière pas une sensibilisation préalable.

Les cellules NK partagent des mécanismes tueurs avec les lymphocytes T CD8+

cytotoxiques et produisent des cytokines de manière similaire aux lymphocytes T

CD4+ helper (Boysen and Storset, 2009). Les interleukines IL-2, IL-15, IL-21 et

l’interféron de type I (IFN- / ) augmentent l’activité cytotoxique des cellules NK

(Boysen and Storset, 2009). Une augmentation de l’activité des cellules NK en

réponse à l’interleukine IL-2 a été mise en évidence chez diverses espèces (Henney et

al., 1981) incluant les belugas et les phoques communs (Ross et al., 1996; De Guise et

al., 1997). L’activité des cellules NK est fortement conservée parmi les vertébrés.

Cette activité a précédemment été détectée chez les tortues d’eau douce (Munoz et al.

2000) contrairement aux tortues vertes (McKinney and Bentley, 1985). Dans notre

étude, la lignée cellulaire YAC-1 de lymphomes T murins constitue la meilleure cible

comparée à la lignée érythroleucémique humaine K-562. L’activité cytotoxique la

plus importante a été obtenue dans le milieu de culture RPMI à 28˚C, paramètres

identiques pour l’évaluation de la prolifération lymphocytaire. Le temps d’incubation

optimal de mise en présence des cellules NK avec leur cible était de deux heures et

demi ou 3 h. Ce laps de temps est similaire à celui des amphibiens anuriens, tilapias,

poissons chat, pour lesquels l’activité cytotoxique NK/ non spécifique a été rapportée

avec les cellules YAC-1 comme cellules cibles (Evans and Cooper, 1990).

2. La prolifération lymphocytaire

La prolifération lymphocytaire mesure seulement une étape unique et précoce

au sein de la réponse immunitaire. La prolifération lymphocytaire (LP) est fortement

diminuée chez les tortues vertes malades (Work et al., 2001) et a été montré comme

étant corrélée positivement aux contaminants organo-chlorés ainsi que les dérivés du

mercure (Day et al., 2007; Keller et al., 2004b). La prolifération lymphocytaire sous

stimulation aux mitogènes a précédemment été étudiée chez les reptiles terrestres et

aquatiques (Farag and El Ridi, 1986; Burnham et al., 2005 ; Munoz et al., 2003) ainsi

que chez les tortues marines (Work et al., 2000; Cray et al., 2001; Keller et al., 2005a,

134

2006). Dans notre étude, les PBMC ont été exposées à quatre mitogènes pour des

concentrations de 1 à 20 µg/ml pendant 96h, ce qui avait déjà été rapporté comme

pouvant induire une mitogènèse chez les lymphocytes de tortues (Ulsh et al., 2001,

Munoz et al., 2003, Keller et al., 2005a). Les indices de stimulation sont plus élevés

pour le PHA que pour la ConA, avec cependant des variations entre animaux

importantes. Le LPS utilisé dans notre étude est celui produit par le sérotype 0127:B8

de E coli. Etant donné que ce sérotype a été le seul testé, les auteurs ne savent pas s'il

était le plus approprié pour induire la prolifération des lymphocytes B. L’utilisation

d’un test ELISA colorimétrique BrdU au lieu des tests impliquant la thymidine tritiée,

rend la comparaison directe avec les résultats précédemment obtenus dans la

littérature très difficile (Keller et al., 2005a). Les études des paramètres

hématologiques effectuées sur ces individus (Rousselet et al., 2013a) ainsi que

d’autres tortues caouannes juvéniles (Bradley et al., 1998; Kakizoe et al., 2007)

démontrent des variations du nombre de leucocytes ainsi que des hématocrites en

fonction de l’âge des individus, ce qui peut avoir comme conséquence la modulation

des fonctions du système immunitaire des ces animaux comparativement à des

animaux plus âgés. Notre étude rapporte une prolifération des lymphocytes B et T

chez les tortues caouannes ce qui concorde avec des études précentes chez la même

espèce (Keller et al., 2005a) ainsi que chez les tortues vertes (Herbst and Klein, 1985;

McKinney et al., 1985; Munoz et al., 2009; Work et al., 2000). Le PHA-P était le

mitogène induisant la prolifération la plus importante tandis que LPS induisait la

réponse la plus faible avec la ConA et le PWM intermédiaires. La réponse

proliférative mesurée successivement à une stimulation par des mitogènes, fournit une

preuve indirecte de l’existence des populations de lymphocytes B et T chez les

reptiles.

C. Conclusion

Le système immunitaire constitue un réseau complexe d’interaction entre

types cellulaires identiques ou différents et de messages faisant intervenir entre autres

les cytokines. Dans cette étude, un nombre de tests précédemment utilisés chez les

mammifères marins (DeGuise et al. 1995a, 1996, 1997) ont été optimisés afin

d’évaluer le type puis la fonction des divers leucocytes chez la tortue caouanne.

Considéré dans sa globalité, une batterie de tests représentatifs de divers aspects du

135

système immunitaire constitue un outil de qualité, permettant d’aider à identifier

l’intégrité des mécanismes de défense dont dispose l’individu. Des études ultérieures

peuvent inclure le développement d’anticorps monoclonaux spécifiques d’un type

cellulaire chez la tortue caouanne ainsi que l’évaluation de niveau d’expression des

cytokines, notamment suite à l’activation des lymphocytes. Ces deux axes permettront

de mieux caractériser les mécanismes sous-jacents des fonctionnalités du système

immunitaire chez les chéloniens.

L’utilisation des outils optimisés dans notre étude donnera de nouvelles pistes

sur les interactions entre le système immunitaire et la susceptibilité aux pathogènes,

comme le fibropapillomavirus (Work et al., 2001). Cela s’applique également aux

individus en centre de réhabilitation, débilités et/ou souffrant d’anémie non

régénérative consécutive à une infection systémique et/ou inflammation sèvere. Cette

thématique a donné lieu à une étude préliminaire, présentée sous forme de poster,

ayant fait l’objet d’un financement de la bourse aux idées Mérial ainsi que de la

Morris Animal Foundation (Annexe 5). Ainsi, l’utilisation de ces tests combinés à

l’hématologie pourrait nous renseigner sur l’état d’évolution du patient en cours de

traitement, et ce à travers la réponse du système immunitaire face au traitement

médical et ainsi potentiellement permettre un ajustement de la prise en charge

médicale chez les individus malades. Enfin, ce travail est un outil à l’investigation des

actions immunotoxiques de certains polluants émergents, décrits comme affectant les

tortues marines (Keller et al., 2004b). Cela va être développé au cours de la partie

suivante.

136

IV. Modulation du système immunitaire inné par les PCBs

A. Résultats

Dans notre étude, nous avons évalué les effets de trois PCBs (PCB-105, -138

et -169), sur la phagocytose et l'activité des cellules tueuses naturelles à partir de

leucocytes de tortues caouannes juvéniles. Les tests utilisés ont été préalablement

validés dans cette espèce (Rousselet et al., 2013b).

Le pourcentage de PBMC viables après exposition à chacun des PCB-105, -

138 et -169, pendant 96 heures a été déterminé par cytométrie de flux. Il n'y avait

aucune différence significative concernant la viabilité des cellules exposées par

comparaison aux cellules non exposées. La viabilité était supérieure à 90%.

1. Effets des PCBs-105 et 138 sur la phagocytose

Les résultats d'au moins trois expériences de phagocytose indépendantes ont

été réunis (trois individus par expérience). Le PCB-105 considéré "dioxine-like",

induisait une augmentation de la phagocytose (1+ beads, 2+ beads et 3+ beads) pour

les éosinophiles (Fig 33) de tortues caouannes consécutivement à leur exposition in

vitro pendant 3 hr et cela contrairement au PCB-138 (Fig. 34). Cette augmentation

était dose-dépendante. Une corrélation positive entre l'activité phagocytaire et la

concentration en PCB-105 a été déterminée pour 1+ beads (Corrélation de Pearson, r

= 0,66, p = 5,2x10-6

), 2+ beads (r = 0,59, p = 4,2x10-5

) et 3+ beads (r = 0,56, p =

1,4x10-4

). Le PCB-105 induisait une augmentation significative aux concentrations de

10 et 15 ppm (p<0,002) tandis que pour le PCB-138 la phagocytose augmentait

significativement pour 15 ppm uniquement (p<0,04).

137

Figure 33. A. Profils obtenus par cytométrie de flux des cellules isolées par gradient de Percoll. B.

Histogramme d’activité phagocytaire des granulocytes correspondants (entourés sur le diagramme de

gauche). C. Une corrélation positive entre l'activité phagocytaire et la concentration en PCB-105 a été

déterminée pour 1+ beads (M1, Corrélation de Pearson, r = 0,66, p = 5,2x10-6), 2+ beads (M2, r = 0,59,

p = 4,2x10-5) et 3+ beads (M3, r = 0,56, p = 1,4x10-4). * Augmentation significative aux concentrations

de 10 et 15 ppm (p<0,002).

Figure 34. Activité phagocytaire en fonction de la concentration en PCB-138. Le PCB-138 induisait

une augmentation significative aux concentrations de 15 ppm (p<0,04)

138

2. Effets des PCBs 105, 138 et 169 sur l’activité NK

Les résultats de l'activité NK étudiée chez quatre individus pour chaque PCB

ont été combinés. Les cellules YAC-1 ont précédemment été définies comme les

cibles des PBMC de tortue caouanne les plus adéquates. Les PBMC ont été exposées

in vitro à chacun des trois PCBs puis la capacité des cellules tueuses naturelles à lyser

les cellules YAC-1 a été déterminée. Les cellules NK montraient une capacité de lyse

statistiquement plus faible (Fig. 35) après exposition aux PCB-105 et 138 et ce aux

concentrations de 15 et 20 ppm (p<0,01) pour un rapport de 50:1 (NK: cellules cibles).

L’exposition aux PCBs n'affectait pas la viabilité des cellules NK. L'activité NK

n'était pas modulée par le PCB-169. Une corrélation négative entre l'activité NK et la

concentration croissante du PCB-105 (Corrélation de Pearson, r = -0,585, p = 0,0027)

ainsi que du PCB-138 (r = -0,557, p = 0,0087) a été déterminée.

Figure 35. Activité cytotoxique des cellules NK avec les cellules YAC-1 comme cellules cibles et ce

pour un rapport de 50 :1. Activité NK statistiquement plus faible après exposition aux PCB-105 et 138

à 15 et 20 ppm (p<0,01). Corrélation négative entre activité NK et concentration croissante des PCB-

105 (Corrélation de Pearson, r = -0,585, p = 0,0027) et PCB-138 (r = -0,557, p = 0,0087).

139

B. Discussion

Il s'agit de la première étude portant sur la modulation de deux fonctions

majeures du système immunitaire inné (phagocytose et activité NK) par les PCBs

chez la tortue caouanne. Les effets biologiques des polluants sur les tortues marines

constituent une préoccupation actuelle critique, listés parmi les 20 priorités de

conservation de ces espèces devant être adressées (Hamann et al., 2010).

Les premières mesures de concentrations de PCBs chez les tortues marines

datent des années 90. Une littérature croissante, témoignant d’une préoccupation

environnementale accrue chez ces espèces nous permet désormais d’avoir plus de

recul sur le sujet. Les concentrations en PCBs ont été mesurées dans de nombreux

organes et pour chacune des 7 espèces de tortues marines. Le tissu adipeux, le foie et

maintenant les œufs (van de Merwe et al., 2009; Alava et al., 2011 et Keller et al.,

2013) sont les tissus biologiques les plus étudiés pour la mesure de ces composés.

Trois auteurs rapportent à ce jour les concentrations de PCB mesurées à partir du

plasma des tortues caouannes (Camacho et al., 2013, 2014; Keller et al., 2004a, 2006,

Ragland et al., 2011). L’utilisation de ce fluide biologique comme matrice de mesure

des PCBs est intéressante car les prises de sang constituent un acte non léthal. Il a été

montré que les PCBs se répartissaient très majoritairement dans le plasma et non dans

les érythrocytes de tortues marines (Keller et al. 2004a).

Le PCB-138, composé hexachloré non coplanaire et marqueur de la

contamination environmentale s’avère être le congénère le plus abondant chez les

tortues caouannes (Camacho et al., 2014; Gardner et al., 2003; Keller et al., 2004b,

2006; Lazar et al., 2011; Oros et al., 2009, 2013; Storelli et al., 2007). D’autres PCBs

coplanaires, tels que les PCB-105 (mono-ortho) et PCB 169 (non-ortho) ont

également été mesurés chez la tortue caouanne (Alava et al., 2011; Camacho et al.,

2013; Storelli et al., 2007; Richardson et al., 2009). Leur détection est importante car

ils sont considérés comme stéréoisomères de la dioxine, possédant des mécanismes

d'actions identiques chez les mammifères, et ce par liaison au récepteur AhR.

Comparativement à d’autres espèces marines cotières (mammifères marins,

elasmobanches, alligators et oiseaux), les concentrations de PCBs sont souvent d’un à

plusieurs ordres de grandeur de différence pour les tortues marines (Keller et al.,

2014). En effet, les concentrations sont beaucoup plus faibles (Camacho et al., 2013;

140

Keller et al., 2004b) ce qui peut s’expliquer grâce à à leur position dans le réseau

trophique et type d’alimentation. Chez les tortues marines, les tortues de Kemp se

situent en haut de ce réseau avec une alimentation carnée, suivi des tortues caouannes

qui sont omnivores et avec un habitus opportuniste. Cela tendrait à favoriser la

bioaccumulation des contaminants (Bjorndal, 1997). Enfin viennent les tortues luth et

vertes se situant au bas de ce réseau. L'ingestion de débris notamment plastifiés

contribue à la variabilité de teneur en PCBs chez ces animaux (Bjorndal, 1997). Les

concentrations peuvent être un million de fois plus élevée que celles de la mer

environnante (Mato et al., 2001).

Bien que pour notre étude, le nombre de congénères testés soit réduit, elle

constitue néanmoins une première approche. Les concentrations en PCBs utilisées

s’échelonnaient de 0,5 à 20 ppm. Les concentrations de dix et 15 ppm de PCB-105

induisaient une augmentation significative de la phagocytose des éosinophiles. Cette

augmentation était dose-dépendante et une corrélation positive a été déterminée. Le

PCB-138 induisait une augmentation significative de la phagocytose pour 15 ppm

uniquement et ce sans relation dose-dépendante. L’exposition aux PCB-105 et 138 a

entraîné une diminution significative de l’activité lytique des cellules NK et ce aux

concentrations de 15 et 20 ppm. Une corrélation négative entre l'activité NK et la

concentration croissante des PCB-105 et PCB-138 a été objectivée. Contrairement

aux deux PCBs précédents, les PCB-169 n’a pas modulé l'activité NK.

Les concentrations de PCBs utilisées dans notre étude sont identiques à celles

précédemment utilisées pour étudier et comparer les effets immunotoxiques des

composés organochlorés chez diverses espèces de mammifères marins (Levin et al.,

2007a). Toutefois, la concentration plasmatique de la somme des PCBs chez les

tortues caouannes se situe en deça. En effet, la gamme de valeur s’étale de 27 ± 42

ng/ml soit 0,027 ± 0,04 ppm (Camacho et al., 2014), à 5560 pg/g soit 5,56 ppm (sang

total, moyenne, Keller et al., 2004a) et 7267 pg/g soit 7,3 ppm (plasma, médiane,

Ragland et al., 2011). Au moment de notre étude (2009), seule le travail de Keller et

al., portant sur le sang total était accessible. Nous nous sommes basés sur les travaux

réalisés chez les mammifères marins, en y incluant la valeur de 5ppm (Keller et al.,

2004a) dans notre gamme de concentration. Chez les mammifères, l’exposition in

vitro aux PCBs entraînent généralement une immunosuppression pour des

141

concentrations correspondant à celles de fin de gamme pour notre étude (13.5

μg/ml=13.5 ppm). Chez de nombreux vertébrés, les PCBs peuvent déclencher une

augmentation de certaines fonctions pour de faibles concentrations alors que ces

même composés vont induire une diminution pour des concentrations plus fortes

(Keller et al., 2005b). Une augmentation de certaines fonctions du sytème

immunitaire a été observée chez le rat pour des concentrations faibles (0,005 μg/ml)

engendrant une augmentation de la prolifération lymphocytaire chez la tortue

caouanne (Keller et al., 2005b). Toutefois, dans notre étude les concentrations

induisant des changements significatifs des fonctions du système immunitaire inné

étaient bien plus élevées que les concentrations mesurées actuellement dans le sang de

ces animaux.

La signification biologique exacte des changements rapportés dans notre étude

portant sur une exposition in vitro des cellules isolées à partir de sang total est

difficile à évaluer. En effet, les animaux « sauvages » sont exposés à une variété de

polluants et contraintes environmentales (température, ressources alimentaires,

interactions négatives, maladies) qui sont autant de facteurs difficiles à transposer

chez des animaux maintenus captifs. Ainsi, dans le but de s’approcher d’une réalité

biologique, il serait nécessaire de pouvoir réaliser cette même étude (utilisation de

sang) sur des animaux sauvages, capturés puis relachés afin de mesurer les fonctions

innées du système immunitaire simultanément aux mesures de PCBs et autres

polluants organiques.

Enfin les animaux utilisés dans notre étude étaient jeunes, en bonne santé et

maintenus captifs. L'eau de mer des bassins individuels dans lesquels ils sont

maintenus est issue de la filtration de l'eau de mer du Golf du Mexique (Galveston,

TX, USA). Bien qu'au moment de l’étude celle-ci n'était pas encore affectée par la

marée noire du Deepwater Horizon (BP), aucune mesure de PCBs potentiellement

présents dans le plasma des animaux n'a été réalisée. Ces limitations sont directement

liées à plusieurs paramètres que sont 1/ le financement nécessaire à la poursuite de ce

projet, 2/ le temps et 3/ la mobilisation de personnel. En effet, concernant le facteur

temporel, deux études publiées ont été réalisées en une année scolaire ainsi que cette

étude préliminaire. Les délais d'obtention des permis fédéraux et IACUC sont longs,

se comptant en mois.

143

Conclusion

Les tortues caouannes (Caretta caretta) sont menacées et figurent sur la liste rouge de l’IUCN des espèces en danger d’extinction. Leurs caractéristiques biologiques ainsi que les risques auxquels ces animaux sont exposés, notamment la pollution chimique, en font des animaux sentinelles de l’environnement marin. Parmi les nombreux polluants organiques, les concentrations de polychlorobiphényles (PCBs) dans divers organes et fluides sont élevées et sont associées à des dysfonctionnements de nombreuses fonctions organiques et hormonales, et du système immunitaire en particulier. Face à l’importance croissante de la conservation des espèces menacées, associée à l’implication des vétérinaires travaillant dans des centres de réhabilitation, la recherche concernant la pathologie variée des tortues marines est devenue nécessaire.

Les paramètres hématologiques et biochimiques constituent des indicateurs pronostiques de premier choix afin d’évaluer l’état de santé global de animaux, y compris lors d’exposition à des polluants environnementaux. Cependant ils ne permettent pas d’évaluer l’aspect fonctionnel du système immunitaire qui constitue une interface entre l’animal et son environnement.

Nous avons donc déterminé 33 paramètres chez cinq classes d’âge successives de tortues caouannes juvéniles et captives afin d’estimer la variabilité inter-classes pour certains de ces paramètres. Ce travail visant à déterminer les valeurs de référence pour ces 33 paramètres a constitué un outil fondamental pour objectiver les dysfonctionnements et suivre les soins et traitements mis en place chez les tortues échouées. Les mêmes animaux pour lesquels les analyses hématologiques et biochimiques ont été réalisées, ont été utilisés pour l’évaluation du système immunitaire. Le second objectif de ce travail était de développer et d’optimiser des tests permettant l’exploration fonctionnelle du système immunitaire inné et acquis. En cytométrie de flux, nous avons isolé, à l’exception des hétérophiles, chacune des populations cellulaires sanguines, à savoir les lymphocytes, les monocytes et les éosinophiles et confirmé leur identité par étalement sur lame. Cette technique nous a permis de nous affranchir de l’absence de marqueurs membranaires disponibles chez les chéloniens. Parmi les lymphocytes, nous avons pu confirmer l’existence de deux populations de lymphocytes, B et T chez la tortue caouanne, grâce à l’utilisation de mitogènes spécifiques. Concernant la composante innée, nous avons mis en évidence pour la première fois dans cette espèce, une activité « natural killer » (NK), confirmé l’importance de la phagocytose portée par diverses populations cellulaires et montré l’influence de paramètres extrinsèques sur ces deux activités.

Une fois ces tests validés, nous les avons utilisés pour évaluer les effets de trois PCBs (PCB-105, -138 et -169) sur le système immunitaire inné des tortues caouannes. Nous avons mis en évidence une modulation de la phagocytose et de l’activité des cellules tueuses naturelles. Cette étude pionnière, constituant une première approche des effets des PCBs sur le système immunitaire des tortues caouannes, devra être confirmée par des études ultérieures. Les concentrations de PCBs devront être mesurées directement à partir du plasma des animaux sauvages, puis des tests fonctionnels du système immunitaire pourront être

144

réalisés ex vivo. Pour des animaux captifs, les résidus de PCBs sanguins seront mesurés puis les tests fonctionnels précédemment cités seront utilisés après exposition in vitro.

Ces tests pourront servir dans un but de suivi sanitaire des animaux en centre de réhabilitation, afin de savoir si l’individu répond correctement au traitement et permettre ainsi l’amélioration de la prise en charge chez ces individus afin d’aboutir à leur ré-introduction dans le milieu naturel.

Thèse de Mme Estelle ROUSSELET-RUSSO

145

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163

Annexes

Annexe 1: Nomenclature IUPAC des PCBs

164

Article 1: J Zoo Wildl Med. 2013 Dec;44(4):859-74. (Annexe 2)

Hematology and plasma biochemistry analytes in five age groups of immature,

captive-reared loggerhead sea turtles (Caretta caretta). Estelle Rousselet, Nicole I.

Stacy, Kara LaVictoire, Benjamin M. Higgins, Maryanne E. Tocidlowski, Joseph P.

Flanagan and Céline A.J. Godard-Codding.

ABSTRACT

Blood samples of 85 immature, apparently healthy, captive-reared loggerhead

sea turtles (Caretta caretta) were analyzed for 13 hematologic variables and total

solids of 5 age groups (8-, 20-, 32-, 44- and 56-month old) and for 20 plasma

biochemical analytes of 4 age groups (20- to 56-month old). Each individual turtle

was sampled under similar conditions during a blood collection period of 3 days.

Hematologic analytes included packed cell volume, white blood cell counts, white

blood cell estimates, and leukocyte differentials. Biochemical analysis included

albumin, alanine aminotransferase, alkaline phosphatase, amylase, aspartate

aminotransferase, blood urea nitrogen, calcium, chloride, cholesterol, creatine kinase,

creatinine, gamma glutamyltransferase, globulins, glucose, phosphorous, potassium,

sodium, total bilirubin, total protein, total solids and uric acid. In due consideration of

small sample size in all 5 age groups, the results of hematologic and biochemical

analysis were used to determine ranges for these analytes and to compare values

among consecutive age groups. Several significant differences in some hematologic

and biochemical variables were identified and need to be considered in the

interpretation of blood work of immature, growing sea turtles in human care.

Word count: 181

Key words: Caretta caretta, loggerhead sea turtle, immature, captivity, hematology,

plasma biochemistry.

165

Article 2: Vet Immunol Immunopathol. 2013 Nov 15;156(1-2):43-53. (Annexe 3)

Evaluation of immune functions in captive immature loggerhead sea turtles (Caretta

caretta). Estelle Rousselet, Milton Levin, Erika Gebhard, Benjamin M. Higgins,

Sylvain DeGuise and Céline A.J. Godard-Codding.

ABSTRACT

Sea turtles face numerous environmental challenges, such as exposure to chemical

pollution and biotoxins, which may contribute to immune system impairment,

resulting in increased disease susceptibility. Therefore, a more thorough assessment

of the host’s immune response and its susceptibility is needed for these threatened and

endangered animals. In this study, the innate and acquired immune functions of sixty-

five clinically healthy, immature, captive loggerhead sea turtles (Caretta caretta)

were assayed using non-lethal blood sample collection. Functional immune assays

were developed and/or optimized for this species, including mitogen-induced

lymphocyte proliferation, natural killer (NK) cell activity, phagocytosis, and

respiratory burst. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and phagocytes were

isolated by density gradient centrifugation on Ficoll Paque and discontinuous Percoll

gradients, respectively. The T lymphocyte mitogens ConA significantly induced

lymphocyte proliferation at one and two µg/ml while PHA significantly induced

lymphocyte proliferation at 5 and 10 µg/ml. The B lymphocyte mitogen LPS

significantly induced proliferation at one µg/ml. Monocytes demonstrated higher

phagocytic activity than eosinophils. In addition, monocytes exhibited respiratory

burst. NK cell activity was higher against YAC-1 than K-562 target cells. These

optimized assays may help to evaluate the integrity of loggerhead sea turtle’s immune

system upon exposure to environmental contaminants, as well as part of a

comprehensive health assessment and monitoring program.

Keywords: Caretta caretta; Lymphocyte proliferation; Mitogen; Natural killer;

Phagocytosis; Respiratory burst; Sea turtle

166

Article 3: Short communication non publiée (Annexe 4)

Communication orale à l’ISTS : International Sea Turtle Society Conference

(Baltimore, 2012)

Modulation of the innate immune system by selected polychlorinated biphenyls upon

in vitro exposure of leukocytes in juvenile loggerhead sea turtles (Caretta caretta).

Estelle Rousselet1, 2, 5

, Milton Levin3, Erika Gebhard

3, Benjamin M. Higgins

4, Sylvain

DeGuise3 and Céline A.J. Godard-Codding

1

1 Department of Environmental Toxicology, The Institute of Environmental and

Human Health, Texas Tech University, 1207 Gilbert Drive, Lubbock, Texas, 79416,

United States 2 Present address: VetAgroSup-Campus Vétérinaire de Lyon, 1 avenue

Bourgelat, 69280 Marcy l’Etoile, France3 Department of Pathobiology and Veterinary

Science, University of Connecticut, 61 North Eagleville Road, U-89 Storrs, CT 06269,

United States4 National Oceanic and Atmospheric Administration, National Marine

Fisheries Service, Southeast Fisheries Science Center, 4700 Avenue U, Galveston,

Texas, 77551, United States 5Corresponding author (email: estelle.rousselet@vetagro-

sup.fr)

ABSTRACT

Endangered loggerhead sea turtles (Caretta caretta) face numerous environmental

challenges including exposure to polychlorinated biphenyls (PCBs). Although banned

in the 1970 in the United States, they still persist in the environment and are

documented to exert immunotoxicity in a wide range of species. This is of particular

concern as modulation of the immune system may lead to an increase of disease’s

susceptibility. In vitro immune assays were used to quantify the direct effects of PCB

105, 138 and 169 on innate immunity at increasing concentrations (0.5, 1, 2.5, 5, 10,

15 and 20 ppm). Peripheral blood mononuclear cell viability was > 90% after 96h of

exposure with both coplanar non-coplanar PCBs. PCB 105 and 138 significantly

increased phagocytosis at 10 and 15 ppm (p<0.002, n=4, PCB 105) and 15 ppm

(p<0.04, n=4, PCB 138) compared to unexposed eosinophils. PCB 169 did not

modulate NK cell activity, while PCBs 138 and 105 significantly decreased NK cell

activity at 15 ppm (p=0.007, n=3) and 20 ppm (p=0.008, n=3) respectively, compared

to unexposed control. This research will help to establish relationships between

chemicals measured in loggerhead sea turtles and the integrity of innate defense

mechanisms as indicators of disease susceptibility to pathogens.

mailto:[email protected]

mailto:[email protected]

167

Widespread coastal oceanic pollution is a result of both direct pollutant

discharges and diffuse sources such as land runoff and atmospheric emissions. Ocean

pollution is leading to a growing concern for the health of threatened marine species.

The loggerhead sea turtle, Caretta caretta, is protected as a threatened species under

the U.S. Endangered Species Act (TEWG, 2009) and is considered an endangered

species under the International Union for Conservation and Nature (IUCN, 2012). Our

understanding of the impact of pollution on marine turtle survival and health is very

limited, in large part due to insufficient knowledge of basic sea turtle toxicology

(Aguirre et al. 1994; Keller et al. 2004b; Lutcavage et al. 1995). Sea turtles are

particularly at risk as they are long-lived, air-breathing marine vertebrates that are

exposed to pollutants through food, seawater and air. Their long life implies long-

term exposure to marine pollutants, which can make them particularly susceptible to

chemical bioaccumulation (Aguirre et al. 2006; Camacho et al. 2013; Hamann et al.,

2010; Keller et al. 2006; Oros et al. 2013). Moreover, sea turtles appear to be very

sensitive to chemical insults (Lutcavage et al. 1997) and various deleterious effects

have been reported in these species such as chronic stress, tissue necrosis and other

physiological disturbances (Camacho et al, 2013; Milton and Lutz, 2003; Oros et al.

2009, 2013). Environmental organochlorine contaminants, including polychlorinated

biphenyls (PCBs) are ubiquitous persistent chemicals widely used until banned in the

late 70s. Due to their bioaccumulative nature, PCBs are still detected in liver, muscle

and fat of Caretta caretta (Camacho et al., 2013; Keller et al., 2004b; Lazar et al.,

2011; Oros et al., 2009, 2013) all around the globe, Chelonia mydas from Pacific

Ocean (Gardner et al. 2003; Miao et al., 2001; van de Merwe et al. 2010) and

Lepidochelys kempi from the Atlantic Ocean (Keller et al., 2004a; Lake et al. 1994;

Swarthout et al. 2010). Only five studies have reported PCBs in the blood of live

loggerheads (Keller et al. 2004a, 2006; Ragland et al. 2011; Camacho et al., 2013;

2014).

Both experimental and epidemiological studies have demonstrated that PCBs

exert negative effects on the immune system of marine mammals (De Guise et al.,

1995 and 1998, 2003; Levin et al., 2005, 2007a, 2007b; Schwacke et al., 2011) and

sea turtles (Keller et al. 2004a, 2006). Impaired immune system may lead to increased

vulnerability to disease (Camacho et al., 2014; Cray et al., 2001; Work et al., 2001;

Keller et al., 2004b; Oros et al., 2013), which could severely affect the recovery of

endangered sea turtles. PCBs have been found positively correlated with WBC and

heterophil counts as well as lymphocyte proliferation (Keller et al. 2004b and 2006).

On the contrary, lysozyme activity decreased with increasing concentration of PCBs

(Keller et al. 2006) and higher concentrations of PCBs were reported in debilitated

animals when compared to healthier one (Keller et al. 2006; Camacho et al., 2014).

In our study, we propose to address for the first time the immunomodulatory

effects of PCB 105, 138 and 169 on phagocytosis and NK activity upon in vitro

exposure of leukocytes of juvenile loggerhead sea turtles. These tests of the innate

immune functions have been previously validated in the loggerhead sea turtles

168

(Rousselet et al., 2013b).

Blood samples were colletected in 2010, from 19 immature captive loggerhead

sea turtles at the NOAA Fisheries Sea Turtle Facility in Galveston, (TX, USA)

(Higgins, 2003) were collected. Animals were 32 and 44 month old with an average

weight of 12.6 kg ± 2.3. All animals in this study were clinically healthy based on a

veterinary examination as well as complete blood count and plasma chemistry panel

values (Rousselet et al., 2013a). All research complied with all institutional animal

care guidelines of the University of Connecticut and conditions described in U.S. Fish

and Wildlife Service Endangered Species Act Section 10a(1)a Scientific Research

Permits# TE-676379-4 and TE#676379-5, and Florida Fish and Wildlife

Conservation Commission Marine Turtle Permit #MTP-015. Eight mL of blood were

collected into lithium heparin tubes kept cool until processed within 24 h. PCBs

(purity >98.4%) were re-suspended in endotoxin free dimethyl sulfoxide and then

added to Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) to prepare working solutions.

The final DMSO concentration did not exceed 0.4%. Peripheral blood mononuclear

cells (PBMC) were isolated by density gradient centrifugation using Ficoll-Paque plus

(1.077 g/mL) as previously described (Rousselet et al., 2013b). Viability of PBMC

after 96 hours of PCBs’ exposure was evaluated by flow cytometry using propidium

iodide (PI) (100 µg/mL) as described by Brousseau et al. (1999). Samples were

analyzed with a FACScan flow cytometer (Becton Dickinson, Rutherford, NJ) and the

fluorescence of 10000 events was read. Data are expressed as a percent of viable cells.

Natural Killer (NK) cell activity after exposure to PCBs was measured using the

murine lymphoma cell line (YAC-1) as previously described (Rousselet et al., 2013b).

PBMCs (effector cells) were adjusted to 106 cells/mL and were incubated in RPMI

with or without one congener of PCB at increasing concentration ranging from 0.5 to

20 ppm for 3h. Then, target cells were added to PBMCs at an effector:target (E:T)

ratio 50:1. NK cell activity was measured after 2.5 hr incubation at 28 C.

Granulocytes were separated using discontinuous Percoll-gradients as previously

described (Rousselet et al., 2013b). Cells obtained at the interface between plasma

and 40% and 40-45% of percoll were pooled and used for phagocytosis. 2x105

leukocytes were plated in each well of round bottom 96-well plates and incubated

with or without one PCB congener at concentration ranging from 0.5 to 15 ppm, for 3

hr at 28 C. The method was then previously described (Rousselet et al., 2013b). Data

from at least three independent phagocytosis experiments (three individuals per

experiment) were pooled. Data from four individuals per NK experiment were used.

One-way repeated-measures analysis of variance (RM ANOVA) followed by

Bonferroni’s or Holm-Sidak’s post-hoc testing were used to compare the different

experimental groups. If only two experimental groups were compared and the data

were normally distributed, t-test was used; otherwise Mann-Whitney Rank Sum test

was used instead. RM ANOVA was evaluated using the SigmaStat Windows 1.0

(Jandel Scientific, San Rafael, CA) software, using p<0.05 for statistical significance.

Statistical power for each experiment was greater than 0.8, the threshold required by

the statistical software to assure confidence in the interpretation of the statistical

169

results.

The percentage of viable cells was > 90% as determined by flow cytometry after in

vitro exposure to PCB-105 138 and 169 for 96 hr. There were no statistically

significant treatment-related effects on the viability of immune cells (data not shown).

The PCB-105 induced a concentration-dependent increase of phagocytosis in

loggerheads’ eosinophils (Fig. 1) for 1+, 2+ and 3+ beads contrary to PCB-138 (Fig.

2). PCB-105 significantly increased phagocytosis at 10 and 15 ppm (p<0.002) while

PCB-138 significantly increased phagocytosis at 15 ppm (p<0.04). The positive

correlation between phagocytic activity and PCB-105 concentrations was found for

1+ beads (Pearson correlation, r = 0.66, p = 5.2.10-6

), 2+ beads (r = 0.59, p = 4.2.10-5

)

and 3+ beads (r = 0.56, p = 1.4.10-4

). The ability of NK cells to lyse YAC-1 cells after

exposure to PCB-105 and -138 showed a significant decrease (Fig. 3) with 15 and 20

ppm (p<0.01) for the 50:1 ratio (NK:target), whereas PCB-169 did not modulate NK

activity. A negative correlation between NK activity and PCB-105 (Pearson

correlation, r = -0.585, p = 0.0027) as well as PCB-138 (r = -0.557, p = 0.0087) was

found.

This is the first report on the modulation of two major functions of the innate

immune system (phagocytosis and NK cell activity) by PCBs in loggerhead sea turtles.

The effect of pollutants is currently of critical concern as it is listed among top 20

research questions for sea turtle conservation on the global level (Hamann et al.,

2010). Although the number of congeners tested is reduced, we tested three of them.

Further studies have to be performed to test additional congeners or mixtures. Non-

coplanar hexachlorinated PCB-138 was tested as it was among the most abundant

congener in loggerhead sea turtles (Camacho et al., 2014; Keller et al., 2004b, 2006;

Lazar et al., 2011; Oros et al., 2009; Storelli et al., 2007). The coplanar mono-ortho

PCB 105 and non-ortho PCB 169 were chosen because they are stereoisomers of the

highly toxic TCDD and have been shown to act through the same mechanism of

action through binding to the AhR. These congeners were reported in the liver of

loggerhead sea turtles (Alava et al., 2011; Camacho et al., 2013; Storelli et al., 2007;

Richardson et al., 2009).

Compared to aquatic mammalians, PCB concentrations are about one order of

magnitude lower in sea turtles (Camacho et al., 2013; Keller et al., 2004). However,

loggerhead sea turtles have omnivorous feeding habits, which make them more likely

to bioaccumulate contaminants than some other sea turtle species, such as leatherback

and green sea turtles (Bjorndal, 1997). Additionally, ingestion of debris might add

variability to the concentrations of PCBs in the sea turtles. Incidental ingestion of

marine debris, particularly plastics that has been found in many sea turtles (Bjorndal,

1997), increase adsorption of PCBs up to 106 higher than surrounding seawater (Mato

et al., 2001).

Only three authors reported measured PCBs in loggerhead sea turtles’ blood

(Camacho et al., 2013; Keller et al., 2004a, 2006, Ragland et al., 2011). In these

studies blood concentration of sum PCBs ranged from 5,560 pg/g (5.56 ppm) wet

mass whole blood (mean, Keller et al., 2004a) to 7,267 pg/g (7.3 ppm) wet mass

plasma (median for transient animals, Ragland et al., 2001). Blood sampling may act

170

as a representative, non-lethal sampling mechanism to test for organochlorine

concentrations (Keller et al. 2004a). The concentrations of tested PCBs ranged from

0.5 to 20 ppm as it represented concentrations previously used to investigate and

compare the immunotoxic effects of OCs upon in vitro exposures in several marine

mammal species (Levin et al., 2007a). The mammalian studies that demonstrated

immunosuppression by PCBs used concentrations near the high end of the range used

in the loggerhead turtle study (13.5 μg/ml=13.5 ppm). Enhancement, of lymphocyte

proliferation was observed in the rat study at a similar concentration that enhanced

loggerhead lymphocyte proliferation (0.005 μg/ml) (Keller et al., 2005). In many

vertebrate species, PCBs have been shown to trigger immunoenhancement at lower

concentrations and immunosuppression at higher concentrations (Keller et al., 2005).

The differences in immunotoxic effects observed between different vertebrate species

may also be explained simply by species differences in immune responses or the use

of different immune function tests.

Finally, the exact in vivo significance of the changes reported in the present in

vitro exposure study is hard to assess. Further studies to be done would measure PCBs

levels in blood of the animals during health assessment campains and use the same

sample to assay the innate immune functions. PCBs concentration was not determined

in the blood of captive animals from our study.

171

Annexe 5 : Poster Morris Animal Foundation Veterinary Student Scholar program:

Combined hematology and immunology : a breakthrough to understand immune

functions of stranded sea turtles

NOM PRENOM : ROUSSELET ESTELLE

TITRE : Etude du système immunitaire de la tortue caouanne (Caretta caretta) : Utilisation comme outil diagnostique et indicateur de toxicité des polychlorobiphényles (PCBs) Thèse d’Etat de Doctorat Vétérinaire : Lyon, (28 Novembre 2014)

RESUME La recherche concernant les pathologies affectant les tortues caouannes (Caretta caretta) et les polluants auxquels elles sont exposées, est incontournable au vu de l’importance croissante de la conservation des espèces menacées d’extinction (IUCN) ainsi que l’implication des vétérinaires en centres de réhabilitation. Les valeurs de référence de 33 paramètres hématologiques et biochimiques ont été déterminées chez cinq classes d’âge successives d’animaux juvéniles et captifs. Des tests permettant l’exploration fonctionnelle du système immunitaire inné et acquis ont été développés et d’optimisés. Lymphocytes, monocytes et éosinophiles ont été isolés par cytométrie de flux puis identifiés. La prolifération des lymphocytes B et T l’activité « natural killer », la phagocytose et l’activité d’explosion respiratoire portée par diverses populations cellulaires ont été étudiées. Une modulation de la phagocytose et de l’activité NK ont été mises en évidence suite à l’exposition des cellules aux PCB-105, -138 et -169. Cette étude constitue une première approche des effets des PCBs sur le système immunitaire et devra être confirmée par des mesures directes de polluants à partir du plasma des animaux sauvages ainsi que de tests fonctionnels du système immunitaire ex vivo.

MOTS CLES : - Biphényles polychlorés - Caretta - Système immunitaire

JURY : Président : Monsieur le Professeur Frédéric BERARD 1er Assesseur : Monsieur le Professeur Michel PEPIN 2ème Assesseur : Monsieur le Professeur Philippe BERNY

DATE DE SOUTENANCE : Vendredi 28 Novembre 2014

ADRESSE DE L’AUTEUR : 4 rue des Nouvelles maisons 69009 Lyon

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