vetagro supvetagro sup campus veterinaire de lyon année 2012 - thèse n° etude de la barriere...

VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON

Année 2012 - Thèse n°

ETUDE DE LA BARRIERE CUTANEE CHEZ LES BOVINS PAR MESURE DE LA PERTE INSENSIBLE EN EAU ET DU PH ET PAR

EXAMENS HISTOPATHOLOGIQUES

THESE

Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I

(Médecine - Pharmacie)

et soutenue publiquement le 5 octobre 2012

pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire

par

PANZUTI Pauline

Née le 29 décembre 1986

à Grenoble (38)

VETAGRO SUP

CAMPUS VETERINAIRE DE LYON

Année 2012 - Thèse n°

ETUDE DE LA BARRIERE CUTANEE CHEZ LES BOVINS PAR MESURE DE LA PERTE INSENSIBLE EN EAU ET DU PH ET PAR

EXAMENS HISTOPATHOLOGIQUES

THESE

Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I

(Médecine - Pharmacie)

et soutenue publiquement le 5 octobre 2012

pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire

par

PANZUTI Pauline

Née le 29 décembre 1986

à Grenoble (38)

3

ENSEIGNANTS CAMPUS VETERINAIRE DE VETAGRO SUP

NOM Prénom Grade Unité Pédagogique

ALOGNINOUWA Théodore Professeur 1ere cl Pathologie du bétail

ALVES-DE-OLIVEIRA Laurent Maître de conférences hors cl Gestion des élevages

ARCANGIOLI Marie-Anne Maître de conférences cl normale Pathologie du bétail

ARTOIS Marc Professeur 1ere cl Santé Publique et Vétérinaire

BECKER Claire Maître de conférences cl normale Pathologie du bétail

BELLI Patrick Maître de conférences associé Pathologie morphologique et clinique

BELLUCO Sara Maître de conférences cl normale Pathologie morphologique et clinique

BENAMOU-SMITH Agnès Maître de conférences cl normale Equine

BENOIT Etienne Professeur 1ere cl Biologie fonctionnelle

BERNY Philippe Professeur 1ere cl Biologie fonctionnelle

BONNET-GARIN Jeanne-Marie Professeur 2eme cl Biologie fonctionnelle

BOULOCHER Caroline Maître de conférences cl normale Anatomie Chirurgie (ACSAI)

BOURDOISEAU Gilles Professeur 1ere cl Santé Publique et Vétérinaire

BOURGOIN Gilles Maître de conférences cl normale Santé Publique et Vétérinaire

BRUYERE Pierre Maître de conférences Contractuel Biotechnologies et pathologie de la reproduction

BUFF Samuel Maître de conférences cl normale Biotechnologies et pathologie de la reproduction

BURONFOSSE Thierry Maître de conférences hors cl Biologie fonctionnelle

CACHON Thibaut Maître de conférences Contractuel Anatomie Chirurgie (ACSAI)

CADORE Jean-Luc Professeur 1ere cl Pathologie médicale des animaux de compagnie

CALLAIT-CARDINAL Marie-Pierre Maître de conférences cl normale Santé Publique et Vétérinaire

CAROZZO Claude Maître de conférences cl normale Anatomie Chirurgie (ACSAI)

CHABANNE Luc Professeur 1ere cl Pathologie médicale des animaux de compagnie

CHALVET-MONFRAY Karine Maître de conférences hors cl Biologie fonctionnelle

COMMUN Loic Maître de conférences cl normale Gestion des élevages

DELIGNETTE-MULLER Marie-Laure Professeur 2eme cl Biologie fonctionnelle

DEMONT Pierre Professeur 2eme cl Santé Publique et Vétérinaire

DESJARDINS PESSON Isabelle Maître de conférences Contractuel Equine

DJELOUADJI Zorée Maître de conférences stagiaire Santé Publique et Vétérinaire

ESCRIOU Catherine Maître de conférences cl normale Pathologie médicale des animaux de compagnie

FAU Didier Professeur 1ere cl Anatomie Chirurgie (ACSAI)

FOURNEL Corinne Professeur 1ere cl Pathologie morphologique et clinique

FRANCK Michel Professeur 1ere cl Gestion des élevages

FRIKHAMohamed-

RidhaMaître de conférences cl normale Pathologie du bétail

GANGL Monika Maître de conférences Contractuel Equine

GARNIER François Professeur 1ere cl Biologie fonctionnelle

GENEVOIS Jean-Pierre Professeur cl ex Anatomie Chirurgie (ACSAI)

GILOT-FROMONT Emmanuelle Professeur 2eme cl Biologie Fonctionnelle

GONTHIER Alain Maître de conférences cl normale Santé Publique et Vétérinaire

GRAIN Françoise Professeur 2eme cl Gestion des élevages

GRANCHER Denis Maître de conférences hors cl Gestion des élevages

GREZEL Delphine Maître de conférences cl normale Santé Publique et Vétérinaire

GUERIN Pierre Professeur 2eme cl Biotechnologies et pathologie de la reproduction

GUERIN-FAUBLEE Véronique Maître de conférences hors cl Biologie fonctionnelle

HUGONNARD Marine Maître de conférences cl normale Pathologie médicale des animaux de compagnie

4

NOM Prénom Grade Unité Pédagogique

JUNOT Stéphane Maître de conférences cl normale Anatomie Chirurgie (ACSAI)

KECK Gérard Professeur 1ere cl Biologie fonctionnelle

KODJO Angeli Professeur 2eme cl Santé Publique et Vétérinaire

LACHERETZ Antoine Professeur 1ere cl Santé Publique et Vétérinaire

LAMBERT Véronique Maître de conférences cl normale Gestion des élevages

LE-GRAND Dominique Maître de conférences hors cl Pathologie du bétail

LEBLOND Agnes Professeur 2eme cl Santé Publique et Vétérinaire

LEFRANC-POHL Anne-Cécile Maître de conférences cl normale Biotechnologies et pathologie de la reproduction

LEPAGE Olivier Professeur 1ere cl Equine

LOUZIER Vanessa Maître de conférences cl normale Biologie Fonctionnelle

MARCHAL Thierry Maître de conférences hors cl Pathologie morphologique et clinique

MIALET Sylvie

Inspecteur de la santé publique

vétérinaire (ISPV) faisant fonction

de MC

Santé Publique et Vétérinaire

MOUNIER Luc Maître de conférences cl normale Gestion des élevages

PEPIN Michel Professeur 1ere cl Santé Publique et Vétérinaire

PIN Didier Maître de conférences cl normale Pathologie morphologique et clinique

PONCE Frédérique Maître de conférences cl normale Pathologie médicale des animaux de compagnie

PORTIER Karine Maître de conférences cl normale Anatomie Chirurgie (ACSAI)

PROUILLAC Caroline Maître de conférences cl normale Biologie fonctionnelle

REMY Denise Professeur 2eme cl Anatomie Chirurgie (ACSAI)

ROGER Thierry Professeur 1ere cl Anatomie Chirurgie (ACSAI)

SABATIER Philippe Professeur 2eme cl Biologie fonctionnelle

SAWAYA Serge Maître de conférences cl normale Anatomie Chirurgie (ACSAI)

SERGENTET Delphine Maître de conférences cl normale Santé Publique et Vétérinaire

THIEBAULT Jean-Jacques Maître de conférences hors cl Biologie fonctionnelle

VIGUIER Eric Professeur 1ere cl Anatomie Chirurgie (ACSAI)

VIRIEUX-WATRELOT Dorothée Maître de conférences Contractuel Pathologie morphologique et clinique

ZENNER Lionel Professeur 2eme cl Santé Publique et Vétérinaire

5

REMERCIEMENTS

A Monsieur le Professeur Frédéric BERARD,

De la faculté de Médecine de Lyon,

Qui nous fait l’honneur d’accepter la présidence de notre jury de thèse,

Hommages respectueux.

A Monsieur le Docteur Didier PIN,

de VetAgro Sup - Campus vétérinaire de Lyon,

Pour nous avoir proposé ce travail et encadrés tout au long de son élaboration,

Pour son enthousiasme sans faille et pour tous ses conseils,

Qu’il trouve dans ces lignes le témoignage de notre reconnaissance la plus sincère.

A Monsieur le Docteur Thierry MARCHAL,

de VetAgro Sup - Campus vétérinaire de Lyon,

Qui nous fait l’honneur d’accepter de juger notre travail et de faire partie de notre jury de thèse,

Qu’il reçoive ici l’expression de nos sincères remerciements.

A Mr Mervil et tous les techniciens animaliers, au service de pathologie du bétail et aux

techniciennes du laboratoire d’histopathologie de VetAgro Sup,

Pour leur travail, leur gentillesse et leur extrême patience, sans lesquels cette thèse n’aurait pas pu

voir le jour.

A Monsieur le Docteur Julien CAPPELLE,

Pour son aide dans la réalisation de ce travail,

Pour toutes ses explications et ses corrections,

Pour son amour incompris de R.

7

TABLE DES MATIERES

LISTE DES TABLEAUX ....................................................................................................... 10

LISTE DES FIGURES .......................................................................................................... 12

LISTE DES ABREVIATIONS ................................................................................................ 16

INTRODUCTION .............................................................................................................. 21

Partie 1 : Rappels bibliographiques ................................................................................. 23

I. La peau : barrière vitale vis-à-vis de l’environnement extérieur ......................................... 25

A. Rappel sur la structure générale de la peau ......................................................................... 25

B. Histologie de l’épiderme ....................................................................................................... 26

Les différentes cellules de l’épiderme (POIRIER et RIBABEAU DUMAS 1993, WHEATER et al. 2001)1.

26

L’organisation stratifiée de l’épiderme ........................................................................................... 27 2.

a. La couche basale ou le stratum basale ....................................................................................... 28

b. La couche épineuse ou le stratum spinosum ............................................................................. 29

c. La couche granuleuse ou le stratum granulosum ....................................................................... 29

d. La couche cornée ou le stratum corneum .................................................................................. 30

Les particularités de l’épiderme des bovins .................................................................................... 31 3.

C. La fonction barrière de l’épiderme ....................................................................................... 32

1. Définition et fonctions de la barrière cutanée ................................................................................ 32

2. Les composants de la barrière épidermique ................................................................................... 32

a. Le stratum corneum ................................................................................................................... 32

i. Les cornéocytes : barrière mécanique .................................................................................... 32

ii. Les lipides intercellulaires : barrière contre les pertes d’eau et d’électrolytes ..................... 36

b. Importance des jonctions intercellulaires de l’épiderme nucléé ............................................... 39

3. Elaboration de la barrière épidermique .......................................................................................... 41

a. Cornification ou kératinisation ................................................................................................... 41

b. Desquamation ............................................................................................................................ 42

c. Principaux facteurs intra et extra cellulaires impliqués dans le contrôle de la fonction barrière

43

i. Les cytokines ........................................................................................................................... 43

ii. Le calcium .............................................................................................................................. 43

iii. L’ AMPc (3’-5’-adénosine monophosphate cyclique) ........................................................... 44

II. Evaluation de la fonction barrière de l’épiderme.............................................................. 45

A. Mesure de la Perte Insensible en Eau (PIE) ou Transepidermal Water Loss (TEWL) ............ 45

1. Origine et définition mathématique (GABARD 2000) ..................................................................... 45

2. Méthode et appareils de mesure .................................................................................................... 46

8

a. Méthode en chambre ouverte ................................................................................................... 46

b. Méthode en chambre fermée : exemple du VapoMeter ....................................................... 47

3. Résultats obtenus : corrélation entre Perte Insensible en Eau et fonction barrière de l’épiderme 48

4. Avantages et inconvénients ............................................................................................................ 49

B. Mesure du pH cutané............................................................................................................ 50

1. Définition et origine ........................................................................................................................ 50

2. Mesure et méthode ........................................................................................................................ 51

3. Résultats obtenus ........................................................................................................................... 51

III. Altérations expérimentales de la barrière cutanée : les différentes méthodes ................. 52

A. L’application de cellophane adhésive ou tape-stripping ...................................................... 52

B. Dissolution des lipides à l’acétone ........................................................................................ 54

Partie 2 : Etude expérimentale ........................................................................................ 55

I. Objectifs .......................................................................................................................... 57

II. Matériels et méthodes .................................................................................................... 57

A. Protocole 1, étude préliminaire sur bovins morts : étude du nombre d’applications de

cellophane adhésive nécessaire à l’élimination totale du stratum corneum ............................... 57

1. Sujet ................................................................................................................................................ 57

2. Méthodologie.................................................................................................................................. 58

a. Principe ....................................................................................................................................... 58

b. Préparation préalable des zones ................................................................................................ 58

c. Le ruban adhésif ......................................................................................................................... 58

d. Manipulateur.............................................................................................................................. 58

e. Réalisation .................................................................................................................................. 58

f. Mise en place du suivi histopathologique ................................................................................... 59

B. Protocole 2, étude préliminaire sur bovins morts : la rupture de la barrière cutanée par

application d’acétone est-elle due à une dissolution des lipides ou à un effet mécanique

« strips » ? ..................................................................................................................................... 60

1. Sujet ................................................................................................................................................ 60

2. Méthodologie.................................................................................................................................. 60

a. Principe ....................................................................................................................................... 60

b. Préparation préalable des zones ................................................................................................ 60

c. Manipulateur .............................................................................................................................. 60

d. Réalisation .................................................................................................................................. 60

e. Mise en place du suivi histopathologique .................................................................................. 61

C. Protocole 3 : étude de la rupture et de la réparation cutanée par tape stripping ............... 61

1. Sujets ............................................................................................................................................... 61

2. Méthodologie.................................................................................................................................. 62

a. Préparations préalables .............................................................................................................. 62

9

b. Réalisation de la rupture de la barrière cutanée ....................................................................... 63

c. Mise en place du suivi histopathologique .................................................................................. 64

d. Mise en place du suivi de la Perte Insensible en Eau ................................................................. 64

D. Protocole 4 : rupture de la barrière cutanée par dissolution des lipides du stratum corneum

65

1. Sujet ................................................................................................................................................ 65

2. Méthodologie.................................................................................................................................. 65

a. Préparations préalables .............................................................................................................. 65

b. Réalisation .................................................................................................................................. 65

c. Mise en place du suivi histopathologique .................................................................................. 66


E. Protocole 5, étude de la rupture et de la réparation cutanée par tape-stripping : révision du

protocole ...................................................................................................................................... 67

1. Sujet ................................................................................................................................................ 67

2. Méthodologie.................................................................................................................................. 67

a. Réalisation .................................................................................................................................. 67

b. Observations cliniques ............................................................................................................... 68

c. Mise en place du suivi histopathologique et immunohistochimie ............................................. 68


e. Mise en place du suivi du pH cutané .......................................................................................... 70

f. Analyse statistique : matériels et méthodes ............................................................................... 71

III. Résultats ....................................................................................................................... 72

A. Observations cliniques .......................................................................................................... 72

B. Suivi histopathologique et immunohistochimie .................................................................. 73

1. Protocole 1 ...................................................................................................................................... 73

a. Prélèvements réalisés sur le front, la partie interne proximale du membre antérieur gauche, les

lombes, l’abdomen et la mamelle ...................................................................................................... 73

b. Prélèvements réalisés sur le mufle ............................................................................................ 73

2. Protocole 2 ...................................................................................................................................... 75

3. Protocole 3 ...................................................................................................................................... 75

Protocole 4 ...................................................................................................................................... 76 4.

Protocole 5 ...................................................................................................................................... 78 5.

a. Suivi histopathologique .............................................................................................................. 78

b. Etude de la prolifération cellulaire ............................................................................................. 79

c. Etude de l’infiltrat inflammatoire ............................................................................................... 82

d. Suivi de la production d’involucrine ........................................................................................... 90

C. Mesure de la Perte Insensible en Eau ................................................................................... 91

Résultats du protocole 3 : étude de la rupture et de la réparation cutanée par tape-stripping .... 91 1.

10

2. Résultats du protocole 4 : rupture de la barrière cutanée par dissolution des lipides du stratum

corneum .................................................................................................................................................. 94

3. Résultats de l’étude de la rupture et de la réparation cutanée après application successives de

cellophane adhésive : protocole 5 .......................................................................................................... 95

a. Site 1 témoin : mise en relation de la Perte Insensible en Eau avec l’Hygrométrie ................... 95

b. Sites 5/6/7/8/9/10/11 et 12 ....................................................................................................... 96

D. Analyse statistique : estimations de la Perte Insensible en Eau par un modèle linéaire

généralisé.................................................................................................................................... 100

E. Mesure du pH cutané .......................................................................................................... 101

IV. Discussion ................................................................................................................... 103

A. Les manipulations sur les bovins ........................................................................................ 103

B. Les différentes méthodes de rupture de la barrière cutanée ............................................ 104

C. Les observations histopathologiques et immunohistochimiques ....................................... 106

D. La Perte Insensible en Eau .................................................................................................. 107

E. La mesure du pH cutané ..................................................................................................... 108

CONCLUSION ................................................................................................................ 111

BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................................. 113

ANNEXES ...................................................................................................................... 119

Annexe 1: Agrément du comité d’éthique ............................................................................. 119

Annexe 2: Tableaux détaillant les résultats des examens histopathologiques ......................... 120

Annexe 3: Tableaux des valeurs de Perte Insensible en Eau brutes du protocole 3 et 4 ........... 132

Annexe 4 : Tableaux des valeurs de Pertes Insensible en Eau brutes du protocole 5 ............... 134

Annexe 5 : Tableau des valeurs brutes des mesures du pH cutané du protocole 5 .................. 142

Annexe 6 : Table R des mesures obtenues lors du protocole 5 ............................................... 143

Annexe 7: Les différentes techniques de coloration en histopathologie ................................. 146

11

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1: Détails des manipulations réalisées sur chaque site pour le protocole 1 .............. 59

Tableau 2: Détails des manipulations réalisées pour le protocole 2 ....................................... 61




Tableau 6: Principaux résultats du modèle linéaire généralisé ............................................. 100

13

LISTE DES FIGURES

Figure 1: Coupe histologique de peau de bovin (coloration HE) x200 .................................... 26

Figure 2: Coupe histologique de l’épiderme de bovin (coloration HE) x400 ........................... 28

Figure 3: Coupe schématique de l'épiderme (échelle non respectée) d’après Madison 2003 31

Figure 4: Représentation schématique de l'assemblage de l'enveloppe cornée d'après Kalinin

et al. 2002 ................................................................................................................................. 35

Figure 5: Vue au microscope électronique d'un corps lamellaire d'épiderme de souris (x300

000) d’après Madison 2003 ...................................................................................................... 36

Figure 6: Vue en microscopie électronique de lamelles lipidiques intercellulaires du stratum

corneum de souris après fixation au tétroxyde de ruthénium d’après Madison 2003. ......... 38

Figure 7: Schéma synthétique de la formation des lamelles lipidiques intercellulaires du

stratum corneum d'après Feingold 2009 ................................................................................. 39

Figure 8: Représentation schématique des principales étapes de la différenciation

épidermique d’après Madison 2003 ........................................................................................ 42

Figure 9: Gradient de calcium avant et après altération de la barrière cutanée d'après

Proksch 2008 ............................................................................................................................ 44

Figure 10: Schéma de la sonde du Tewameter 300 d’après Yoshihara et al. 2007 .............. 47

Figure 11: Schéma d’une sonde d’appareil à chambre fermée d’après Imhof et al. 2009 ...... 48

Figure 12: Photographie de peau après réalisation de la biopsie du site témoin ................... 59

Figure 13: Contention des sujets .............................................................................................. 62

Figure 14: Sujet après tonte et rasage, matérialisation des sites au feutre ............................ 63

Figure 15: Prise de mesure de Perte Insensible en Eau à l'aide du Vapometer ...................... 64

Figure 16: Mesure du pH cutané .............................................................................................. 70

Figure 17: Coupe histologique de mufle de bovin après 50 applications de cellophane

adhésive (à gauche) et de bovin sain (à droite) (coloration HE) x50 ....................................... 74

Figure 18: Evolution du nombre de couches de cornéocytes en fonction du nombre

d'applications de cellophane adhésive sur le mufle ................................................................ 74

Figure 19: Evolution du Ki 67 au cours du temps ..................................................................... 79

Figure 20: Coupe transversale de peau saine de bovin après immunomarquage des cellules

engagées dans le cycle cellulaire (x200) .................................................................................. 80

Figure 21: Coupe transversale de peau de bovin 72 heures après l'application de cellophane

adhésive après immunomarquage des cellules engagées dans le cycle cellulaire (x200) ....... 81

14

Figure 22: Evolution au cours du temps des populations cellulaires positives aux

immunomarquages BLA 36, CD3, ou à la coloration de LUNA ................................................ 83


adhésive, coloration de luna, x200 .......................................................................................... 84


adhésive, coloration de luna, x400 .......................................................................................... 85

Figure 25: Coupe transversale de peau saine de bovin après immunomarquage CD3 (x400) 86

Figure 26: Coupe transversale de peau de bovin 12 heures après les applications de

cellophane adhésive, après immunomarquage CD3, x400 ...................................................... 87

Figure 27: Coupe transversale de peau saine de bovin après immunomarquage BLA 36

(x200) ........................................................................................................................................ 88


adhésive, après immunomarquage BLA 36 (x200) .................................................................. 89

Figure 29: Coupes transversales de peau de bovin après immunomarquage de l’involucrine

.................................................................................................................................................. 90

Figure 30: Evolution de la Perte Insensible en Eau en fonction du nombre d’applications de

cellophane adhésive (protocole 3) ........................................................................................... 92

Figure 31: Evolution au cours du temps de la Perte Insensible en Eau après 80 applications

de cellophane adhésive (Protocole 3) ...................................................................................... 93

Figure 32: Evolution au cours du temps de la Perte Insensible en Eau après application

d'acétone ou de PBS (protocole 4) ........................................................................................... 94

Figure 33: Evolution de la Perte Insensible en Eau et de l'hygrométrie sur le site 1 temoin .. 95

Figure 34: Régression linéaire entre la Perte Insensible en Eau et l'hygrométrie ................... 96


cellophane adhésive associée au suivi au cours du temps de l’hygrométrie sur le site 5 ....... 97









15


cellophane adhésive associée au suivi au cours du temps de l’hygrométrie sur le site 10 ..... 98





Figure 43: Estimations de la Perte Insensible en Eau par un modèle linéaire généralisé, sous

différentes conditions ............................................................................................................ 101

Figure 44: Evolution du pH cutané en fonction du nombre d'applications de cellophane

adhésive ................................................................................................................................. 102

Figure 45: Evolution moyenne du pH cutané en fonction de nombre d'applications de

cellophane adhésive ............................................................................................................... 102

17

LISTE DES ABREVIATIONS

PIE: Perte Insensible en Eau

TEWL: Transepidermal Water Loss

SC: Stratum corneum

AMPc: 3’-5’-adénosine monophosphate cyclique

HE: Hémalun-Eosine

19

« En essayant continuellement on finit par réussir. Donc : plus ça rate, plus on a de chance que ça marche. »

Jacques Rouxel

Extrait de la BD Les Shadoks

21

INTRODUCTION

La peau est l’organe le plus vaste des mammifères. Il s’agit d’un organe de

revêtement couvrant la totalité du corps en continuité avec les muqueuses au niveau des

orifices naturels. La peau isole l’organisme du milieu extérieur et possède de très

nombreuses fonctions de protection essentielles à la vie. Elle est, en particulier, une barrière

de perméabilité permettant de lutter contre la dessiccation : elle s’oppose à des pertes

excessives d’eau et d’électrolytes. Elle constitue aussi une barrière physique contre l’entrée

de substances chimiques ou d’agents pathogènes. Cette barrière cutanée est localisée au

niveau d’une partie précise de l’épiderme : la couche cornée ou stratum corneum.

Notre travail est une étude préliminaire dont l’objectif est d’actualiser les données

sur les propriétés physico-chimiques et histopathologiques de la peau des bovins, en

s’intéressant particulièrement à la notion de barrière cutanée. En effet, comparativement à

d’autres espèces comme l’Homme ou le chien, la peau des bovins n’a que peu été étudiée.

Dans un premier temps, nous présenterons, après avoir rappelé brièvement

l’histologie de la peau et plus précisément de l’épiderme, les composants de la barrière

cutanée ainsi que les mécanismes de son élaboration. Puis, nous nous intéresserons aux

différentes méthodes permettant l’évaluation de la fonction barrière de l’épiderme et à

celles permettant d’induire expérimentalement une rupture de la barrière cutanée.

Dans un second temps, nous présenterons notre étude expérimentale originale qui

consiste en la réalisation d’une rupture de la barrière cutanée selon différents protocoles et

en l’étude de sa restauration par la mesure de la Perte Insensible en Eau et celle du pH

associées à divers examens histopathologiques. Nous terminerons par la présentation des

résultats obtenus suivi de leur discussion.

23

Partie 1 : Rappels bibliographiques

25

I. La peau : barrière vitale vis-à-vis de l’environnement extérieur

La peau est l’organe le plus vaste de l’organisme des mammifères. Il s’agit d’un organe

de revêtement couvrant la totalité du corps, en continuité avec les muqueuses au niveau des

orifices naturels. La peau assure un rôle essentiel de barrière avec le milieu extérieur et joue

un rôle protecteur contre les ultra-violets, les agressions mécaniques, chimiques et

thermiques, et l’invasion par des agents pathogènes (SCOTT 2001). La peau est aussi un

organe immunitaire ainsi qu’un organe sensitif à l’origine de la sensibilité tactile, thermique

et de la nociception (SCOTT 2001). Enfin, la peau joue un rôle majeur dans la

thermorégulation (SCOTT 2001).

A. Rappel sur la structure générale de la peau

La peau est constituée de trois couches tissulaires superposées (WHEATER et al. 2001) :

• L’épiderme, couche la plus externe, formé par un épithélium pluristratifié

kératinisé se renouvelant continuellement. Sa principale fonction est celle de

barrière entre le corps et son environnement extérieur.

• Le derme sous-jacent, séparé de l’épiderme par la jonction dermo-épidermique.

Il s’agit d’un tissu conjonctif très largement innervé et vascularisé, contenant les

annexes cutanées. Il joue un rôle nourricier pour l’épiderme mais est aussi

impliqué dans la thermorégulation, la cicatrisation et la défense contre les

agents pathogènes grâce à la présence de cellules immunitaires.

• En profondeur, l’hypoderme, essentiellement constitué de tissu adipeux, joue un

rôle de réserve énergétique, de protection contre les chocs et d’isolant

thermique.

A ces trois couches s’ajoutent des annexes cutanées : follicules pileux, glandes sudoripares

et sébacées (SCOTT 1988).

26

FIGURE 1: COUPE HISTOLOGIQUE DE PEAU DE BOVIN (COLORATION HE) X200

B. Histologie de l’épiderme

Les différentes cellules de l’épiderme (POIRIER et RIBABEAU DUMAS 1993, 1.

WHEATER et al. 2001)

L’épiderme est composé de différentes populations cellulaires :

• Les kératinocytes : ils constituent plus de 90 % des cellules épidermiques. Au cours

de la différenciation épidermique, les kératinocytes subissent de nombreux

changements morphologiques et métaboliques, aboutissant à la formation de

cellules mortes cornifiées : les cornéocytes formant le stratum corneum. Ce

processus de différenciation particulier se nomme la kératinisation ou cornification.

• Les cellules de Langerhans : il s’agit de cellules dendritiques d’origine

hématopoïétique représentant 5% de la population cellulaire épidermique, localisées

dans les couches basales et suprabasales de l’épiderme. Ces cellules dendritiques

présentatrices d’antigènes interviennent dans l’immunité acquise et spécifique. Elles

sont en effet capables d’internaliser les agents pathogènes ainsi que toutes les

molécules entrant par la peau. Puis, après leur migration vers les organes lymphoïdes

drainant la peau, elles présentent les antigènes aux lymphocytes T, dans le but de

déclencher une réponse immune adaptée au pathogène détecté.

Epiderme

Derme

Glande sébacée

Follicule pileux

27

• Les cellules de Merkel : cette lignée minoritaire dans l’épiderme appartient au

système neuro-endocrinien diffus. Ces cellules jouent un rôle de mécanorécepteurs à

adaptation lente.

• Les mélanocytes : ils sont responsables de la synthèse et de la sécrétion du pigment

naturel de la peau indispensable à la photoprotection, la mélanine, stockée dans des

mélanosomes. Les mélanosomes sont ensuite transférés aux kératinocytes voisins via

les dendrites des mélanocytes. Puis, une fois dans les kératinocytes, les

mélanosomes constituent une enveloppe supranucléaire, dans le but de protéger le

matériel génétique des effets mutagènes des rayons ultra-violets. On dénombre

environ un mélanocyte pour 10 à 20 kératinocytes (SCOTT 1988), au niveau de la

couche basale de l’épiderme.

L’organisation stratifiée de l’épiderme 2.

L’épiderme est un épithélium pluristratifié constitué de quatre couches superposées

(SCOTT 1988). L’épaisseur de l’épiderme varie entre 16 et 145 µm chez les bovins (SCOTT

1988) dans les régions couvertes en poils. Son épaisseur augmente dans les régions

dépourvues de poils (SCOTT 1988) comme par exemple au niveau du mufle. C’est aussi le

siège d’un processus de différenciation qui a lieu de la profondeur vers la surface : la

kératinisation ou cornification.

28

FIGURE 2: COUPE HISTOLOGIQUE DE L’EPIDERME DE BOVIN (COLORATION HE) X400

a. La couche basale ou le stratum basale

Le stratum basale constitue la couche germinative de l’épiderme. Il s’agit d’une

monocouche de cellules séparée du derme par une membrane basale, la jonction dermo-

épidermique. Les kératinocytes de la couche basale sont ancrés à la jonction dermo-

épidermique par des jonctions particulières, les hémidesmosomes (WEATHER et al. 2001). A

ces cellules s’ajoutent quelques mélanoyctes dans un rapport de un mélanocyte pour 10 à

20 kératinocytes (SCOTT 1988).

Les kératinocytes basaux sont de forme cubique ou cylindrique, avec un noyau

volumineux. Tous les organites cellulaires classiques y sont présents. Ils possèdent aussi,

dans leur cytoplasme, des filaments intermédiaires de kératine K5, K14 et K15 (SANDILANDS

et al. 2009), groupés autour du noyau et s’insérant sur les desmosomes ou les

hémidesmosomes. Les kératinocytes sont unis entre eux par des desmosomes contenant des

glycoprotéines particulières transmembranaires, dont la desmogléine 3. Ces kératinocytes

de la couche basale sont les seuls à être mitotiquement actifs et sont peu différenciés. Ils

assurent, donc, le renouvellement des cellules épithéliales de l’épiderme. Il a été montré par

Lechler et Fuchs (LECHLER et FUCHS 2005), que certains kératinocytes constituent les

« cellules souches épidermiques » et utilisent leur polarité pour se diviser asymétriquement.

Elles génèrent ainsi, soit des cellules suprabasales incapables de se diviser mais entrant dans

le processus de kératinisation, soit des cellules basales prolifératives encore appelées

29

cellules amplificatrices transitoires (LECHLER et FUCHS 2005). Ce modèle s’appuie sur la

capacité des cellules souches épidermiques à se diviser en orientant leur fuseau mitotique

de telle sorte qu’une cellule se retrouve dans la couche épineuse et que l’autre soit

maintenue dans la couche basale (FUCHS 2007).

b. La couche épineuse ou le stratum spinosum

Le stratum spinosum est composé de plusieurs assises cellulaires d’ancathocytes,

cellules filles des kératinocytes de la couche basale (SCOTT 1988). Il doit son nom à la

présence des nombreuses « épines », visibles en microscopie optique qui semblent lier les

cellules entre elles (WEATHER et al. 2001). Il s’agit en réalité des desmosomes assurant la

cohésion intercellulaire. A partir de cette strate, les cellules perdent le pouvoir de se diviser

et commencent à se différencier. Les cellules de cette zone sont relativement grandes et

polyédriques avec des noyaux volumineux dans les assises les plus profondes, puis elles vont

progressivement s’élargir et s’aplatir lors de leur progression vers les couches supérieures.

La desmogléine 3 des desmosomes est remplacée par la desmogléine 1. De plus, les

filaments de kératine K4 et K15 sont remplacés par de la kératine K1 et K10 par des

changements dans l’expression des gènes (SANDILANDS et al. 2009).

c. La couche granuleuse ou le stratum granulosum

Le stratum granulosum correspond aux dernières couches de cellules vivantes de

l’épiderme. Il est formé d’une à trois assises de cellules (SCOTT 1988) de forme aplatie avec

un noyau commençant à se rétracter. Ces cellules se caractérisent par la présence de

granulations denses dans leur cytoplasme, visibles en microscopie optique. Ces granulations

sont des grains de kératoyaline. Ils sont composés de protéines non fibreuses, riches en

cystéine et histidine (STEINERT 1975, UGEL 1975), dont la principale est la profilaggrine

(SANDILANDS et al. 2009). Ces grains de kératoyaline furent mis en évidence chez les bovins

par Urgel et Idler en 1972. Mais, à l’époque, leur rôle était inconnu (UGEL et IDLER 1972). En

1975, ils publient une étude détaillant la composition précise de ces grains de kératoyaline :

8 % d’ARN 92 % d’acides aminés dont la sérine, la glycine, l’acide glutamique, l’arginine et

l’histidine représentent 78 % du total (UGEL 1975). Ils observent que la sérine serait l’acide

30

aminé majoritaire dans les grains de kératoyaline de bovins puisqu’elle représente à elle

seule 27 % du total des acides aminés (UGEL 1975). Steinert suggère, en 1975, la possible

existence de liaisons entre les tonofilaments, contenu dans le cytosquelette, et les grains de

kératoyaline (STEINERT 1975). Ceci n’est, à ce jour, toujours pas confirmé.

On observe, en microscopie électronique, des structures tubulo-vésiculaires, les

corps lamellaires ou corps d’Odland (MADISON 2003). Ceux-ci jouent un rôle majeur en

déversant, par exocytose, leur contenu lipidique, glucidique et enzymatique, dans l’espace

intercellulaire. Ce contenu forme ensuite des lamelles lipidiques dans l’espace intercellulaire

et participe à la création du ciment intercornéocytaire.

d. La couche cornée ou le stratum corneum

Le stratum corneum correspond à 30 à 40 couches (SCOTT 1988) de cellules aplaties

mortes et anucléées : les cornéocytes (WHEATER et al. 2001). Son épaisseur est estimée

chez les bovins à environ 30 µm (SCOTT 1988). La teneur en eau du stratum corneum est de

seulement 15%, tandis que les autres couches de l’épiderme contiennent environ 70 % d’eau

comme dans la plupart des tissus (MARKS 2004).

Les cornéocytes résultent de la transformation de kératinocytes de la couche

granuleuse, lors de la kératinisation ou cornification, en cellules mortes dont la membrane

plasmique est remplacée par une enveloppe cornéocytaire lipidique doublée à sa face

interne d’une enveloppe cornée. Le cytoplasme est rempli d’une matrice filamenteuse dense

composée par des filaments de kératine agrégés par de la filaggrine (STEINERT et al. 1981)

dont l’orientation se fait parallèlement à la peau. Les différentes étapes de la cornification

seront abordées ultérieurement. Les cornéocytes sont unis par des desmosomes renforcés

par un dépôt de cornéodesmosine, les cornéodesmosomes, ainsi que par des jonctions

serrées.

On distingue deux parties dans le stratum corneum. Premièrement, le stratum

compactum, qui correspond à la partie la plus profonde, constitué de cornéocytes encore

cohésifs grâce à l’existence de cornéodesmosomes. En surface, le stratum disjonctum est

composé de cornéocytes de moins en moins cohésifs. Cette dernière strate est en exfoliation

permanente et participe en partie à la défense de l’organisme en éliminant les virus,

31

bactéries et champignons présents à la surface de la peau. L’exfoliation permanente des

cornéocytes est compensée par la multiplication des cellules de la couche basale, ce qui

permet de maintenir constante l’épaisseur de l’épiderme (SCOTT 1988).

FIGURE 3: COUPE SCHEMATIQUE DE L'EPIDERME (ECHELLE NON RESPECTEE) D’APRES MADISON 2003

Les particularités de l’épiderme des bovins 3.

Peu de données sont disponibles sur la structure de l’épiderme des bovins. On

recense dans la bibliographie quelques études, la plupart datant des années 60 et 70.

L’épaisseur de l’épiderme entier est estimée entre 16 et 145 µm chez les bovins

(SCOTT 1988). L’épaisseur varie selon la localisation anatomique comme chez les autres

espèces. Comme pour la plupart des espèces, l’épaisseur de l’épiderme chez les bovins

diminue du dos au ventre (SCOTT 1988). Les régions du mufle, du sabot possèdent un tissu

épidermique très épais (UGEL et IDLER 1970). Ugel et Idler montrent, en 1970, que cette

forte épaisseur provient certes d’un stratum compactum plus épais mais surtout d’un

stratum granulosum exceptionnellement développé (UGEL et IDLER 1970). En effet, ils

dénombrent vingt couches cellulaires dans le stratum granulosum du bourrelet coronaire du

sabot de bovins tandis que chez les autres espèces telles que l’homme, le rat ou le cobaye,

32

l’épaisseur du stratum granulosum n’excède jamais trois à cinq couches cellulaires (UGEL et

IDLER 1970).

C. La fonction barrière de l’épiderme

1. Définition et fonctions de la barrière cutanée

Une barrière est un obstacle naturel qui interdit le passage ou le rend difficile. Le but

ultime de la différenciation épidermique est de créer une barrière, le stratum corneum,

entre le corps et l’environnement extérieur, le protégeant ainsi des traumatismes physiques,

chimiques ou mécaniques et d’une perte en eau transcutanée excessive (MARKS 2004,

PROKSCH et al. 2008, MADISON 2003, HUMBERT 2003).

2. Les composants de la barrière épidermique

a. Le stratum corneum

i. Les cornéocytes : barrière mécanique

Les cornéocytes résultent de la transformation des kératinocytes lors du processus

de kératinisation. Ce sont des cellules mortes, anucléées, aplaties dont le cytoplasme est

dépourvu d’organites cellulaires. Ils sont organisés en couches multiples et reliés entre eux

par des cornéodesmosomes et des jonctions serrées. Leur épaisseur est inférieure à 1 µm

(MARKS 2004).

Le processus de kératinisation aboutit à des cellules très modifiées. En effet, sous

l’action de la filaggrine (condensé de « filament-aggregating protein »), un polypeptide

dérivé de la profilaggrine, les filaments intermédiaires de kératine contenus dans le

cytoplasme des cellules s’agrègent pour former une matrice cytoplasmique fibreuse et

dense qui donne aux cornéocytes leur résistance mécanique (SANDILANDS et al. 2009). De

plus, cette agrégation s’accompagne de l’effondrement des cellules pour aboutir à la forme

aplatie caractéristique des cornéocytes (PROKSH 2008). Par la suite, la filaggrine est

dégradée, par différentes protéases, en acides aminés libres ou encore en acide urocanique

(issu de la dégradation de l’histidine), regroupés sous de le nom de Facteur Naturel

d’Hydratation (NMF en anglais pour « Natural Moisturizing Factor »), lequel contribue à

33

l’hydratation cutanée et à la protection contre les ultra-violets (SANDILANDS et al. 2009). Le

rôle crucial de la filaggrine, dans la cornification et l’établissement de la barrière cutanée, est

mis en évidence lors d’étude de certaines dermatoses (SANDILANDS et al. 2009). L’exemple

de l’ichtyose vulgaire, une dermatose congénitale caractérisée par une peau sèche et

d’aspect écailleux (ichtyus veut dire « écaille de poissons »), peut être cité. On observe une

perte de la couche granuleuse, l’absence de marquage immunohistochimique de la filaggrine

ainsi que des niveaux réduits d’ARN messagers du gène codant la profilaggrine. Le

séquençage de ce gène, dans des familles atteintes d’ichtyose vulgaire, montre la présence

de deux mutations, une mutation non-sens et une délétion, entraînant l’apparition précoce

de codons stop. Les individus portant ces deux mutations, de façon homozygote ou

hétérozygote, n’expriment pas la filaggrine au sein de leur épiderme (SANDILANDS et al.

2009).

Au cours du processus de kératinisation, la membrane plasmique des kératinocytes

est transformée en une structure mince, imperméable et résistante : l’enveloppe cornée

d’environ 10 nm (MADISON 2003). Elle est constituée par deux sous-enveloppes :

l’enveloppe protéique et l’enveloppe lipidique.

L’enveloppe protéique se forme sous la membrane plasmique à sa face interne. Elle

est principalement composée de deux protéines : l’involucrine et la loricrine (KUBILUS et al.

1987). Sa formation débute dès le stratum spinosum. Différentes protéines, dont

l’envoplakine, la périplakine et l’involucrine, vont se lier entre elles sous l’action de

transglutaminases (KALININ et al. 2002). Ces liaisons sont des liaisons isopeptides de type N-

epsilon-(gamma-glutamyl)lysine (PROKSCH 2008) et sont résistantes à une grande majorité

des enzymes protéolytiques (PROKSCH 2008), ce qui procure à l’enveloppe cornée une

grande importance dans le rôle de barrière épidermique du stratum corneum. Puis, au

niveau du stratum granulosum, la loricrine s’associe aux Small Proline-Rich Proteins (SPR).

On aboutit, alors, à un maillage protéique très dense et résistant, recouvrant toute la face

interne de la membrane plasmique.

L’enveloppe lipidique, issue de la transformation de la membrane plasmique du

kératinocyte, est située par-dessus l’enveloppe protéique. Elle est formée de céramides ω-

hydroxylés estérifiés par des acides gras à très longue chaîne. Certains sont liés à des résidus

d’acides aminés de l’involucrine (KALININ et al. 2002, MADISON 2003). Ces liaisons seraient

34

aussi catalysées par les enzymes transglutaminases (KALININ et al. 2002, MADISON 2003).

L’enveloppe lipidique assure le caractère insoluble de l’enveloppe cornée.

Enfin, les cornéocytes sont reliés entre eux par des desmosomes spécifiques,

renforcés par un dépôt de cornéodesmosine, nommés cornéodesmosomes. Ces structures

d’adhésion assurent une bonne cohésion des cornéocytes entre eux. Entre les cellules de la

couche granuleuse, des desmosomes dits de transition assurent la cohésion entre le stratum

granulosum et le stratum corneum (PROKSCH 2008). Ces desmosomes de transition, les

cornéodesmosomes et les jonctions serrées créent une très forte cohésion mécanique entre

les cellules et confèrent au stratum corneum son rôle de barrière mécanique.

Un cytoplasme résistant, une enveloppe cornée imperméable et résistante, et enfin

des jonctions intercellulaires fortes sont donc indispensables à la fonction barrière exercée

par le stratum corneum.

35

FIGURE 4: REPRESENTATION SCHEMATIQUE DE L'ASSEMBLAGE DE L'ENVELOPPE CORNEE D'APRES KALININ ET

AL. 2002

36

ii. Les lipides intercellulaires : barrière contre les pertes d’eau et

d’électrolytes

Les lipides intercellulaires constituent un ciment hydrophobe comblant les espaces

intercellulaires du stratum corneum et sont indispensables à la fonction barrière de

l’épiderme.

Ils proviennent des corps lamellaires, organites émanant de l’appareil de Golgi

contenus dans le cytoplasme des cellules de la couche granuleuse. Les corps lamellaires sont

de petits organites, de 0,2 à 0,3 µm de diamètre (ELIAS 1983), entourés d’une bicouche

lipidique dont le contenu est composé de piles de lamelles lipidiques. Les mécanismes de

leur formation sont mal connus (FEINGOLD 2007) mais celle-ci commence dans les cellules

du stratum spinosum (ELIAS 1983).

A la jonction de la couche granuleuse et de la couche cornée, sous l’influence de la

variation de la concentration en calcium (PROKSCH et al. 2008, FEINGOLD 2007) et d’autres

facteurs, comme le taux d’hydratation, les corps lamellaires migrent jusqu’à la membrane

plasmique apicale avec laquelle leur enveloppe fusionne. Ils peuvent ainsi déverser leur

contenu dans l’espace intercellulaire. La sécrétion des corps lamellaires peut être

expérimentalement provoquée par une altération de la barrière cutanée par tape-stripping

ou encore badigeonnage à l’acétone (FEINGOLD 2007).

FIGURE 5: VUE AU MICROSCOPE ELECTRONIQUE D'UN CORPS LAMELLAIRE D'EPIDERME DE SOURIS (X300 000)

D’APRES MADISON 2003

37

Les lamelles lipidiques contenues dans les corps lamellaires sont composées en

grande majorité de phospholipides, de glycosylcéramides et de cholestérol qui sont les

précurseurs des lipides composant le ciment intercellulaire du stratum corneum. Ces lipides

sont, soit synthétisés au niveau de l’épiderme comme une grande partie du cholestérol à

partir d’acétate (FEINGOLD 2007), soit proviennent de sources extra-cutanées.

Les corps lamellaires contiennent aussi de nombreuses enzymes dont la β-

glucocérébrosidase, la sphingomyélinase et des phospholipases chargées de convertir les

précurseurs des lipides intercellulaires après leur sécrétion dans l’espace intercellulaire.

Ainsi, la glucocérébrosidase a pour rôle de transformer les glycosylcéramides en céramides,

la sphingomyélinase, les sphingomyélines en céramides, et, enfin, les phospholipases

convertissent les phospholipides en acides gras libres et glycérol (FEINGOLD 2007). Des

études ont montré qu’une altération de la perméabilité cutanée engendre une

augmentation de l’activité de la β-glucocérébrosidase et de la sphingomyélinase. Ces deux

enzymes sont donc capitales dans le maintien de la barrière cutanée et sa restauration

(FEINGLOD 2007, JENSEN et al. 1999).

Concernant la composition lipidique du stratum corneum chez les bovins, une étude

porte sur les variations des teneurs des différents lipides selon la profondeur de l’épiderme

de mufle de bovins (LONG V.J.W 1970). Elle montre que la composition en lipides varie en

fonction des couches de l’épiderme. On observe, de la couche basale vers le stratum

corneum, une augmentation de la concentration en cholestérol, ce qui prouve que sa

synthèse a lieu in situ. Pour les triglycérides et les acides gras libres, leur concentration est

faible dans les deux premières couches de l’épiderme, puis elle augmente pour atteindre son

maximum dans la couche cornée. La concentration des phospholipides augmente de la

couche basale à la couche granuleuse puis on observe une diminution forte de celle-ci

lorsqu’on se rapproche de la couche cornée. L’auteur suppose, à l’époque, l’existence de

phospholipases expliquant cette chute brutale de concentration (LONG V.J.W. 1970). De

plus, ces variations de proportions entre les différents lipides seraient liées à une diminution

de la concentration en glucose de la couche basale vers le stratum corneum (LONG V.J.W.

1970).

Les lipides du stratum corneum sont composés de 50 % de céramides, 25 % de

cholestérol et 15 % d’acides gras libres (MADISON 2003). Les piles de lamelles lipidiques se

réorganisent dans l’espace intercellulaire : les petites piles de membranes lipidiques

38

fusionnent entre elles pour former de longues lamelles lipidiques continues (MADISON

2003). Il est possible d’observer cette organisation au microscope électronique après

fixation au tétroxyde de ruthénium.

Enfin, d’autres molécules sont présentes dans l’espace intercellulaire mais en plus

petites quantités. On trouve, par exemple, le sulfate de cholestérol qui a un rôle clé dans les

mécanismes de desquamation (FEINGOLD 2007) ou encore le glycérol, formé lors de la

transformation des phospholipides en acides gras libres par les phospholipases, qui, grâce à

ses capacités de rétention d’eau, permet de maintenir un bon état d’hydratation du stratum

corneum (FEINGOLD 2007).

FIGURE 6: VUE EN MICROSCOPIE ELECTRONIQUE DE LAMELLES LIPIDIQUES INTERCELLULAIRES DU STRATUM

CORNEUM DE SOURIS APRES FIXATION AU TETROXYDE DE RUTHENIUM D’APRES MADISON 2003.

K: FILAMENTS DE KERATINE AGGLOMERES DANS LES CORNEOCYTES; ICS: ESPACE INTERCELLULAIRE; FLECHES:

ENVELOPPE CORNEE

39

La figure 7 présente une synthèse du mécanisme de formation des lamelles lipidiques

intercellulaires.

FIGURE 7: SCHEMA SYNTHETIQUE DE LA FORMATION DES LAMELLES LIPIDIQUES INTERCELLULAIRES DU

STRATUM CORNEUM D'APRES FEINGOLD 2009

L’importance de la composition lipidique de la matrice extracellulaire dans la fonction

barrière de l’épiderme est clairement établie par l’étude de certaines dermatoses, telles que

la dermatite atopique, caractérisées par une composition lipidique différente de celle d’une

peau normale (HUMBERT 2003).

b. Importance des jonctions intercellulaires de l’épiderme nucléé

Le stratum corneum est, certes, la partie de l’épiderme la plus impliquée dans la

fonction barrière mais des études ont montré l’implication, aussi, des couches sous-jacentes

et, en particulier, des jonctions intercellulaires reliant leurs cellules. En effet, si certaines

maladies, comme le syndrome d’épidermolyse staphylococcique, entraînent une perte du

40

stratum corneum et d’une partie de la couche granuleuse, les conséquences (augmentation

de la perte d’eau transépidermique) ne mettent pas en jeu le pronostic vital du malade

(PROSCH et al. 2008). A contrario, des maladies impliquant des modifications dans les

couches inférieures de l’épiderme, telles que le pemphigus vulgaire, entraînent des pertes

excessives d’eau et des surinfections bactériennes mettant en jeu le pronostic vital de

l’individu (PROKSCH et al. 2008).

Trois types de jonctions intercellulaires sont impliqués dans la fonction barrière de

l’épiderme :

• Les jonctions serrées : ce sont des jonctions spécifiques des tissus épithéliaux qui

permettent de connecter les cellules entre elles, de séparer l’espace

intercellulaire du pôle apical de celui du pôle basal et de contrôler le passage des

molécules entre les cellules en rendant l’espace intercellulaire imperméable aux

substances (WHEATER 2001 et al.). Leur rôle dans la fonction barrière a été

démontré dans des études menées chez la souris porteuse d’une mutation de la

claudine, une protéine impliquée dans la structure des jonctions serrées. Les

souris porteuses de la mutation mouraient, dès les premiers jours de vie, d’une

perte d’eau transépidermique excessive (PROKSCH et al. 2008, BRANDNER 2007).

Les jonctions serrées jouent, donc, un rôle essentiel en fermant les espaces

intercellulaires et en établissant une barrière paracellulaire (BRANDNER 2007).

• Les jonctions adhérentes et les desmosomes : ce sont des jonctions d’ancrage

permettant de fixer fortement deux cellules épithéliales entre elles en

permettant la fixation des filaments intermédiaires de kératine pour les

desmosomes, des filaments d’actine pour les jonctions adhérentes, de part et

d’autre de la jonction (WHEATER et al. 2001, PROKSCH et al. 2008). Ces jonctions

sont principalement constituées de glycoprotéines dont la desmogléine pour les

desmosomes et l’E-cadhérine pour les jonctions adhérentes (PROKSCH et al.

2008). Une altération de ces structures conduit aussi à une altération de la

fonction barrière de l’épiderme comme c’est le cas lors de pemphigus chez

l’homme : des anticorps anti-desmogléine entraînent une perte d’adhésion entre

les kératinocytes causant des décollements intraépidermiques (PROKSCH et al.

2008).

41

• Les jonctions gap ou jonctions communicantes : ce sont des jonctions

permettant le passage d’ions ou de petites molécules entre les cellules et

impliquées dans les mécanismes de communication intercellulaire (WHEATHER

2001 et al., PORKSCH 2008). Elles sont formées par des protéines

transmembranaires appelées connexines formant des connexons. L’étude d’une

mutation touchant la connexine 43, connexine la plus importante en termes de

quantité, ont montré chez la souris des déficits de la barrière épidermique ainsi

qu’une altération de la transformation de la filaggrine (PROKSCH et al. 2008).

3. Elaboration de la barrière épidermique

a. Cornification ou kératinisation

La cornification correspond au processus continu de différenciation des kératinoyctes

des couches inférieures vers les couches supérieures de l’épiderme. Son but ultime est la

production d'une gaine extérieure cohésive et imperméable (ELIAS 1983). De nombreuses

modifications morphologiques et physiologiques aboutissent à la formation de cornéocytes.

La cornification peut se décomposer en quatre évènements majeurs (ELIAS 1983) :

• La kératinisation au sens propre : il s’agit de la synthèse des protéines fibreuses des

kératinocytes dont les principales sont les kératines.

• La synthèse des grains de kératoyaline, contenant la profilaggrine, précurseur de la

filaggrine dont le rôle est essentiel dans la formation de la matrice cytoplasmique,

fibreuse et dense, des cornéocytes.

• La formation d’une enveloppe cornée insoluble et résistante à la plupart des enzymes

protéolytiques.

• La formation d’une matrice lipidique, organisée en lamelles, issue de l’exocytose du

contenu des corps lamellaires et dont le rôle est de combler l’espace

intercornéocytaire.

42

b. Desquamation

L’épiderme ayant une épaisseur constante, le processus de desquamation vient

contrebalancer la multiplication cellulaire des kératinocytes basaux. La desquamation

correspond au détachement des cornéocytes superficiels à la surface de l’épiderme. Celle-ci

est possible grâce à la dégradation définitive des cornéodesmosomes sous l’action

d’enzymes protéolytiques dont la plus connue est l’enzyme chymotryptique du stratum

corneum (PROKSCH et al. 2008, MARKS 2004). Ces enzymes proviennent des corps

lamellaires et sont excrétées dans l’espace intercornéocytaire en même temps que les

lipides (MARKS 2004).

Le sulfate de cholestérol, un métabolite mineur du métabolisme des lipides cutanés,

joue, lui aussi, un rôle dans la régulation de la desquamation. En effet, il a été montré que le

sulfate de cholestérol inhibe les protéases chargées de lyser les cornéodesmosomes

(PROKSCH et al. 2008)

FIGURE 8: REPRESENTATION SCHEMATIQUE DES PRINCIPALES ETAPES DE LA DIFFERENCIATION EPIDERMIQUE

D’APRES MADISON 2003

43

c. Principaux facteurs intra et extra cellulaires impliqués dans le contrôle

de la fonction barrière

i. Les cytokines

Une altération de la barrière cutanée entraine une augmentation de l’expression de

certaines cytokines dont le Tumor Necrosis Factor (TNF) et les interleukines 1 et 6 (PROKSCH

2008 et al.). Celles-ci induisent une stimulation des mitoses et des synthèses lipidiques. Des

études menées sur des souris présentant une déficience du récepteur du TNF ont montré

que le temps de formation des lipides est augmenté et que cela entraine une diminution de

l’activité de la sphingomyélinase impliquée dans la formation des céramides (JENSEN et al.

1999). A l’inverse, une application locale de TNF, après perturbation de la barrière cutanée

par tape-stripping, conduit à une réparation plus rapide de cette barrière (JENSEN et al.

1999) L’importance des cytokines est donc évidente dans la restauration de la barrière

cutanée.

ii. Le calcium

Le gradient de calcium joue un rôle capital dans le processus de restauration de la

barrière cutanée après son altération. En situation normale, on observe des concentrations

maximales en calcium dans la couche granuleuse tandis que des concentrations plus faibles

sont présentes au niveau du stratum corneum (PROKSCH 2008 et al., LEE et al. 1992). Une

altération de la barrière cutanée va entraîner une augmentation du flux d’eau et de calcium

vers l’extérieur aboutissant à la perte de ce gradient de calcium entre la couche granuleuse

et le stratum corneum. Cette diminution de la concentration du calcium au niveau de la

couche granuleuse est responsable de l’exocytose accrue des corps lamellaires dans l’espace

intercellulaire du stratum corneum. Le calcium est aussi impliqué dans la régulation de la

synthèse ou de l’activité de nombreuses protéines, dans la régulation de l’activité de la

transglutaminase 1 ainsi que dans les mécanismes de la différentiation épidermique

(PROKSCH 2008 et al.). Lee et al. concluent que le processus de réparation induit par une

rupture de la barrière est contrôlé par une diminution des concentrations en ions, dont le

calcium (mais aussi le potassium), dans l'épiderme (LEE et al. 1992). Cette diminution est due

au flux d’eau et à la diffusion passive des ions, secondaire à une rupture de la barrière

cutanée (LEE et al. 1992).

44

Enfin, il est possible que la profilaggrine ait un rôle dans la transduction du signal

induit par les variations de concentration de calcium au cours de la prolifération et de la

différenciation des kératinocytes (MARKOVA et al. 1993).

FIGURE 9: GRADIENT DE CALCIUM AVANT ET APRES ALTERATION DE LA BARRIERE CUTANEE D'APRES PROKSCH

2008

iii. L’ AMPc (3’-5’-adénosine monophosphate cyclique)

Denda et al. mettent en évidence son implication en 2004. Pour cela, ils réalisent

tout d’abord une altération de la barrière cutanée par tape-stripping ou dissolution des

lipides à l’acétone. Immédiatement après, ils appliquent des composés qui, soit activent la

synthèse d’AMPc, soit l’inactivent. Lors de l’application d’un composé activant la synthèse

d’AMPc, ils observent un retard de la réparation de la barrière cutanée et, parallèlement, en

microscopie électronique, ils montrent que ce retard est lié à une diminution de la sécrétion

des corps lamellaires. Inversement, lors de l’application d’un composé inhibant la synthèse

d’AMPc, ils observent une accélération de la réparation de la barrière cutanée et,

parallèlement, en microscopie électronique, ils montrent que cette accélération est liée à

une sécrétion accrue des corps lamellaires. L’AMPc est donc bien impliqué dans la

restauration de la barrière cutanée (DENDA et al. 2004).

45

II. Evaluation de la fonction barrière de l’épiderme

A. Mesure de la Perte Insensible en Eau (PIE) ou Transepidermal Water Loss (TEWL)

1. Origine et définition mathématique (GABARD 2000)

La Perte Insensible en Eau (PIE), ou Transepidermal Water Loss (TEWL) en anglais,

correspond à la quantité d’eau échangée entre le milieu intérieur - le corps - et le milieu

extérieur - l’environnement - de façon passive. Il est important de bien différencier cette

notion de la transpiration. En effet, l’eau peut traverser la peau de l’intérieur du corps vers

l’extérieur via deux chemins : de manière active par la transpiration et de manière passive

par diffusion à travers le stratum corneum (HUMBERT 2003). Cette diffusion passive est une

conséquence de l’existence d’un gradient de pression de vapeur d’eau de chaque côté de

l’épiderme et est régie par la première loi de Fick :

Le flux d’une molécule (J en mol/cm/s) par unité de distance (δ en cm) est

proportionnel au gradient de concentration (∆C) et au coefficient de diffusion (D en cm²/s) de

cette molécule.

Le stratum corneum n’étant pas une simple membrane inerte, la première loi de Fick

est complétée en introduisant un coefficient de partage traduisant l’affinité du stratum

corneum pour l’eau :

Km= ��’��

��é��

On obtient alors la formule suivante :

J= - Km x D (∆∆∆∆C / δδδδ ) avec Km= 0,06

Cette formule impliquant le gradient de pression en vapeur d’eau entre le corps et le

milieu extérieur, la Perte Insensible en Eau dépend donc de l’humidité relative extérieure.

Par conséquent, plus l’humidité relative extérieure sera importante, moins la Perte

Insensible en Eau sera forte (GABARD 2000). De plus, le taux de diffusion de l’eau dépend du

nombre de couches du stratum corneum (HUMBERT 2003).

46

2. Méthode et appareils de mesure

Plusieurs méthodes pour évaluer la Perte Insensible en Eau ont été développées

depuis les années 70. La principale méthode consiste à estimer un gradient de la pression en

vapeur d’eau (HUMBERT 2003). Pour cela deux types d’appareils de mesure existent : les

appareils à chambre ouverte et ceux à chambre fermée.

a. Méthode en chambre ouverte

La méthode en chambre ouverte est la plus largement utilisée (YOSHIHARA et al.

2007) pour mesurer la Perte Insensible en Eau.

Cette méthode permet la mesure du gradient de vapeur d’eau s’établissant dans une

couche de 10mm d’épaisseur au-dessus de la surface cutanée : on estime donc le gradient

de pression de vapeur d’eau dans la couche d’air adjacente à la peau (HUMBERT 2003). Ce

gradient sera considéré comme proportionnel à l’échange de vapeur d’eau depuis la peau.

Une sonde appliquée sur la peau délimite une chambre cylindrique ouverte à l’air ambiant.

Dans cette chambre, sont placés l’un au dessus de l’autre, deux détecteurs semi-

conducteurs sensibles à l’humidité, chacun est aussi couplé à un thermistor. La pression en

vapeur d’eau p est calculée au niveau de chaque détecteur par la formule : p = RH x psat avec

psat la pression à saturation et RH l’humidité relative. Ceci permet de mesurer le gradient de

vapeur d’eau se mettant en place entre la peau et l’air ambiant. La Perte Insensible en Eau

est calculée en appliquant la première loi de Fick. L’unité de mesure est le g/m²/h (GABARD

2000).

Un des appareils utilisant cette méthode est le Tewamètre 300 (Courage + Khazaka

Electronic). Il mesure la Perte Insensible en Eau entre 0 et 90 g/m²/h avec un écart type de

10% (DE PAEPE et al. 2005) dans des conditions d’humidité relative de 0 à 100 %.

47

FIGURE 10: SCHEMA DE LA SONDE DU TEWAMETER 300 D’APRES YOSHIHARA ET AL. 2007

Cette méthode présente néanmoins des inconvénients majeurs. L’appareil est très

sensible aux mouvements d’air qu’ils soient dus aux conditions d’ambiance ou aux

mouvements du sujet (YOSHIHARA et al. 2007, DE PAEPE et al. 2005). Les turbulences de l’air

peuvent donc entraîner des variations dans les mesures (YOSHIHARA et al. 2007). De plus,

sur les études faites sur les animaux, même après tonte du pelage, les capteurs d’humidité

détectent et prennent en compte l’humidité présente sur les poils restants, entraînant des

variations dans les mesures réalisées (YOSHIHARA et al. 2007). Les temps de mesure sont

relativement élevés. Enfin, les appareils ne sont pas portables, ce qui, en expérimentation

animale, est très contraignant.

b. Méthode en chambre fermée : exemple du VapoMeter

Mis au point plus récemment, les appareils à chambre fermée, tels que le

VapoMeter (Delfin Technologies Ltd, Kuopio, Finland), semblent plus adaptés pour réaliser

des mesures sur animaux. Des comparaisons entre appareils à chambre ouverte

(Tewameter) et appareils à chambre fermée (VapoMeter) ont été réalisées (DE PAEPE et

al. 2005) : il en ressort que les résultats obtenus par le Vapometer sont plutôt fiables mais

pas aussi précis qu’avec le Tewameter. L’avantage souligné par les auteurs de l’étude est

qu’il s’agit d’un appareil beaucoup plus pratique à utiliser.

Le principe est le suivant : une sonde appliquée sur la peau délimite une chambre

fermée contenant des capteurs de température et d’humidité relative. Lorsque l’on place la

sonde en contact avec la peau, l’humidité relative dans la chambre va augmenter et permet

48

ainsi la mesure de la Perte Insensible en Eau. Entre chaque mesure, un temps de ventilation

de la chambre est nécessaire afin de rétablir dans la chambre le taux d’humidité relative de

l’air ambiant (NUUTINEN et al. 2003). Le temps de mesure est d’environ 10 secondes. Son

principal avantage par rapport aux autres appareils disponibles sur le marché est qu’il est

portable. De plus, il faut lors de l’utilisation respecter certaines conditions ambiantes :

l’humidité relative doit être comprise entre 10 et 60 %, la température entre 20 et 25 °C

(Site Delfin Technology).

FIGURE 11: SCHEMA D’UNE SONDE D’APPAREIL A CHAMBRE FERMEE D’APRES IMHOF ET AL. 2009

3. Résultats obtenus : corrélation entre Perte Insensible en Eau et fonction

barrière de l’épiderme

De nombreuses études chez l’homme, la souris et le chien montrent une corrélation

entre la Perte Insensible en Eau et la fonction barrière de l’épiderme (FLUHR et al. 2006,

SHIMADA et al. 2008, YOSHIHARA et al. 2007).

L’une des plus importantes menée par Fluhr et al. a comparé ex vivo et in vivo chez

l’homme et la souris, les valeurs de Perte Insensible en Eau obtenues à l’aide de différents

appareils (VapoMeter, H4300 et MEECO) avec celles obtenues par gravimétrie. Il en

résulte une similitude entre ces valeurs. La mesure de la Perte Insensible en Eau permet

donc une évaluation fiable du statut de la fonction barrière de la peau (FLUHR et al. 2006).

49

Chez le chien, la corrélation entre la Perte Insensible en Eau et la fonction barrière de

l’épiderme a été mise en évidence par Shimada et al. en 2008. Le stratum corneum de dix

chiens sains fut altéré par tape-stripping. La diminution de l’épaisseur du stratum corneum

fut mise en évidence par une coloration fluorescente : le colorant fluorescent ne pouvait pas

passer lorsque le stratum corneum était intact tandis qu’il pénétrait dans l’épiderme lorsque

le stratum corneum était altéré. En parallèle, des mesures de Perte Insensible en Eau furent

réalisées avec un appareil à chambre fermée (CC-01). Ils établirent alors la relation entre

l’altération croissante de la barrière cutanée et l’augmentation de la Perte Insensible en Eau.

Chez les bovins, une étude a été menée par Burmeister et al. en 1996. Leur but était

de montrer que la mesure de la Perte Insensible en Eau est une méthode directe,

quantitative et sensible, pour montrer l’effet irritant, sur la peau du trayon, d’un produit

désinfectant de post-trempage (BURMEISTER et al. 1996). La mesure de la Perte Insensible

en Eau permettrait l’évaluation de la santé du trayon.

4. Avantages et inconvénients

Les mesures de Perte Insensible en Eau sont faciles à réaliser surtout avec les nouveaux

appareils type VapoMeter et de nombreuses études ont montré la très bonne corrélation

entre l’augmentation de la Perte Insensible en Eau et l’altération de la fonction barrière de

l’épiderme.

Néamoins, de nombreux facteurs peuvent entraîner des variations dans les résultats des

mesures. Tout d’abord, les conditions d’ambiance : elles doivent être maitrisées car les

valeurs extrêmes et les variations de température et d’humidité ambiante affectent

considérablement la Perte Insensible en Eau (YOSHIHARA et al. 2007). Il convient, donc, de

définir précisément les conditions de mesures afin d’obtenir des résultats fiables et

cohérents.

De plus, il a été démontré que les mesures de Perte Insensible en Eau varient de

manière significative selon le site anatomique (LAU-GILLARD et al. 2010, YOSHIHARA et al.

2007) et en fonction de l’individu (LAU-GILLARD et al. 2010).

50

B. Mesure du pH cutané

1. Définition et origine

Le potentiel hydrogène ou pH est déterminé par la quantité d’ions hydrogène H+ par

rapport aux ions hydroxydes OH-. Cela se traduit mathématiquement par la définition de

Sorensen (1909) : le pH est le négatif du logarithme de la concentration molaire en ions H+

soit :

�� = −�� (��)

Le pH de la surface de la peau est le résultat de l’action combinée des substances

aqueuses du stratum corneum, des diverses substances produites par les glandes cutanées

(sébacées et sudoripares) et du film hydrolipidique de surface (MATOUSEK et al. 2002). Les

molécules contribuant à l’acidité de la peau sont : les produits de dégradation de la

filaggrine, des acides aminés issus de la transpiration, du sébum et du stratum corneum,

ainsi que des lipides acides tels que le sulfate de cholestérol ou des acides gras libres

(MATOUSEK et al. 2002). Ceux-ci ont trois origines : les sécrétions des glandes sébacées, la

dégradation du sébum par les bactéries présentent à la surface de la peau et l’épiderme où

ils sont produits à partir des phospholipides lors de la différentiation des kératinocytes

(MATOUSEK et al. 2002). D’autres molécules sont présentes et contribuent, elles, à

l’alcalinisation de la peau : l’ammoniaque produit par les glandes sudoripares ainsi que du

dioxyde de carbone et du bicarbonate (MATOUSEK et al. 2002). Les facteurs impliqués dans

le maintien du pH cutané sont complexes. C’est la combinaison de facteurs acidifiants et

alcalinisants qui aboutit à ces niveaux de pH cutané.

Chez les bovins, le pH de la surface cutanée varie entre 6,49 et 7,13, selon la

localisation anatomique (MEYER et NEURAND 1991).

51

2. Mesure et méthode

Au début du vingtième siècle, les premières mesures furent réalisées par des

méthodes colorimétriques (EHLERS et al. 2001) mais les résultats obtenus étaient peu précis.

De nouvelles techniques sont, aujourd’hui, à notre disposition, telles que des électrodes en

verres.

Pour mesurer le pH cutané, le Hanna Instrument HI 83141 peut être utilisé. Il mesure

le pH grâce à une sonde électrochimique plate, de 4 cm de longueur, spécialement conçue

pour les mesures de pH cutané. L’électrode de mesure contient une solution tampon,

séparée par une paroi en verre, de la solution à tester. La solution à tester est, dans ce cas, la

peau. L’extrémité de cette sonde, plate, est étudiée pour obtenir un contact étroit avec la

peau.

Comme tout pH-mètre, l’appareil nécessite un calibrage, réalisé une fois par semaine,

à l’aide de deux solutions tampons à pH 4 et pH 7.

Pour réaliser une mesure, la sonde doit être appliquée sur la peau selon un axe

vertical de préférence. Puis, il est nécessaire d’attendre, au minimum une minute, afin que la

valeur se stabilise. Pour cela, il convient de limiter au maximum les mouvements de l’animal.

3. Résultats obtenus

Chez l’homme, le pH de la peau est relativement acide (4,0-4,9) comparé à celui de

nombreuses espèces animales (MATOUSEK et al. 2002).

Plusieurs études ont été menées sur le pH de la peau des bovins. Les valeurs

obtenues varient entre 4,5 et 8,8 (MATOUSEK et al. 2002). Une étude menée sur un

troupeau d’Ayrshire montre que, pour la plupart des individus, le pH cutané est compris

entre 5,0 et 5,5. Cette même étude met aussi en évidence, comme chez l’homme, l’effet de

l’âge sur le pH cutané. En effet, les veaux ont un pH cutané plus élevé (environ 6,10) que les

adultes (5,62) (MATOUSEK et al. 2002). De plus, Meyer et Neurand montrent que la peau des

bovins femelles a un pH moins élevé (6,10-8,00) que la peau des bovins mâles (8,00-8,15)

(MEYERS et NEURAND 1991). Le pH à la surface de la peau varie aussi selon les différentes

régions du corps (SCOTT 1988) : autour de 5,40 au niveau du ventre et autour de 5,75 au

niveau de la croupe (SCOTT 1988). De plus, sa valeur dépend des paramètres ambiants et, en

52

particulier, de la température. En revanche, le pH ne varie pas significativement en fonction

de l’heure de la mesure ou des jours (SCOTT 1988).

Chez les bovins, il y a donc des différences significatives de valeurs de pH cutané,

entre les individus et entre les sites anatomiques, sur un même individu.

Chez l’homme, une étude menée par Ohman et Vahlquist en 1994 porte sur la

variation du pH au sein de l’épiderme. Une altération de la barrière cutanée est réalisée par

tape-stripping. Cela permet une délamination progressive du stratum corneum. Les mesures

de pH, réalisées régulièrement, donnent sur peau saine un pH d’environ 4,5 qui augmente,

parallèlement au nombre d’applications de cellophane adhésive, jusqu’à atteindre un

maximum de 6,9 lorsque tout le stratum corneum a été retiré. Le suivi de la variation du pH

cutané permettrait donc d’évaluer l’altération de la barrière cutanée.

Il a été prouvé qu’en règle générale, le pH de la peau augmente avec le nombre

d’applications de cellophane adhésive (MATOUSEK et al. 2002). De plus, les plus grandes

variations de pH sont observées à la jonction entre le stratum corneum et le stratum

granulosum (MATOUSEK et al. 2002). En effet, chez la souris, aucun changement de pH n’est

observé les quinze premières applications de cellophane adhésive, mais, pour les cinq

suivantes, le pH augmente de 5,9 à 7,0. Ce gradient joue un rôle essentiel dans le processus

de kératinisation en régulant les enzymes à l’activité pH-dépendante (MATOUSEK et al.

2002).

III. Altérations expérimentales de la barrière cutanée : les différentes méthodes

A. L’application de cellophane adhésive ou tape-stripping

Wolf décrit, pour la première fois, en 1940 la méthode par application de cellophane

adhésive ou tape-stripping. A l’époque, il montre qu’une application de cellophane adhésive

sur la peau décolle une couche de cellules cornées et que celle-ci peut être ensuite visualisée

au microscope après application sur une lame de verre (PINKUS 1951). Quelques années plus

tard, Pinkus reprend cette méthode et montre que des applications successives de

cellophane adhésive permettent d’enlever la totalité du stratum corneum. Il estime, de cette

manière, le nombre de couches de cellules cornées du stratum corneum sain entre 15 et 20

chez l’homme. Cette étude lui permet aussi d’observer la réparation de l’épiderme à l’aide

53

de biopsies (PINKUS 1951). La méthode du tape-stripping est désormais standardisée et son

utilisation est devenue commune dans le domaine de la recherche dermatologique.

L’application de cellophane adhésive est une méthode simple et efficace pour induire

une altération de la barrière cutanée (BRETERNITZ et al. 2006). Cette méthode consiste à

appliquer de façon répétée un morceau de ruban adhésif sur la peau, à le presser, puis à le

retirer. La couche la plus superficielle du stratum corneum, adhérant au ruban adhésif, est

arrachée ce qui entraîne une diminution de l’épaisseur du stratum corneum.

Malgré la simplicité de cette méthode, elle nécessite d’être standardisée. Il faut ainsi

définir :

• Un site anatomique : l’altération de la barrière cutanée, évaluée par des mesures

de la Perte Insensible en Eau après un nombre identique d’applications de

cellophane adhésive, présente des différences significatives selon le site

anatomique choisi (LOFFLER et al. 2004). Les résultats obtenus sur deux régions

anatomiques distinctes ne peuvent être comparés. La surface choisie doit être

propre, lisse et dépourvue de poil (LADEMANN et al. 2008). Pour cela, une tonte

douce est réalisée au préalable.

• Le type de ruban adhésif utilisé : de nombreuses cellophanes adhésives sont

disponibles variant par leur taille et la composition de leur colle. Les cellophanes

adhésives utilisées vont du disque adhésif purement destiné aux techniques

d’application de cellophane adhésive (D-squame) au simple Scotch Cristal.

L’essentiel étant d’utiliser un ruban adhésif dont la colle est répartie de manière

homogène et est compatible avec la peau (LADERMANN et al. 2008).

• La pression appliquée sur le ruban adhésif : celle-ci doit être uniforme et

constante. Pour cela, divers instruments sont utilisés, selon les études, comme

une spatule, une roulette ou encore un poids (LADERMANN et al. 2008, LOFFLER

et al. 2004). La pression peut être, aussi, simplement réalisée à l’aide du pouce.

Il existe, en effet, des différences significatives d’altération de la barrière

cutanée (évaluée par des mesures de la Perte Insensible en Eau) selon la

pression exercée sur le ruban adhésif (LOFFLER et al. 2004).

54

• La vitesse de retrait du ruban adhésif : elle doit être constante. Une vitesse de

retrait assez lente est conseillée : cela permettrait d’arracher une plus grande

quantité de stratum corneum (LADERMANN et al. 2008).

D’autres paramètres tels que le sujet, son âge ou, encore, la saison sont responsables de

variations de la quantité de stratum corneum retirée par une application de cellophane

adhésive. Ceux-ci ne sont malheureusement pas maîtrisables.

B. Dissolution des lipides à l’acétone

Il s’agit de la deuxième méthode, non mécanique, permettant d’induire une altération

de la barrière cutanée. L’acétone est appliquée par badigeonnage de la peau, à l’aide d’un

coton-tige, pendant plusieurs minutes. L’application d’acétone entrainerait une dissolution

des lipides intercornéocytaires et, par conséquent, une diminution de la barrière

imperméable. Cette méthode est néanmoins discutée : une étude compare l’altération de la

barrière cutanée obtenue par tape-stripping avec celle obtenue par dissolution des lipides à

l’acétone (RISSMANN et al. 2009). Des cotons-tiges imbibés d’acétone sont roulés sur le

flanc d’une souris nue pendant environ 11 minutes. La Perte Insensible en Eau est mesurée à

environ 60 g.m-2

.h-1

. Sur l’autre flanc, des applications de cellophane adhésive sont réalisées

au ruban adhésif afin d’obtenir la même valeur de Perte Insensible en Eau. Aucune

différence significative n’est observée : la quantité de stratum corneum retiré semble

identique. De plus, l’analyse de la composition lipidique des surfaces traitées par l’acétone

et des surfaces délaminées par applications de cellophane adhésive ne révèle pas non plus

de différence significative : les proportions des lipides composant la barrière cutanée

(cholestérol, acides gras libres et céramides) sont les mêmes. Rissmann et al. concluent que

le badigeonnage à l’acétone des lipides aboutit, certes, à une altération de la barrière

cutanée, mais que cette altération est due à un retrait de cornéocytes par frottement du

coton-tige et non à une dissolution des lipides intercornéocytaires comme d’autres études

l’affirmaient.

55

Partie 2 : Etude expérimentale

57

I. Objectifs

L’objectif principal de cette étude est d’obtenir des données sur la barrière de l’épiderme

des bovins. En effet, peu de données sont disponibles dans la littérature.

Ensuite, cette étude a pour but d’étudier les modalités d’altération et de réparation de la

barrière cutanée chez les bovins. Pour cela, l’altération de la barrière cutanée sera réalisée

mécaniquement par la technique de tape-stripping et chimiquement par la technique de

badigeonnage à l’acétone. L’altération de la barrière cutanée sera évaluée par examen

histopathologique de biopsies cutanées, par la mesure de la Perte Insensible en Eau et par le

suivi du pH cutané. Ensuite, la réponse de la peau à la rupture de la barrière cutanée et la

restauration de cette dernière seront étudiées de la même manière.

II. Matériels et méthodes

A. Protocole 1, étude préliminaire sur bovins morts : étude du nombre d’applications

de cellophane adhésive nécessaire à l’élimination totale du stratum corneum

L’absence de données sur la barrière cutanée des bovins nous a amené à effectuer une

étude préliminaire sur peau de bovin fraîchement euthanasié (pour des raisons médicales

mais sans lésion cutanée), dans le but de déterminer le nombre d’applications de cellophane

adhésive nécessaire à l’élimination totale du stratum corneum.

1. Sujet

Le sujet est un bovin charolais de trois ans euthanasié, le jour même, pour des

raisons médicales. Aucune anomalie au niveau cutané n’est relevée lors de l’autopsie. Des

lambeaux de peaux d’environ 15x15 cm sont découpés sur différentes parties du corps :

front, partie interne proximale du membre antérieur gauche, lombes, abdomen, mamelle et

mufle.

58

2. Méthodologie

a. Principe

On utilise la méthode du tape-stripping. Pour cela, on réalise des applications

successives de morceaux de cellophane adhésive, de taille identique, sur un même site des

différents lambeaux de peau prélevés.

b. Préparation préalable des zones

Un brossage est réalisé dans le but d’éliminer toutes les poussières puis une tonte

douce des différents lambeaux de peau est effectuée et est complétée par un rasage délicat,

afin de ne pas léser la peau. On matérialise ensuite au feutre, sur chaque lambeau de peau,

huit sites de 2x2 cm.

c. Le ruban adhésif

La même marque de cellophane adhésive est utilisée pour toutes les manipulations, il

s’agit de Scotch cristal. Une application de cellophane adhésive correspond à l’application

de Scotch cristal pendant 10 secondes à l’aide du pouce, avec une pression constante sur

toute la surface du morceau de cellophane adhésive. La cellophane adhésive est ensuite

retirée lentement, en environ deux secondes, de façon unidirectionnelle.

d. Manipulateur

Afin de diminuer la variabilité, un seul manipulateur réalise les applications successives de

cellophane adhésive.

e. Réalisation

Sur chaque lambeau de peau sont réalisées les manipulations suivantes :

59

Site 1 :

biopsie témoin

Site 2 :

10 applications de

cellophane adhésive +

biopsie

Site 3 :

20 applications de


biopsie

Site 4 :

30 applications de


biopsie

Site 5 :

40 applications de


biopsie

Site 6 :

50 applications de


biopsie

TABLEAU 1: DETAILS DES MANIPULATIONS REALISEES SUR CHAQUE SITE POUR LE PROTOCOLE 1

FIGURE 12: PHOTOGRAPHIE DE PEAU APRES REALISATION DE LA BIOPSIE DU SITE TEMOIN

f. Mise en place du suivi histopathologique

Des biopsies cutanées sont effectuées à l’aide d’un trépan à biopsie, de 6 mm de

diamètre, après la réalisation du nombre d’applications de cellophane adhésive défini pour

chaque site. Celles-ci sont conservées dans une solution de formol à 10 % avant d’être

incluses en paraffine. Chaque biopsie est ensuite sectionnée à 5 µm et colorée à l’Hémalun-

Eosine.

60

B. Protocole 2, étude préliminaire sur bovins morts : la rupture de la barrière cutanée

par application d’acétone est-elle due à une dissolution des lipides ou à un effet

mécanique « strips » ?

1. Sujet

Le même bovin utilisé dans l’étude précédente. Un seul lambeau de peau est prélevé

au niveau des lombes.

2. Méthodologie

a. Principe

On cherche à réaliser une rupture de la barrière cutanée par badigeonnage à l’aide

d’un écouvillon imbibé d’acétone. Un témoin est réalisé par badigeonnage à l’aide d’un

écouvillon imbibé de PBS (Phosphate Buffered Saline), solution tampon phosphate salin.

b. Préparation préalable des zones

Un brossage du lambeau de peau est réalisé dans le but d’éliminer toutes les

poussières puis une tonte douce et, est complétée par un rasage délicat, afin de ne pas léser

la peau. On matérialise ensuite deux sites au feutre d’environ 2x2 cm.

c. Manipulateur

Afin de diminuer la variabilité, un seul manipulateur réalise les badigeonnages.

d. Réalisation

Sur chaque site, on roule un écouvillon imbibé d’acétone ou de PBS doucement à pression

constante, sans frotter, pendant 5 minutes.

61

Site 1 :

Badigeonnage acétone 5 minutes + biopsie

Site 2 :

Badigeonnage PBS 5 minutes +

Biopsie

TABLEAU 2: DETAILS DES MANIPULATIONS REALISEES POUR LE PROTOCOLE 2

e. Mise en place du suivi histopathologique

Des biopsies cutanées sont réalisées à l’aide d’un trépan à biopsie, de 6 mm de

diamètre, après le badigeonnage, de l’acétone ou du PBS. Une moitié de la biopsie est

conservée une solution de formol à 10 % puis incluse en paraffine afin de réaliser une

coloration Hémalun-Eosine. L’autre moitié est congelée (inclusion dans l’OCT et congélation

par immersion dans l’isopentane refroidi dans l’azote liquide) pour pouvoir pratiquer une

coloration « oil red O » dans le but de mettre en évidence les lipides cutanés.

C. Protocole 3 : étude de la rupture et de la réparation cutanée par tape stripping

1. Sujets

Les sujets sont trois vaches du troupeau pédagogique de VetagroSup – Campus

vétérinaire de Lyon. Toutes les procédures utilisées lors de cette étude ont été approuvées

par le comité d’éthique de VetagroSup – Campus vétérinaire de Lyon. Ces trois vaches ne

présentent aucune anomalie cutanée et n’ont pas reçu de traitement dans les trois mois

précédant l’étude.

Les manipulations sont réalisées en couloir de contention, chaque vache étant prise

au cornadis.

Une vache est exclue des manipulations suite à la découverte d’un hématome

volumineux au niveau de l’encolure.

62

FIGURE 13: CONTENTION DES SUJETS

2. Méthodologie

a. Préparations préalables

La veille des manipulations, les vaches sont brossées afin d’éliminer le maximum de

poussière puis elles sont tondues et rasées au niveau de deux régions : en arrière de l’épaule

et plus bas en arrière du coude sur une surface d’environ 15x15 cm. Le rasage doit être

délicat afin de ne pas créer de lésion. On matérialise ensuite au feutre 9 sites d’environ 2x2

cm par région.

63

FIGURE 14: SUJET APRES TONTE ET RASAGE, MATERIALISATION DES SITES AU FEUTRE

b. Réalisation de la rupture de la barrière cutanée

Pour chacun des sites, on réalise le nombre d’applications de cellophane adhésive

établi par le tableau suivant :

Site 1 :

Témoin

Site 2 :

40 applications de


biopsie immédiate

Site 3 :

80 applications de


biopsie immédiate

Site 4 :

80 applications de


biopsie à 1 heure

Site 5 :

80 applications de


biopsie à 6 heures

Site 6 :

80 applications de


biopsie à 18 heures

Site 7 :

80 applications de



Site 8 :

80 applications de



Site 9 :

80 applications de




64

c. Mise en place du suivi histopathologique

Des biopsies cutanées sont effectuées à l’aide d’un trépan à biopsie, de 6 mm de

diamètre, après la réalisation du nombre d’applications de cellophane adhésive défini pour

chaque site, sous anesthésie locale (1 mL de lidocaïne injecté en sous-cutané, 10 minutes

avant la réalisation de la biopsie cutanée). Celles-ci sont conservées dans une solution de

formol à 10 % avant d’être incluses en paraffine afin de réaliser une coloration Hémalun-

Eosine.

d. Mise en place du suivi de la Perte Insensible en Eau

La perte d’eau transépidermique est mesurée pour chaque site toutes les 10

applications de cellophane adhésive à l’aide d’un évaporimètre à chambre fermée

(Vapometer, Delfin Technologie Ltd, Kuopio, Finland) en attendant deux minutes après la

fin de la dernière application de cellophane adhésive pour permettre la stabilisation du flux

d’eau transépidermique. Puis ces mesures sont renouvelées avant la réalisation de chaque

biopsie cutanée aux heures correspondantes pour chaque site.

A chaque fois, une série de trois mesures est réalisée successivement et leur moyenne

est relevée manuellement dans un tableau Excel. De plus, nous notons l’hygrométrie et la

température indiquées par l’appareil lors de chaque mesure.

FIGURE 15: PRISE DE MESURE DE PERTE INSENSIBLE EN EAU A L'AIDE DU VAPOMETER

65

D. Protocole 4 : rupture de la barrière cutanée par dissolution des lipides du stratum

corneum

1. Sujet

Le sujet est une vache du troupeau pédagogique de VetagroSup – Campus vétérinaire

de Lyon. Cette vache ne présente aucune anomalie cutanée et n’a pas reçu de traitement

dans les trois mois précédant l’étude. Les manipulations sont réalisées en couloir de

contention, la vache étant prise au cornadis.

2. Méthodologie

a. Préparations préalables

La veille des manipulations, la vache est brossée afin d’éliminer le maximum de

poussière puis tondue et rasée, en arrière de l’épaule sur une surface d’environ 15x15 cm.

Le rasage doit être délicat afin de ne pas créer de lésions. On matérialise ensuite au feutre

15 sites d’environ 2x2 cm par région.

b. Réalisation

Pour chaque site, on réalise un badigeonnage à l’écouvillon, de 5 minutes, soit au PBS

soit à l’acétone. La mesure de la Perte Insensible en Eau est réalisée après chaque

badigeonnage, en attendant deux minutes pour permettre la stabilisation du flux d’eau

transépidermique. Puis, ces mesures sont renouvelées avant la réalisation des biopsies

cutanées à différentes heures, définies par le tableau suivant :

66

Site 1 :

Témoin

Site 2 :

PBS + biopsie

immédiate

Site 3 :

Acétone + biopsie

immédiate

Site 4 :

PBS + biopsie à 1

heure

Site 5 :

Acétone + biopsie à

1 heure

Site 6 :

PBS + Biopsie à

6 heures

Site 7 :


6 heures

Site 8 :

PBS + biopsie à

18 heures

Site 9 :


18 heures

Site 10 :

PBS + biopsie à

24 heures

Site 11 :


24 heures

Site 12 :

PBS + biopsie à

48 heures

Site 13 :


48 heures

Site 14 :

PSB + biopsie à

72 heures

Site 15 :


72 heures


c. Mise en place du suivi histopathologique

Des biopsies cutanées sont réalisées à l’aide d’un trépan à biopsie de 6 mm de

diamètre, aux heures définies, sous anesthésie locale (1 mL de Xilocaïne injecté en sous-

cutané, 10 minutes avant la réalisation de la biopsie cutanée). Une moitié de chaque biopsie

est conservée dans une solution de formol 10 % avant d’être incluse en paraffine afin de

réaliser une coloration Hémalun-Eosine. L’autre moitié est congelée (inclusion dans l’OCT et

congélation par immersion dans l’isopentane refroidi dans l’azote liquide) afin de pratiquer

une coloration « oil red O ».


La perte d’eau transépidermique est mesurée pour chaque site toutes les 10




67


biopsie cutanée aux heures correspondantes pour chaque site.

A chaque fois, une série de trois mesures est réalisée successivement et leur

moyenne est relevée manuellement dans un tableau Excel. De plus, nous notons

l’hygrométrie et la température indiquées par l’appareil lors de chaque mesure.

E. Protocole 5, étude de la rupture et de la réparation cutanée par tape-stripping :

révision du protocole

1. Sujet

Le sujet est une vache du troupeau pédagogique de VetagroSup – Campus vétérinaire

de Lyon. Cette vache ne présente aucune anomalie cutanée et n’a pas reçu de traitement

dans les trois mois précédant l’étude. Les manipulations sont réalisées dans un box des

hôpitaux de Pathologie du bétail, la vache étant prise au cornadis.

2. Méthodologie

La veille des manipulations, la vache est brossée afin d’éliminer le maximum de

poussière puis tondue et rasée, en arrière de l’épaule sur une surface d’environ 15x15 cm.

Le rasage doit être délicat afin de ne pas créer de lésions. On matérialise ensuite au feutre

12 sites d’environ 2x2 cm par région.

a. Réalisation

Pour chacun des sites, on réalise le nombre d’applications de cellophane adhésive

établi par le tableau suivant :

68

Site 1 :

témoin

Site 2 :

40 applications de

cellophane adhésive

+ biopsie immédiate

Site 3 :

70 applications de


+ biopsie immédiate

Site 4 :

70 applications de


+ biopsie à 1 heure

Site 5 :

70 applications de


+ biopsie à 4 heures

Site 6 :

70 applications de



Site 7 :

70 applications de



Site 8 :

70 applications de



Site 9 :

70 applications de



Site 10 :

70 applications de



Site 11 :

70 applications de



Site 12 :

70 applications de




b. Observations cliniques

Sur chaque site, des observations macroscopiques sont réalisées. Nous évaluons la

couleur de la peau, l’apparition d’éventuelles croûtes, la présence d’une exsudation, d’une

desquamation ou d’une inflammation. Cet examen est pratiqué avant l’application des

cellophanes adhésives puis avant la réalisation des biopsies aux heures correspondantes

pour chaque site.

c. Mise en place du suivi histopathologique et immunohistochimie

Des biopsies cutanées sont réalisées, sous anesthésie locale (1 mL de lidocaïne

injecté en sous-cutané, 10 minutes avant la réalisation de la biopsie cutanée) à l’aide d’un

trépan à biopsie, de 6 mm de diamètre, après la réalisation du nombre d’applications de

cellophane adhésive défini pour chaque site. Celles-ci sont fixées dans une solution de

formol à 10% avant d’être incluses en paraffine afin de réaliser, une coloration Hémalun-

Eosine, une coloration de Luna et un marquage Ki67, CD3 et BLA 36. Les différentes

techniques de coloration sont présentées en annexe 7.

69

Les observations histologiques sont réalisés et ciblent les points suivants: l’épaisseur

du stratum corneum, de la présence de bourgeonnement épidermique ou non, des

changements dans les différentes couches de l’épiderme, l’inflammation du derme et enfin

la composition et la quantification de l’infiltrat cellulaire du derme. Les polynucléaires

éosinophiles sont visualisés et comptés en utilisant la coloration de Luna, qui colore les

granules des éosinophiles en rouge. On procède à un comptage des cellules marquées dans

le derme, sur trois champs différents, au grossissement 400.

Le marquage Ki67 est réalisé avec un anticorps anti-Ki67 qui se fixe sur toutes les cellules

engagées dans le cycle cellulaire (l’antigène Ki67 est présent sur une protéine nucléaire des

cellules prolifératives). Le marquage nous permet de calculer l’index Ki67, exprimé en

pourcentage, reflétant l’intensité des multiplications cellulaires. L’index Ki67 est calculé

grâce au dénombrement des cellules marquées parmi cent cellules basales, présentes sur

trois champs pris au hasard au fort grossissement (x 400).

Le marquage CD3 est réalisé avec un anticorps anti-CD3 marquant les lymphocytes T. On

procède à un comptage des cellules marquées dans le derme, sur trois champs différents, au

grossissement 400.

Le marquage BLA 36 est réalisé avec un anticorps anti-BLA 36 marquant les cellules

dendritiques (l’antigène BLA 36 est présent au niveau de la membrane plasmique). On

procède à un comptage des cellules marquées dans l’épiderme, sur trois champs différents,

au grossissement 400.

Afin de compléter notre étude, deux biopsies sur peau saine sans rasage (tonte seule)

sont réalisées. Nous procédons aux mêmes colorations et immunomarquages que

précédemment.


La perte d’eau transépidermique est mesurée, pour chaque site, toutes les 10




70


biopsie cutanée.

A chaque fois, une série de trois mesures est réalisée successivement et leur

moyenne est relevée manuellement dans un tableau Excel. De plus, nous notons

l’hygrométrie et la température indiquées par l’appareil lors de chaque mesure.

Afin d’avoir un suivi sur une semaine, sur le site témoin, des mesures de Perte

Insensible en Eau sont réalisées deux fois par jour : le matin à 8 heures et en début d’après-

midi entre 13 et 14 heures. Nous prenons soin pour chaque mesure de relever l’hygrométrie

et la température indiquées par l’appareil.

e. Mise en place du suivi du pH cutané

Dans cette étude, des mesures du pH cutané sont aussi réalisées toutes les 10

applications de cellophane adhésive et avant chaque biopsie à l’aide d’un pH-mètre portatif

dédié aux mesures du pH cutané grâce à une électrode de pH de surface à extrémité plate

(Société HANNA instruments).

Afin d’avoir un suivi sur une semaine sur le site témoin, des mesures de pH cutané

sont réalisées deux fois par jour : le matin à 8 heures et en début d’après-midi entre 13 et 14

heures.

FIGURE 16: MESURE DU PH CUTANE

71

f. Analyse statistique : matériels et méthodes

Dans notre étude, nous cherchons à mesurer l’effet de la perte de l’épiderme puis de

sa régénération sur la Perte Insensible en Eau. Idéalement, de telles mesures doivent se faire

à hygrométrie constante, car l’hygrométrie a un impact sur la Perte Insensible en Eau

(GABARD 2000). Du fait des contraintes liées au modèle bovin, les mesures furent réalisées

sous différentes valeurs d’hygrométrie. En effet, il est impossible sur de telles espèces de

réaliser les manipulations dans des enceintes où la température et l’hygrométrie sont

constantes. Afin de prendre en compte l’effet combiné des applications de cellophane

adhésive, du temps de régénération de l’épiderme et de l’hygrométrie, nous avons utilisé un

modèle linéaire généralisé, qui permet d’avoir une approche multifactorielle.

Les modèles linéaires généralisés sont une généralisation de la régression linéaire

classiquement utilisée en statistiques (NELDER et al. 1972). Les modèles linéaires généralisés

permettent de relier une variable réponse (dans notre cas la Perte Insensible en Eau) à une

combinaison linéaire de variables explicatives (dans notre cas le nombre d’applications de

cellophane adhésive, le temps de régénération et l’hygrométrie) à travers une fonction lien.

Cette fonction lien varie (identité, inverse, log) en fonction du type de distribution de la

variable réponse (normale, binomiale, poisson). Dans notre cas, la distribution de nos

mesures de Perte Insensible en Eau étant quasi-normale, nous utiliserons la fonction lien

identité. La relation modélisée sera ainsi de la forme :

Perte Insensible en Eau (PIE) = α + β1 . Hygrométrie + β2 . Nb Applications de cellophane

adhésive + β3 . Tps Régénération

Avec α étant une constante correspondant à la valeur estimée de la Perte Insensible

en Eau pour des valeurs nulles de toutes les variables explicatives, et β 1 β 2 β 3 les coefficients

relatifs aux effets des trois variables explicatives

Les paramètres du modèle sont estimés par un algorithme utilisant la méthode du

maximum de vraisemblance implémenté dans les fonctions de base du logiciel R (fonction

glm) (R Development Core Team 2008).

72

La variable réponse de notre modèle est la Perte Insensible en Eau et les trois

variables explicatives intégrées dans le modèle sont le nombre d’applications de cellophane

adhésive, le temps de régénération et l’hygrométrie. Le temps de régénération correspond

au temps après la dernière application de cellophane adhésive attendu pour réaliser la

mesure de Perte Insensible en Eau. Pour le modèle présenté ici, nous avons considéré que

les différents sites étaient équivalents. Nous noterons qu’un modèle mixte linéaire

généralisé, permettant de prendre en compte l’effet aléatoire lié au site a également été

réalisé. Les résultats étant très proches du modèle linéaire généralisé présenté ici, notre

hypothèse sur les différents sites est confirmée et nous ne le présenterons pas par souci de

simplification.

III. Résultats

A. Observations cliniques

L’application de cellophane adhésive répétée conduit, dans les protocoles 3 et 5, à

l’apparition d’un érythème léger. Mais l’apparition de cet érythème n’est pas constante

selon les sites. De plus, il disparaît en 24 heures au maximum.

Nous observons aussi, immédiatement après l’application successive de 70 morceaux

cellophane adhésive, que la peau semble « lissée » et « brillante ».

Sur certains sites, nous notons, en plus, la présence d’un léger exsudat, qui disparaît en

quelques heures.

Enfin, rarement, le lendemain des applications de cellophane adhésive, nous observons

la présence de petites excoriations, se transformant ensuite en petites croûtes.

73

B. Suivi histopathologique et immunohistochimie

L’étude détaillée des biopsies est présentée dans les tableaux de l’annexe 2.

1. Protocole 1

Seule une coloration standard Hémalun-Eosine a été réalisée.

a. Prélèvements réalisés sur le front, la partie interne proximale du

membre antérieur gauche, les lombes, l’abdomen et la mamelle

L’épiderme de bovins sur ces prélèvements, compte en moyenne de 3 à 5 couches

cellulaires.

Sur les prélèvements des sites témoins, avant rasage, la couche cornée est présente

avec sa partie aérée (stratum disjonctum) et sa partie compacte (stratum compactum). La

partie aérée peut être comptée en « feuillets » : entre 2 et 12 selon la zone anatomique.

Enfin, au fil des applications de cellophane adhésive, nous observons une diminution

du nombre de feuillets de la couche aérée, ainsi qu’un décollement de la couche compacte.

A partir de 30 applications de cellophane adhésive, nous observons, sur certains

prélèvements, la disparition complète de la couche cornée.

b. Prélèvements réalisés sur le mufle

L’épiderme au niveau du mufle compte entre 70 et 80 couches cellulaires. Sur le

prélèvement du site témoin du mufle, la couche cornée est épaisse, et est composée

exclusivement de sa partie compacte. Nous dénombrons environ 50 couches de cornéocytes

(Figure 17).

Au fil des applications de cellophane adhésive, nous observons une diminution

marquée du nombre de couches de cornéocytes. Au bout de 30 applications de cellophane

adhésive, nous ne comptabilisons plus qu’une trentaine de couches de cornéocytes. Enfin,

au bout de 50 applications de cellophane adhésive, il ne reste qu’une quinzaine de couches

(Figure 17).

74

FIGURE 17: COUPE HISTOLOGIQUE DE MUFLE DE BOVIN APRES 50 APPLICATIONS DE CELLOPHANE ADHESIVE

(A GAUCHE) ET DE BOVIN SAIN (A DROITE) (COLORATION HE) X50

La figure 18 met clairement en évidence, la décroissance du nombre de couches de

cornéocytes en fonction du nombre d’applications de cellophane adhésive.

FIGURE 18: EVOLUTION DU NOMBRE DE COUCHES DE CORNEOCYTES EN FONCTION DU NOMBRE

D'APPLICATIONS DE CELLOPHANE ADHESIVE SUR LE MUFLE

0

10

20

30

40

50

60

Témoin 30S 40S 50S

Nb

de

co

uch

es

de

corn

éo

cyte

s

Sites

75

2. Protocole 2

Pour des raisons techniques, les deux biopsies réalisées n’ont pu être analysées.

3. Protocole 3

Ce protocole n’a pu être réalisé entièrement et a dû être adapté en cours d’étude. En

effet, le temps prévu pour chaque manipulation avait été sous-estimé et les manipulations

n’ont pu être réalisées sur toutes les vaches. De plus, certains sites ont dû être exclus de

l’étude car les vaches les avaient léchés.

L’annexe 2 présente les résultats détaillés des observations histopathologiques

réalisées sur les biopsies obtenues.

Premièrement, aucune atteinte des follicules pileux et des glandes sudoripares n’est

notée.

Sur les deux lames témoins, dos et ventre des vaches numéro 1818 et 1652, nous ne

notons pas de différences majeures au niveau microscopique. La couche cornée est présente

et est composée d’une partie compacte et d’une partie aérée comptant environ quatre

feuillets. Néanmoins, elle est relativement peu épaisse. Concernant l’évaluation de l’œdème,

de la congestion et de l’état inflammatoire, nous évaluons ceux-ci sur une échelle de 0 à 2.

Le zéro correspond aux observations faites sur les lames témoins.

Six heures après la réalisation des quatre-vingts applications de cellophane adhésive,

nous observons pour les deux vaches, l’apparition d’un œdème et d’une congestion au

niveau du derme. De plus, un infiltrat inflammatoire est présent en région périvasculaire.

Pour la vache 1652, nous observons certaines zones où la couche cornée est toujours

présente. Pour la vache 1818, une fine couche cornée compacte est présente sur quasiment

l’ensemble de la lame. De plus, nous observons dans celle-ci de la parakératose.

Dix-huit heures après la réalisation des quatre-vingts applications de cellophane

adhésive, nous observons une augmentation de l’œdème, de la congestion et de l’infiltrat

inflammatoire pour la vache 1652, que ce dernier reste de niveau un pour la vache 1818. De

plus, nous observons de la nécrose de coagulation sur quasiment tout l’épiderme de la vache

76

1652 et l’absence totale de couche cornée. Pour la vache 1818, on note un épaississement

de la couche cornée compacte toujours associé au phénomène de parakératose.

Vingt-quatre heures après la réalisation des quatre-vingts applications de cellophane

adhésive, nous observons toujours pour la vache 1652 des zones de nécrose de coagulation.

L’état inflammatoire du derme est toujours de niveau deux. Pour la vache 1818, on note

l’apparition des petits foyers de nécrose de coagulation et de spongiose au niveau de

l’épiderme. L’état inflammatoire atteint un niveau deux, avec la présence d’un infiltrat en

région périvasculaire à diffus.

Quarante-huit heures après la réalisation des quatre-vingts applications de

cellophane adhésive, nous relevons une nette diminution de l’état inflammatoire pour les

deux vaches. La couche cornée compacte réapparaît toujours associée à de la parakératose.

De petites croûtes sont visibles au-dessus de celle-ci, dans certaines zones.

Enfin, soixante-douze heures après la réalisation des quatre-vingts applications de

cellophane adhésive, l’épiderme est quasiment identique à celui observé sur les témoins.

L’inflammation est toujours présente mais très faiblement. Nous observons la réapparition

de la couche cornée aérée.

En conclusion, nous observons bien une diminution, ou une disparition, de la couche

cornée suite aux applications de cellophane adhésive. Cette diminution de la couche cornée

est accompagnée d’une augmentation de l’état inflammatoire dans le derme. Elle est suivie

par une réapparition de la couche cornée, de manière très rapide, ce qui explique le

phénomène de parakératose. En revanche, sur certaines zones, les applications de

cellophane adhésive ont induit des lésions de nécrose.

Protocole 4 4.

L’annexe 4 présente les résultats détaillés des observations histopathologiques. Les

colorations Red OIl n’ont pu être réalisées pour des raisons techniques.


notée.

77

Nous observons, tout d’abord, sur la lame témoin, un épiderme composé d’environ

quatre couches cellulaires. La couche cornée est fine et est composée de sa partie compacte

et aérée (environ deux feuillets).

Suite au badigeonnage de PBS ou d’acétone, pendant cinq minutes, on observe la

disparition sur certaines zones de la couche cornée dans sa totalité ou partiellement. Aucun

autre changement par rapport à la lame témoin n’est noté.

Six heures après le badigeonnage, nous observons, dans le cas du PBS, des foyers de

nécrose de coagulation de l’épiderme. La couche cornée est présente par intermittence et

on remarque la présence de parakératose. On note également l’apparition, au niveau du

derme, d’œdème et de congestion. Un léger infiltrat inflammatoire est présent en région

périvasculaire. Dans le cas de l’acétone, une fine couche cornée compacte est présente. Le

nombre de couches cellulaires de l’épiderme augmente entre cinq et sept. En revanche,

aucun état inflammatoire n’est noté.

Dix-huit heures et vingt-quatre heures après le badigeonnage, dans les deux cas PBS

et acétone, la couche cornée compacte est présente et fine, associée au phénomène de

parakératose. L’inflammation est visible, dans les deux cas, et semble augmenter à dix-huit

heures pour le cas du PBS.

Quarante-huit heures après le badigeonnage, nous notons une augmentation de

l’épaisseur de la couche cornée compacte (visuellement) dans les deux cas PBS et acétone.

Dans le cas de l’acétone, nous observons aussi de la couche cornée aérée dans certaines

régions. L’inflammation semble diminuée.

Enfin, soixante-douze heures après le badigeonnage, la peau présente un aspect

proche de celle observée sur le témoin, à la seule différence du nombre plus élevé de

couches cellulaires dans l’épiderme.

78

Protocole 5 5.

a. Suivi histopathologique

L’étude détaillée des biopsies est présentée dans les tableaux de l’annexe 2.


notée.

Nous comparons, tout d’abord, les lames obtenues sur peau saine sans rasage et sur

peau saine après rasage (le rasage a été réalisé vingt-quatre heures avant le début des

manipulations). Sur les lames réalisées avant le rasage, l’épiderme comporte entre 3 et 4

assises cellulaires. La couche cornée est composée d’environ six couches compactes et de

quelques feuillets aérés. La lame basale est lisse et ses cellules sont cuboïdales. Après rasage

(vingt-quatre heure après), nous notons six couches cellulaires dans l’épiderme. La couche

cornée est présente mais seulement dans sa partie compacte, d’une épaisseur d’une

douzaine de couches. Dans le derme, nous observons la présence d’un œdème léger (de

niveau un) et d’une congestion de niveau un.

Une heure après les applications de cellophane adhésive, la couche cornée n’est plus

présente sur l’ensemble de la lame. Le derme superficiel présente un léger œdème et une

congestion. Un infiltrat inflammatoire faible est présent en région périvasculaire.

Quatre heures après les applications de cellophane adhésive, nous observons, dans la

couche cornée compacte, des zones de parakératose, associées à une diminution de

l’épaisseur de la couche granuleuse (visuellement). L’état inflammatoire du derme

augmente et l’infiltrat inflammatoire s’étend dans l’ensemble du derme superficiel. De plus,

nous notons la présence de foyer de nécrose de coagulation et de spongiose dans

l’épiderme. La lame basale apparaît irrégulière.

Douze heures après les applications de cellophane adhésive, la couche cornée présente

des foyers de parakératose mais l’épaisseur de la couche compacte semble augmenter.

L’inflammation du derme diminue nettement. Néanmoins, des foyers de spongiose sont

présents dans l’épiderme.

A soixante-douze heures, la peau semble s’être stabilisée. On observe une réapparition

de la couche cornée aérée associée à une légère augmentation de l’épaisseur de la couche

cornée compacte. L’inflammation est toujours visible mais diminue. Enfin, à quarante-huit et

79

soixante-douze heures, le nombre de couches cellulaires de l’épiderme augmente et nous

observons de foyers de bourgeonnement épidermique.

b. Etude de la prolifération cellulaire

L’index Ki67 est calculé grâce au dénombrement des cellules marquées parmi cent

cellules basales, sur trois champs pris au hasard au fort grossissement (x 400).

L’index Ki 67 est mesuré à 32 et 34 % pour les deux sites témoins, correspondant à de

la peau saine. On observe, ensuite, une augmentation progressive de l’index Ki 67, pour

aboutir, 72 heures après les 70 applications de cellophane adhésive, à une valeur de 89 %. A

72 heures, la majorité des cellules basales et suprabasales est engagée dans le cycle

cellulaire.

La figure 19 présente l’évolution au cours du temps de l’index Ki 67.

FIGURE 19: EVOLUTION DU KI 67 AU COURS DU TEMPS

La figure 20 présente une coupe transversale de peau de bovin saine après

immunomarquage des cellules engagées dans le cycle cellulaire. Les cellules positives sont

des cellules, présentes dans la lame basale, dont la coloration brun-noire (due à la

péroxydase) se distingue des autres colorées dans les tons de violet. La figure 21 présente

une coupe transversale de peau, du même bovin, 72 heures après les applications de

cellophane adhésive. Si on compare visuellement ces deux figures, nous pouvons noter,

clairement, une augmentation du nombre de cellules positives à l’immunomarquage Ki 67.

0102030405060708090

100

Ind

ex

Ki

67

en

%

80

De plus, nous remarquons, 72 heures après les applications de cellophane adhésive, une

irrégularité de la lame basale, avec la présence de bourgeonnements épidermiques dans

lesquels semblent se regrouper les cellules prolifératives.

FIGURE 20: COUPE TRANSVERSALE DE PEAU SAINE DE BOVIN APRES IMMUNOMARQUAGE DES CELLULES

ENGAGEES DANS LE CYCLE CELLULAIRE (X200)

81

FIGURE 21: COUPE TRANSVERSALE DE PEAU DE BOVIN 72 HEURES APRES L'APPLICATION DE CELLOPHANE

ADHESIVE APRES IMMUNOMARQUAGE DES CELLULES ENGAGEES DANS LE CYCLE CELLULAIRE (X200)

82

c. Etude de l’infiltrat inflammatoire

La coloration de Luna et les immunomarquages BLA 36 et CD3 nous permettent

d’étudier la composition et l’évolution de l’infiltrat inflammatoire, suite à la réalisation des

applications de cellophane adhésive.

La figure 22 présente l’évolution au cours du temps des différentes populations de

cellules impliquées dans l’état inflammatoire de la peau.

Nous remarquons que les premières cellules à affluer massivement sont les

polynucléaires éosinophiles, quatre heures après les applications de cellophane adhésive.

Nous en dénombrons en moyenne une trentaine par champ (grossissement 400), soit quatre

fois plus qu’en peau saine non rasée. Le contingent de polynucléaires éosinophiles diminue,

ensuite, dès douze heures. Les figures 23 et 24 présentent une coupe transversale de peau

de bovin, quatre heures après la réalisation des applications de cellophane adhésive. Les

polynucléaires éosinophiles sont présents dans le derme en région périvasculaire. Ils se

reconnaissent par leur couleur fuchsia due aux granulations cytoplasmiques, mis en

évidence par la coloration de Luna.

Ensuite, le nombre de cellules (lymphocytes T) positives à l’immunomarquage CD3

augmente pour atteindre son maximum à douze heures. Nous dénombrons une quinzaine

de cellules marquées, tandis que sur le site témoin sans rasage, seulement sept cellules

marquées sont comptées. La figure 25 présente une coupe transversale de peau saine de

bovin après immunomarquage CD3, et la figure 26 présente une coupe de peau douze

heures après les applications de cellophane adhésive. Des lymphocytes T se distinguent par

leur forme arrondie et leur positivité à l’immunomarquage CD3. Ils sont, en grande majorité,

localisés dans le derme, en région périvasculaire. Nous observons, visuellement, leur

augmentation entre la peau saine et douze heures après les applications de cellophane

adhésive.

Enfin, nous observons, au niveau de la couche basale de l’épiderme, une légère

augmentation du nombre de cellules positives à l’immunomarquage BLA 36, seize heures

après les applications de cellophane adhésive. En revanche, soixante-douze heures après, les

cellules positives se font rares. La figure 27 présente une coupe transversale de peau saine

de bovin après immunomarquage BLA 36, et la figure 28 présente cette même coupe seize

heures après les applications de cellophane adhésive. Nous observons la présence de

83

cellules dendritiques dans la couche basale de l’épiderme. Celles-ci et leurs prolongements

cytoplasmiques sont marquées en brun-noir. Nous notons, visuellement, leur augmentation

entre la peau saine et seize heures après les applications de cellophane adhésive.

FIGURE 22: EVOLUTION AU COURS DU TEMPS DES POPULATIONS CELLULAIRES POSITIVES AUX

IMMUNOMARQUAGES BLA 36, CD3, OU A LA COLORATION DE LUNA

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

Témoin:

peau

saine

sans

rasage

70S + 1h 70S + 4h 70S +

12h

70S+ 16h 70S +

20h

70S +

24h

70S +

48h

70S +

72h

No

mb

re d

e c

ell

ule

s

Cellules dendritiques Lymphocytes T Eosinophiles

84


ADHESIVE, COLORATION DE LUNA, X200

85


ADHESIVE, COLORATION DE LUNA, X400

86

FIGURE 25: COUPE TRANSVERSALE DE PEAU SAINE DE BOVIN APRES IMMUNOMARQUAGE CD3 (X400)

87

FIGURE 26: COUPE TRANSVERSALE DE PEAU DE BOVIN 12 HEURES APRES LES APPLICATIONS DE CELLOPHANE

ADHESIVE, APRES IMMUNOMARQUAGE CD3, X400

88

FIGURE 27: COUPE TRANSVERSALE DE PEAU SAINE DE BOVIN APRES IMMUNOMARQUAGE BLA 36 (X200)

89


ADHESIVE, APRES IMMUNOMARQUAGE BLA 36 (X200)

90

d. Suivi de la production d’involucrine

L’involucrine est un marqueur précoce de la différenciation épidermique visible après

immunomarquage dès les couches supérieures du stratum spinosum et dans le stratum

granulosum.

FIGURE 29: COUPES TRANSVERSALES DE PEAU DE BOVIN APRES IMMUNOMARQUAGE DE L’INVOLUCRINE

Nous notons, sur peau saine, un très léger marquage de l’involucrine (visualisé par

une coloration bordeaux) dans certaines cellules du stratum granulosum. Quatre heures

après la rupture de la barrière cutanée, l’expression de l’involucrine augmente : nous notons

sa présence dans le stratum granulosum, marqué d’une coloration plus intense. De plus,

l’expression de l’involucrine intervient plus précocement : nous pouvons noter la présence

d’une coloration dès le stratum spinosum. Seize heures et quarante-huit heures après les

dernières applications de cellophane adhésive, la coloration apparaît ponctuellement sur

certaines zones des coupes histologiques. L’interprétation de ces résultats est difficile.

91

C. Mesure de la Perte Insensible en Eau

Toutes les valeurs brutes obtenues sont regroupées dans les tableaux des annexes 1 et 2.

Chaque valeur de Perte Insensible en Eau correspond à la moyenne de trois mesures

successives.

Résultats du protocole 3 : étude de la rupture et de la réparation cutanée par 1.

tape-stripping

Ce protocole n’a pu être réalisé entièrement et a dû être adapté en cours de route.

En effet, le temps prévu pour chaque manipulation avait été sous-estimé et les

manipulations n’ont pu être réalisées sur toutes les vaches. De plus, certains sites ont dû

être exclus de l’étude car les vaches les avaient léchés. Enfin, sur les premiers sites réalisés

nous n’observions pas d’augmentation de la perte d’eau transépidermique significative au

bout de 80 applications de cellophane adhésive, nous avons donc décidé de réaliser sur trois

sites 160 applications de cellophane adhésive à la suite.

Nous avons donc réalisé :

• Sur 3 sites : 160 applications de cellophane adhésive avec des mesures de la

Perte Insensible en Eau toutes les 10 applications de cellophane adhésive

(Figure 30).

• Sur 3 sites : 80 applications de cellophane adhésive avec des mesures de la

Perte Insensible en Eau à T0 + 18 heures, T0 + 24 heures, T0 + 48 heures et T0

+ 72 heures (Figure 31).

Lors de cette étude, la température et l’humidité ont varié respectivement entre 17

et 20 °C, et 31 et 33 %. Elles seront donc considérées comme constantes et n’influençant pas

les valeurs obtenues de Perte Insensible en Eau.

Les valeurs brutes de Perte Insensible en Eau sont référencées en annexe 3.

Les trois sites choisis sont situés sur le dos de la même vache, en arrière de l’épaule.

On note que les valeurs témoins de la Perte Insensible en Eau sont quasi identiques, variant

de 19,9 à 22,1 g.m-2

.h-1

(Figure 30).

92

On observe, comme attendu, une augmentation de la Perte Insensible en Eau

proportionnelle au nombre d’applications de cellophane adhésive (Figure 16). Les courbes

des sites 2 et 3 présentent une pente relativement proche et suivent la même tendance. En

revanche, la courbe du site 1 présente une pente beaucoup plus faible. Les trois sites n’étant

séparés entre eux que de deux cm, les variations observées entre les sites 2 et 3 et le site 1

laissent supposer l’existence d’une différence, antérieure aux manipulations, des sites entre

eux : le site 3 pourrait être le lieu d’une ancienne blessure et serait composé d’un tissu

cicatriciel ou encore le site d’une ancienne piqûre de mouche.

FIGURE 30: EVOLUTION DE LA PERTE INSENSIBLE EN EAU EN FONCTION DU NOMBRE D’APPLICATIONS DE

CELLOPHANE ADHESIVE (PROTOCOLE 3)

Nous observons des différences dans l’évolution des valeurs de Perte Insensible en

Eau des trois sites (figure 31). Pour les trois sites étudiés, les valeurs basales (valeurs

mesurées sur les sites témoins) de Perte Insensible en Eau sont relativement homogènes et

varient entre 21,4 g.m-2

.h-1

pour le site « dos vache 1652 » et 24,1 g.m-2

.h-1

pour le site

« ventre vache 1818 ».

En revanche, nous notons des différences dans l’évolution des trois sites au cours du

temps.

En effet, pour le site « ventre vache 1818 », la Perte insensible en Eau continue à

augmenter, jusqu’à 48 heures après la réalisation des 80 applications de cellophane

adhésive, et atteint une valeur de 44 g.m-2

.h-1

(Figure 31)

0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

120.0

Té

mo

in

10

S

20

S

30

S

40

S

50

S

60

S

70

S

80

S

90

S

10

0S

11

0S

12

0S

13

0S

14

0S

15

0S

16

0S

TE

WL

TEWL (g.m-2.h-1)

Site dos 1 vache 1818

TEWL (g.m-2.h-1)


TEWL (g.m-2.h-1)


93

Pour le site « dos vache 1818 », la Perte Insensible en Eau atteint son maximum, 24

heures après la réalisation des 80 applications de cellophane adhésive, soit 32,1 g.m-2

.h-1

.

Puis, la Perte Insensible en Eau décroit pour atteindre à 72 heures 24,8 g.m-2

.h-1

. Cette

valeur reste, à 72 heures, au-dessus de la valeur basale (21,4 g.m-2

.h-1

)(figure 30).

Pour le site « dos vache 1652 », la Perte Insensible en Eau, diminue, dans un premier

temps, au cours de 18 premières heures après la réalisation des 80 applications de

cellophanes adhésive. A 18 heures, la Perte insensible en Eau vaut 20,4 g.m-2

.h-1

et, est

inférieure à la valeur basale (21,4 g.m-2

.h-1

). A 24 heures, la Perte Insensible en Eau remonte

jusqu’à une valeur de 32,1 g.m-2

.h-1

. Enfin, elle diminue, une nouvelle fois, pour atteindre, à

72 heures, la valeur de 28,8 g.m-2

.h-1

(Figure 31).

Nous remarquons, qu’à 24 heures, les valeurs mesurées de Pertes Insensible en Eau

sont, pour les trois sites, relativement proches : 32,6 g.m-2

.h-1

pour le site « dos 1818 », 33,8

g.m-2

.h-1

pour le site « ventre 1818 » et 32,1 g.m-2

.h-1

pour le site « dos 1652 » (Figure 31).

FIGURE 31: EVOLUTION AU COURS DU TEMPS DE LA PERTE INSENSIBLE EN EAU APRES 80 APPLICATIONS DE

CELLOPHANE ADHESIVE (PROTOCOLE 3)

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

Témoin 80S + 18h 80S + 24h 80S + 48h 80S + 72h

TE

WL

TEWL (g.m-2.h-1)

Site dos vache 1818

TEWL (g.m-2.h-1)

Site ventre vache

1818

TEWL (g.m-2.h-1)

Site dos vache 1652

94

2. Résultats du protocole 4 : rupture de la barrière cutanée par dissolution des

lipides du stratum corneum

Lors de cette étude, la température et l’humidité ont varié respectivement entre 17

et 20 °C, et 31 et 33 %. Elles seront donc considérées comme constantes et n’influençant pas

les valeurs obtenues de Perte Insensible en Eau.

On observe effectivement une augmentation de la Perte Insensible en Eau après

application d’acétone sur la peau (Figure 32). Mais, la même observation est faite suite à

l’application de PBS, une solution tampon. De plus, les deux courbes suivent la même

tendance au cours du temps. L’analyse statistique, permettant de montrer qu’aucune

différence significative n’existe entre les sites PBS et Acétone, n’a pas été réalisée car la

puissance statistique du test aurait été trop faible compte-tenu du faible nombre de valeurs.

FIGURE 32: EVOLUTION AU COURS DU TEMPS DE LA PERTE INSENSIBLE EN EAU APRES APPLICATION

D'ACETONE OU DE PBS (PROTOCOLE 4)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

TE

WL

TEWL (g.m-2.h-1) Sites

PBS

TEWL (g.m-2.h-1) Sites

Acétone

95

3. Résultats de l’étude de la rupture et de la réparation cutanée après application

successives de cellophane adhésive : protocole 5

a. Site 1 témoin : mise en relation de la Perte Insensible en Eau avec

l’Hygrométrie

La figure 33 présente la courbe des variations de la Perte Insensible en Eau du site

témoin, au cours de la semaine, à laquelle la courbe des variations de l’Hygrométrie est

superposée.

La relation entre la Perte Insensible en Eau et l’hygrométrie de l’environnement

apparaît clairement. En effet, lorsque l’hygrométrie augmente, la Perte Insensible en Eau

diminue et inversement.

FIGURE 33: EVOLUTION DE LA PERTE INSENSIBLE EN EAU ET DE L'HYGROMETRIE SUR LE SITE 1 TEMOIN

Nous pouvons, alors, établir une relation linéaire significative (p = 0.001) entre la

Perte Insensible en Eau et l’Hygrométrie (Figure 34) :

PIE= 25,96 – (0,19 × Hygrométrie) avec R2= 0,76 et p =0,001

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Hy

gro

mé

trie

(%

)

TE

WL

(g.m

-2.h

-1)

96

FIGURE 34: REGRESSION LINEAIRE ENTRE LA PERTE INSENSIBLE EN EAU ET L'HYGROMETRIE

Plus un coefficient de corrélation linéaire est proche de -1 ou 1, plus la relation entre

les deux variables (ici la Perte Insensible en Eau et l’hygrométrie) est forte. Avec R2=0,76, la

Perte Insensible en Eau et l’Hygrométrie sont fortement corrélées et avec p≈0,001 cette

relation est significative.

b. Sites 5/6/7/8/9/10/11 et 12

Les figures 35 à 42 présentent l’évolution de la Perte Insensible en Eau en fonction

du nombre d’applications de cellophane adhésive. En parallèle, nous avons réalisé un suivi

de l’hygrométrie. Nous observons, encore une fois, le lien entre la Perte Insensible en Eau et

l’hygrométrie. En effet, sur chacune des courbes suivantes, la Perte Insensible en Eau semble

diminuer lorsque l’hygrométrie augmente et inversement. En revanche, nous ne pouvons, à

partir de ces simples courbes, observer l’effet du nombre d’applications de cellophane

adhésive sur la Perte Insensible en Eau.

Toutes les données obtenues ont été utilisées pour établir un modèle linéaire

généralisé permettant de prendre en compte l’effet de l’hygrométrie et du nombre

d’applications de cellophane adhésive.

y = -0,1908x + 25,958

R² = 0,76

p = 0.001

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

50 55 60 65 70 75 80 85 90 95

TE

WL

(g.m

-2.h

-1)

Hygrométrie (%)

97

FIGURE 35: EVOLUTION DE LA PERTE

INSENSIBLE EN EAU EN FONCTION DU

NOMBRE D’APPLICATIONS DE

CELLOPHANE ADHESIVE ASSOCIEE AU

SUIVI AU COURS DU TEMPS DE

L’HYGROMETRIE SUR LE SITE 5













74

76

78

80

82

84

86

88

90

92

94

0

5

10

15

20

25

Hy

gro

mé

trie

(%

)

PIE

(g

.m-2

.h-1

)

72

74

76

78

80

82

84

86

0

5

10

15

20

25

30

Té

mo

in

10

S

20

S

30

S

40

S

50

S

60

S

70

S

70

S +

1h

70

S +

4h

70

S +

8h

Hy

gro

mé

trie

(%

)

TE

WL

(g.m

-2.h

-1)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0

5

10

15

20

25

Té

mo

in

10

S

20

S

30

S

40

S

50

S

60

S

70

S

70

S +

1h

70

S +

4h

70

S +

8h

70

S +

12

h

Hy

gro

mé

trie

(%

)

TE

WL

(g.m

-2.h

-1)

98



















0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

5

10

15

20

25

Hy

gro

mé

trie

(%

)

TE

WL

(g.m

-2.h

-1)

56

58

60

62

64

66

68

70

72

74

0

5

10

15

20

25

30H

yg

rom

étr

ie (

%)

TE

WL

(g.m

-2.h

-1)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Té

mo

in

10

S

20

S

30

S

40

S

50

S

60

S

70

S

70

S +

1h

70

S +

4h

70

S +

8h

70

S +

12

h

70

S +

16

h

70

S +

20

h

70

S +

24

h

Hy

gro

mé

trie

(%

)

TE

WL

(g.m

-2.h

-1)

99

FIGURE 41: EVOLUTION DE LA

PERTE INSENSIBLE EN EAU EN

FONCTION DU NOMBRE

D’APPLICATIONS DE CELLOPHANE

ADHESIVE ASSOCIEE AU SUIVI AU

COURS DU TEMPS DE


FIGURE 42: EVOLUTION DE LA

PERTE INSENSIBLE EN EAU EN

FONCTION DU NOMBRE

D’APPLICATIONS DE CELLOPHANE

ADHESIVE ASSOCIEE AU SUIVI AU

COURS DU TEMPS DE


0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0

5

10

15

20

25

30

35

Té

mo

in

10

S

20

S

30

S

40

S

50

S

60

S

70

S

70

S +

1h

70

S +

4h

70

S +

8h

70

S +

12

h

70

S +

16

h

70

S +

20

h

70

S +

24

h

70

S +

48

h

Hy

gro

mé

trie

(%

)

TE

WL

(g.m

-2.h

-1)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

5

10

15

20

25

30

Té

mo

in

10

S

20

S

30

S

40

S

50

S

60

S

70

S

70

S +

1h

70

S +

4h

70

S +

8h

70

S +

12

h

70

S +

16

h

70

S +

20

h

70

S +

24

h

70

S +

48

h

70

S +

72

h

Hy

gro

mé

trie

(%

)

TE

WL

(g.m

-2.h

-1)

100

D. Analyse statistique : estimations de la Perte Insensible en Eau par un modèle

linéaire généralisé

Les principaux résultats du modèle sont synthétisés dans le tableau 6. Ces résultats

montrent que les trois variables explicatives ont un effet significatif sur la Perte Insensible en

Eau. La Perte Insensible en Eau augmente avec l’augmentation du nombre d’applications de

cellophane adhésive et diminue avec l’augmentation de l’hygrométrie et du temps de

régénération. L’estimation des coefficients faite par le modèle permet d’obtenir une

estimation de la Perte Insensible en Eau à partir de la relation suivante :

PIE = 39,7 – 0,36 .Hygrométrie + 0,112.Nb Applications de cellophane adhésive – 0,155 Tps

Régénération

En se basant sur ces résultats, nous pouvons utiliser le modèle pour faire des

estimations de la Perte Insensible en Eau sous différentes conditions. La figure 43 montre les

estimations de la Perte Insensible en Eau pour différentes hygrométries, nombre

d’applications de cellophane adhésive et temps de régénération.

Source de variation du TEWL Coefficient Ecart Type Niveau de signification

(p)

Constante 39.70334 2.74857 < 2 e-16 ***

Hygrométrie -0.35989 0.03637 6.60 e-16 ***

Nombre de Strips 0.11171 0.01403 5.94 e-12 ***

Régénération (heures) -0.15548 0.03406 1.64 e-05 ***

TABLEAU 6: PRINCIPAUX RESULTATS DU MODELE LINEAIRE GENERALISE

101

FIGURE 43: ESTIMATIONS DE LA PERTE INSENSIBLE EN EAU PAR UN MODELE LINEAIRE GENERALISE, SOUS

DIFFERENTES CONDITIONS

E. Mesure du pH cutané

Toutes les valeurs obtenues sont regroupées dans les tableaux de l’annexe 5.

Nous avons réalisé sur huit sites différents des mesures de pH cutané. La figure 42

présente l’ensemble des courbes obtenues pour ces huit sites. La figure 43 présente la

courbe moyenne obtenue à partir de l’ensemble des valeurs. Le pH témoin de chaque site

varie entre 7,56 et 8,64 avec une moyenne de 7,9 et un écart-type faible de 0,43. Nous

observons ensuite une diminution du pH aux alentours de 6,4 (valeur moyenne) après vingt

applications de cellophane adhésive. Puis, le pH ré-augmente à des valeurs autour de 7,32

lorsqu’on continue les applications de cellophane adhésive. Enfin, le pH re-diminue à une

valeur moyenne de 7, soixante-douze heures après la dernière application de cellophane

adhésive.

102

FIGURE 44: EVOLUTION DU PH CUTANE EN FONCTION DU NOMBRE D'APPLICATIONS DE CELLOPHANE

ADHESIVE

FIGURE 45: EVOLUTION MOYENNE DU PH CUTANE EN FONCTION DE NOMBRE D'APPLICATIONS DE

CELLOPHANE ADHESIVE

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

pH

Moyenne des 8 sites

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Té

mo

in

10

S

20

S

30

S

40

S

50

S

60

S

70

S

70

S +

1h

70

S +

4h

70

S +

8h

70

S +

12

h

70

S +

16

h

70

S +

20

h

70

S +

24

h

70

S +

48

h

70

S +

72

h

pH

Site 5

Site 6

Site 7

Site 8

Site 9

Site 10

Site 11

Site 12

103

IV. Discussion

Notre étude semble remplir son objectif principal, à savoir, fournir des données

réactualisées sur les propriétés de la peau des bovins et constitue une étude préliminaire à

la caractérisation de la barrière cutanée des bovins.

Néanmoins, cette étude a mis en évidence un certain nombre de points qu’il s’avère

nécessaire de discuter.

A. Les manipulations sur les bovins

Tout d’abord, il s’agit d’animaux de grande taille dont la contention n’est pas toujours

aisée. Il faut, alors, tenir compte dans les protocoles du temps de préparation des animaux,

tel que le déplacement au lieu de manipulation et la prise au cornadis. Ce temps est variable

selon la docilité de l’animal. Pour les protocoles 3 et 4, ce temps de préparation a été sous-

estimé, ce qui explique que nous n’avons pas réalisé, dans leur totalité, ces protocoles.

De plus, la notion de sécurité du manipulateur est un point important lors de

manipulations de gros animaux. Pour la réalisation des biopsies, les vaches ont été prises au

cornadis, puis bloquées avec un licol, afin de limiter leurs mouvements. Une anesthésie

locale a été réalisée et nous avons attendu dix minutes au minimum avant d’effectuer la

biopsie. Dans de rares cas, la vache a levé le postérieur mais nous n’avons pas eu besoin de

procéder à une sédation. Néanmoins, il est impossible qu’un animal de 600 kg ne bouge

absolument pas. Or, pour le Vapometer autant que pour le pH-mètre, les mesures doivent

se faire sur un animal le plus immobile possible. Dans ces conditions, nous avons dû

recommencer plusieurs fois certaines prises de mesures, induisant des retards dans le

planning des manipulations. Afin de limiter les mouvements gênants des animaux, nous

recommandons de choisir de animaux ayant l’habitude d’être régulièrement manipulés et de

limiter leur stress lors des manipulations, en procédant calmement, par des gestes lents et

sûrs.

Enfin, lors des études réalisées sur le chien (VIDEMONT 2011), les sites d’application de

cellophane adhésive étaient protégés d’un jour à l’autre, en mettant un collier élisabethain

aux chiens, afin qu’ils ne se lèchent pas. Cette mesure étant impossible chez les vaches, des

sites du protocole 3, situés au niveau du ventre et au niveau du dos, ont dû être abandonnés

104

en cours de manipulation pour le protocole 3. En effet, les vaches avaient léché les sites, à

l’origine de l’apparition de croûtes, sur tous les sites encore vierges d’applications de

cellophane adhésive. Nous recommandons, alors, de choisir des sites que les vaches ne

peuvent atteindre, comme par exemple sur l’épaule ou le haut du dos. Il convient aussi de

choisir des sites qui assurent une sécurité optimale au manipulateur.

Dernièrement, les manipulations ont dues être réalisées en extérieur semi-couvert, étant

donné la taille des animaux. Nous étions par conséquent, complètement dépendants de la

météo. Certaines mesures, réalisées en hiver, n’ont pas été retenues car les appareils de

mesures souffraient du froid. Ce genre de désagrément n’est pas présent lors de

manipulations sur de plus petites espèces. En effet, les équipes de recherche disposent de

salles dont la température et l’hygrométrie sont maintenues à des valeurs optimales (25-28

°C et humidité relative de 40-60 %, VIDEMONT 2011). L’idéal serait de disposer, dans le

futur, de telles salles suffisamment grandes pour accueillir un bovin.

B. Les différentes méthodes de rupture de la barrière cutanée

Pour induire la rupture de la barrière cutanée, nous avons choisi de comparer la

technique de tape-stripping et celle du badigeonnage à l’acétone.

Pour les protocoles 3 et 5, nous nous sommes inspirés des protocoles mis au point pour

l’étude de la barrière cutanée chez le chien (VIDEMONT 2011). Nous les avons adaptés à

partir des observations histopathologiques faites sur peau de bovins morts. Nous avons

décidé de réaliser, tout d’abord, cinquante applications de cellophane adhésive car, chez le

chien, trente étaient nécessaires pour éliminer la totalité du stratum corneum. Mais les

observations histopathologiques ont montré que cela était insuffisant. Par conséquent, nous

avons fixé à 80 les applications de cellophane adhésive pour le protocole 3 et 70 pour le

protocole 5. De plus, lors de la première semaine de manipulations, la Perte Insensible en

Eau augmentait très peu. Nous avons donc poursuivi nos mesures jusqu’à 160 applications

de cellophane adhésive. Nous recommandons, afin de ne pas créer des lésions telles que des

croûtes, de ne pas dépasser 80 applications de cellophane adhésive.

105

Afin de se prémunir des facteurs dépendant de l’opérateur abordés dans les rappels

bibliographiques, un seul opérateur a réalisé les applications de cellophane adhésive en

standardisant au maximum les applications (pression appliquée, durée d’application, vitesse

de retrait) (LADERMANN 2008, LOFFLER 2004). Mais nous observons que, même en

standardisant au maximum cette technique, il est difficile d’obtenir des résultats identiques

sur les différents sites. En effet, nous avons pu observer que, pour un nombre d’applications

de cellophane adhésive identique, la quantité de couche cornée restante pouvait varier.

De plus, un facteur important a influencé nos résultats. Les bovins étant beaucoup plus

densément poilus que les chiens, nous avons dû, en plus de la tonte, raser délicatement les

zones de manipulation. Afin de ne pas observer les effets inflammatoires de la tonte, celle-ci

a été réalisée une semaine avant les manipulations, mais la repousse étant trop rapide, nous

avons dû effectuer un nouveau rasage 24 heures avant le début des manipulations. L’effet

du rasage est donc à intégrer dans l’interprétation des résultats. Il faut alors se demander si

le rasage est responsable de la faible épaisseur de stratum corneum observé en

histopathologie. Pour cela, nous avons complété notre étude en réalisant deux biopsies sur

une peau juste tondue. Aucune différence d’épaisseur du stratum corneum n’est mise en

évidence (Annexe 5).

En conclusion, nous avons tout de même montré, comme observé chez la souris, le chien

et l’homme, que la méthode de tape-stripping permet une rupture mécanique de la barrière

cutanée par retrait de cornéocytes.

Les protocoles 2 et 4 se sont inspirés des études réalisées par Rissman and al. en 2008.

Nous avons complété le protocole en ajoutant un badigeonnage témoin au PBS. Rissman et

al. concluent dans leur étude, que le badigeonnage à l’acétone de l’épiderme aboutit à une

altération de la barrière cutanée, mais que celle-ci est la conséquence d’un retrait

mécanique des cornéocytes dû aux frottements du coton-tige et non à une dissolution des

lipides intercornéocytaires. Nos résultats semblent aboutir à la même conclusion. En effet,

nous observons dans les deux cas une altération de la barrière cutanée, à l’histologie et par

mesure de la Perte Insensible en Eau. Malheureusement, nous n’avons pu compléter notre

étude par la réalisation de colorations Red Oil O. Celles-ci auraient pu nous montrer

l’existence ou non d’une variation de la quantité de lipides intercornéocytaires suite à

l’application d’acétone.

106

En conclusion, il semblerait donc que, comme décrit chez la souris par Rissmann and

al. en 2009, l’altération de la barrière cutanée par badigeonnage d’acétone soit liée au

retrait des cornéocytes par frottement et non à la dissolution des lipides intercornéocytaires

par l’acétone.

C. Les observations histopathologiques et immunohistochimiques

Tout d’abord, nous observons un rétablissement du stratum corneum, qui débute entre

18 et 24 heures. Le rétablissement de la couche cornée semble quasiment complet au bout

de 72 heures. De plus, aucun foyer de nécrose de coagulation, induit par le tape-stripping,

n’est présent à 72 heures. Le traumatisme créé est donc modéré. L’observation du

phénomène de parakératose nous montre que la restauration de la couche cornée se fait de

façon très rapide, voire trop. Nos résultats semblent cohérents avec ceux obtenus chez

d’autres espèces. En effet, chez le chien, la réapparition du stratum corneum est visible au

bout de 48 heures et celui-ci est totalement restauré à 72 heures (VIDEMONT 2011).

Ensuite, l’étude de l’évolution de l’index de prolifération Ki 67, suite à une rupture de la

barrière cutanée, nous montre que cette rupture entraîne une prolifération marquée des

cellules de la couche basale. L’index de prolifération n’a cessé d’augmenter jusqu’ à 72

heures, pour atteindre une valeur de 89 %. Chez le chien, le maximum de l’index Ki 67 a été

observé 48 heures après les applications de cellophane adhésive (VIDEMONT 2011). Les

mêmes observations ont été faites par Pinkus chez l’homme (PINKUS 1951). Néanmoins, il

serait nécessaire de poursuivre les mesures après 72 heures pour, dans un premier temps,

observer le pic maximum de l’index Ki67 et l’heure à laquelle il se produit. Puis nous

pourrions observer le retour à des valeurs basales du Ki67. De plus, nous observons une

valeur élevée du Ki67 une heure après les manipulations. Cette valeur n’est pas

interprétable, il pourrait s’agir d’un foyer épidermique où la prolifération des cellules basales

est plus intense, pour diverses raisons.

Enfin, cette étude nous a permis de mettre en évidence l’apparition d’un phénomène

inflammatoire suite à une rupture de la barrière cutanée par application de cellophane

adhésive. Nous avons observé, dans un premier temps, l’apparition d’un œdème et d’une

congestion des capillaires au niveau du derme. Ceux-ci sont maximaux entre 4 et 16 heures

après les applications de cellophane adhésive. Ensuite, nous avons remarqué l’apparition

107

d’un infiltrat inflammatoire au bout de quatre heures, composé majoritairement de

polynucléaires éosinophiles. Après quatre heures, le contingent de polynucléaires

éosinophiles redescend à des valeurs de base. Ce résultat est similaire à celui obtenu chez le

chien par Videmont et al. en 2011. Ensuite, les polynucléaires éosinophiles sont remplacés

progressivement, par des cellules mononucléées, dont des lymphocytes, marqués par les

anticorps anti-CD3. Nous les visualisons principalement en région périvasculaire.

L’immunomarquage BLA 36 met en évidence, dans la couche basale de l’épiderme ainsi que

dans le derme, des cellules morphologiquement comparables à des cellules dendritiques,

tandis que chez l’homme il marque les lymphocytes B. Néanmoins, les observations réalisées

chez le chien, semblent aboutir aux mêmes conclusions : le marqueur BLA 36 se fixe sur les

cellules dendritiques. Cette population de cellules, dans l’épiderme et dans le derme,

augmente légèrement seize heures après la rupture de la barrière.

En conclusion, l’altération de la barrière cutanée entraîne une réaction inflammatoire

localisée et modérée dont les principales cellules impliquées sont les polynucléaires

éosinophiles. De plus, cette altération engendre une stimulation des mécanismes de

prolifération cellulaire au niveau de la couche basale de l’épiderme. Enfin, au bout de 72

heures, la restauration de la couche cornée semble complète. Il faut cependant retenir que

ces observations n’ont été faites que sur une seule vache. Il conviendrait de répéter ces

manipulations sur d’autres vaches, afin de les confirmer.

D. La Perte Insensible en Eau

De nombreuses études ont montré chez l’homme, la souris et le chien, la corrélation

entre la Perte Insensible en Eau et la fonction barrière de l’épiderme (FLUHR 2006, SHIWADA

2008, YOSHIHARA 2007).

Chez les bovins, la principale difficulté a été de s’adapter aux conditions météorologiques.

En effet, comme détaillé dans les rappels bibliographiques, les conditions d’ambiance ont un

impact considérable sur la Perte Insensible en Eau (YOSHIHARA 2007). Lors de la première

semaine de manipulations, la température ambiante ainsi que l’humidité relative ont peu

varié (Protocole 3 et 4). Les résultats du protocole 3 ont mis en évidence le lien entre la

Perte Insensible en Eau et le statut de la barrière cutanée. Mais, si pour les deux sites Dos 2

vache 1818 et Dos 3 vache 1818, l’évolution de la Perte Insensible en Eau semble suivre la

108

même tendance, le site Dos 1 vache 1818 présente une augmentation beaucoup moins

marquée (Figure 18). Il avait été mis en évidence par Lau-Gillard et al. en 2008 que les

valeurs de Perte Insensible en Eau varient significativement en fonction du site corporel, de

l’individu et de jours en jours. Pourtant, dans notre cas, les sites sont distants de quelques

centimètres les uns des autres, il ne s’agit pas de régions anatomiques distinctes. L’étude

menée sur le chien (VIDEMONT 2011) avait montré que la maîtrise des facteurs de variations

limite considérablement les variations de Perte Insensible en Eau sur un même chien, d’un

jour à l’autre. Lors de notre étude, ces facteurs de variations n’ont pu être aussi bien

maîtrisés.

Lors de la réalisation du protocole 5, les paramètres Température et Hygrométrie ont

atteint des valeurs extrêmes. Nous avons, néanmoins, continué les manipulations. Le

Vapometer a donc été utilisé hors plage de valeurs recommandées. Les résultats bruts

obtenus n’étant pas interprétables, nous avons estimé les variations de Perte Insensible en

Eau à l’aide d’un modèle linéaire généralisé. Celui-ci nous a permis d’établir la relation

suivante :

PIE = 39,7 – 0,36 .Hygrométrie + 0,112.Nb Applications de cellophane adhésive – 0,155 Tps

Régénération

Cette relation nous permet de prévoir pour une hygrométrie fixée et un nombre

d’applications de cellophane adhésive donné, la valeur de la Perte Insensible en Eau.

Néanmoins, ce modèle est limité. En effet, il a été obtenu avec des valeurs mesurées sur une

seule vache. Malgré le fait que les valeurs ont été réalisées sur douze sites différents, il

conviendrait de réaliser ces mesures sur un plus grand nombre de bovins.

L’utilisation du modèle linéaire généralisé reste tout de même intéressante dans le cadre

d’études où les facteurs de variations ne peuvent être maîtrisés et où leur impact sur les

valeurs de la mesure souhaite être connu.

E. La mesure du pH cutané

Les valeurs de pH cutané chez les bovins disponibles dans la littérature varient

énormément. Matousek et al. obtiennent des valeurs entre 4,5 et 8,8, tandis que Meyer et

al. obtiennent des pH cutanés variant entre 6,1 et 8 pour les femelles et 8 et 8,15 pour les

109

mâles. Scott décrit, en revanche, des valeurs plus acides, variant entre 5,4 et 5,75. Dans

notre étude, nous obtenons un pH cutané moyen, en peau saine, de 7,9 avec un écart-type

de 0,43. Le pH, à la surface de la peau des bovins, est donc légèrement basique,

contrairement à l’homme ou la souris chez lesquels le pH cutané est acide (HOHMAN 1994,

MATOUSEK 2002).

Dans les études réalisées chez l’homme et la souris, il a été démontré que le pH cutané

augmente au fil des applications de cellophane adhésive jusqu’à atteindre un pH neutre à la

jonction du stratum corneum avec le stratum granulsosum. Nous observons une diminution

du pH cutané, jusqu’ à vingt applications de cellophane adhésive, à des valeurs moyennes de

6,37. On peut supposer que les vingt premières applications de cellophane adhésive

« décollent » les diverses substances et la saleté responsable du pH basique de la surface

cutané. Puis, le pH augmente pour atteindre la valeur neutre de 7 les cinquante applications

de cellophane adhésive suivantes. Par conséquent, si nous réalisons l’analogie avec les

résultats de Matousek, à 70 applications de cellophane adhésive, nous nous situons à la

jonction stratum corneum/stratum granulosum.

111

CONCLUSION

113

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119

ANNEXES

Annexe 1: Agrément du comité d’éthique

120

Annexe 2: Tableaux détaillant les résultats des examens histopathologiques

EPIDERME DERME

PROTOCOLE 1 Epaisseur (en couches

cellulaires) Aspect de la couche cornée Aspect de la couche basale

Lombes avant rasage 3 à 4

Aérée (8 feuillets)

+

Fine couche de compacte

Organisée

Cellules cuboïdales

Lombes après rasage 3 à 4

Aérée (3 à 12 feuillets)

+


Organisée


Lombes 10S 3 à 4


+


Organisée


Lombes 20S 3 à 4

Aérée (1 feuillet)

+


qui se décolle

Organisée


Lombes 30S 3 à 4


+


qui se décolle

Organisée


Lombes 40S 3 à 4

Zone sans couche cornée

+

Zone avec décollement de

la couche compacte

Absence de couche aérée

Organisée


Lombes 50S 3 à 4


+


la couche compacte


Organisée


121

EPIDERME DERME



Abdomen avant rasage 3 à 4


+


Organisée


Abdomen après rasage 3 à 4


+


qui se décolle

Organisée


Abdomen 10 S 3 à 4


selon sur les "pics"

+


+/- décollée

Organisée


Abdomen 20S 3 à 4


+


qui se décolle

Organisée


Abdomen 30S 3 à 4


+


qui se décolle


Organisée


Abdomen 40S 3 à 4


+


qui se décolle


Organisée


Abdomen 50S 3 à 4


+


la couche compacte


Organisée


122

EPIDERME DERME



Mufle témoin 70 à 80 Absence de couche aérée

Compacte: 50 feuillets

Organisée


Mufle 30S 70 à 80 Absence de couche aérée


Organisée




Organisée




Organisée


EPIDERME DERME



Antérieur avant rasage 3 à 4


+


Organisée


Antérieur après rasage 3 à 4


+


Organisée


Antérieur 10S 3 à 4


+

Couche compacte très fine

Organisée




+

Fine couche compacte

Organisée




+


Organisée




+


Organisée




+


+


Organisée


124

EPIDERME DERME



Front avant rasage 3 à 4


+

Entièrement décollée des

couches sous-jacentes

Organisée


Front après rasage 3 à 4


+


Organisée


Front 10S 3 à 4


+


Organisée


Front 20S 3 à 4


+


Organisée


Front 30S 3 à 4


+


Organisée


Front 40S 3 à 4


+


+


Organisée


Front 50S 3 à 4


+


+


Organisée


125

EPIDERME DERME



Mamelle témoin 4 à 5


+


Organisée


Mamelle 10S 4 à 5


+


Organisée


Mamelle 20S 4 à 5


+


qui se décolle

Organisée


Mamelle 30S 4 à 5


+


qui se décolle

Organisée


Mamelle 40S 4 à 5


+


qui se décolle

Organisée


Mamelle 50S 4 à 5


+


qui se décolle

Organisée


12

6

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2

2

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1

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Pré

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7

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18

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2

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Do

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S +

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+

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0

1

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12

8

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RM

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RM

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4

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0

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4

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PB

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P

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pe

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rég

ula

rité

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S +

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Fin

e c

ou

che

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pa

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Ré

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Ré

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S +

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S +

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Fin

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ou

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com

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Ré

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+

1

1

1

L

ég

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irré

gu

lari

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la la

me

ba

sale

89

,00

3

Annexe 3: Tableaux des valeurs de Perte Insensible en Eau brutes du protocole 3 et 4

PIE (g.m-2

.h-1

)

Site dos 1 vache

1818

PIE (g.m-2

.h-1

)


PIE (g.m-2

.h-1

)


Témoin 22,1 19,9 19,9

10S 22,2 27,6 28,6

20S 27,3 34,7 33,8

30S 30,4 42,3 35,1

40S 27,6 51,4 42,4

50S 29,7 50,3 42,9

60S 32,0 59,5 43,9

70S 31,1 58,2 54,8

80S 32,7 71,7 65,8

90S 28,2 61,1 52,7

100S 31,7 71,5 82,1

110S 35,7 72,2 83,7

120S 35,3 63,2 100,9

130S 36,4 70,9 100,3

140S 33,7 78,4 100,3

150S 40,3 83,6 94,8

160S 37,2 93,1 101,5

133

PIE (g.m-2

.h-1

)

Site dos vache 1818

PIE (g.m-2

.h-1

)

Site ventre vache 1818

PIE (g.m-2

.h-1

)

Site dos vache 1652

Témoin 22,1 24,1 21,4

80S + 18h 27,2 27,7 20,4

80S + 24h 32,6 33,8 32,1

80S + 48h 29,9 44,0 30,8

80S + 72h 24,8 NA 28,8

PIE (g.m

-2.h

-1) Sites PBS PIE (g.m

-2.h

-1) Sites Acétone

Témoin 24,6 21,1

+ 0h 37,5 35,3

+ 18h 14,2 15,8

+ 24h 24,6 27,6

+ 48h 23,8 15,4

+ 72h 13,9 16,7

134

Annexe 4 : Tableaux des valeurs de Pertes Insensible en Eau brutes du protocole 5

SITE 1: TEMOIN

T°C Hygrométrie

(%)

PIE

(g.m-2

.h-1

)

pH

Lundi 17.10 8h 17 55,7 14,5 7,45

Lundi 17.10 14h 21,7 67,7 15,7 8,4

Mardi 18.10 8h 15,7 81,3 11,7 8,39

Mardi 18.10 12h 21,7 56,0 13,7 8,25

Mercredi 19.10 8h 14,7 87,3 10,2 8,11

Mercredi 19.10 12h 13,7 90,0 9,3 8,1

Jeudi 20.10 8h 11,0 92,0 6,2 7,63

Jeudi 20.10 12h 16,0 71,7 13,4 8,09

Vendredi 21.10 8h 9,3 92,0 7,5 7,88

Vendredi 21.10 12h 13,3 72,3 11,2 8,23

135

SITE 5: 70S + 4h

T°C Hygrométrie

(%)

PIE

(g.m-2

.h-1

)

pH

Témoin 14,3 85,3 9,8 7,98

10S 14,7 85,7 11,7 6,5

20S 15,3 83,7 13,3 5,9

30S 15,7 80,7 16,4 6,7

40S 14,7 83,7 15,8 6,65

50S 15,0 82,7 15,2 6,5

60S 15,0 80,7 19,1 6,65

70S 15,7 82,3 16,8 7,19

70S + 4h 14,0 92,3 11,7 7,32

SITE 6: 70S + 8h

T°C Hygrométrie

(%)

PIE

(g.m-2

.h-1

)

pH

Témoin 16,7 84,3 12,2 8,64

10S 16,0 79,3 14,1 7,11

20S 16,0 79,0 16,9 6,18

30S 16,0 78,7 18,4 6,02

40S 16,3 81,0 19,3 6,23

50S 16,7 80,3 21,4 6,38

60S 16,3 78,0 22,7 6,88

70S 16,0 77,0 24,4 6,96

70S + 1h 16,3 77,0 22,8 6,90

70S + 4h 16,0 78,3 21,1 6,74

70S +8h NA NA NA NA

136

SITE 7: 70S + 12h

T°C Hygrométrie

(%)

PIE

(g.m-2

.h-1

)

pH

Témoin 19,7 66,7 20,1 7,63

10S 20,0 66,3 19,3 7,26

20S 19,7 67,0 19,4 6,81

30S 19,0 69,7 20,1 6,4

40S 19,7 70,0 21,2 6,57

50S 19,0 69,0 20,6 6,87

60S 18,3 72,3 19,5 7,1

70S 18,7 72,7 18,6 7,2

70S + 1h NA NA NA NA


70S +8h NA NA NA NA

70S + 12h 15,0 85,3 8,8 7,65

137

SITE 8: 70S + 16h

T°C Hygrométrie

(%)

PIE

(g.m-2

.h-1

)

pH

Témoin 21,0 58,0 14,4 7,88

10S 19,7 63,0 17,0 7,18

20S 20,0 62,7 19,0 6,45

30S 20,0 60,3 20,4 6,35

40S 19,7 63,0 23,3 6,61

50S 20,0 65,0 22,3 6,43

60S 19,7 66,0 21,6 6,67

70S 19,0 67,7 20,7 6,7

70S + 1h 16,7 69,7 19,0 7,2


70S +8h NA NA NA NA


70S +16h 16,0 86,3 11,8 7,45

138

SITE 9: 70S + 20h

T°C Hygrométrie

(%)

PIE

(g.m-2

.h-1

)

pH

Témoin 16,0 69,0 12,3 8,35

10S 14,0 72,0 12,0 7,28

20S 15,0 68,7 14,0 6,6

30S 15,0 64,0 15,0 6,74

40S 15,0 62,3 15,3 6,58

50S 15,0 62,0 18,9 6,67

60S 14,0 61,7 21,8 6,7

70S 13,7 62,0 24,0 6,9

70S + 1h

70S + 4h

70S +8h

70S + 12h

70S +16h

70S +20h

139

SITE 10: 70S + 24h

T°C Hygrométrie

(%)

PIE

(g.m-2

.h-1

)

pH

Témoin 12,0 92,0 5,9 7,33

10S 12,7 89,3 7,5 6,52

20S 12,7 88,0 9,3 6,29

30S 13,7 83,0 11,2 6

40S 13,7 79,3 12,4 6,4

50S 14,0 78,3 14,8 6,07

60S 14,0 75,0 16,3 6,35

70S 14,3 77,0 15,2 6,49

70S + 1h 15,0 78,7 12,7 6,88

70S + 4h

70S +8h

70S + 12h

70S +16h

70S +20h

70S +24h 11,3 85,0 11,4 7,24

140

SITE 11: 70S + 48h

T°C Hygrométrie

(%)

PIE

(g.m-2

.h-1

)

pH

Témoin 22,0 59,7 17,1 7,8

10S 19,3 62,0 23,5 6,5

20S 19,3 61,3 26,7 6,62

30S 19,3 64,0 27,8 6,84

40S 19,0 58,7 30,2 6,9

50S 18,7 63,3 29,9 7,14

60S 19,0 65,0 25,9 7,1

70S 19,0 63,3 29,3 7,36

70S + 1h 18,7 61,7 28,4 7,4

70S + 4h

70S +8h

70S + 12h

70S +16h

70S +20h 15,0 84,3 10,7 7,54

70S +24h 19,0 68,0 21,2 7,63

70S +48h 16,0 81,0 14,4 7,65

141

SITE 12: 70S + 72h

T°C Hygrométrie

(%)

PIE

(g.m-2

.h-1

)

pH

Témoin 14,7 72,0 10,2 7,56

10S 14,3 66,3 10,4 6,36

20S 16,3 73,0 13,0 6,14

30S 15,7 77,0 13,5 6,41

40S 15,3 81,0 14,6 6,48

50S 15,3 81,7 15,9 7,24

60S 15,3 83,3 17,1 7,12

70S 15,7 82,0 16,9 7,30

70S + 1h 14,3 88,7 14,7 7,38

70S + 4h 20,0 62,7 27,8 7,90

70S +8h

70S + 12h

70S +16h

70S +20h

70S +24h 16,0 80,7 12,5 8,16

70S +48h 16,0 74,7 10,8 7,31

70S +72h 15,0 75,3 11,6 7,03

142

Annexe 5 : Tableau des valeurs brutes des mesures du pH cutané du protocole 5

Site 5 Site 6 Site 7 Site 8 Site 9 Site

10

Site

11

Site

12

Moyenne

des 8

sites

Ecart

type

Variance

Témoin 7,98 8,64 7,63 7,88 8,35 7,33 7,8 7,56 7,90 0,43 0,18

10 S 6,5 7,11 7,26 7,18 7,28 6,52 6,5 6,36 6,84 0,40 0,16

20 S 5,9 6,18 6,81 6,45 6,6 6,29 6,62 6,14 6,37 0,30 0,09

30 S 6,7 6,02 6,4 6,35 6,74 6 6,84 6,41 6,43 0,32 0,10

40 S 6,65 6,23 6,57 6,61 6,58 6,4 6,9 6,48 6,55 0,20 0,04

50 S 6,5 6,38 6,87 6,43 6,67 6,07 7,14 7,24 6,66 0,37 0,16

60 S 6,65 6,88 7,1 6,67 6,7 6,35 7,1 7,12 6,82 0,28 0,08

70 S 7,19 6,96 7,2 6,7 6,9 6,49 7,36 7,3 7,01 0,31 0,09

70 S + 1h 6,9 7,2 6,88 7,4 7,38 7,15 0,23 0,06

70 S + 4h 7,32 6,74 7,9 7,32 0,58 0,34

70 S + 8h

70 S +

12h

7,65 7,65

70 S +

16h

7,45 7,45 0,00

70 S +

20h

7,54 7,54

70 S +

24h

7,24 7,63 8,16 7,68 0,46 0,21

70 S +

48h

7,65 7,31 7,48 0,24 0,06

70S + 72h 7,03 7,03

143

Annexe 6 : Table R des mesures obtenues lors du protocole 5

Vache Site T° Hygro PIE pH Nb Strips 70S+h

B BT 17 55,7 14,5 7,45 0 0

B BT 21,7 67,7 15,7 8,4 0 0

B BT 15,7 81,3 11,7 8,39 0 0

B BT 21,7 56,0 13,7 8,25 0 0

B BT 14,7 87,3 10,2 8,11 0 0

B BT 13,7 90,0 9,3 8,1 0 0

B BT 11,0 92,0 6,2 7,63 0 0

B BT 16,0 71,7 13,4 8,09 0 0

B BT 9,3 92,0 7,5 7,88 0 0

B BT 13,3 72,3 11,2 8,23 0 0

B B5 14,3 85,3 9,8 7,98 0 0

B B5 14,7 85,7 11,7 6,5 10 0

B B5 15,3 83,7 13,3 5,9 20 0

B B5 15,7 80,7 16,4 6,7 30 0

B B5 14,7 83,7 15,8 6,65 40 0

B B5 15,0 82,7 15,2 6,5 50 0

B B5 15,0 80,7 19,1 6,65 60 0

B B5 15,7 82,3 16,8 7,19 70 0

B B5 14,0 92,3 11,7 7,32 70 4

B B6 16,7 84,3 12,2 8,64 0 0

B B6 16,0 79,3 14,1 7,11 10 0

B B6 16,0 79,0 16,9 6,18 20 0

B B6 16,0 78,7 18,4 6,02 30 0

B B6 16,3 81,0 19,3 6,23 40 0

B B6 16,7 80,3 21,4 6,38 50 0

B B6 16,3 78,0 22,7 6,88 60 0

B B6 16,0 77,0 24,4 6,96 70 0

B B6 16,3 77,0 22,8 6,90 70 1

B B6 16,0 78,3 21,1 6,74 70 4

144

B B7 19,7 66,7 20,1 7,63 0 0

B B7 20,0 66,3 19,3 7,26 10 0

B B7 19,7 67,0 19,4 6,81 20 0

B B7 19,0 69,7 20,1 6,4 30 0

B B7 19,7 70,0 21,2 6,57 40 0

B B7 19,0 69,0 20,6 6,87 50 0

B B7 18,3 72,3 19,5 7,1 60 0

B B7 18,7 72,7 18,6 7,2 70 0

B B7 15,0 85,3 8,8 7,65 70 12

B B8 21,0 58,0 14,4 7,88 0 0

B B8 19,7 63,0 17,0 7,18 10 0

B B8 20,0 62,7 19,0 6,45 20 0

B B8 20,0 60,3 20,4 6,35 30 0

B B8 19,7 63,0 23,3 6,61 40 0

B B8 20,0 65,0 22,3 6,43 50 0

B B8 19,7 66,0 21,6 6,67 60 0

B B8 19,0 67,7 20,7 6,7 70 0

B B8 16,7 69,7 19,0 7,2 70 1

B B8 16,0 86,3 11,8 7,45 70 16

B B9 16,0 69,0 12,3 8,35 0 0

B B9 14,0 72,0 12,0 7,28 10 0

B B9 15,0 68,7 14,0 6,6 20 0

B B9 15,0 64,0 15,0 6,74 30 0

B B9 15,0 62,3 15,3 6,58 40 0

B B9 15,0 62,0 18,9 6,67 50 0

B B9 14,0 61,7 21,8 6,7 60 0

B B9 13,7 62,0 24,0 6,9 70 0

B B10 12,0 92,0 5,9 7,33 0 0

B B10 12,7 89,3 7,5 6,52 10 0

B B10 12,7 88,0 9,3 6,29 20 0

B B10 13,7 83,0 11,2 6 30 0

B B10 13,7 79,3 12,4 6,4 40 0

B B10 14,0 78,3 14,8 6,07 50 0

145

B B10 14,0 75,0 16,3 6,35 60 0

B B10 14,3 77,0 15,2 6,49 70 0

B B10 15,0 78,7 12,7 6,88 70 1

B B10 11,3 85,0 11,4 7,24 70 24

B B11 22,0 59,7 17,1 7,8 0 0

B B11 19,3 62,0 23,5 6,5 10 0

B B11 19,3 61,3 26,7 6,62 20 0

B B11 19,3 64,0 27,8 6,84 30 0

B B11 19,0 58,7 30,2 6,9 40 0

B B11 18,7 63,3 29,9 7,14 50 0

B B11 19,0 65,0 25,9 7,1 60 0

B B11 19,0 63,3 29,3 7,36 70 0

B B11 18,7 61,7 28,4 7,4 70 1

B B11 15,0 84,3 10,7 7,54 70 20

B B11 19,0 68,0 21,2 7,63 70 24

B B11 16,0 81,0 14,4 7,65 70 48

B B12 14,7 72,0 10,2 7,56 0 0

B B12 14,3 66,3 10,4 6,36 10 0

B B12 16,3 73,0 13,0 6,14 20 0

B B12 15,7 77,0 13,5 6,41 30 0

B B12 15,3 81,0 14,6 6,48 40 0

B B12 15,3 81,7 15,9 7,24 50 0

B B12 15,3 83,3 17,1 7,12 60 0

B B12 15,7 82,0 16,9 7,30 70 0

B B12 14,3 88,7 14,7 7,38 70 1

B B12 20,0 62,7 27,8 7,90 70 4

B B12 16,0 80,7 12,5 8,16 70 24

B B12 16,0 74,7 10,8 7,31 70 48

B B12 15,0 75,3 11,6 7,03 70 72

146

Annexe 7: Les différentes techniques de coloration en histopathologie

LA COLORATION HEMALUN-EOSINE

PRINCIPE:

Le protocole consiste à réaliser différents étapes de bains pour les lames afin d’obtenir une coloration finale

exploitable. La coloration Hémalun-Eosine est une coloration de base en histologie, elle permet d’observer

l’aspect morphologique général d’un tissu.

MODE OPERATOIRE :

Mettre des gants et mettre en route la hotte pendant toute la durée de la coloration.

Préparer les solutions d’Acide chlorhydrique, d’eau lithinée et de Phloxine.

Réaliser trois bains d’OTTIX pendant 10 minutes.

Réaliser un bain d’OTTIX Shapper pendant 2 minutes.

Réaliser un bain d’Alcool pendant 1 minute.

Réaliser deux bains successifs d’eau du robinet pendant 30 secondes.

Réaliser un bain d’Hémalun pendant exactement 5 minutes.

Réaliser plusieurs bains d’eau du robinet jusqu’à ce que l’eau reste incolore.

Réaliser un aller-retour dans un bain d’Acide chlorhydrique.

Réaliser un bain d’eau du robinet pendant une minute.

Réaliser un aller-retour dans un bain d’eau lithinée.

Réaliser un bain d’eau du robinet pendant une minute.

Réaliser un bain de Phloxine pendant exactement 5 minutes.


Réaliser un allez-retour dans un bain d’Alcool Absolu.

Réaliser un bain d’OTTIX Shapper pendant 30 secondes.


Procéder au montage des lames.

Mettre les lames à sécher dans une étuve.

RESULTATS:

On obtient un tissu dont les noyaux sont colorés en bleu, le cytoplasme en rose et les fibres de collagène en

rose très pâle.

147

LA COLORATION PERIODIC ACID SHIFF (PAS)

PRINCIPE :

Le protocole consiste à réaliser différentes étapes de bains de coloration pour les lames afin d’obtenir une

coloration finale exploitable. Lors de biopsie cutanée, il n’est pas nécessaire de réaliser un témoin positif, la

lame basale servant alors de témoin intrinsèque. Cette coloration permet la mise en évidence et la détection

dans les tissus des glucides, tels que les homoglycanes (glycogène, amidon, cellulose…), les

homopolyaminosaccharides (Chitine), les hétéroglycanes (sialomucines et acide hyaluronique), les

glycoprotéïnes (hormones hypophysaires glycoprotéïques, thyroglobuline, mucines gastriques, mucus des

glandes salivaires, réticuline, …) et les glycolipides (cérébrosides et gangliosides).

MODE OPERATOIRE SIMPLIFIE:

Mettre des gants et mettre la hotte en route pendant toute la durée de la coloration.

Préparer une solution d’Acide périodique.



Réaliser un bain d’Alcool pendant 1 minute.


Réaliser un bain dans l’Acide périodique pendant exactement 10 minutes.

Réaliser un bain d’eau distillée pendant 1 minutes.

Réaliser un bain de réactif de Shiff pendant 30 minutes.

Réaliser un bain d’eau du robinet pendant 1 minute.

Réaliser un bain d’Hémalun pendant exactement 2 minutes.


Réaliser un aller-retour dans un bain d’Alcool Absolu.




Mettre les lames à sécher à l’étuve.

Vérifier la positivité du témoin intrinsèque.

RESULTATS :

On obtient un tissu dont la substance positive au PAS est colorée en rose à rouge-pourpre, les noyaux sont

colorés en bleu, et le fond en une teinte bleue pâle.

148

LA COLORATION LUNA

PRINCIPE:

Le protocole consiste à realiser différentes étapes de bains pour les lames afin d’obtenir une coloration finale

exploitable. Cette méthode de coloration permet la mise en évidence des granules dans les éosinophiles.

MODE OPERATOIRE SIMPLIFIE :

Préparer une solution d’éthanol à 95°, d’éthanol à 70°, d’hématoxyline, de chlorure de fer mère, de chlorure de

fer finale, de scarlet biebrich à 1%, d’hématoxyline de Weigerts-scarlet biebrich, d’acide alcool et de carbonate

de lithium.

Mettre en route la hotte pendant toute la durée de la coloration.

Mettre des gants et mettre la hotte en route pendant toute la durée de la coloration.

Préparer une solution d’Acide périodique.



Réaliser un bain d’Alcool Absolu pendant 1 minute.


A l’aide d’une pipette Pasteur mettre la solution d’hématoxyline/scarlet biebrich sur les lames pendant 5

minutes.

Différencier les lames avec la solution d’acide alcool pendant 1 à 2 minutes, toujours à l’aide d’une pipette

Pasteur.

Rincer les lames à l’eau du robinet pendant 1 minute.

Plonger les lames dans la solution de carbonate de lithium jusqu’à ce que la section devienne bleue et les

érythrocytes rouges.

Rincer à l’eau du robinet pendant 2 minutes.

Réaliser un aller-retour dans un bain d’Alcool Absolu.




RESULTATS :

On obtient un tissu dont le fond est coloré en bleu, les granules éosinophiles en rouge et les érythrocytes en

rouge.

149

LES IMMUNOMARQUAGES

PRINCIPE:

Le protocole consiste à faire différentes étapes de bains pour les lames pour obtenir une coloration finale

exploitable.

MODE OPERATOIRE SIMPLIFIE :

Préparer une solution d’eau oxygénée, de tampon citrate, de PBS, et les différents anticorps à diluer à l’aide du

diluent d’anticorps selon la concentration requise (Dilution 1/100 pour Ki67, 1/25 pour BLA 36, pur pour CD3 et

1/50 pour l’involucrine).



Réaliser un bain d’Alcool Absolu pendant 1 minute.


Réaliser un bain de PBS pendant 10 minutes.

Mettre les lames dans le tampon citrate au bain-marie pendant 40 minutes à 90°C.

Préparer les dilutions des anticoprs primaires dans la solution Antibody diluant.

Sortir les lames du bain-marie et les laisser refroidir.

Réaliser un bain dans le PBS pendant 10 minutes.

Mettre 500 L d’H2O2 sur chaque lame pendant 10 minutes.

Réaliser un bain dans le PBS pendant 10 minutes.

Mettre 200 L de sérum de blockage sur chaque lame pendant 30 minutes.

Mettre 200 L de l’anticorps primaire pendant 1 heure. Pour les témoins négatifs, mettre les lames témoins

dans le PBS en attendant les autres pendant 1 heure.

Oter l’anticorps primaire.

Mettre 200 L de l’anticorps secondaire pendant 30 minutes.

Oter l’anticorps secondaire et réaliser un bain de PBS pendant 10 minutes.

Mettre 200 L de complexe péroxydase sur chaque lame pendant 30 minutes.

Oter le complexe et réaliser un lavage dans le PBS pendant 10 minutes.

Mettre 200 L de Novared sur chaque lame pendant 5 minutes puis faire de lavages successifs dans l’eau du

robinet pendant 2 minutes.

Réaliser un bain dans l’Hémalun pendant 1 minute.


Faire une déshydratation (Alcool, Shapper, Ottix) comme pour les colorations classiques.

PANZUTI Pauline

Etude de la barrière cutanée chez les bovins par mesure de la Perte Insensible en Eau et du pH et par examens histopathologiques

Thèse d’Etat de Doctorat Vétérinaire : Lyon, 5 octobre 2012

RESUME :

L’objectif de ce travail était de mener une étude préliminaire dans le but de réactualiser nos connaissances sur les caractéristiques physico-chimiques (PIE, pH) et histopathologiques de la peau des bovins. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés à l’épiderme et à son rôle de barrière.

Nous avons réalisé une étude expérimentale originale, permettant à la fois, l’obtention de données sur la barrière cutanée des bovins, ainsi que l’élaboration d’un modèle de rupture de la barrière cutanée. Nos résultats nous ont permis de construire un premier modèle mettant en évidence la corrélation entre le statut de la barrière cutanée et la Perte Insensible en Eau. Nous avons aussi pu quantifier l’évolution du pH cutané. Enfin, des examens histopathologiques nous ont renseignés sur les phénomènes inflammatoires cutanés induits par une rupture de la barrière.

MOTS CLES : - bovins - épiderme - perméabilité - rupture

JURY : Président : Monsieur le Professeur Frédéric BERARD 1er Assesseur : Monsieur le Docteur Didier PIN 2ème Assesseur : Monsieur le Docteur Thierry MARCHAL

DATE DE SOUTENANCE : 5 octobre 2012

ADRESSE DE L’AUTEUR : 12 boulevard de coucy 69550 AMPLEPUIS

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