Mémoire de fin d'études

présenté pour l'obtention du diplôme d’Ingénieur Agronome

Spécialité : Elevage en Milieux Difficiles

Histologie du tractus génital femelle et caractérisation bioénergétique et oxydative des

ovocytes camelins avant et après maturation in vitro

par Bénédicte BENEULT

Année de soutenance : 2012

Organismes d'accueil :

- Dépt. Prod. Animales, Univ. Aldo Moro, Bari, Italie - Faculté d’Agriculture, Université du Caire, Egypte - CIRAD Montpellier, UMR SELMET

Mémoire de fin d'études

présenté pour l'obtention du diplôme d’Ingénieur Agronome

Spécialité : Elevage en Milieux Difficiles

Histologie du tractus génital femelle et caractérisation bioénergétique et oxydative des

ovocytes camelins avant et après maturation in vitro

par Bénédicte BENEULT

Mémoire préparé sous la direction de : François BOCQUIER

Présenté le : 30/08/2012 devant le jury composé de :

Présidente : Danièle MONTAGNAC, SupAgro, Dépt. MPRS

Maître de Stage: Bernard FAYE, Camel and range Research Center, Saoudi Arabia

Rapporteur Extérieur : Christelle BERTRAND-GADAY, INRA UMR-DMEM

Rapporteur Enseignant : Alexandre ICKOWICZ, CIRAD UMR-SELMET

Tuteur Ecole : François BOCQUIER, SupAgro, UMR-SELMET

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RESUME

Bénédicte Béneult

Titre : Histologie du tractus génital femelle et caractérisation bioénergétique et oxydative des ovocytes camelins avant et après maturation in vitro.

L’efficacité de reproduction des dromadaires est généralement connue pour être faible et ceci est dû à des caractéristiques propres de l’espèce (ovulation induite) et aux conditions d’élevage (milieux difficiles). Les techniques de reproduction assistée qui se développent peu à peu chez l’espèce cameline pourraient conduire à des avancées, des connaissances originales en reproduction et à des applications génétiques intéressantes. Cette étude s’intéresse à trois points principaux qui pourraient constituer un frein à la maîtrise de la reproduction chez les camelins : l’histologie du tractus génital, la réalisation des différentes étapes de production et de maturation des ovocytes in vitro et la maîtrise du statut bioénergétique et oxydatif de ces ovocytes. L’oviducte et l’utérus d’une femelle cyclique et d’une femelle gestante ont été comparés sur le plan histologique. Trois informations principales ressortent de cette comparaison : la présence chez la femelle cyclique de cloques apicales sur les cellules sécrétrices de l’épithélium de l’ampoule, la réduction -presque disparition- de la lumière au niveau de l’isthme chez la femelle gestante et une désorganisation de l’épithélium endométrique par l’insertion de cellules trophoblastiques au cours de la gestation. D’autre part, après prélèvements d’ovaires à l’abattoir, des ovocytes ont été collectés, maturés et colorés afin d’étudier, au cours de leur développement, leurs caractéristiques bioénergétiques et oxydatives. Les résultats montrent que les taux de collecte (5,9 ovocytes par ovaire) et de maturation (50%) obtenus correspondent à ceux rapportés dans la bibliographie. La caractérisation bioénergétique révèle qu’au cours de la maturation il se produit une relocalisation des mitochondries vers la périphérie de l’ovocyte, un changement d’organisation de ces mitochondries passant de petits agrégats à un réseau tubulaire et une augmentation de l’activité mitochondriale. Les Espèces Réactives de l’Oxygène conservent une organisation plus homogène entre les stades GV et M II mais leur intensité de fluorescence augmente également au cours de la maturation. En conclusion, cette étude de courte durée, a permis de mettre en place des méthodes descriptives de l’oviducte et l’utérus de dromadaire qui pourront être appliquée au matériel biologique que nous avons contribué à collecter. Les méthodologies appliquées classiquement aux ovocytes ovins ont permis de suivre la cinétique d’évolution d’ovocytes camelin. Nos résultats sont largement cohérents avec l’organisation et l’activité bioénergétique et oxydative de l’ovocyte in vitro. Toutefois, les quelques particularités que nous avons isolées doivent encore être validées dans des conditions de cultures qui pourraient justifier des ajustements méthodologiques mieux adaptées à l’espèce cameline.

Mots clés

Ovocyte, Dromadaire, maturation, oviducte, utérus, mitochondrie, ROS

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ABSTRACT

Bénédicte Béneult

Title: Dromedary camel genital tract histology and oocytes bioenergy and oxidative characterization during in vitro maturation process.

Biotechnologies in camel reproduction are still less developed than in other livestock

species. However biotechnologies could improve genetic merit and reproductive performance in camelids. The aim of this study is to investigate three parameters which could limit the success of assisted reproduction: genital tract status (histology), different steps of oocytes production and maturation and, lastly, oocytes bio-energy and oxidative status before and after maturation. A histological comparison of uterus and oviduct from a cyclic and a pregnant female has been lead. This comparison reveals three differences observation of apical blebs on secreting cells of the cyclic female that do not appears in the pregnant one, the isthmus of pregnant female is characterized by a narrow lumen and insertion of irregular trophoblastic cells into the pregnant uterus epithelium. On another side, we manipulate oocytes that have been collected by slicing of ovaries up taken from local slaughterhouses. These oocytes have been in vitro matured and stained to evaluate, during the development, their bio-energy and oxidative characteristics Results showed that collection rate (5.9 oocytes /ovary) and maturation rate (50%) obtained during the experiment are in agreement with previous studies. Along maturation, bio-energy characterization reveals changes, immature oocytes are characterised by an homogeneous mitochondria distribution and/or an organization in small aggregates while M II oocytes have pericortical mitochondria distribution and an organisation in tubular network. We could also observe that there is an increase of mitochondrial activity from immature to matured oocytes. Reactive oxygen species have a more homogeneous distribution in GV and M II stages but their fluorescence intensity also increase during the maturation. To conclude, this short time study ensured a provision of knowledge on oviduct and uterus descriptive methods of dromedary that still need to be developed. These methods could be used in further studies to analyse remaining biological samples that we contributed to collect. These methodologies, which are generally used in other mammals’ species, allow following camel oocytes kinetic evolution. Our results are in general agreement with bio-energy and oxidative organization and activity of in vitro oocytes. However we should consider camel particularities that we observed should be validated in culture condition and, eventually, some steps should be improved to enhance the efficiency of mature oocytes process in dromedary.

Key words

Oocytes, dromedary camel, oviduct, uterus, mitochondria, ROS

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الملخص العربي

بندكت بينوالتركيب النسيجي للجھاز التناسلي ا�نثوي في الجمال العربية و حيوية البويضات و خصائص ا�كسدة خ�ل : العنوان

.عملية ا�نضاج المعملي

فانه يمكن تحسين الكفاءة و مع ذلك . التقدم في التكنولوجيا الحيوية ما زال متأخراً في الجمال مقارنةً بباقي ا�نواع المزرعيةوالھدف من ھذه الدراسة ھو التحقق من ث�ثة مقاييس و التي . الوراثية و القدرة التناسلية للنوق باستخدام التكنولوجيا الحيوية

ناء التركيب الھيستولوجي للجھاز التناسلي ا�نثوي، الخطوات المختلفة اث: يمكن أن تحد من نجاح التقنيات التناسلية المساعدةعند المقارنة بين التركيب . تجميع البويضات و انضاجھا، وأخيرا حيوية البويضات و حالة ا�كسدة لھا قبل و بعد ا�نضاج

، إتضحت ث�ثة )اثناء الدورة المبيضية(الھيستولوجي للرحم وقناة المبيض بين ناقة اثناء الحمل و ناقة اخري ليست حاملل على الخ�يا المفرزة ل�نثي الغير حامل و التي لم تظھر في الناقة الحامل، يتميز اخت�فات، ظھور تجمعات من السوائ

من . برزخ الناقة الحامل بوجود تجويف ضيق و كذلك بوجود خ�يا تروفوب�ست غير منتظمة في الغشاء المبطن للرحمل عليھا من المجازر المحلية، استخدمت ناحية اخري تم التعامل مع البويضات التي تم تجميعھا من المبايض التي تم الحصو

التطور اثناء اثناء النضج، (تم انضاج ھذه البويضات في المعمل و صبغھا لتقييم .في تجميع البويضات) slicing(طريقة ال و معدل ا�نضاج ) مبيض/بويضة 5.9(اوضحت النتائج ان معدل تجميع البويضات ). حيوية البويضات، خصائص ا�كسدة

ا�نضاج لفترة طويلة و خصائص حيوية . الحصول عليھم خ�ل التجربة و بالتوافق مع الدراسات السابقة تم%) 50(با�ضافة (البويضات اظھرت عدة اخت�فات، البويضات الغير ناضجة تتميز بالتوزيع الغير متجانس للميتوكوندريا

و بانتظاميضات الناضجة فإن الميتوكوندريا تتوزع ان الميتوكوندريا تنظم في مجموعات صغيرة، بينما في البو )او&الىكما يمكن م�حظة زيادة في نشاط الميتوكوندريا في البويضات الناضجة عنھا في . تنظم الميتوكوندريا في شبكة انبوبية

ة ا�مية يكون لھا توزيع اكثر تجانساً في البويضات في المرحل) ROS(انواع ا�كسجين التفاعلية. البويضات الغير ناضجة)GV ( و مرحلة النضج)M II (ضمنت ھذه الدراسة قصيرة ا�جل إجما�ً، . و لكن كثافة ا�شعاع تزداد خ�ل ا�نضاج

و يمكن استخدام . توفير المعرفة بطرق وصف قناة المبيض و الرحم للجمال العربية و التي مازالت في حاجة الى تطويرھذه المنھجيات و التي تستخدم . على العينات المتبقية و التي ساھمت في تجميعھا ھذه الطرق في إجراء المزيد من الدراسات

النتائج التي تحصلنا عليھا . عادة في ا�نواع الخرى من الثدييات تسمح بتتبع التطور الحركي لبويضات الجمال العربيةو مع ذلك ينبغي دراسة . داخل المعملكانت متفقة بصورة عامة مع حيوية البويضات و تنظيم ا�كسدة و نشاط البويضات

خصوصيات الجمل التي �حظناھا كما ينبغي التحقق من صحة ظروف الزراعة في المعمل، و في النھاية ينبغي تحسين .بعض الخطوات لتحسين كفاءة ا�نضاج المعملي لبويضات الجمال العربية

الكلمات المفتاحية ROSبيض، الرحم، الميتوكوندريا،البويضات، الجمال العربية، قناة الم

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REMERCIEMENTS

Je tiens à remercier en premier lieu Bernard FAYE, mon maître de stage pour m’avoir donné l’opportunité de réaliser ce stage dans un domaine qui me tenait particulièrement à cœur.

Je remercie ensuite François BOCQUIER qui m’a suivie tout au long de ce stage, m’a soutenue et encouragée dans les moments de doutes et m’a fourni ses précieux conseils lors de la rédaction.

Mes remerciements vont également à Giovanni Michele LACALANDRA pour m’avoir accueillie au sein de son département Productions Animales de l’Université Aldo Moro, Bari, Italie.

Je remercie Elena DELL’AQUILA et toute son équipe : Manuel Filioli URANIO, Nicola Antonio MARTINO, Lucia RUTIGLIANO, qui m’ont parfaitement intégré dans leur équipe, ont pris le temps de partager leur savoir et m’ont beaucoup aidé dans le déroulement des expériences. Une pensée particulière pour Roberto RUSSO, qui m’a offert son aide et son expérience même pendant la rédaction de sa thèse.

Un grand merci à l’équipe du Laboratoire d’Embryologie de la Faculté d’Agriculture de l’Université du Caire : Dr. Asharaf Abdel HALIM EL-SAYED, Mohamed Magdy HASSAN, Abd El-Hay Gaber ABU-HESSIN, Omnia EL-SAYED qui ont su nous mettre à l’aise et mettre à disposition ce dont nous avons besoin pendant le mois que nous avons passé au Caire. Un merci tout particulier à Mohammed Hassan KHALIFA qui a toujours été très disponible, s’est plié en quatre pour nous rendre service et nous a fait partager la culture de son pays. Je tiens aussi à remercier Salvatore DE SANTIS pour sa disponibilité, son aide et sa participation à l’analyse des données. Je remercie tous les membres du jury : Danièle MONTAGNAC, Christelle BERTRAND-GADAY, Alexandre ICKOWICZ, Bernard FAYE et François BOCQUIER d’avoir accepté de juger mon travail et de modifié leur emploi du temps pour que cette soutenance ait lieu. Merci à mes co-équipiers pour ce travail en Italie et au Caire : Davide MONACO qui m’a accueillie et a su partager son expérience des dromadaires; Marcello RUBESSA pour sa bonne humeur, son humour mais aussi sa capacité partager ses compétences; Francesca CIANNARELLA avec qui j’ai partagé ma chambre, mes loisirs et le travail réalisé.

Enfin je tiens à exprimer ma gratitude envers mes amis italiens Barbara AMBRUOSI et Gian Luca ACCOGLI qui en plus de me faire découvrir leur pays m’ont également participé activement au travail de recherche ce qui m’a apporté une aide très précieuse.

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TABLE DES MATIERES

Résumé ....................................................................................................................................... 3

Abstract ...................................................................................................................................... 4

Remerciements ........................................................................................................................... 6

Table des matières ...................................................................................................................... 7

Avant-Propos .............................................................................................................................. 8

Sigles et acronymes .................................................................................................................... 9

Introduction générale ................................................................................................................ 10

Matériel et méthode .................................................................................................................. 12

Résultats ................................................................................................................................... 19

Discussion ................................................................................................................................ 27

Conclusions et perspectives ..................................................................................................... 31

Références bibliographiques .................................................................................................... 32 Liste des Tableaux et Figures ................................................................................................... 35

Annexes .................................................................................................................................... 36

Résumé ..................................................................................................................................... 38

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AVANT-PROPOS

Ce stage de fin d’étude s’inscrit dans un grand projet financé par l’union Européenne : le projet PROCAMED. L’objectif de ce projet est de promouvoir des systèmes en élevage camelin innovants pour le développement durable des filières locales et la gestion des territoires sahariens.

PROCAMED implique quatre partenaires :

- Le CIRAD, coordonnateur du projet ; - L’Institut des Régions Arides (IRA) - Laboratoire d’élevage et de la faune sauvage (Tunisie, Médenine) ; - Le Centre de Recherche sur le Désert (DRC) - Division de la Production Animale et des Volailles (Egypte) ; - L’Université des Etudes de Bari - Département Production Animale (Italie, Puglia)

De plus, la Faculté d’Agriculture de l’Université du Caire en Egypte qui travaille en étroit partenariat avec le DRC, a également collaboré à ce projet en nous accueillant dans ses locaux et en participant aux travaux de recherche. Le stage s’est déroulé en quatre parties et en trois lieux différents. Il est venu en support à des activités de recherche en cours de mise en œuvre par les partenaires italiens et égyptiens. Une première phase d’introduction a été réalisée au cours du mois d’avril à la Faculté Vétérinaire de Bari en Italie. Ensuite une phase de collecte de données et de réalisation des cultures d’un mois a eu lieu à la Faculté d’Agriculture du Caire en Egypte. Les mois de juin et juillet ont été consacrés au traitement et à l’analyse des données à Bari. Enfin, la rédaction s’est déroulée en France, au CIRAD et à Montpellier SupAgro. Il a bénéficié d’un soutien logistique et humain de l’ensemble des partenaires. NB : Les données expérimentales qui sont discutées dans ce mémoire, présentent un caractère préliminaire, et sont la propriété intellectuelle du projet PROCAMED.

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SIGLES ET ACRONYMES

ATP: Adénosine TriPhosphate

CIRAD: Centre international de recherche agronomique pour le développement

DCDHF DA : 2’,7’-19 dichlorodihydrofluorescein diacetate

FCS: Fetal Calf Serum, sérum de veau fœtal

GV: Vésicule Germinale

H199 (Sigma M-0393) : Milieu de rinçage ICSI: Intra-Cytoplasmic Spermatozoid injection intra cytoplasmique de spermatozoïde. M I: Métaphase I M II: Métaphase II M III: Métaphase III PROCAMED: Promotion des systèmes camelins innovants et des filières locales pour une gestion durable des territoires sahéliens

PBS : Phosphate Buffered Saline

ROS: Reactive Oxygen Species, espèces réactives de l’oxygène.

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INTRODUCTION GENERALE

L’efficacité de reproduction des dromadaires est généralement connue pour être faible et ceci est dû à des caractéristiques propres de l’espèce : ovulation induite, la saisonnalité et la courte période de reproduction, un âge de la puberté élevé (4 à 5 ans), une période de gestation longue (13 mois), une période d’anœstrus post-partum élevée (8 à 9 mois) avec un intervalle entre mise bas prolongé et quasiment aucune naissance de jumeaux (Skidmore, 2005). Bien que le premier clone par transfert nucléaire de cellules somatiques ait été produit récemment (Wani et al. 2010) et que les biotechnologies commencent peu à peu à se développer chez l’espèce cameline, les connaissances dans ce domaine sont encore bien loin de celles connues chez d’autres espèces domestiques. Pourtant, l’application et le développement de la maturation d’ovocytes in vitro, de la cryoconservation des gamètes et des embryons et d’autres techniques pourraient conduire à des avancées reproductives et génétiques intéressantes pour cette espèce.

Le développement des techniques de reproduction artificielle est limité par de nombreux aspects : tout d’abord la difficulté de récolter la semence du mâle ; les meilleurs résultats sont obtenus en utilisant un vagin artificiel et un mannequin mais cela nécessite une bonne maitrise de la technique et des coûts de mise en place élevés. Ensuite des traitements utilisant la FSH, l’eCG ou une combinaison des deux hormones permettent d’induire une superovulation mais des problèmes existent avec ces traitements, en effet certains animaux ne répondent pas au traitement, d’autres sont sur-stimulés et produisent de très nombreux follicules qui pour la plus part n’atteignent pas une taille suffisante pour ovuler et enfin certains animaux deviennent également réfractaires au traitement ce qui peut conduire à l’arrêt total de leur activité ovarienne (Tibary and Anouassi, 1997). D’autre part, les dromadaires sont une espèce à ovulation induite ce qui complique l’obtention d’une synchronisation de l’ovulation. Enfin, l’utilisation des gamètes et des embryons de cette espèce sans conservation donne des résultats assez satisfaisants mais lorsqu’ils sont conservés par réfrigération ou par congélation, les performances obtenues sont fortement réduites (Skidmore, 2005).

L’augmentation des rendements de ces techniques passe avant tout par une connaissance de la morphologie du tractus de l’animal où se déroulent les différentes étapes de la reproduction mais également par une connaissance de la structure et des modifications de structure des gamètes au cours du processus de reproduction.

Le tractus génital de la femelle dromadaire, comme celui des autres mammifères, comporte les trompes, l'utérus et le vagin. Du point de vue histologique, ces éléments ont tous la même structure de base : une paroi musculaire lisse, une bordure interne qui est la muqueuse et une couche externe de tissu conjonctif. La muqueuse et la couche musculaire présentent d'importantes variations selon leur localisation et leurs stades fonctionnels. L’ensemble du tractus subit des changements cycliques sous l'influence des hormones ovariennes libérées au cours du cycle. Ces changements cycliques du tractus génital facilitent l'entrée de l'ovule dans la trompe, la remontée des spermatozoïdes dans la trompe, le passage de l'ovule fécondé dans l'utérus et son implantation et son développement dans la muqueuse bordant la paroi utérine (endomètre). Parallèlement, les gamètes subissent de nombreuses modifications suite à leur émission en particulier au niveau cytoplasmique. Les mitochondries sont des organites intracellulaires où siège le métabolisme énergétique de la cellule reproductrice. La maturation et la redistribution des mitochondries, la production d’ATP et

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l’accumulation d’énergie durant l’oogenèse sont des éléments cruciaux pour l’activation, la fertilisation et le développement ultérieur des ovocytes (Van Blerkom et Davis 2007 ; Thompson et al., 2000). En particulier, pendant la maturation ovocytaire et le développement embryonnaire précoce, les mitochondries se relocalisent dans des régions spécifiques de l’ovocyte et cette localisation serait étroitement liée avec la qualité de l’ovocyte (Stojkovic et al., 2001). L’activité bioénergétique des mitochondries, y compris dans l’ovocyte, passe par la production d’ATP, l’homéostasie du calcium, la régulation du statut redox cytoplasmique et par l’émission de signaux de transduction (Dumollard et al, 2009). Des anomalies ou des dysfonctionnements de l’activité mitochondriale peuvent compromettre les processus de développement de l’ovocyte en induisant un désordre dans la ségrégation des chromosomes, des échecs de maturation et de fertilisation ou des fragmentations cellulaires.

Les ROS est un terme qui décrit et quantifie les molécules réactives et de radicaux libres dérivés des molécules d’oxygène (anion superoxyde O2

-, peroxyde d’hydrogène H2 O2,

radical péridroxyl OH-) (Turrens, 2003). Ces molécules peuvent servir à la fois de messagers intra- et intercellulaires. La majorité de ces molécules sont surtout des co-produits des transports d’électrons au cours de la phosphorylation oxydative mitochondriale (Cadenas et Davies 2000). Ces espèces sont responsables, d'une manière directe ou indirecte, de nombreux dommages oxydatifs au niveau moléculaire (acides nucléiques, protéines, lipides...) pouvant affecter considérablement l’intégrité des mécanismes cellulaires (Gardes-Albert et al., 2003). Sous des conditions physiologiques, les ROS sont normalement neutralisés par un système élaboré de défense (Winyard, Moody, et Jacob 2005). Mais hors de ces conditions, par exemple lors de culture in vitro, les ROS qui s’accumulent pourraient affecter certain mécanismes cellulaires et nuire à l’efficacité de la culture.

Dans cette étude, nous avons voulu traiter de trois points principaux qui pourraient constituer un frein à la maîtrise de la reproduction chez les camelins. Il s’agit de l’étude du tractus génital dans deux états extrêmes, ainsi que de la réalisation des différentes étapes de production et de maturation des ovocytes. A ma connaissance, peu d’études ont été réalisées sur l’histologie de l’oviducte et de l’utérus de dromadaire (Tayeb M.A.F, 1953 ; Osman A., 1965 ; Abdo M.S., Al-Janabi A.S., Al-Kafawi A.A., 1969 ; El-Wishy 1988), une seule étude récente concerne la distribution et l’activité mitochondriale dans l’ovocyte camelin (Abdoon et al. 2011) et aucune n’a encore traité de la distribution et des ROS dans les ovocytes de dromadaires. L’objectif général de cette étude est donc d’apporter des connaissances supplémentaires sur ces différents éléments reproductifs.

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MATERIEL ET METHODE

Morphologie de l’utérus et de l’oviducte : comparaison entre femelle gestante et femelle non gestante.

Collecte des échantillons Les tractus génitaux de dromadaires sont collectés à l’un des abattoirs du Caire puis transportés au laboratoire dans une glacière maintenue à 4°C par des blocs de glace. Au laboratoire, pour chaque appareil génital reçu, la phase du cycle œstral ainsi que les caractéristiques visibles relatives à l’animal sont identifiées et notées sur une fiche (annexe 1). Ensuite des échantillons sont prélevés sur différentes parties du tractus. Du côté gauche et du côté droit de l’appareil génital trois parties distinctes sont prélevées : l’oviducte (1), la jonction utéro-tubaire (2) et une partie de la corne utérine (3). La partie centrale de l’utérus (4) est également prélevée.

Figure 1 : Photographie de l’appareil génital d’une femelle dromadaire et localisation des sections réalisées (prise par

D.Monaco) Une fois prélevés de l’appareil génital, les échantillons sont redécoupés : pour la corne utérine et l’utérus les échantillons conservés doivent mesurer entre 3 et 5 mm d’épaisseur. Concernant l’oviducte, trois échantillons sont prélevés: un échantillon de la partie se trouvant du coté de l’ovaire : l’ampoule, un échantillon central et enfin un échantillon de la partie se trouvant du coté de la corne utérine : l’isthme. Traitement des échantillons Lorsque les échantillons ont été découpés, ils sont directement placés dans une flasque en plastique (Falcon, 50mL) contenant une solution de Bouin. La solution de Bouin est un

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2 3

4

4cm

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fixateur cellulaire utilisé en cyto-histologie. Il se compose d'acide picrique, d'acide acétique et de formaldéhyde, il permet une bonne conservation des noyaux et des chromosomes. Les échantillons sont placés pendant 24h dans cette solution. Rinçage A l’issue des 24h, la solution de Bouin est retirée puis remplacée par de l’éthanol à 50%. Ensuite pendant 24h les échantillons restent dans l’éthanol à 50% qui est renouvelé toutes les deux heures pendant les 6 premières heures puis le temps entre les renouvellements augmente (toute les 3h, 4h, etc…). Lorsque les 24h dans l’éthanol à 50% sont écoulés, l’éthanol à 50% est remplacé par de l’éthanol à 70% et la même opération est répétée. Les différents rinçages ayant été effectués, la procédure de déshydratation peut commencer. Procédure de déshydratation La déshydratation se déroule de la manière suivante :

• 2 rinçages dans l’éthanol 50% (30 minutes chacun) • 2 rinçages dans l’éthanol 70% (30 minutes chacun)

Si le temps n’est pas suffisant pour effectuer tous les rinçages dans la journée, on peut laisser les parties prélevées dans de l’éthanol 50% ou 70% (suivant l’étape où l’on s’arrête) et reprendre les échantillons le lendemain en effectuant de nouveau un ou plusieurs rinçages dans l’éthanol 50% ou 70% (suivant l’étape où l’on s’est arrêté).

• 2 rinçages dans l’éthanol 80% (30 minutes chacun) • 2 rinçages dans l’éthanol 96% (30 minutes chacun) • 3 rinçages dans l’éthanol 100% (20 minutes chacun) ou 2 rinçages de 30min • Mettre tous les échantillons dans le xylène maximum une heure et demie normalement

la réaction a lieu 30 à 40 min après immersion dans le xylène, les tissus doivent devenir transparents, dans ce cas on peut arrêter l’immersion.

Le xylène sert de liquide intermédiaire car il est miscible à la fois à l’alcool et à la paraffine. Inclusion

Après la déshydratation, les prélèvements sont transférés dans de la paraffine à 60°C d’abord pendant 30 minutes puis un second passage avec changement de paraffine pendant 2 heures. Les échantillons sont ensuite disposés deux par deux (trois maximum) dans des petits récipients en aluminium, un couvercle en plastique est posé sur les récipients puis le tout est rempli de paraffine. Une fois cette opération terminée, les petits blocs sont placés dans le réfrigérateur à 4°C. Réalisation des coupes A partir des blocs de paraffine réalisés auparavant et à l’aide d’un microtome, des sections de 5 ou 6 µm sont obtenues. Ces sections sont ensuite récoltées sur des lames avant d’être ensuite colorées. Coloration des sections obtenues Avant d’initier la coloration, les lames sont passées dans deux bains de xylène de 7 minutes chacun pour permettre le déparaffinage puis elles vont être soumises à une réhydratation. La

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réhydratation consiste en des bains successifs d’alcool de concentration descendante tous d’une durée de 5 minutes : d’abord alcool 100%, puis 96%, 80%, 70% et 50%. Après un rinçage de 2 minutes dans de l’eau distillée, les lames sont placées dans le premier colorant : l’Hématoxyline pendant 8 minutes (figure 2). L’Hématoxyline va se fixer sur les acides phosphoriques des noyaux permettant ainsi une coloration nucléaire. Ensuite, un rinçage dans l’eau pendant 10 minutes est effectué avant d’effectuer la seconde coloration. La seconde coloration dure 25 minutes pendant lesquelles les lames sont plongées dans l’Eosine. L’Eosine se fixe sur les groupements positifs des protéines cytoplasmiques elle permet donc une coloration du cytoplasme des cellules. A la suite de ces 25 minutes, les lames subissent un bain de 2minutes dans un mélange d’eau et d’acide acétique qui permet de fixer la coloration de l’Eosine puis une déshydratation en effectuant le procédé inverse : des bains de 5 minutes dans de l’alcool mais cette fois en concentration ascendante. La coloration termine comme elle l’a commencé avec deux bains de 7 minutes dans du xylène. Les lames sont recouvertes et collées avec des lamelles, elles sont ainsi prêtes pour l’observation (figure 3).

Figure 2 : Bain de coloration dans l’Hématoxyline Figure 3 : Lame obtenue après coloration

Caractérisation bioénergétique et oxydative des ovocytes in vitro Collecte des ovocytes Les ovaires de dromadaires sont collectés par un des membres du laboratoire d’embryologie de la Faculté d’Agriculture du Caire dans trois abattoirs situés aux alentours du Caire. Après collecte, les ovaires sont immédiatement placés à 38°C dans une bouteille thermos contenant un milieu isotonique, puis transportés en moins de deux heures au laboratoire d’embryologie. Arrivés au laboratoire, les ovaires sont d’abord lavés dans la solution saline puis débarrassés de l’oviducte et du ligament ovarien. Après un court bain (3-4 secondes) dans l’éthanol à 70%, les ovaires sont conservés à 30°C dans une solution saline. La méthode utilisée pour collecter les ovocytes est l’incision des follicules. Sur les ovaires, chaque follicule est incisé avec une lame de rasoir au dessus d’une boite de pétri contenant un peu de PBS (figure 4), puis ils sont rincés au PBS à l’aide d’une seringue. Le fluide folliculaire est ainsi récolté dans la boite de pétri. Les ovocytes présents sont observés et collectés ensuite sous microscope.

Figure 4 : Incision d’un follicule à la surface de l’ovaire

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Une fois collectés et rincés dans une solution de H199 (Sigma M-0393) +10% FCS (Fetal Calf Serum, Sigma F-4135), les ovocytes sont triés sous microscope grâce à une micropipette en 4 catégories : A : cytoplasme homogène et plusieurs couches de cellules du cumulus B : cytoplasme homogène, seulement une ou deux couches de cellules du cumulus C : cytoplasme moins régulier avec quelques zones sombres, cumulus moins compact D : cytoplasme irrégulier et/ou sans cellules du cumulus Seuls les ovocytes de catégories A et B disposant de cellules du cumulus sont conservés pour l’étude présente. En effet, chez le bovin, il existe une forte communication entre les cellules du cumulus et l’ovocyte qui est importante pour les échanges de métabolites au cours de la maturation. Les ovocytes entourés d’une ou plusieurs couches de cellules du cumulus et avec un cytoplasme homogène présentent de meilleurs taux de maturation et de fertilisation (Stojkovic et al, 2001). Cependant environ 150 ovocytes de catégories C et D ont été collectés et confiés à l’équipe du laboratoire égyptien pour réaliser une étude sur l’expression génétique. Une partie de ces ovocytes est mise en maturation puis colorée, l’autre partie est directement colorée. Maturation Le milieu de maturation utilisé est le suivant (Wani, 2008) :

- M 199 (Gibco 22340) - 0.25mg/ mL pyruvic acid (Sigma 4562) - 50µG/mL gentamicine (Sigma G-1272) - 10µg/m L bFSH (Sigma F-8174) - 10µg/m L bLH ( Sigma L-5269) - 1µg/m L Estradiol ( Sigma E-8875) - 20ng/mL eGF - 15 % FCS (Fetal Calf Serum, Sigma F-4135) (750 µL) - 0.3 mM cystine ( Sigma C-6727) (inspiré de Rubessa,

données non publiées) Figure 5 : Boite de pétri contenant

le milieu de maturation La solution de maturation est placée dans une boite de pétri à 4 puits (figure 5). Les ovocytes A et B sélectionnés sont disposés dans ces puits (environ 30 par puits). La maturation dure 42h dans l’incubateur à 38°C et avec 5% de CO2. Après les 42h de maturation, les ovocytes sont dénudés dans un milieu de rinçage (H199 + 10 % FCS) contenant 80U d’acide hyaluronique (Sigma H-3506) . Une fois dénudés, les ovocytes sont examinés, triés et répartis en 5 catégories: morts, présentant un globule polaire, activés, présentant deux globules polaires ou en vie mais sans globule polaire. Cette répartition et ce comptage permettent de déterminer le taux de maturation.

16

Coloration Le but des colorations est de pouvoir identifier spécifiquement la localisation et l’intensité de l’activité mitochondriale (Mitotracker Orange CMTM Ros, Molecular Probes M-7510, Oregon, USA), la localisation et l’intensité de l’activité des ROS (DCDHF DA, Sigma D6883) et enfin pour observer la chromatine au sein de l’ovocyte pour déterminer le statut nucléaire (Hoechst 33258, Sigma B-1155). Ces trois colorations peuvent être réalisées successivement car les différents colorants ne sont pas toxiques et se fixent sur des cellules différentes au sein de l’ovocyte. Cette étape est effectuée sur tous les ovocytes immatures ou matures dénudés. Les ovocytes sont lavés trois fois dans du PBS contenant 3% d’albumine de sérum bovin (BSA) puis incubés pendant 30 min dans le PSB+ BSA 3% additionné de 280 nM MitoTracker Orange (CMTM Ros Molecular Probes M-7510, Oregon, USA) à 38,5°C et 5%

CO2 (Ambruosi et al, 2011; Martino et al, 2012). Le Mitotracker est un colorant qui se lie à certaines molécules de la membrane interne de la mitochondrie et permet sous microscope à fluorescence de déterminer la distribution et l’activité mitochondriale de l’ovocyte. A la suite de ces 30 minutes, les ovocytes sont rincés une fois dans une solution de PBS+ BSA 0,3% puis ils sont incubés pendant 15 minutes dans une solution de PBS+BSA 0.3% +10 µM 2’,7’-19 dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCDHF DA; Yang et al. 1998; Kuznetsov et al. 2011) dans le but de localiser et de détecter les sources d’espèces réactives de l’oxygène. La membrane cellulaire est perméable à la molécule de DCDHF DA qui, sous l’activité estérase intracellulaire, se transforme et peut ensuite réagir avec H2O2 ou bien des peroxydes lipidiques. Sous éclairage fluorescent, l’intensité et la localisation de la fluorescence permet de caractériser l’activité des ROS. Après ces deux colorations, les ovocytes sont rincés trois fois dans du PBS puis fixés dans une solution de PBS + 2% paraformaldéhyde pendant une nuit à 4 °C. La dernière étape de la coloration consiste à colorer les ovocytes à l’aide de 2.5 µg/mL d’Hoechst 33258 dans 3:1 (v/v) glycerol/PBS. L’ Hoechst 33258 est un colorant chromosomique qui interagit avec l’ADN. Les ovocytes sont ensuite montés entre lames et lamelles fixées avec du vernis à ongles. Les lames obtenues peuvent ensuite être conservées dans l’obscurité à 4°C jusqu’au moment de l’observation. Observations et évaluations Statut nucléaire Le stade méiotique des ovocytes est évalué sous un microscope à épifluorescence (Nikon Eclipse 600; grossissement 400x) équipé d’un filtre B-2 A (excitation 460 nm / émission 346 nm). Différents stades sont observés :

• vésicule germinale (GV) : début de prophase, chromatine pas encore condensée • métaphase I (M I) : pendant la première division, la chromatine est condensée et les

paires de chromosomes homologues se placent de part et d'autre du plan équatorial. • métaphase II (M II) : pendant la seconde division, les chromosomes viennent se placer

sur la plaque équatoriale. • métaphase III (M III) : ovocyte présentant trois spots fluorescents : la chromatine de

l’ovocyte et deux globules polaires. Ces ovocytes sont des ovocytes activés. (Wani, 2008)

• dégénérés : pas de chromatine observable.

17

Distribution mitochondriale et localisation des espèces réactives de l’oxygène Après l’évaluation nucléaire, seuls les ovocytes non dégénérés sont utilisés pour réaliser l’évaluation mitochondriale et des ROS. Les ovocytes sont observés au grossissement 600 avec immersion dans l’huile sous un microscope confocal à balayage laser Nikon C1/TE2000. Un rayon laser hélium/néon à 543 nm et un filtre G-2 A (exposition 576 nm et émission 551 nm) ont été utilisés pour révéler le MitoTracker orange CMTM Ros (figure 6). Et un rayon laser aux ions argon à 488nm avec un filtre B-2 A (exposition 495 nm et émission 519 nm) a été utilisé pour révéler le DCF.

Figure 6 : Microscope confocal relié à l’ordinateur

Une série de 25 balayages depuis le sommet jusqu’au bas de l’ovocyte est réalisée ce qui permet d’obtenir une vision tridimensionnelle. Un tri des ovocytes est effectué en fonction de la distribution des mitochondries et des ROS. Les dénominations retenues pour le tri sont les suivantes :

• SA (Small Aggregates): petits agrégats, répartition homogène • DTN (Diffused Tubular Network) : réseau tubulaire diffus • PCTN ( PeriCortical Tubular Network) : réseau tubulaire plus intense en périphérie de

l’ovocyte • PC/NTN (PeriCortical/Perinuclear Tubular Network) : réseau tubulaire plus intense en

périphérie de l’ovocyte et autour du noyau. (inspiré par Ambruosi et al. 2011; Martino et al. 2012.

Quantification de l’intensité de fluorescence du Mitotracker Orange CMTM Ros et du DCDHF DA Pour chaque ovocyte, l’intensité de fluorescence est mesurée au niveau du plan équatorial à l’aide du logiciel « EZ-C1 Gold Version 3.70 image analysis » pour microscope confocal Nikon C1. Un cercle est dessiné autour de l’ovocyte de manière à ne mesurer que la zone cytoplasmique. L’’intensité de fluorescence est mesurée par le logiciel et est exprimé en ADU (Arbitrary Densitometric Units). Les paramètres relatifs à l’intensité (énergie du laser, détection du signal) sont maintenus constants pour l’ensemble des mesures.

18

Analyse de la co-localisation mitochondrie/ROS L’analyse de la co-localisation est effectuée en utilisant le logiciel EZC1 Gold Version 3.70. Le degré de co-localisation obtenu représente le coefficient de corrélation de Pearson qui permet de quantifier le degré de chevauchement entre la fluorescence du Mitotracker et celle du DCDHF DA (Martino et al., 2012). L’hypothèse étant qu’une co-localisation élevée entre activité mitochondriale et ROS serait l’indicateur d’une forte production d’ATP et traduirait des conditions cellulaires saines dans les hépatocytes (Raval et al. 2006). Chez l’espèce ovine, un haut niveau de co-localisation se révèle également être un bon indicateur d’ovocytes au stade M II maturés in vivo (Martino et al., 2012). Analyse statistique Pour l’analyse qualitative des données de la distribution des mitochondries et des ROS, le test du χ2 avec une correction de Yates a été utilisé. Concernant les valeurs quantitatives de l’intensité de fluorescence, les moyennes et écart-types ont été calculés puis les valeurs ont été comparées par groupe deux à deux à l’aide d’un test de Student bilatéral (SigmaPlot software).

19

RESULTATS

Morphologie de l’utérus et de l’oviducte : comparaison entre femelle gestante et femelle non gestante.

Les appareils génitaux proviennent d’animaux abattus dont nous ne connaissons pas l’historique. Les estimations sur l’âge et l’état des animaux ne sont réalisés qu’à partir du tractus génital. Les coupes obtenues proviennent de deux animaux différents : 1 : une femelle non gestante d’âge moyen avec des ovaires fonctionnels en activité. 2 : une femelle gestante avec un fœtus de 30cm soit une gestation d’environ 5 mois. Pour cette étude, trois parties distinctes du tractus ont été coupées, observées et analysées : l’ampoule, l’isthme et l’utérus. Les parties de l’oviducte, l’ampoule et l’isthme ont été prélevés sur le coté gauche du tractus pour chacun des deux animaux.

Comme pour la plupart des mammifères, la paroi de l'oviducte est divisée en trois couches, de l'extérieur vers l'intérieur se trouvent : une couche séreuse (adventice), une couche musculaire et une muqueuse. La couche séreuse ou adventice est constituée d’un tissu conjonctif très vascularisé. La couche musculaire présente deux sous-couches, une interne où les fibres musculaires lisses sont disposées de manière circulaire, et une externe où elles sont disposées longitudinalement. La microscopie optique révèle que l’ensemble de la muqueuse de l'oviducte est constitué d’un tissu conjonctif lâche appelé lamina propria et ce tissu est bordé d’un épithélium pseudo-stratifié comprenant des cellules épithéliales prismatiques. Cet épithélium présente deux types cellulaires distincts, des cellules ciliées et non-ciliées (sécrétrices). L’ampoule L'ampoule est caractérisée par de nombreux replis longitudinaux de la muqueuse qui forment d’importantes ramifications ainsi que par une paroi musculaire de faible épaisseur pour les deux animaux (figure 7 A et B). Dans l'ampoule de l’animal 1, les cellules non-ciliées présentent des cloques apicales (figure 7 C) qui ne sont pas observables chez l’animal 2 (figure 7 D).

Figure 7 : A : coupe transversale de l’oviducte au niveau(G=2.5), B : coupe transversale de l’oviducte au niveau de l’ampoule de l’animal 2 (G=2.5),

C : agrandissement de l’épithélium de l’animal 1 (G=100),l’épithélium de l’animal 2 (G=100).

L’Isthme

Contrairement à l'ampoule, l'isthme des deux échantillons montrecourts et sans ramifications. La couche musculaire est que sur les sections de l’ampouleparticulièrement remarquable. En effet, pour l’animal 2, la lumière au centre de l’oviducte est quasi-inexistante. L’espace entre les replis est très étroit et contient une substance filamenteuse (figure 8 D). Les cellules noncloques apicales (figure 8 C, D).

Cyclique

Figure 8 : A : coupe transversale de l’oviducte au niveau de l’isthme de l’animal 1 (G=2.5), B : coupe transversale de l’oviducte au niveau de l’isthme de l’animal 2 (G=2.5), Cagrandissement de l’épithélium de l’animal 1 (G=100),de l’animal 2 (G=100).

L

R

CM

CA

R

L CM

20

oupe transversale de l’oviducte au niveau de l’ampoule: coupe transversale de l’oviducte au niveau de l’ampoule de l’animal 2 (G=2.5),

: agrandissement de l’épithélium de l’animal 1 (G=100), D : agrandissement de l’épithélium de l’animal 2 (G=100).

mpoule, l'isthme des deux échantillons montre des replis de la muqueuseLa couche musculaire est bien plus développée

que sur les sections de l’ampoule (figure 8 A, B). Une différence entre les deux aparticulièrement remarquable. En effet, pour l’animal 2, la lumière au centre de l’oviducte est

inexistante. L’espace entre les replis est très étroit et contient une substance es cellules non-ciliées des deux échantillons

C, D). En gestation

: coupe transversale de l’oviducte au niveau de l’isthme de l’animal 1 (G=2.5), ’oviducte au niveau de l’isthme de l’animal 2 (G=2.5), C

agrandissement de l’épithélium de l’animal 1 (G=100), D : agrandissement de l’épithélium

L

R

CM A

C

MF

A

C

R CM

de l’ampoule de l’animal 1 : coupe transversale de l’oviducte au niveau de l’ampoule de l’animal 2 (G=2.5),

: agrandissement de

replis de la muqueuse développée et plus épaisse

Une différence entre les deux animaux est particulièrement remarquable. En effet, pour l’animal 2, la lumière au centre de l’oviducte est

inexistante. L’espace entre les replis est très étroit et contient une substance ne montrent pas de

: coupe transversale de l’oviducte au niveau de l’isthme de l’animal 1 (G=2.5), ’oviducte au niveau de l’isthme de l’animal 2 (G=2.5), C :

: agrandissement de l’épithélium

R : Replis de la muqueuse L : Lumière de l’oviducte

CM : Couche musculaire CA : Cloques apicales

B

D

R : Replis de la muqueuse L : Lumière de l’oviducte CM : Couche musculaire M MF : Matériel filamenteux

B

D

L’utérus En ce qui concerne l’animal cycliqueuni-stratifié à cellules prismatiques. Sous cet épithélium se trouve également une lamina propria : tissu conjonctif spécialisé riche en cellules, contenant des vaisseaux sanguins et également des glandes tubulairesdes changements important au niveau de l'utérus pendant la gestationparticulier, l’épithélium a une structure différente de celui de l’animal observer une modification de la forganisation. Ainsi l'épithéliumcubiques entre lesquelles sont insérés de nombreux petits vaisseaux sanguins. Ces cellules épithéliales sont également en contact avec des cellules plus grandes et plus irrégulières qui sont des cellules du trophoblastesur la paroi utérine depuis le début du développement embryonnairenotamment permettre l’attachement de l’embryon à la paroi utérine mais elles ont également un rôle nourricier pour l’embryon.

Figure 9 : A : coupe transvertransversale de l’utérus de l’animal 2 (G=2.5), B’la muqueuse (G=40), CD : agrandissement de l’épithélium de l’animal 2

E : Epithélium de l’endomètre C : Tissu conjonctif G : Glande tubulaire M V : Vaisseau sanguin

T : Cellule du trophoblaste

E

21

cyclique, la paroi utérine : l’endomètre est bordé d’un épithélium stratifié à cellules prismatiques. Sous cet épithélium se trouve également une lamina

: tissu conjonctif spécialisé riche en cellules, contenant des vaisseaux sanguins et également des glandes tubulaires (figure 9 A, C). La microscopie optique

au niveau de l'utérus pendant la gestation (particulier, l’épithélium a une structure différente de celui de l’animal observer une modification de la forme des cellules épithéliales mais également de leur

l'épithélium de l’animal en gestation montre des cellules épithéliales cubiques entre lesquelles sont insérés de nombreux petits vaisseaux sanguins. Ces cellules

alement en contact avec des cellules plus grandes et plus irrégulières qui sont des cellules du trophoblaste (figure 9 B ', D). Les cellules du trophoblaste sont présentes sur la paroi utérine depuis le début du développement embryonnaire : elles ont plusnotamment permettre l’attachement de l’embryon à la paroi utérine mais elles ont également un rôle nourricier pour l’embryon.

Cyclique En gestation

coupe transversale de l’utérus de l’animal 1 (G=20), Btransversale de l’utérus de l’animal 2 (G=2.5), B’ : agrandissement au niveau de la muqueuse (G=40), C : agrandissement de l’épithélium de l’animal 1 (G=40),

: agrandissement de l’épithélium de l’animal 2 (G=100).

G

T

V

C

C

V

G A

C

E

G

G

V

C

bordé d’un épithélium stratifié à cellules prismatiques. Sous cet épithélium se trouve également une lamina

: tissu conjonctif spécialisé riche en cellules, contenant des vaisseaux sanguins et La microscopie optique révèle clairement

(figure 9 B, D). En particulier, l’épithélium a une structure différente de celui de l’animal cyclique. On peut

mais également de leur de l’animal en gestation montre des cellules épithéliales

cubiques entre lesquelles sont insérés de nombreux petits vaisseaux sanguins. Ces cellules alement en contact avec des cellules plus grandes et plus irrégulières qui

Les cellules du trophoblaste sont présentes : elles ont plusieurs rôles

notamment permettre l’attachement de l’embryon à la paroi utérine mais elles ont également

En gestation

sale de l’utérus de l’animal 1 (G=20), B : coupe agrandissement au niveau de

: agrandissement de l’épithélium de l’animal 1 (G=40),

E

E

B

D

B’

C

22

Caractérisation bioénergétique et oxydative des ovocytes Collecte des ovocytes et maturation

Sur l’ensemble des 4 semaines qui se sont déroulées au Caire, nous avons reçu un total de 196 ovaires. A partir de ces ovaires, environ 1150 ovocytes des catégories A et B ont été obtenus ce qui fait une moyenne de 5,9 ovocytes A et B par ovaire. Plusieurs usages ont été fait de ces ovocytes : 55 ovocytes immatures ont été conservés pour la coloration des mitochondries et des ROS, 65 ovocytes ont été confiés à l’équipe égyptienne dans le but de réaliser une étude sur l’expression génétique (plus 155 ovocytes de catégories C et D), et enfin environ 1000 ovocytes ont été mis en maturation. Au total 11 essais de maturation ont été réalisés. Toutefois après les deux premières expériences, une contamination microbienne est survenue au cours de la maturation. Ce qui a eu pour conséquence la perte de près de la moitié des ovocytes. Pour remédier à cette contamination par une bactérie non identifiée après analyse au laboratoire, l’antibiotique du milieu de maturation : la gentamicine a été remplacée par un mélange d’antibiotique plus efficace : pénicilline-streptomycine (même quantité que la gentamicine). L’usage de cet antibiotique nous a permis de stopper la contamination mais a engendré une forte baisse du taux de maturation. En effet pour les deux premières expériences de maturation qui ont été effectuées, le taux d’ovocytes présentant un globule polaire après maturation était de 51%. Alors que pour les dernières expériences avec la pénicilline-streptomycine le taux n’était plus que de 25%.

Figure 7 : A : Ovocyte immature B: ovocyte mature présentant un globule polaire (GP)

Finalement, après les différentes manipulations et colorations, 40 ovocytes sans maturation et 110 ovocytes après maturation ont été placés entre lame et lamelles pour l’observation. Remarque : aucune différence n’a été observée entre les ovocytes maturés avec ou sans pénicilline-streptomycine, nous avons donc décidé de les regrouper.

Évaluation du statut nucléaire Les observations sous microscope à fluorescence nous ont permis de déterminer le statut nucléaire de chaque ovocyte grâce à la coloration avec l’Hoechst 33258. Les résultats obtenus sont les suivant :

GP

A B

23

Tableau 1 : Les différents statuts nucléaires des ovocytes

Sans maturation Après maturation

GV 24 16

M I 4 27

M II 0 40

M III 1 9

Dégénérés 11 18

Total 40 110

Cette évaluation nucléaire a été réalisée sur l’ensemble des ovocytes placés entre lame et lamelles. Par la suite, les ovocytes dégénérés et les ovocytes endommagés n’ont pas été retenus pour l’évaluation des mitochondries et des ROS. Evaluation de la distribution des mitochondries

Dans le Tableau 2 sont portés les résultats de la distribution mitochondriale en fonction du stade de l’ovocyte.

Tableau 2 : Répartition de la distribution des mitochondries pour les différents groupes d’ovocytes selon de leur statut nucléaire.

Conventions: SA (Small Aggregates), DTN (Diffused Tubular Network), PCTN (PeriCortical Tubular Network) et PC/NTN (PeriCortical/Perinuclear Tubular Network) .Toutes les valeurs

accompagnées d’un exposant différent diffèrent au seuil de 5% (p<0,05) par le test du χ2. L’absence d’exposant indique qu’il n’y a aucune différence significative entre ces valeurs.

Les tests statistiques ont été réalisés que pour les groupes GV et M II car pour le groupes M I et M III, les effectifs sont trop faibles pour pouvoir utiliser ces tests. Les résultats montrent que pour la majorité des ovocytes au stade GV les mitochondries sont réparties de façon homogène dans l’ovocyte et se présentent sous forment de petits agrégats. Cette répartition en petits agrégats ne se retrouve ni chez les ovocytes M I ni chez les ovocytes M III et très peu chez les M II ; pour ces ovocytes MI, MII, MIII, les mitochondries sont organisées en réseau tubulaire. Dans ces trois types regroupés, les mitochondries sont principalement réparties en périphérie de l’ovocyte et/ou autour du noyau (entre 63 et 80%).

Evaluation de la distribution des ROS

De la même manière que pour la distribution mitochondriale, le tableau 3 présente la répartition de la distribution des ROS selon les différents groupes d’ovocytes.

Mito. Total SA DTN PCTN PC/NTN Anormal

GV 23(100%) 15 (65%) a 6 (26%)

2 (9%)

b 0 0

M I 10(100%) 0 2 (20%)

5 (50%) 3 (30%)

0

M II 34(100%) 5 (15%) b

9 (27%) 14 (41%)

a 4 (12%)

2 (6%)

M III 9(100%) 0 2 (22%) 3 (33%)

4 (44%)

0

24

ROS Total SA DTN PCTN PC/NTN Anormal

GV 23(100%) 17 (74%) 6 (26%) 0 0 0

M I 10(100%) 0 6 (60%) 3 (30%) 1 (10%) 0

M II 34(100%) 16 (47%) 7 (21%) 7 (21%) 2 (6%) 2 (6%)

M III 9(100%) 0 4 (44%) 2 (22%) 3 (33%) 0

Toutes les valeurs accompagnées d’un exposant différent, différent au seuil de 5% (p<0,05) par le test du χ2. L’absence d’exposant indique qu’il n’y a aucune différence significative entre ces

valeurs.

Aucun résultat significatif n’est ressorti de cette évaluation, on peut toutefois remarquer que la répartition des ROS au sein de l’ovocyte est plus homogène que celle des mitochondries. Pour les ovocytes MI et MIII, l’organisation des ROS est majoritairement tubulaire tout comme les mitochondries mais pour les ovocytes GV et M II les ROS sont plutôt organisés en petits agrégats.

A B C D E

GV

MI

M II

M III

Figure 8 : Photographies pour chacun des groupes des observations microscopiques de contraste (A), d’évaluation du statut nucléaire (B), de la distribution mitochondriale (C), de la distribution des ROS (D) et de la co-localisation entre mitochondrie et ROS (E)

Tableau 3: Répartition de la distribution des ROS pour les différents types d’ovocytes en fonction de leur statut nucléaire.

25

Intensité de fluorescence des mitochondries et des ROS

Les valeurs obtenues à l’aide du logiciel « EZ-C1 Gold Version 3.70 image analysis » pour microscope confocal Nikon C1 permettent de représenter l’évolution de l’intensité de fluorescence des mitochondries et des ROS en fonction du statut nucléaire de l’ovocyte.

Figure 9 : Représentation graphique de l’intensité de fluorescence pour les différents groupes d’ovocytes. Test de Sudent : a,b :p<0,05 ; a,c :p<0,05 Une amélioration du statut bioénergétique est observable entre les stades GV et M I et entre les stades GV et MII. En effet, on observe une augmentation de l’activité mitochondriale et du niveau intracellulaire des ROS entre les différents stades. L’intensité de fluorescence est maximale au stade M II puis diminue au stade MIII. L’activité mitochondriale et le niveau intracellulaire d’ROS évoluent de manière similaire quoique non significative dans le cas des ROS.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

IF MITO IF ROS

Intensité de fluorescence aux différents stades de

maturation

GV

M I

MII

M III

ac

a

b

c

26

Figure 10 : Représentation graphique de la co-localisation entre

mitochondrie et ERO pour les différents groupes d’ovocytes. Test de Sudent : a,b :p<0,05 ; a,c :p<0,05

D’après ces résultats, il n’existe pas de différence significative entre la co-localisation du groupe GV et du groupe M II, mais il en existe une entre les groupes GV et MI et également entre les groupes GV et MIII.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

GV M I MII MIII

Colocalisation Mito/ROSb,c

a

b a,b

27

DISCUSSION

Histologie de l’oviducte de dromadaire : comparaison de stades physiologique extrêmes

Les appareils génitaux qui ont été étudiés proviennent d’animaux abattus dont nous ne connaissons pas l’historique. Les estimations sur l’âge et l’état des animaux ne sont réalisés qu’à partir du tractus génital. Les résultats de la première partie de l’étude concernant l’histologie de l’oviducte et de l’utérus montrent que l’organisation générale de l’oviducte des dromadaires est semblable à celle des autres espèces domestiques (Abdalla, 1968 ; Salari, 2011). On retrouve une organisation de la paroi en trois couches différentes : la couche séreuse, la couche musculaire et la muqueuse. L’épithélium de la muqueuse est un épithélium pseudo-stratifié comprenant des cellules épithéliales prismatiques. Il présente deux types cellulaires distincts, des cellules ciliées (motrices) et non-ciliées (sécrétrices). Ces observations concordent avec celles publiées récemment (Mahgoub, 2011). Au niveau de l’ampoule, la femelle cyclique se différencie clairement de celle en gestation par la présence de cloques sur la face apicale des cellules sécrétrices (Cf. figure 7 et 11).

Figure 11 : Schéma des cellules ciliées et des cellules sécrétrices avec cloques apicales

observables au niveau de l’épithélium de l’ampoule de la femelle cyclique. Chez d’autres espèces, telles que le chat (Bareither et Verhage, 1981), le chien (Sawyer, Olson, et Gorell, 1984), le singe (Odor, Gaddum-Rosse, et Rumery, 1983) ou encore le mouton (Murray 1995), l’apparition de ces cloques apicales intervient lorsque les cellules sécrétrices sont très développées et en phase maximale de production. Ceci se produit au cours du cycle lorsque la production d’œstradiol s’accroît. Inversement, la progestérone cause une atrophie de cette couche par la perte des cellules sécrétrices. Or chez le dromadaire, la concentration en œstradiol augmente avec la taille des follicules jusqu’à être maximale (environ 40 pg/mL) pour des follicules atteignant entre 1,3 et 2,0 cm. La progestérone, quant à elle, est détectable dès le neuvième jour après l’ovulation et reste comprise entre 2 et 4 ng/ml jusqu’au 300ème jour de gestation (Zarrouk, Souilem, et Beckers, 2003). Ces variations hormonales sont tout à fait compatibles avec les différences que nous observons entre l’animal cyclique et l’animal en gestation. De plus, on peut supposer que l’animal cyclique présentait une concentration en œstradiol élevée puisque les cloques apicales au niveau des cellules sécrétrices sont très nettes (Cf. figure 7). Si cette hypothèse était validée elle permettrait d’apporter des informations plus précises sur le stade reproductif de cette femelle. Dans le cas présent on aurait pu faire l’hypothèse qu’avec de telles cloques apicales cette femelle était à un stade pré-ovulatoire. Toutefois une étude plus récente (2009) de Lei et ses

Tissu conjonctif

Cellule sécrétrice

Cellule ciliée

Cloque apicale

28

collaborateurs indique que les changements histologiques au cours du cycle de la femelle Bactrian sont peu apparents au niveau de l’ampoule et de la jonction isthme-ampoule et que la surface apicale des cellules sécrétrices est extrêmement variables au cours du cycle. Il faudrait donc connaître le stade exact de la femelle étudiée pour valider nos observations qui sont peut-être trop fragmentaires. En revanche, l’animal en gestation devait très vraisemblablement présenter une concentration élevée de progestérone ce qui explique que les cloques apicales ne soient plus visibles.

La partie de l’isthme présente également des différences entre l’individu cyclique et l’individu en gestation. En effet, l’isthme de l’animal en gestation se caractérise par une lumière quasi-absente (Cf. figure 8 D). La lumière permet normalement un transfert de fluides biologiques entre l’oviducte et l’utérus. Chez l’animal en gestation, ces flux entre l’oviducte et l’utérus est donc fortement réduit. Ce résultat est cohérent avec l’observation réalisée au niveau de l’ampoule : les cellules sécrétrices et leur activité sont réduites au cours de la gestation, il y a donc également une réduction du flux. La réduction de la lumière au niveau de l’isthme pourrait constituer également une barrière à l’entrée des spermatozoïdes (s’ils étaient présents) dans l’oviducte. Pour les deux individus, les structures de l’ampoule et de isthme sont identiques à celles des autres mammifères avec pour l’ampoule une couche musculaire fine et une muqueuse avec de nombreux replis présentant des ramifications alors que l’isthme présente une couche musculaire épaisse et une muqueuse avec quelques replis sans ramification.

Les changements structurels de l’épithélium utérin - désorganisation de l’épithélium uni-stratifié et insertion de cellules trophoblastiques - sont dus à la présence de l’embryon dans l’utérus. En effet au 14ème jour après l’ovulation, les cellules trophoblastiques de forme allongée sont apposées aux cellules épithéliales de l’endomètre. Ceci implique la perte des microvillosités et une érosion considérable du glycocalyx au niveau de la zone de contact (Skidmore, Wooding, et Allen 1996). C’est donc l’implantation de l’embryon et son système de communication nutritive et respiratoire avec la paroi de l’utérus par l’intermédiaire du placenta qui est à l’origine des modifications observées.

En condition in vivo, suite à l’ovulation, l’ovocyte est libéré dans la partie terminale de l’oviducte – le pavillon- puis c’est au niveau de l’ampoule qu’il sera fécondé. Le microenvironnement contenu dans l’oviducte est essentiel pour la maturation de l’ovocyte et l’acquisition de sa capacité à être fécondé. Or en condition in vitro, les ovocytes sont privés de ce microenvironnement, ce sont donc les milieux synthétiques qui doivent compenser ce manque afin d’obtenir des taux de maturation in vitro qui s’approchent des taux in vivo et de pouvoir utiliser cette technique pour la reproduction assistée.

Collecte et maturation in vitro des ovocytes

Une fois les ovaires collectés à l’abattoir, la méthode choisie pour la collecte des ovocytes est la collecte par incision des follicules. Chez les lamas, cette méthode est reconnue comme étant celle qui permet de récolter le plus de complexes ovocytes-cellules du cumulus (COCs) (Ratto et al. 2005). Le taux de récolte obtenue lors de notre étude est en moyenne de 5.9 COCs par ovaire. Ce taux est semblable à celui reporté dans l’étude de Torner et ses collaborateurs en 2003 qui était compris entre 5.2 et 6.3 COCs par ovaire. Mais il est inférieur à celui présenté par Abdoon en 2001 qui obtient un taux de recouvrement de 10.8 COCs par ovaire. D’autre part, des données publiées chez la chèvre (de Smedt, Crozet, et Gall, 1994) ou le mouton (Cognie et al., 1998) montrent que la technique d’incision, même si elle permet de récolter plus de COCs, peut entraîner la collecte de COCs provenant de petits follicules qui ne seront pas capables d’atteindre le stade M II après maturation in vitro. Ainsi une attention

particulière à la technique de collecte et à la taille des follicules incisés pourrait peutpermettre d’obtenir à la fois de meilleurs taux de collecte et des COCs plus apte à la maturation in vitro.

Les résultats des taux de maturation in vitro dépendent également notamment du milieu de culture utilisé mais également de la saison à laquelle est réalisée l’expérimentation (Zeidan et al.de maturation obtenu dans la présente étude est de 50%. Dans son étude, Zeidan obtient avec un milieu TCM 199, en saison de reproduction un taux de maturation de 68.2% et hors saison de reproduction un taux de 44.4%. La saison de reproduction en Egypte s’étale de Décembre à Mai (Shalash et Nawito, 1963)de mai. La période tardive de prélèvement pourrait être un des éléments expliquant les taux de maturation assez faibles que nous avons obtenu.

Caractérisation bioénergétique et oxydative des ovocytes

Des études ont montrée l’imporlocalisation et de leur organisation pendant la maturation ovocytaire sur le développement embryonnaire précoce (Stojkovic et al.concernant la distribution mitochondriale montrent une distribution homogène des mitochondries avec une organisation en petits agrégats lorsque les ovocytes sont au stade GV. Lorsque les ovocytes initient leur maturation (M l’organisation mitochondriales sont totalement modifiées. Les mitochondries sont alors relocalisées en périphérie de l’ovocyte et les petits agrégats laissent place à une organisation en réseau tubulaire (Cf. tableau 2).

Figure 12 : Comparaison de la distribution mitochondriale entre les stades GV et M I.A : ovocyte au stage GV

Ces distributions observées semblent caractéristiques des ovocytes immatures et matures puisqu’on retrouve la même description de la distribution dans une précédente étude menée sur les dromadaires (Abdoon et al.2010). Ainsi chez le dromadaire, la distribution mitochondriale est liée au stade dans lequel se trouve l’ovocyte. L’intensité de fluorescence a également montré que l’activité mitochondriale évoluait en fonction du stade de l’ovocyte. Les valeurs de l’intensité de fluorescence sont significativement différentes entre les stades GV et M II. Plus l’ovocyte avance vers la maturation plus l’activité mitochondriale est élevée (Cf. figure 9). Cette augmentation de l’activité et la redistribution mitochondriale sont sans doute impliqul’accumulation d’ATP ou de calcium ou encore dans la régulation du pH des régions spécifiques de l’ovocyte qui ont des rôles essentiels dans les processus de développement tels que l’exocytose des granules corticaux et la formation des fuseaux méi

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la technique de collecte et à la taille des follicules incisés pourrait peutpermettre d’obtenir à la fois de meilleurs taux de collecte et des COCs plus apte à la

Les résultats des taux de maturation in vitro dépendent également notamment du milieu de culture utilisé mais également de la saison à laquelle est réalisée

t al., 2011). Ayant été calculé sur les deux premiers essais le taux de maturation obtenu dans la présente étude est de 50%. Dans son étude, Zeidan obtient avec un milieu TCM 199, en saison de reproduction un taux de maturation de 68.2% et hors saison

reproduction un taux de 44.4%. La saison de reproduction en Egypte s’étale de Décembre à 1963) et nous avons effectué la collecte des ovocytes à la fin du mois

de mai. La période tardive de prélèvement pourrait être un des éléments expliquant les taux de maturation assez faibles que nous avons obtenu.

Caractérisation bioénergétique et oxydative des ovocytes

Des études ont montrée l’importance des mitochondries et en particulier de leur localisation et de leur organisation pendant la maturation ovocytaire sur le développement

(Stojkovic et al., 2001). Dans notre étude, les résultats obtenus concernant la distribution mitochondriale montrent une distribution homogène des mitochondries avec une organisation en petits agrégats lorsque les ovocytes sont au stade GV. Lorsque les ovocytes initient leur maturation (M I) ou sont matures (M II), la distribution et l’organisation mitochondriales sont totalement modifiées. Les mitochondries sont alors relocalisées en périphérie de l’ovocyte et les petits agrégats laissent place à une organisation

ableau 2).

: Comparaison de la distribution mitochondriale entre les stades GV et M I.: ovocyte au stage GV ; B : ovocyte au stade M I

Ces distributions observées semblent caractéristiques des ovocytes immatures et matures u’on retrouve la même description de la distribution dans une précédente étude menée

(Abdoon et al., 2011) mais également chez les chiens romadaire, la distribution mitochondriale est liée au stade dans lequel se

trouve l’ovocyte. L’intensité de fluorescence a également montré que l’activité mitochondriale évoluait en fonction du stade de l’ovocyte. Les valeurs de l’intensité de

sont significativement différentes entre les stades GV et M II. Plus l’ovocyte avance vers la maturation plus l’activité mitochondriale est élevée (Cf. figure 9). Cette augmentation de l’activité et la redistribution mitochondriale sont sans doute impliqul’accumulation d’ATP ou de calcium ou encore dans la régulation du pH des régions spécifiques de l’ovocyte qui ont des rôles essentiels dans les processus de développement tels que l’exocytose des granules corticaux et la formation des fuseaux méiotiques.

A

la technique de collecte et à la taille des follicules incisés pourrait peut-être permettre d’obtenir à la fois de meilleurs taux de collecte et des COCs plus apte à la

Les résultats des taux de maturation in vitro dépendent également d’autres facteurs notamment du milieu de culture utilisé mais également de la saison à laquelle est réalisée

. Ayant été calculé sur les deux premiers essais le taux de maturation obtenu dans la présente étude est de 50%. Dans son étude, Zeidan obtient avec un milieu TCM 199, en saison de reproduction un taux de maturation de 68.2% et hors saison

reproduction un taux de 44.4%. La saison de reproduction en Egypte s’étale de Décembre à cytes à la fin du mois

de mai. La période tardive de prélèvement pourrait être un des éléments expliquant les taux de

Caractérisation bioénergétique et oxydative des ovocytes

tance des mitochondries et en particulier de leur localisation et de leur organisation pendant la maturation ovocytaire sur le développement

re étude, les résultats obtenus concernant la distribution mitochondriale montrent une distribution homogène des mitochondries avec une organisation en petits agrégats lorsque les ovocytes sont au stade GV.

I) ou sont matures (M II), la distribution et l’organisation mitochondriales sont totalement modifiées. Les mitochondries sont alors relocalisées en périphérie de l’ovocyte et les petits agrégats laissent place à une organisation

: Comparaison de la distribution mitochondriale entre les stades GV et M I.

Ces distributions observées semblent caractéristiques des ovocytes immatures et matures u’on retrouve la même description de la distribution dans une précédente étude menée

mais également chez les chiens (Valentini et al., romadaire, la distribution mitochondriale est liée au stade dans lequel se

trouve l’ovocyte. L’intensité de fluorescence a également montré que l’activité mitochondriale évoluait en fonction du stade de l’ovocyte. Les valeurs de l’intensité de

sont significativement différentes entre les stades GV et M II. Plus l’ovocyte avance vers la maturation plus l’activité mitochondriale est élevée (Cf. figure 9). Cette augmentation de l’activité et la redistribution mitochondriale sont sans doute impliquées dans l’accumulation d’ATP ou de calcium ou encore dans la régulation du pH des régions spécifiques de l’ovocyte qui ont des rôles essentiels dans les processus de développement tels

otiques.

B

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La distribution des ROS quant à elle est plus homogène selon le stade de l’ovocyte, aucune différence significative n’est ressortie lors de notre étude (Cf. tableau 3). L’intensité de fluorescence des ROS augmente en passant du stade GV à M II. Ces deux résultats peuvent s’expliquer par le fait que la principale source de ROS est les mitochondries donc si l’activité mitochondriale augmente il est logique que l’abondance en ROS augmente mais comme les ROS sont également produits par d’autres organites au sein de l’ovocyte, leur distribution ne suive pas exactement celle des mitochondries. D’ailleurs, concernant le niveau de co-localisation, nous constatons que celui-ci ne change pas entre les stades GV et M II mais qu’il est systématiquement plus élevé pour les stades M I et M III. Or cette co-localisation serait, selon Raval et ses collaborateurs (2006), l’indicateur d’une forte production d’ATP et traduirait des états cellulaires sains. Nos résultats indiqueraient donc qu’il y a une plus grande production d’ATP aux stades M I et M III qu’aux stades GV et M II. Ceci n’est pas cohérent avec nos résultats cités ci-dessus où l’activité mitochondriale est maximale au stade M II. Toutefois, si les cinétiques de redistribution des mitochondries et des ROS sont différentes dans l’ovocyte il est logique que leur co-localisation n’évolue pas de façon continue au cours des différents stades.

Plusieurs limites sont à prendre en compte dans cette étude et pourraient conduire à des améliorations pour des expérimentations futures. Les conditions expérimentales n’ont pas été idéales. Il en résulte que nous n’avons pas pu équilibrer les effectifs des différents types d’ovocytes. Ceci peut avoir biaisé la représentativité des données que nous avons analysées et discutées. Toutefois, après les avoir confrontés aux travaux publiés, il apparait qu’ils sont assez cohérents avec les connaissances acquises sur d’autres espèces, voire, moins souvent, sur les camelins eux-mêmes. Ceci est sans doute dû aux méthodologies qui nous ont été proposées et que nous avons mises en œuvre pendant ce stage. Toutefois, il faudra encore réaliser des études en améliorant la reproductibilité des résultats pour que les différences observées avec les autres espèces constituent des questions de recherche.

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CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

Ces travaux sur les camelins font partie d’un vaste programme intégré au projet PROCAMED dans lequel plusieurs équipes se penchent sur ces questions de maîtrise de la reproduction. En particulier, à l’Université de Bari où j’ai fait ce stage de recherche, des démarches parallèles ont été entreprises sur les espèces ovine et équine. En guise de perspective il me semble important de tirer les enseignements de ma modeste expérience. La première difficulté réside dans la qualité des prélèvements biologiques obtenus en abattoir. En dehors des problèmes sanitaires, nous avons vu, en particulier sur le tractus reproductif, que le stade physiologique précis, au cours du cycle œstral, n’était pas connu. Ceci constitue un écueil pour reconstituer l’évolution histologique et fonctionnelle du tractus, puisqu’en dehors de l’état de gravidité qui est facile à identifier de fortes incertitudes subsistent et l’examen de l’ovaire n’est pas suffisamment discriminant. Cette question se pose également pour les ovocytes collectés, même si leur prélèvement intra-folliculaire, leur analyse morphologique et le tri qui est ensuite effectué permet apparemment de constituer des groupes homogènes. Il faudrait, à terme, pouvoir disposer de femelles à des stades reproductifs maîtrisés par des traitements hormonaux exogènes comme cela a été réalisé sur les autres espèces d’élevage. En outre, dans le cas des camelins, la solution qui consiste à collecter par « ovum pick up » des ovocytes pré-ovulatoires (donc matures) a déjà été étudiée (Wani et Skidmore, 2010) et n’a pas montré de différence de compétences de développement par rapport à des ovocytes d’ovaires prélevés à l’abattoir et maturés in vitro comme les nôtres. Cependant il faudra probablement considérer l’importance, ou pas, des stimuli qui conduisent naturellement à une ovulation chez le dromadaire, si l’on veut améliorer la qualité des ovocytes qui sont mis en maturation. La collecte d’ovocytes ayant subit une induction d’ovulation naturelle, par exemple par « ovum pick up » juste après accouplement permettrait peut être de décider si l’incision intra-folliculaire, telle que nous l’avons réalisée, est susceptible d’amélioration de rendements.

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RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Abdalla, O. 1968. « Observations on the morphology and histochemistry of the oviducts of the sheep. » Journal of Anatomy 102 (Pt 2) (janvier): 333-344.

Abdo M.S., Al-Janabi A.S., Al-Kafawi A.A., 1969. Studies of the ovaries of the female camel during the reproductive cycle and in conditions affected with cysts. Cornell Vet., 59, 418-425

Abdoon, A. S. S. 2001. « Factors affecting follicular population, oocyte yield and quality in camels (< i> Camelus dromedarius</i>) ovary with special reference to maturation time in vitro ». Animal Reproduction Science 66 (1): 71–79.

Abdoon, A. S.S, O. M Kandil, S. M Zeng, et M. Cui. 2011. « Mitochondrial distribution, ATP-GSH contents, calcium [Ca2+] oscillation during in vitro maturation of dromedary camel oocytes ». Theriogenology.

Ambruosi, Barbara, Manuel Filioli Uranio, Anna Maria Sardanelli, Paola Pocar, Nicola Antonio Martino, Maria Stefania Paternoster, Francesca Amati, et Maria Elena Dell’Aquila. 2011. « In vitro acute exposure to DEHP affects oocyte meiotic maturation, energy and oxidative stress parameters in a large animal model ». PloS one 6 (11): e27452. doi:10.1371/journal.pone.0027452.

Bareither, M L, et H G Verhage. 1981. « Control of the secretory cell cycle in cat oviduct by estradiol and progesterone ». The American journal of anatomy 162 (2) (octobre): 107-118. doi:10.1002/aja.1001620203.

Blerkom, Jonathan Van, et Patrick Davis. 2007. « Mitochondrial Signaling and Fertilization ». Molecular Human Reproduction 13 (11) (janvier 11): 759-770. doi:10.1093/molehr/gam068.

Cadenas, E, et K J Davies. 2000. « Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging ». Free radical biology & medicine 29 (3-4) (août): 222-230.

Cognie, Y, F Benoit, N Poulin, H Khatir, et M A Driancourt. 1998. « Effect of follicle size and of the FecB Booroola gene on oocyte function in sheep ». Journal of reproduction and fertility 112 (2) (mars): 379-386.

Dumollard, R, J Carroll, M R Duchen, K Campbell, et K Swann. 2009. « Mitochondrial function and redox state in mammalian embryos ». Seminars in cell & developmental biology 20 (3) (mai): 346-353.

El-Wishy, A. B. 1988. « A Study of the Genital Organs of the Female Dromedary (Camelus Dromedarius) ». Journal of Reproduction and Fertility 82 (2) (janvier 3): 587-593. doi:10.1530/jrf.0.0820587.

Gardes-Albert, Monique, Dominique Bonnefont-Rousselot, Zohreh Abedinzadeh, et Daniel Jore. « Espèces réactives de l’oxygène : Comment l’oxygène peut-il devenir toxique ? » L’ Actualité chimique (11-12): 91-96.

Kuznetsov, Andrey V, Ingeborg Kehrer, Andrey V Kozlov, Martina Haller, Heinz Redl, Martin Hermann, Michael Grimm, et Jakob Troppmair. 2011. « Mitochondrial ROS production under cellular stress: comparison of different detection methods ». Analytical and bioanalytical chemistry 400 (8) (juin): 2383-2390. doi:10.1007/s00216-011-4764-2.

Lei, Zhu, Luo YiWei, Zhang XiuYing, et Wang JianLin. 2009. « Observations by scanning

33

electron microscopy of oviductal epithelial cells from bactrian camel (Camel bactrianus) at follicular and postovulatory phases. » Journal of Camel Practice and Research 16 (2): 259-264.

Mahgoub, I. T. Kadim and D. S. Al-Ajmi. 2011. « Anatomy and Histology of the Female Reproductive Tract of the Arabian Camel ». Emirates Journal of Food and Agriculture 13 (1) (janvier 9). http://ejfa.info/index.php/ejfa/article/view/5225.

Martino, Nicola Antonio, Giovanni Michele Lacalandra, Manuel Filioli Uranio, Barbara Ambruosi, Michele Caira, Fabio Silvestre, Flavia Pizzi, Salvatore Desantis, Gianluca Accogli, et Maria Elena Dell’Aquila. 2012. « Oocyte mitochondrial bioenergy potential and oxidative stress: within-/between-subject, in vivo versus in vitro maturation, and age-related variations in a sheep model ». Fertility and sterility 97 (3) (mars): 720-728.e1. doi:10.1016/j.fertnstert.2011.12.014.

Murray, M K. 1995. « Epithelial lining of the sheep ampulla oviduct undergoes pregnancy-associated morphological changes in secretory status and cell height ». Biology of reproduction 53 (3) (septembre): 653-663.

Odor, D L, P Gaddum-Rosse, et R E Rumery. 1983. « Secretory cells of the oviduct of the pig-tailed monkey, Macaca nemestrina, during the menstrual cycle and after estrogen treatment ». The American journal of anatomy 166 (2) (février): 149-172. doi:10.1002/aja.1001660203.

Osman A., 1965. Anatomical study of the female genital system of the one-humped camel (Camelus dromedarius): 1. The ovaries. Sudan J. Vet. Sci. Anim. Husb., 6, 41-52

Ratto, Marcelo, Marco Berland, Wilfredo Huanca, Jaswant Singh, et Gregg P Adams. 2005. « In vitro and in vivo maturation of llama oocytes ». Theriogenology 63 (9) (juin): 2445-2457. doi:10.1016/j.theriogenology.2004.09.053.

Raval, Jay, Suzanne Lyman, Takashi Nitta, Dagmara Mohuczy, John J Lemasters, Jae-Sung Kim, et Kevin E Behrns. 2006. « Basal reactive oxygen species determine the susceptibility to apoptosis in cirrhotic hepatocytes ». Free radical biology & medicine 41 (11) (décembre 1): 1645-1654. doi:10.1016/j.freeradbiomed.2006.07.023.

Salari, E. ;Raji. 2011. « Comparative study of anatomy and histology on the ovary and oviduct in camel (Camelus dromedarius) and cow ». Journal of Camel Practice and Research 18 (1): 115-118.

Sawyer, H R, P N Olson, et T A Gorell. 1984. « Effects of progesterone on the oviductal epithelium in estrogen-primed prepubertal beagles: light and electron microscopic observations ». The American journal of anatomy 169 (1) (janvier): 75-87. doi:10.1002/aja.1001690107.

Shalash, M R, et M Nawito. 1963. « [Some aspects of sterility in the female camel] ». Deutsche tierärztliche Wochenschrift 70 (18) (septembre 15): 522-524.

Skidmore, J A, F B Wooding, et W R Allen. 1996. « Implantation and early placentation in the one-humped camel (Camelus dromedarius) ». Placenta 17 (4) (mai): 253-262.

Skidmore, J. A. 2005. « Reproduction in dromedary camels: an update ». Anim Reprod 2: 161–171.

de Smedt, V, N Crozet, et L Gall. 1994. « Morphological and functional changes accompanying the acquisition of meiotic competence in ovarian goat oocyte ». The Journal of experimental zoology 269 (2) (juin 1): 128-139. doi:10.1002/jez.1402690206.

Stojkovic, Miodrag, Sergio A. Machado, Petra Stojkovic, Valeri Zakhartchenko, Peter Hutzler, Paolo B. Gonçalves, et Eckhard Wolf. 2001. « Mitochondrial Distribution and Adenosine Triphosphate Content of Bovine Oocytes Before and After In Vitro

34

Maturation: Correlation with Morphological Criteria and Developmental Capacity After In Vitro Fertilization and Culture ». Biology of Reproduction 64 (3) (janvier 3): 904-909. doi:10.1095/biolreprod64.3.904.

Tayeb M.A.F. 1953. « Les organes génitaux de la chamelle ». Revue d’élevage et de médecine vétérinaire des pays tropicaux, 6, 17-21.

Thompson, J. G., C. McNaughton, B. Gasparrini, L. T. McGowan, et H. R. Tervit. 2000. « Effect of Inhibitors and Uncouplers of Oxidative Phosphorylation During Compaction and Blastulation of Bovine Embryos Cultured in Vitro ». Journal of Reproduction and Fertility 118 (1) (janvier 1): 47-55. doi:10.1530/jrf.0.1180047.

Tibary A, Anouassi A. 1997. Artificial breeding and manipulation of reproduction in camelidae. In: Tibary A, Anouassi (Ed.). Theriogenology in camelidae: anatomy, physiology, pathology and artificial breeding. Rabat, Morocco: Actes Editions. pp.423-442.

Torner, H., B. Heleil, H. Alm, I. M. Ghoneim, V. Srsen, W. Kanitz, A. Tuchscherer, et E. M. Fattouh. 2003. « Changes in cumulus–oocyte complexes of pregnant and non-pregnant camels (< i> Camelus dromedarius</i>) during maturation in vitro ». Theriogenology 60 (5): 977–987.

Turrens, J. F. 2003. « Mitochondrial formation of reactive oxygen species ». The Journal of physiology 552 (2): 335–344.

Valentini, Luisa, Alina Iulia Iorga, Teresa De Santis, Barbara Ambruosi, Karine Reynaud, Sylvie Chastant-Maillard, Antonio Ciro Guaricci, Michele Caira, et Maria Elena Dell’Aquila. 2010. « Mitochondrial distribution patterns in canine oocytes as related to the reproductive cycle stage ». Animal reproduction science 117 (1-2) (janvier): 166-177. doi:10.1016/j.anireprosci.2009.03.008.

Wani, N A, et J A Skidmore. 2010. « Ultrasonographic-guided retrieval of cumulus oocyte complexes after super-stimulation in dromedary camel (Camelus dromedarius) ». Theriogenology 74 (3) (août): 436-442. doi:10.1016/j.theriogenology.2010.02.026.

Wani, N. A, U. Wernery, F. A. H. Hassan, R. Wernery, et J. A. Skidmore. 2010. « Production of the first cloned camel by somatic cell nuclear transfer ». Biology of reproduction 82 (2): 373–379.

Wani, N. A. 2008. « Chemical activation of in vitro matured dromedary camel (Camelus dromedarius) oocytes: Optimization of protocols ». Theriogenology 69 (5): 591–602.

Winyard, Paul G, Christopher J Moody, et Claus Jacob. 2005. « Oxidative activation of antioxidant defence ». Trends in biochemical sciences 30 (8) (août): 453-461. doi:10.1016/j.tibs.2005.06.001.

Yang, H W, K J Hwang, H C Kwon, H S Kim, K W Choi, et K S Oh. 1998. « Detection of reactive oxygen species (ROS) and apoptosis in human fragmented embryos ». Human reproduction (Oxford, England) 13 (4) (avril): 998-1002.

Zarrouk, A, O Souilem, et J.F Beckers. 2003. « Actualités sur la reproduction chez la femelle dromadaire ( Camelus dromedarius ) = Update on the reproduction of she-camel ( Camelus dromedarius )= Actualidades sobre la reproduccion en la hembra dromedaria ( Camelus dromedarius ) ». Revue d’élevage et de médecine vétérinaire des pays tropicaux. 56 (1-2) : 95-102. http://remvt.cirad.fr/revue/notice_fr.php?dk=520007.

Zeidan, A. E. B., M. A. El-Harairy, S. A Gabr, M. A.T El-Dien, S. A.A El-Rahman, et A. M. Amer. 2011. « In Vitro Maturation of Camel Oocytes As Affected By Different Media during Breeding and Non-Breeding Seasons ». Journal of American Science 7 (1).

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LISTE DES TABLEAUX ET FIGURES

Figure 1 : Photographie de l’appareil génital d’une femelle dromadaire et localisation des sections réalisées (prise par D.Monaco) Figure 2 : Bain de coloration dans l’Hématoxyline Figure 3 : Lame obtenue après coloration Figure 4 : Incision d’un follicule à la surface de l’ovaire Figure 5 : Boite de pétri contenant le milieu de maturation Figure 6 : Microscope confocal relié à l’ordinateur Figure 7 : A : Ovocyte immature B: ovocyte mature présentant un globule polaire (GP) Figure 8 : Photographies pour chacun des groupes des observations microscopiques de contraste (A), d’évaluation du statut nucléaire (B), de la distribution mitochondriale (C), de la distribution des ROS (D) et de la co-localisation entre mitochondrie et ROS (E) Figure 9 : Représentation graphique de l’intensité de fluorescence pour les différents groupes d’ovocytes. Figure 10 : Représentation graphique de la co-localisation entre mitochondrie et ERO pour les différents groupes d’ovocytes. Figure 11 : Schéma des cellules ciliées et des cellules sécrétrices avec cloques apicales observables au niveau de l’épithélium de l’ampoule de la femelle cyclique. Figure 12 : Comparaison de la distribution mitochondriale entre les stades GV et M I. A : ovocyte au stage GV ; B : ovocyte au stade M I Tableau 1 : Les différents statuts nucléaires des ovocytes Tableau 2 : Répartition de la distribution des mitochondries pour les différents groupes d’ovocytes selon de leur statut nucléaire. Tableau 3 : Répartition de la distribution des ROS pour les différents types d’ovocytes en fonction de leur statut nucléaire.

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ANNEXES

Annexe 1 : Fiche d’identification des prélèvements du tractus génital

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Annexe 1 : Fiche d’identification des prélèvements du tractus génital

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RESUME

Bénédicte Béneult

Titre : Histologie du tractus génital femelle et caractérisation bioénergétique et oxydative des ovocytes camelins avant et après maturation in vitro.

L’efficacité de reproduction des dromadaires est généralement connue pour être faible et ceci est dû à des caractéristiques propres de l’espèce (ovulation induite) et aux conditions d’élevage (milieux difficiles). Les techniques de reproduction assistée qui se développent peu à peu chez l’espèce cameline pourraient conduire à des avancées, des connaissances originales en reproduction et à des applications génétiques intéressantes. Cette étude s’intéresse à trois points principaux qui pourraient constituer un frein à la maîtrise de la reproduction chez les camelins : l’histologie du tractus génital, la réalisation des différentes étapes de production et de maturation des ovocytes in vitro et la maîtrise du statut bioénergétique et oxydatif de ces ovocytes. L’oviducte et l’utérus d’une femelle cyclique et d’une femelle gestante ont été comparés sur le plan histologique. Trois informations principales ressortent de cette comparaison : la présence chez la femelle cyclique de cloques apicales sur les cellules sécrétrices de l’épithélium de l’ampoule, la réduction -presque disparition- de la lumière au niveau de l’isthme chez la femelle gestante et une désorganisation de l’épithélium endométrique par l’insertion de cellules trophoblastiques au cours de la gestation. D’autre part, après prélèvements d’ovaires à l’abattoir, des ovocytes ont été collectés, maturés et colorés afin d’étudier, au cours de leur développement, leurs caractéristiques bioénergétiques et oxydatives. Les résultats montrent que les taux de collecte (5,9 ovocytes par ovaire) et de maturation (50%) obtenus correspondent à ceux rapportés dans la bibliographie. La caractérisation bioénergétique révèle qu’au cours de la maturation il se produit une relocalisation des mitochondries vers la périphérie de l’ovocyte, un changement d’organisation de ces mitochondries passant de petits agrégats à un réseau tubulaire et une augmentation de l’activité mitochondriale. Les Espèces Réactives de l’Oxygène conservent une organisation plus homogène entre les stades GV et M II mais leur intensité de fluorescence augmente également au cours de la maturation. En conclusion, cette étude de courte durée, a permis de mettre en place des méthodes descriptives de l’oviducte et l’utérus de dromadaire qui pourront être appliquée au matériel biologique que nous avons contribué à collecter. Les méthodologies appliquées classiquement aux ovocytes ovins ont permis de suivre la cinétique d’évolution d’ovocytes camelin. Nos résultats sont largement cohérents avec l’organisation et l’activité bioénergétique et oxydative de l’ovocyte in vitro. Toutefois, les quelques particularités que nous avons isolées doivent encore être validées dans des conditions de cultures qui pourraient justifier des ajustements méthodologiques mieux adaptées à l’espèce cameline.

Mots clés

[Ovocyte, dromadaire, maturation, oviducte, utérus, mitochondrie, ROS]

Pour citer ce document : [Béneult, Bénédicte, 2012. Histologie du tractus génital femelle et caractérisation bioénergétique et oxydative des ovocytes camelins avant et après maturation in vitro. Document pdf, diplôme d’Ingénieur Agronome, spécialité Elevage en Milieux Difficiles, Montpellier SupAgro. 38p.]

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