etudes des caractéristiques culturales des actinomycètes

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO

****************************

=================

FACULTE DES SCIENCES

****************

DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE

*****************

MEMOIRE DE RECHERCHE POUR L’OBTENTION DU DIPLOME D’ETUDES

APPROFONDIES EN SCIENCES DE LA VIE

OPTION : BIOTECHNOLOGIE-MICROBIOLOGIE

Présenté par:

RAMASINDRANO Aina Tantely Arisoa

Maître ès-Sciences

Soutenu publiquement le 12 Décembre 2013 devant les membres de jury :

Président : Professeur ANDRIANTSIMAHAVANDY Abel

Rapporteurs : Docteur RASOLOMAMPIANINA Rado

Docteur RAMAMONJISOA Daniel

Examinateurs : Docteur RANDRIANIERENANA Ando

Docteur RAZAFINDRAZAKA Vonimanitra

EEEtttuuudddeeesss dddeeesss cccaaarrraaaccctttééérrriiissstttiiiqqquuueeesss cccuuullltttuuurrraaallleeesss dddeeesss AAAccctttiiinnnooommmyyycccèèèttteeesss

iiimmmpppllliiiqqquuuééésss dddaaannnsss lllaaa bbbiiiooodddééégggrrraaadddaaatttiiiooonnn dddeee lllaaa ccceeelllllluuulllooossseee,,, dddeeesss

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RemerciementsRemerciementsRemerciementsRemerciements

Tout d’abord, je remercie Dieu tout puissant de m’avoir donnée le courage et la

patience pour terminer ce travail.

Je remercie chaleureusement Monsieur JEANNODA VictorJEANNODA VictorJEANNODA VictorJEANNODA Victor, Professeur titulaire

à l’Université d’Antananarivo, responsable de la formation doctorale, de m’avoir permise

de soutenir ce mémoire.

Mes vifs remerciements à Monsieur le Professeur Professeur Professeur Professeur ANDRIANTSIMAHAVANDY ANDRIANTSIMAHAVANDY ANDRIANTSIMAHAVANDY ANDRIANTSIMAHAVANDY

AbelAbelAbelAbel, malgré ses nombreuses responsabilités, qui nous fait l’honneur de présider le jury

de ce mémoire.

Je remercie également Madame le Docteur RANDRIANIERANANA AndoDocteur RANDRIANIERANANA AndoDocteur RANDRIANIERANANA AndoDocteur RANDRIANIERANANA Ando, Chef

du Département de Biochimie Fondamentale et Appliquée et Madame le Docteur

RAZAFINDRAZAKA VonimanitraRAZAFINDRAZAKA VonimanitraRAZAFINDRAZAKA VonimanitraRAZAFINDRAZAKA Vonimanitra qui ont répondu à notre sollicitation de siéger en tant

que membres de ce jury.

Mes sincères gratitudes au Professeur Professeur Professeur Professeur REJO FélicitéeREJO FélicitéeREJO FélicitéeREJO Félicitée et au Professeur Professeur Professeur Professeur

RAVELONANDRO Pierre,RAVELONANDRO Pierre,RAVELONANDRO Pierre,RAVELONANDRO Pierre, Directeurs se succédant au Centre National de Recherches

sur l’Environnement (CNRE), de m’avoir accueillie au sein de cette institution.

Je souhaite exprimer ma sincère reconnaissance au Docteur Docteur Docteur Docteur

RASOLOMAMPIANINA RadoRASOLOMAMPIANINA RadoRASOLOMAMPIANINA RadoRASOLOMAMPIANINA Rado, rapporteur de ce mémoire et Chef du Laboratoire de

Microbiologie de l’Environnement (LME) du Centre National de Recherches sur

l’Environnement (CNRE), pour son aide et ses précieux conseils durant la réalisation de

ce travail.

J’adresse mes vifs remerciements au Docteur RAMAMONJISOADocteur RAMAMONJISOADocteur RAMAMONJISOADocteur RAMAMONJISOA DanielDanielDanielDaniel, co-

encardreur de ce mémoire, pour sa disponibilité et son aide.

Je souhaite adresser mes remerciements à toute l’équipe du LME, en particulier,

Madame ANDRIAMBELOSON ANDRIAMBELOSON ANDRIAMBELOSON ANDRIAMBELOSON Herivonjyerivonjyerivonjyerivonjy Onja Onja Onja Onja et Monsieur RABENAIVO Clet RABENAIVO Clet RABENAIVO Clet RABENAIVO Clet

MarcellinMarcellinMarcellinMarcellin pour les multiples aides et conseils qu’ils n’ont cessé de me donner durant la

réalisation de ce travail.

J’exprime mes remerciements à mes collègues du laboratoire LME, surtout à

BerthinBerthinBerthinBerthin et HarimisaHarimisaHarimisaHarimisa pour leur encouragement, leur aide et leur amitié.

Mes reconnaissances s’adressent spécialement à mes parents, à toute ma famille

qui m’ont soutenue et encouragée depuis toujours.

Enfin je remercie à tous ceux qui, de près ou de loin, ont contribué à la réalisation

de ce mémoire.

Tables des matières

TABLES DES MATIERES

GLOSSAIRE .............................................................................................................................. i

LISTE DES ABREVIATIONS ............................................................................................... ii

LISTE DES TABLEAUX ....................................................................................................... iii

LISTE DES FIGURES ............................................................................................................. v

INTRODUCTION .................................................................................................................... 1

PREMIERE PARTIE: SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ............................................... 3

I.1. Biodégradation des composés organiques complexes naturels ...................................... 3

I.1.1. La cellulose ....................................................................................................................... 3

I.1.2. Les hémicelluloses ............................................................................................................ 4

I.1.3. La lignine .......................................................................................................................... 4

I.1.4. La pectine .......................................................................................................................... 5

I.2. Biodégradation des composés organiques de synthèse (Xénobiotiques) ...................... 5

I.2.1. Les pesticides .................................................................................................................... 6

I.2.2. Les xylénols ...................................................................................................................... 6

I.3. Les Actinomycètes: agents de biodégradation dans la nature ....................................... 8

I.3.1. Définition, caractéristiques principales ............................................................................. 8

I.3.2. Ecologie ............................................................................................................................ 8

I.3.3. Biologie de développement ............................................................................................. 11

I.3.3.1. Mycélium aérien et mycélium du substrat ................................................................... 11

I.3.3.2. Formation des spores ................................................................................................... 11

I.3.3.3. Structures particulières ................................................................................................. 13

I.4. Taxonomie des Actinomycètes ........................................................................................ 13

I.4.1. Critères de détermination des genres d’Actinomycètes .................................................. 14

I.4.1.1. Caractères morphologiques .......................................................................................... 14

I.4.1.2. Colorations et caractéristiques biochimiques ............................................................... 14

I.4.1.3. Caractères chimiotaxonomiques .................................................................................. 15

I.5. Les Actinomycètes: producteurs d’enzymes de biodégradation ................................. 17

I.5.1. Enzymes de biodégradation des composés organiques naturels ..................................... 17


I.5.2. Enzymes de biodégradation des composés organiques de synthèse ............................... 18

DEUXIEME PARTIE: MATERIELS ET METHODES ................................................... 19

II.1. MATERIELS .................................................................................................................. 19

II.1.1. Echantillonnage du sol ................................................................................................ 19

II.1.2. Milieux d’étude ............................................................................................................ 20

II.1.2.1. Milieu d’isolement ...................................................................................................... 20

II.1.2.2. Milieu de préparation des inocula pour les tests de biodégradation et de pré-

identification ........................................................................................................................................ 21

II.1.2.3. Milieu pour les tests de biodégradation ............................................................................ 21

i. Milieu pour la biodégradation de la cellulose.............................................................................. 21

ii. Milieu pour la biodégradation de pectine ................................................................................... 21

iii. Milieu pour la biodégradation de 2,5-xylénol et 2,6-xylénol .................................................. 21

iv. Milieu pour la tolérance au 2,5-xylénol et au 2,6-xylénol ....................................................... 21

II.1.2.4. Milieu d’identification ................................................................................................ 21

i. Milieu d’identification macroscopique ................................................................................. 21

ii. Milieu pour la détermination des pigments mélanoïdes et des pigments diffusibles ........... 22

iii. Milieu pour la détermination des caractères biochimiques ................................................. 22

• Recherche de nitrate réductase ............................................................................... 22

iv. Milieu pour la détermination des caractères physiologiques .............................................. 22

• Détermination de la température optimale de croissance .......................................... 22

• Détermination du pH optimal ........................................................................................ 22

• Milieu pour la détermination du type respiratoire ...................................................... 23

• Milieu pour la détermination de la mobilité ................................................................ 23

II.2. METHODES ............................................................................................................................. 23

II.2.1. Isolement des souches d’Actinomycètes .................................................................... 23

II.2.1.1. But .............................................................................................................................. 23

II.2.1.2. Principe ....................................................................................................................... 23

II.2.1.3. Techniques d’isolement .............................................................................................. 23

• Sélection par antibiotiques ........................................................................................... 23

• Traitement à haute température .................................................................................... 24

• Sol aérosolisé ................................................................................................................ 24


II.2.1.4. Prélèvements des colonies d’Actinomycètes .............................................................. 24

II.2.1.5. Coloration de Gram .................................................................................................... 24

II.2.2. Conservation des souches d’Actinomycètes .............................................................. 24

II.2.3. Préparation des inocula d’Actinomycètes pour les tests de biodégradation et de

pré-identification .................................................................................................................... 25

II.2.4. Mise en évidence de la biodégradation des composés organiques complexes

naturels .................................................................................................................................... 25

II.2.4.1. Biodégradation de la cellulose (activité cellulolytique) ............................................ 25

II.2.4.2. Biodégradation de la pectine (activité pectinolytique) .............................................. 25

II.2.5. Mise en évidence de la biodégradation des composés organiques de synthèse ...... 26

II.2.5.1. Biodégradation de 2,5-xylénol et du 2,6-xylénol ....................................................... 26

II.2.5.2. Tolérance au 2,5-xylénol et au 2,6-xylénol ................................................................ 26

II.2.6. Pré-identification des souches d’Actinomycètes actives .......................................... 27

II.2.6.1. Aspect macroscopique ................................................................................................ 27

II.2.6.2. Détermination des pigments mélanoïdes et des pigments diffusibles ....................... 28

II.2.6.3. Aspect microscopique ................................................................................................. 28

II.2.6.4. Détermination de l’acido-alcoolo-résistance .............................................................. 28

II.2.6.5. Caractéristiques biochimiques .................................................................................... 29

i. Recherche de la catalase ........................................................................................................ 29

ii. Recherche de la Bêta -Galactosidase ................................................................................... 29

iii. .Recherche de Nitrate-Réductase........................................................................................ 29

II.2.6.6. Caractères physiologiques .......................................................................................... 30

i. Détermination de la température optimale de croissance ..................................................... 30

ii. Détermination du pH optimal de croissance ....................................................................... 30

iii. Détermination du type respiratoire .................................................................................... 30

iv. Détermination de la mobilité .............................................................................................. 30

TROISIEME PARTIE: RESULTATS ................................................................................. 31

III.1. Isolement des souches d’Actinomycètes ..................................................................... 31

III.2. Biodégradation des composés organiques complexes naturels ................................. 32

III.2.1. Biodégradation de la cellulose (activité cellulolitique) ............................................... 32

III.2.2. Biodégradation des substances pectiques (activité pectinolitique) ............................. 33


III.3. Biodégradation de composés organiques de synthèse (le 2,5-xylénol et le 2,6-

xylénol) ................................................................................................................................... 34

III.4. Pré -identification des souches d’Actinomycètes actives ............................................ 37

III.4.1. Aspect macroscopique .................................................................................................. 37

III.4.2. Détermination des pigments mélanoïdes et diffusibles ................................................ 38

III.4.3. Aspect microscopique .................................................................................................. 39

III.4.4. Coloration et caractéristiques biochimiques................................................................. 40

III.4.4.1. Coloration de Ziehl-Nielsen ...................................................................................... 40

III.4.4.2. Caractéristiques biochimiques ................................................................................... 40

III.4.4.3. Caractères physiologiques ......................................................................................... 40

DISCUSSION ......................................................................................................................... 42

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES .......................................................... 46

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ............................................................................. 47

ANNEXES

Glossaire

i

GLOSSAIRE

Actinomycose: maladie infectieuse très rare, causée par une bactérie vivant dans

la cavité buccale de l'homme.

Chimioautotrophe: organisme qui utilise une substance chimique inorganique

comme source d'énergie (chimio-) et du CO2 comme source de

carbone.

Conidies: spores produits par le mycélium des champignons et des

Actinomycètes.

Enzyme: protéine catalysant une réaction biochimique.

Hétérotrophe: organisme qui utilise des matières organiques préformées

provenant d’autres organismes comme source de carbone et

d’énergie pour son métabolisme.

Hyphe: filament plus ou moins ramifié, constituant l’appareil végétatif

des champignons et des Actinomycètes.

Mycélium: partie végétative des champignons et des Actinomycètes,

composé d’un ensemble de filaments appelés hyphes.

Nocardiose: infection pulmonaire causée par une bactérie appartenant au

genre Nocardia.

Procaryote: organisme unicellulaire dépourvu de vrai noyau délimité par une

membrane, le matériel génétique étant localisé dans une région

irrégulière appelée nucleoïde ou région nucléaire.

Récalcitrante: non biodégradable.

Saprophyte: végétal ou microorganisme qui vit aux dépens des matières

organiques inertes.

Spore: cellule ou organe de multiplication végétative ou de

reproduction.

Ubiquitaire: qui se trouve partout.

Xénobiotique: substance étrangère à l’organisme vivant.

Liste des abréviations

ii

LISTE DES ABREVIATIONS

AS: Antibiotic Selection.

CNRE: Centre National de Recherches sur l’Environnement.

CTAB: bromure d’héxadécyl tri-méthyl ammonium.

CYD: casamino acids yeast extracts D-glucose.

DAB: acide 2,4-diaminobutyrique.

DAP: l’acide 2,6-diaminopimélique.

GAS: Grayson Aerosol Sampler.

ISP: International Streptomyces Project.

LME: Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement.

ONPG: ortho-nitrophényl-Béta-Galactoside.

PAHs: polycyclic aromatic hydrocarbons.

PCB: chlorobiphényls.

p/v: poids sur volume.

SCE: Source de Carbone et d’Energie.

UFC/ml: Unité Formant Colonie par millilitre.

v/v: volume sur volume.

Liste des tableaux

iii

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1: Propriétés physico-chimiques des xylénols ........................................................ 7

Tableau 2: Fréquence de divers genres d’Actinomycètes dans le sol (Lechevalier et

Lechevalier, 1967) .............................................................................................. 9

Tableau 3: Exemples d’Actinomycètes impliqués dans le processus de compostage ........ 10

Tableau 4: Caractères d'identification présomptive des Nocardia et des autres genres

d'Actinomycètes apparentés au genre Nocardia (Boiron et al., 1993; Carlotti et

al., 1994) ........................................................................................................... 15

Tableau 5: Types pariétaux en fonction des constituants distinctifs majeurs des parois

cellulaires (Lechevalier et Lechevalier, 1980).................................................. 16

Tableau 6: Types pariétaux et types glucidiques cellulaires des Actinomycètes aérobies à

méso-DAP (Lechevalier et Lechevalier, 1980) ........................................................................... 16

Tableau 7: Codification des échantillons ............................................................................ 20

Tableau 8: Nombre d’Actinomycètes isolés selon la technique d’isolement et le point de

prélèvement....................................................................................................... 31

Tableau 9: Croissance des souches d’Actinomycètes sur le milieu de base ISP9 contenant

la cellulose cristalline (Sigmacell, type 101) comme unique source de carbone

et d’énergie ....................................................................................................... 32

Tableau 10: Diamètres des zones claires résultant de la dégradation de la pectine par les

souches d’Actinomycètes ................................................................................. 33

Tableau 11: Croissance des souches d’Actinomycètes sur milieu minéral contenant le 2,5-

xylénol et le 2,6-xylénol comme seule source de carbone et d’énergie ........... 35

Tableau 12: Tolérance des souches actives aux 2,5-xylénol et 2,6-xylénol ......................... 36

Liste des tableaux

iv

Tableau 13: Résultats récapitulatifs des souches actives sur les composés organiques

étudiés ....................................................................................................................................... 37

Tableau 14: Aspect macroscopique des souches d’Actinomycètes actives.......................... 38

Tableau 15: Détermination des pigments mélanoïdes et diffusibles chez les souches

d’Actinomycètes. .............................................................................................. 39

Tableau 16: Aspect microscopique des souches d’Actinomycètes actives. ......................... 40

Tableau 17: Caractères physiologiques des souches d’Actinomycètes actives. ................... 41

Liste des figures

v

LISTE DES FIGURES

Figure 1: Structure moléculaire de la cellulose, d’après Odier (1985) .............................. 4

Figure 2: Structure moléculaire de la pectine (Perez et al., 2000) ..................................... 5

Figure 3: Une colonie du genre Streptomyces sur milieu solide (Dvorak, 1999) ............ 11

Figure 4: Cycle de vie des Streptomyces (Breton et al., 1989).......................................... 13

Figure 5: Situation géographique et vue d’ensemble de la forêt du Massif Ibity. ........... 19

Figure 6: Pré-identification des souches d’Actinomycètes actives. ................................. 27

Figure 7: Histogramme montrant le nombre de souches d’Actinomycètes isolées par

point de prélèvement et méthodes d’isolement. ............................................... 31

Figure 8: Diamètres des zones claires résultant de l’activité pectinolytique. .................. 34

Figure 9: Tolérance de la souche S31 au 2,5-xylénol et au 2,6-xylénol jusqu’à une

concentration de 3000 mg/l (technique des disques). ....................................... 36

Figure 10: Production de pigment mélanoïde. ................................................................... 39

Introduction

1

INTRODUCTION

Depuis plusieurs décennies, la dépollution et la valorisation des déchets agricoles et

agro-industriels constituent un des principaux thèmes de recherche en microbiologie.

Les dérivés cellulosiques et les substances pectiques sont les cibles de plusieurs

études, étant donné qu’ils sont rejetés annuellement en quantités considérables en tant que

résidus agricoles ou par l’industrie du papier et des jus.

Des recherches de bioconversion des déchets cellulosiques par les cellulases sont

établies afin de les valoriser et de les transformer en un mélange de sucres plus intéressants

sur le plan nutritif et gustatif, ou encore transformer ces mêmes sucres par fermentation en

alcool utilisé dans différents domaines (Ouled et al. 2005).

Des recherches pour la valorisation des résidus issus de fruits riches en substances

pectiques sont en cours, tel que le traitement des fibres végétales par les pectinases, pour être

utilisés dans les textiles et d’autres industries (Nicemol et al., 2006).

Par ailleurs, la mauvaise gestion des pesticides et des fertilisants dans les zones

agricoles modifie les conditions environnementales: non seulement la vie sauvage et

aquatique est en danger mais les risques existent également pour les humains.

La biorémédiation ou dépollution biologique est une méthode pratique pour épurer

l’environnement contaminé. Elle est définie par l’utilisation d’organismes vivants pour

détruire les polluants environnementaux (Perry et al., 2004).

Divers microorganismes tels que les espèces d’Actinomycètes présentent des capacités

de biodégradation des molécules organiques aussi variées que récalcitrantes (Mc Carthy et al.,

1992).

Cette fonction de biodégradation des Actinomycètes est due à la variété d’enzymes

qu’ils peuvent synthétiser. En effet, après les antibiotiques, les enzymes sont les plus

importants produits élaborés par les Actinomycètes (Lopes et al., 1999; Nascimento et al.,

2002). Ces enzymes conduisent à la dégradation des nutriments et constituent une source

d’énergie plus ou moins complexe. Elles sont aussi utilisées dans la dégradation des

biomasses végétales et animales, dans l’industrie alimentaire et en biologie moléculaire

(William et al., 1993).

Selon d’autres études, certaines espèces d’Actinomycètes dégradent des composés

organiques de synthèse qui sont en principe non biodégradables, tel que le 2,6-xylénol

Introduction

2

hautement toxique et largement utilisé en industrie, mais pouvant être dégradé par le genre

Mycobacterium (Jens et al., 1989).

Madagascar est connu par sa richesse en matière de biodiversité en faune et en flore,

susceptible de renfermer diverses populations d’Actinomycètes telluriques capables de

dégrader les composés organiques dans le sol et d’avoir une application dans la

biodégradation des composés organiques naturels complexes et des composés organiques de

synthèse.

La présente étude a donc pour objectif de valoriser les souches d’Actinomycètes

telluriques susceptibles de dégrader des composés organiques complexes ou encore des

composés organiques de synthèse à partir des échantillons de sol forestier du Massif Ibity.

A cette fin, différentes activités sont réalisées au sein du Laboratoire de Microbiologie

de l’Environnement du CNRE selon les étapes ci-après:

- Isolement, purification et conservation des souches d’Actinomycètes à partir du sol

forestier du Massif Ibity.

- Mise en évidence de la capacité de biodégradation de composés organiques

complexes naturels (cellulose, substances pectiques) par les souches d’Actinomycètes.

- Mise en évidence de la capacité de biodégradation de composés organiques de

synthèse comme les xénobiotiques (2,5-xylénol, 2,6-xylénol).

- Pré-identification des souches d’Actinomycètes actives (caractères culturaux,

biochimiques et physiologiques).

Les travaux effectués sont présentés dans ce document en trois parties: la synthèse

bibliographique, les matériels et méthodes, et les résultats. La première partie est précédée par

une introduction générale et la dernière partie est suivie par une discussion, une conclusion et

des perspectives.

Synthèse bibliographique

3

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

I.1. Biodégradation des composés organiques complexes naturels

Tous les composés organiques issus de la biosynthèse sont potentiellement

biodégradables par les microorganismes.

Leur biodégradation dépend des facteurs environnementaux:

- Facteurs écologiques et physiologiques: il s’agit des caractéristiques biologiques et

physico- chimiques du milieu qui influencent l’activité des microorganismes impliqués dans

les mécanismes de biodégradation, tels que le pH, la température, le potentiel redox, la

quantité d’oxygène ou la disponibilité du récepteur d’électrons adéquat, les composés

minéraux ou organiques nutritionnels présents dans le milieu, la présence de microorganismes

inhibiteurs ou coopérateurs (Manfe, 1993).

- Facteurs structuraux: ils correspondent à la nature des composés organiques. La

biodégradabilité d’un composé organique dépend en effet de sa structure chimique.

Certains composés naturels de structure complexe sont difficiles à métaboliser et

nécessitent des temps de décomposition très longs et une action hydrolytique de populations

microbiennes mixtes et hautement spécialisées. Les polysaccharides végétaux (cellulose,

hémicelluloses, lignine, pectine) constituant les parois sont parmi les composés organiques

naturels les plus difficilement biodégradables (Mustin, 1987).

I.1.1. La cellulose

La cellulose est un des constituants principaux de la paroi cellulaire des végétaux. Il

s’agit de macromolécule la plus abondante dans la nature (Brown, 2004).

Elle est un homopolymère linéaire d’unités de D-glucopyrannose liées par une liaison

β-(1-4) glucosidique (Kögel-Knabner, 2002) (figure 1). Le degré de polymérisation des

chaines de cellulose varie entre 500-25000 (Kuhad et al., 1997).

L’hydrolyse de la cellulose fait intervenir trois enzymes agissant en synergie:

endoglucanases, exoglucanases et β-glucosidases (Paul et Clark, 1996; Kumari et al., 2006).

Les chaines de cellulose peuvent s’associer entre elles pour former des microfibrilles

dont le diamètre varie en fonction de l'espèce végétale (Chanzy et al., 1990). Cette structure

existe sous forme amorphe, ou sous forme cristalline, plus résistante à la dégradation

enzymatique ou microbienne (Stevenson, 1994).

La biodégradation de la cellulose est assurée par des

qui sécrètent à cet effet un ensemble d’enzyme

Parmi les bactéries cellulolytiques figurent des bactéries appartenant aux genres

Cellulomonas, Thermomonospora, Streptomyces, Ruminococcus

Ainsi, la cellulose constitue une source d’énergie renouv

inépuisable. Pour cela, des recherches de bioconversion des déchets cellulosiques sous

l’action des cellulases sont établies

Figure 1: Structure moléculaire de la cellulose, d’après

I.1.2. Les hémicelluloses

Les polysaccharides non cellulosiques sont souvent appelés hémicelluloses ou

polyoses (Kögel-Knabner, 2002).

Les hémicelluloses

monosaccharides incluant principalement des hexoses tels que le glucose, le mannose et le

galactose ainsi que des pentoses tels que la xylose et l’arabinose (Lynch, 1992).

Elles ont un degré de polyméri

1995; Zykwinska et al., 2005)

Les hémicelluloses font partie des substances ayant des effets

constituent une source d’oligosaccharides, de sucres, d’alcools et d’autres composés

organiques qui peuvent être libérés sous l’action des

I.1.3. La lignine

La lignine est un polymère tridimensionnel amorphe de nature

2002).

Elle résulte d’une polymérisation

coniférylique, sinapylique et p

Beaucoup de miccroorganismes dont les

l’hémepéroxidase, enzyme responsable de biodégradation de la lignine


ation de la cellulose est assurée par des microorganismes cellulolytiques

qui sécrètent à cet effet un ensemble d’enzymes spécialisées: les cellulases.


Cellulomonas, Thermomonospora, Streptomyces, Ruminococcus et Clostridium

Ainsi, la cellulose constitue une source d’énergie renouvelable pratiquement

des recherches de bioconversion des déchets cellulosiques sous

sont établies.

Structure moléculaire de la cellulose, d’après Odier (1985)

I.1.2. Les hémicelluloses


Knabner, 2002).

Les hémicelluloses sont des hétéropolysaccharides constituées de divers



ont un degré de polymérisation inférieur à celui de la cellulose

, 2005).

Les hémicelluloses font partie des substances ayant des effets

une source d’oligosaccharides, de sucres, d’alcools et d’autres composés

organiques qui peuvent être libérés sous l’action des hémicellulases (Rodionova

La lignine est un polymère tridimensionnel amorphe de nature phénolique (

Elle résulte d’une polymérisation oxydative de nature phénolique

p-coumarilique (ou p-hydroxyphényl) (Rouau

Beaucoup de miccroorganismes dont les Actinomycètes sont capables de produire

enzyme responsable de biodégradation de la lignine (Mason


4

microorganismes cellulolytiques

: les cellulases.


Clostridium.

elable pratiquement

des recherches de bioconversion des déchets cellulosiques sous

Odier (1985)


sont des hétéropolysaccharides constituées de divers



la cellulose (Vincken et al.,

Les hémicelluloses font partie des substances ayant des effets critiques. Elles

une source d’oligosaccharides, de sucres, d’alcools et d’autres composés

(Rodionova et al., 1992).

phénolique (Lédé et al.,

oxydative de nature phénolique: les alcools

(Rouau et Thibault, 1987).

Actinomycètes sont capables de produire

(Mason et al., 2001).

I.1.4. La pectine

La pectine est un polymère d’acide galacturonique présent principalement dans les

parois cellulaires végétales. Elle peut être extraite des pépins de fruits, de la pulpe et de

l’écorce de pommes, d’agrumes, de betteraves sucrières, de tournesol ou encore d’algues.

Il s’agit d’un polysaccharide anionique ramifié dont le poids moléculaire peut varier

de 50 à 150 kilodaltons. Le squelette de la pectine est composé majoritairement d’unités

d’acide D-galacturonique reliées par des liens glycosidiques

Figure 2: Structure moléculaire de la pectine

La biodégradation de la pectine est assurée par des microorganismes pectinolytiques

tels que différentes souches d’A

à cet effet un ensemble d’enzyme

Stutzenberger, 1987).

L’action combinée de trois activités pectinolytiques (pectine lyase, pectine

polygalacturonase) conduit à la dégradation complète de la pectine.

Dans l’industrie alimentaire

fruits, l’extraction des huiles et la fermentation du café et du thé.

I.2. Biodégradation des co

Divers bactéries et champignons sont capables de dégrader les xénobiotiques

certains sont totalement oxydés en CO

dégradés. Il existe deux types de mécanismes ou métabolismes

xénobiotiques: la biodégradation gratuite (dégradation par métabolisme) et le co

� Biodégradation gratuite:

Dans ce type de biodégradation

carbone et d’énergie par les microorganismes (Alexander, 1973)



végétales. Elle peut être extraite des pépins de fruits, de la pulpe et de

pommes, d’agrumes, de betteraves sucrières, de tournesol ou encore d’algues.


0 à 150 kilodaltons. Le squelette de la pectine est composé majoritairement d’unités

galacturonique reliées par des liens glycosidiques α-(1-4) (figure 2)

Structure moléculaire de la pectine (Perez et al., 2000)


tels que différentes souches d’Actinomycètes (Streptomyces, Thermomonospora)

à cet effet un ensemble d’enzymes spécialisées: les pectinases. (Agate

L’action combinée de trois activités pectinolytiques (pectine lyase, pectine

polygalacturonase) conduit à la dégradation complète de la pectine.

Dans l’industrie alimentaire, ces enzymes sont utilisées pour la clarification des jus de

fruits, l’extraction des huiles et la fermentation du café et du thé.

I.2. Biodégradation des composés organiques de synthèse (xénobiotiques)

Divers bactéries et champignons sont capables de dégrader les xénobiotiques

certains sont totalement oxydés en CO2 alors que d’autres ne peuvent être que partiellement

existe deux types de mécanismes ou métabolismes de dégradation de

: la biodégradation gratuite (dégradation par métabolisme) et le co

Biodégradation gratuite:

Dans ce type de biodégradation, le produit chimique est utilisé comme source de

carbone et d’énergie par les microorganismes (Alexander, 1973).


5


végétales. Elle peut être extraite des pépins de fruits, de la pulpe et de

pommes, d’agrumes, de betteraves sucrières, de tournesol ou encore d’algues.


0 à 150 kilodaltons. Le squelette de la pectine est composé majoritairement d’unités

igure 2).

2000)


Thermomonospora) qui secrètent

(Agate et al., 1962;

L’action combinée de trois activités pectinolytiques (pectine lyase, pectine estérase,

s pour la clarification des jus de

énobiotiques)

Divers bactéries et champignons sont capables de dégrader les xénobiotiques dont

tre que partiellement

de dégradation de

: la biodégradation gratuite (dégradation par métabolisme) et le cométabolisme.

le produit chimique est utilisé comme source de


6

� Le cométabolisme

Le cométabolisme est la transformation d’un substrat incapable à lui seul d’assurer la

croissance microbienne et qui ne s’accomplit qu’en présence de substrat de croissance ou co-

substrat (Dalton et Stirling, 1982).

Selon Golovleva (1980), différents co-substrats (glucose, xylose, glycérol, acétate) ont

des effets différents sur la transformation du xylène par Pseudomonas aeruginosa.

Parmi les xénobiotiques, les pesticides regroupent les insecticides, les herbicides et les

fongicides utilisés pour la protection des cultures.

I.2.1. Les pesticides

Les pesticides sont des substances destinées à lutter contre les êtres vivants nuisibles,

en particulier les mauvaises herbes (herbicides), les animaux (insecticides, acaricides), les

bactéries et champignons (bactéricides et fongicides) (DGS, 2005; IFEN, 2006).

Les pesticides peuvent provoquer des effets néfastes sur la santé humaine et polluants

pour l’environnement.

Divers procédés sont proposés pour éliminer cette pollution. Parmi eux, le traitement

biologique offre un avantage économique contrairement au traitement physico-chimique

classique, souvent plus complexe dans sa réalisation et souvent onéreux.

Les xylénols largement utilisés en industrie sont parmi les pesticides représentant un

danger pour l’environnement et des recherches sont en cours pour leur élimination.

I.2.2. Les xylénols

Le xylénol ou diméthylphénol est un composé aromatique, constitué d'un cycle

benzénique avec deux groupes méthyles et un groupe hydroxyle.

Il existe six isomères du xylénol en fonction de la position des trois substituants sur le

cycle (tableau 1). Cependant, l'isomère le plus répandu est le 2,6-xylénol avec les deux

groupes méthyles en position ortho du groupe hydroxyle.

Tableau 1: Propriétés physico

Les xylénols entrent dans la composition des insecticides utilisés dans l’industrie de

préservation du bois. Ils servent

produits industriels comme les résines, les antioxydants, les désinfectants et les vernis

(Callahan et al., 1982; Goerlits

Plusieurs voies de dégradation sont envisageables pour ces polluants.

antérieures, cinq isomères parmi les six sont métabolisés par

(Chapman, 1972).

La dégradation du 2,3

l’hydroxylation du noyau benzène en 3,

dimethylbenzène), suivie par un mécanisme de fission de ce noyau

Par contre la première étape de dégradation du

groupement méthyle en groupement hydroxyle suivie par l’attaque du deuxième groupement

méthyle (Chapman et Hopper,

Le 2,5-xylénol et 3,5

Pseudomonas putida, par oxydation initiale de l’un des groupements méthyle

hydroxylation du noyau benzène

Nom 2,3-xylénol 2,4-xylénol

Structure

Point de

fusion °C 73 à 75 24

Point

d'ébullition

°C

216 210

pK A 10,50 10,45

Solubilité peu soluble dans l'eau (2,6-xylénol: soluble) à très soluble dans l’eau (3,4


physico-chimiques de xylénol

dans la composition des insecticides utilisés dans l’industrie de

Ils servent aussi d’intermédiaires dans la fabrication de plusieurs


; Goerlits et al., 1985).

Plusieurs voies de dégradation sont envisageables pour ces polluants.

parmi les six sont métabolisés par les souches

2,3- et 3,4-xylénol par Pseudomonas putida

l’hydroxylation du noyau benzène en 3,4-diméthylcatéchol (1,2

dimethylbenzène), suivie par un mécanisme de fission de ce noyau (Feist et

Par contre la première étape de dégradation du 2,4-xylénol est l’oxydation du


, 1968).

xylénol et 3,5-xylénol sont métabolisés par Pseudomonas alcaligenes

oxydation initiale de l’un des groupements méthyle

hydroxylation du noyau benzène (Hopper et Kemp, 1980).

Xylénol

xylénol 2,5-xylénol 2,6-xylénol 3,4

75 à 77 46 à 48

212 203

10,45 10,22 10,59

xylénol: soluble) à très soluble dans l’eau (3,4-xylénol: miscible), très soluble dans l'


7

dans la composition des insecticides utilisés dans l’industrie de

intermédiaires dans la fabrication de plusieurs


Plusieurs voies de dégradation sont envisageables pour ces polluants. Selon les études

souches de Pseudomonas

utida est initiée par

catéchol (1,2-dihydroxy-3,4-

et Hegeman, 1969).

est l’oxydation du


domonas alcaligenes et

oxydation initiale de l’un des groupements méthyles suivie d’une

3,4-xylénol 3,5-xylénol

65 à 68 61

226 219

10,32 10,15

xylénol: miscible), très soluble dans l'éthanol et l'éther


8

Peu d'informations existent sur la biodégradation du 2,6-xylénol tel que son utilisation

par la souche Mycobacterium sp. comme seule source de carbone et d’énergie (Jens et al.,

1989).

I.3. Les Actinomycètes: agents de biodégradation dans la nature

I.3.1. Définition, caractéristiques principales

Les Actinomycètes sont des bactéries dont la croissance donne lieu à des colonies

circulaires constituées d’hyphes (Eunice et Prosser, 1983), c’est-à-dire de filaments qui

irradient par croissance centrifuge, tout autour du germe qui leur a donné naissance. (Gottlieb,

1973; Lechevalier et Lechevalier, 1981; Eunice et Prosser, 1983).

Le mot «Actinomycètes» provient de deux substantifs grecs « Aktis » et «mykes» qui

signifient «champignons à rayon» ou «champignons rayonnants». Leur cycle biologique est

semblable à celui de certains champignons, mais leur structure procaryotique, sans noyau

distinct, les a classés parmi les bactéries.

Les Actinomycètes constituent l’ordre des Actinomycétales (Mariat et Sebald, 1990).

Ce sont des procaryotes à coloration Gram positif (Williams et al., 1993; Sanglier et Trujillo,

1997) dont le coefficient de Chargaff (GC%) est supérieur à 55%, généralement compris entre

60 et 75% (Ensign, 1978; Larpent et Sanglier, 1989; Chun et al., 1997).

Leur croissance est plus lente que celle des autres bactéries; le temps de génération

moyen est d’environ 2 à 3 heures (Ottow et Glathe, 1968; Larpent et Sanglier, 1989).

Physiologiquement, les Actinomycètes sont aérobies mais certaines sont aérobies

facultatives.

La plupart des Actinomycètes sont neutrophiles, avec une croissance maximale à pH

neutre ou légèrement alcalin (Lee et Hwang, 2002). Ils sont généralement mésophiles,

cependant, il existe des souches thermophiles isolées à une température située entre 50°C et

60°C (Edwards, 1993).

En général, les Actinomycètes sont des microorganismes hétérotrophes mais plusieurs

espèces sont capables aussi de croissance chimioautotrophe (Ensign et al., 1993).

I.3.2. Ecologie

Les Actinomycètes sont des microorganismes très ubiquitaires: ils sont adaptés à

divers milieux écologiques (Waksman, 1959; Lacey, 1973; Porter, 1971; Williams et al.,

1984).


9

� Sols

Les Actinomycètes sont très largement distribués dans les sols. Ils produisent des

substances spécifiques telles que la géosmine et le 2-méthyl isobornéol qui contribuent

significativement à l’odeur caractéristique des sols. (Omura, 1992; Zaitlin et al., 2003).

Ils sont présents depuis la surface jusqu’à plus de 2 mètres de profondeur du sol.

(Breton et al., 1989).

Le nombre de ces microorganismes peut atteindre généralement jusqu’à 106 germes

par gramme de sol séché (Goodfellow et Williams 1983).

Les Actinomycètes les plus abondants dans le sol appartiennent au genre Streptomyces

(Lechevalier 1964) (tableau 2).

Tableau 2: Fréquence de divers genres d’Actinomycètes dans le sol (Lechevalier et

Lechevalier, 1967)

Genres Pourcentages%

Streptomyces 95,34

Nocardia 1,98

Micromonospora 1,40

Thermomonospora 0,22

Actinoplanes 0,20

Microbispora 0,18

Mycobacterium 0,14

Streptosporangium 0,10

Actinomadura 0,10

Mycropolyspora 0,10

Pseudonocardia 0,06

Microellobosporia 0,04


10

� Milieux aquatiques

Les Actinomycètes sont rencontrés dans:

- les eaux de mer et le sédiment marin (Jensen et al., 1991; Kitouni et al., 2005)

- les marécages salés (Al- Zarban et al., 2002; Boughachiche et al.,2005)

� Air

Pour les Actinomycètes, l’air constitue un moyen de transport mais pas un habitat

(Ouhdouch, 1989). Les spores des Actinomycètes sont des contaminants importants pour

l’environnement et peuvent causer des effets néfastes sur la santé humaine (Gazenko et al.,

1998; Reponen et al.,1998; Suutari et al.,2002).

� Les Composts

Certains genres d’Actinomycètes sont isolés à partir des composts:

Thermoactinomyces, Sacharomonospora et d’autres thermotolérants tels que Microbispora,

Micropolyspora, Pseudonocardia (Ensign et al., 1993; Lacey, 1997; Song et al., 2001). Le

tableau 3 montre quelques exemples d’Actinomycètes impliqués dans le processus de

compostage.

Tableau 3: Exemples d’Actinomycètes impliqués dans le processus compostage

Espèces Références

Actinobifida chromogena Lacey (1973)

Pseudonocardia thermophilia Fergus (1964)

Streptomyces thermoviolaceus Fergus (1964)

Streptomyces thermofuscus Makawi (1980)

Streptomyces thermovulgaris Fergus (1964)

Thermoactinomyces vulgaris Waksman (1939b)

Thermoactinomyces sacchari Lacey (1973)

� Les végétaux, l’animal et l’homme

Les Actinomycètes peuvent être aussi pathogènes pour les végétaux, l’animal et

l’homme (Pirouz et al., 1999). On peut citer par exemple:

- Streptomyces scabies, responsable de la gale de pomme de terre;

- Actinomyces bovis, responsable d’une actinomycose chez le bétail;

- Mycobacterium tuberculosis

de la lèpre;

- Nocardia asteroides

- Micropolyspora faeni

I.3.3. Biologie de développement

Les Actinomycètes possèdent un caractère tout à fait remarquable qui se traduit le plus

souvent par une différenciation importante et l’existence d’un cycle biologique

celui de certains Eucaryotes.

Les Actinomycètes les plus différenciés développent

d’hyphes mycéliens répartis en deux couches distinctes: le mycélium aérien et le mycélium du

substrat. Selon les cas, des spore

mycélium du substrat ou les deux à la fois,

I.3.3.1. Mycélium aérien et mycélium du substrat

Le mycélium du substrat, également dénommé mycélium végétatif ou

développe à partir du tube de germination issu de la spore (Theilleux, 1993).

le support solide où il puise les nutriments. La croissance des hyphes est apicale.

Le mycélium aérien, appelé aussi mycélium secondaire, est

sur le mycélium du substrat (figure 3).

ramifiés que les hyphes du substrat. Ils sont en général pigmentés et enfermés dans une

enveloppe externe hydrophobe.

Divers mutants de Streptomyces

été décrits (Chater et Merrick, 1979).

Figure 3: Une colonie du genre

I.3.3.2. Formation des spores

Les spores d’Actinomycètes sont classées en grand

formation: exospores et endospores.

Surface de la

gélose


Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium leprae, agents de la tuberculose

Nocardia asteroides, responsable de la nocardiose humaine;

Micropolyspora faeni, responsable d’une pneumonie allergique chez l’homme

développement

ctinomycètes possèdent un caractère tout à fait remarquable qui se traduit le plus

souvent par une différenciation importante et l’existence d’un cycle biologique

les plus différenciés développent, sur un milieu gélosé


substrat. Selon les cas, des spores peuvent se former sur le mycélium aérien ou sur le

mycélium du substrat ou les deux à la fois, pour permettre la propagation de la souche.

Mycélium aérien et mycélium du substrat

Le mycélium du substrat, également dénommé mycélium végétatif ou

développe à partir du tube de germination issu de la spore (Theilleux, 1993).

es nutriments. La croissance des hyphes est apicale.

Le mycélium aérien, appelé aussi mycélium secondaire, est formé d’hyphes dressés

sur le mycélium du substrat (figure 3). Ces hyphes aériens sont plus épais et beaucoup moins


enveloppe externe hydrophobe.

eptomyces sans mycélium aérien ou incapables de sporuler ont

(Chater et Merrick, 1979).

Une colonie du genre Streptomyces sur milieu solide (Dvorak, 1999)

I.3.3.2. Formation des spores

ctinomycètes sont classées en grands groupes selon leur mode de

endospores.


11

de la tuberculose et

e pneumonie allergique chez l’homme.

ctinomycètes possèdent un caractère tout à fait remarquable qui se traduit le plus

souvent par une différenciation importante et l’existence d’un cycle biologique semblable à

sur un milieu gélosé, une masse


s peuvent se former sur le mycélium aérien ou sur le

la propagation de la souche.

Le mycélium du substrat, également dénommé mycélium végétatif ou primaire, se

développe à partir du tube de germination issu de la spore (Theilleux, 1993). Il est ancré dans

es nutriments. La croissance des hyphes est apicale.

formé d’hyphes dressés

Ces hyphes aériens sont plus épais et beaucoup moins


sans mycélium aérien ou incapables de sporuler ont

(Dvorak, 1999)

es selon leur mode de

Mycélium aérien

Mycélium végétatif


12

� Les exospores

Généralement, les Actinomycètes forment des exospores par septation des extrémités

des filaments. La plupart des exospores ne sont pas particulièrement résistantes à la chaleur,

mais supportent bien la dessiccation, et ont de ce fait une importante faculté adaptative

(Prescott et al., 2007).

� Les endospores

Les endospores sont produites par des Actinomycètes thermophiles et elles sont issues

d’une réorganisation cytoplasmique avec formation d’une nouvelle paroi dans l’hyphe.

Les spores des Thermoactinomyces contiennent de l’acide dipicolinique associé à de

grandes quantités d’ions calcium et magnésium, l’ensemble jouant un rôle dans la résistance

des spores à la chaleur (Sykes et Skinner, 1973).

� Germination des spores

Il s’agit d’une séquence de changements morphologiques de la spore en structure

végétative. La germination des spores passe par quatre étapes: l’activation, l’initiation,

l’émergence du tube germinatif et enfin la croissance.

Les exospores germent après activation par un choc thermique qui peut être par

exemple de 50°C chez Streptomyces viridochromogenes.

Les endospores ne germent dans des conditions de milieu favorable qu’avec une

activation spécifique de nature physique. Un refroidissement à 20 °C de 2 à 48 heures est

nécessaire pour permettre aux spores de Thermoactinomyces vulgaris de répondre ensuite au

choc thermique de 55°C inducteur de la germination (Leveau et Buix, 1993).

La figure 4 résume le cycle de vie d’un Actinomycète (Streptomyces).


13

Figure 4: Cycle de vie des Streptomyces (Breton et al., 1989)

I.3.3.3. Structures particulières

Des structures particulières peuvent être présentes chez certains Actinomycètes. Ces

structures ne correspondent ni aux mycéliums ni aux spores, et leur fonction n’est pas toujours

définie:

�� Les sclérotes trouvés chez Chainia sont constitués par une masse d’hyphes

cloisonnés dont les vacuoles sont chargées de glycérides et d’acides gras ramifiés.

�� Les sporanges sont des sacs contenant des spores. Ils peuvent être rencontrés sur

le mycélium aérien bien développé ou sur la surface de colonies dépourvues ou ayant un

mycélium aérien peu développé.

�� Les synnemata ou encore corémies, sont des assemblages compacts d’hyphes

dressés, parfois fusionnés et portant des conidies apicales ou latérales (Theilleux et al, 1993).

Cette structure est caractéristique du genre Actinosynnema.

I.4. Taxonomie des Actinomycètes

Selon la classification du "Taxonomic Outline of The Procaryotes, Bergey's Manual of

Systematic Bacteriology", seconde édition 2004 (Garrity et al., 2004), le phylum (bactéries à

Gram positif et GC% élevé) est constitué d'une seule classe dénommée également

"Actinobacteria".


14

La classe "Actinobacteria"

En 1997, Stackebrandt et al. proposent une nouvelle classification hiérarchique des

Actinomycètes qui repose uniquement sur l'analyse des séquences des ARNr 16S et des gènes

codant pour les ARNr 16S. Une nouvelle classe est décrite dans cette classification.

La classe des Actinobacteria est divisée en 5 sous-classes: Acidimicrobidae,

Rubrobacteridae, Coriobacteridae, Sphaerobacteridae et Actinobacteridae.

Chacune de ces sous classes est constituée d'un ou plusieurs ordres eux-mêmes formés

d'une ou de plusieurs familles. Dans la sous-classe des Actinobacteridae, l'ordre des

Actinomycetales est subdivisé en 10 sous-ordres: Actinomycineae, Micrococcineae,

Corynebacterineae, Micromonosporineae, Propionibacterineae, Psuedonocardineae,

Streptomycineae, Streptosporangineae, Frankinea et Glycomycineae (Stackebrandt et al.,

1997; Labeda et Kroppenstedt, 2000; Stackebrandt et Schumann, 2000).

I.4.1. Critères de détermination des genres d’Actinomycètes

La clé de détermination de genres et espèces d’Actinomycètes est basée sur les

caractères morphologiques, les caractères physiologiques et la composition chimique de la

paroi cellulaire (Boone et Pine, 1968; Lechevalier and Lechevalier, 1970; Lechevalier et al.,

1973; Lechevalier et al., 1977; Xu et Jiang, 1996).

I.4.1.1. Caractères morphologiques

Les principaux caractères morphologiques des Actinomycètes correspondent à:

- La présence, l’importance et la disposition des hyphes du mycélium du substrat ou

du mycélium aérien.

- La présence de spores, leur mobilité, leur disposition sur les hyphes et leurs

formes.

- La présence de structures particulières comme les sporanges, les sclérotes ou

synnemata (Schofieled et Schaal, 1981; Demain et Solomon, 1985).

I.4.1.2. Colorations et caractéristiques biochimiques

Certains groupes d’Actinomycètes ont une paroi cellulaire très riche en lipides appelés

acides mycoliques. La présence de ces acides gras complexes à l’extérieur du peptidoglycane

rend les bactéries positives à la coloration de Ziehl-Nielsen (acido-alcoolo-résistance).


15

L’acido-alcoolo-résistance est caractéristique du genre Mycobacterium. L’acido-

alcoolo-résistance des Nocardia est partielle avec la technique modifiée de Ziehl-Nielsen.

A côté de ces colorations, d’autres tests sont utilisés pour distinguer les Nocardia des

Rhodococcus, Tsukumurella et Gordonia, comme l’analyse de la sensibilité au lysozyme,

ainsi que la recherche d’une activité β-galactosidase (enzyme permettant l’hydrolyse du

lactose en glucose et galactose) et d’un nitrate réductase (enzyme qui catalyse la réaction de

réduction des nitrates (tableau 4).

Tableau 4: Caractères d’identification présomptive des Nocardia et des autres genres

d’Actinomycètes apparentés au Nocardia (Boiron et al., 1993; Carelotti et al., 1994)

Nocardia Rhodococcus Mycobacterium Gordonia Tsukurella

Mycélium aérien + - - - -

ONPG + - - - +

Nitrate réductase + V + + -

Résistance aux lysozymes R S V S R

R: résistant; S: sensible; V: variable; ONPG: Ortho-Nitrophényl-Béta-galactosidase

I.4.1.3. Caractères chimiotaxonomiques

La composition de la paroi cellulaire des Actinomycètes constitue un outil pratique

pour leur taxonomie (Stanek et Roberts, 1974; Lechevalier et al., 1977), permettant de répartir

ces microorganismes en huit types. La plupart des Actinomycètes possèdent une paroi

cellulaire de type I à type IV.

�� Les acides aminés

La paroi cellulaire des Actinomycètes est composée soit d’une:

- Glycoprotéine contenant de la lysine; ce type de paroi est rencontré chez les formes

fermentatives, telles que les Actinomyces (Lechevalier et Lechevalier, 1985).

- Glycoprotéine contenant le plus souvent de l’acide 2,6 diaminopimélique (DAP); ce

type de paroi se rencontre chez les formes oxydatives telles que les Streptomyces. Il se

présente sous deux formes: la forme LL et la forme méso (Lechevalier et Lechevalier, 1970;

Demain et Solomon, 1985). Les Actinomycètes avec des parois cellulaires de type I possèdent

principalement de l’acide diaminopimélique de forme LL, alors que la forme méso de ce

même acide est caractéristique des types II, III et IV (tableau 5).


16

Une quantité importante de glycine est également présente chez les Streptomyces et les

Actinoplanetes (Larpent et Sanglier, 1989).

Tableau 5: Types pariétaux en fonction des constituants majeurs des parois des

Actinomycètes (Lechevalier et Lechevalier, 1980)

Types de paroi Constituants majeurs Exemples de genres

I LL-DAP, glycine Streptomyces

II Méso–DAP*, glycine Micromonospora

III Méso-DAP Actinomadura, Streptosporangium,

IV Méso-DAP, arabinose, galactose Nocardia

V Lysine, ornithine Actinomyces israelii

VI Lysine Oerskovia

VII DAB*, glycine Agromyces

VIII Ornithine Cellulomonas

*DAP: Acide 2,6-diaminopimélique; DAB: Acide 2,4-diaminobutirique

�� Les sucres

Les glucides de la paroi cellulaire permettent une séparation des Actinomycètes de type

pariétal II, III et IV contenant du méso-DAP en quatre groupes majeurs (tableau 6). Sur cette

même base, il est aussi possible de répartir en deux sous groupes les Actinomycètes de type

pariétal III selon la présence ou l’absence de Madurose.

Tableau 6: Types pariétaux et types glucidiques cellulaires des actinomycètes aérobies à méso-

DAP (Lechevalier et Lechevalier, 1980).

Type pariétal Constituants pariétaux distinctifs majeurs

Type glucidique cellulaire (Spectre glucidique)

Constituants glucidiques

caractéristiques

II Glycine D Xylose, Arabinose

III Aucun B Madurose

C Aucun

IV Arabinose, galactose A Arabinose, galactose


17

�� Les lipides

Les lipides polaires, les ménaquinones et les acides mycoliques constituent les groupes des

lipides taxonomiquement importants.

- Les lipides polaires sont les phospholipides d’origine membranaire les plus

communs chez les Actinomycètes (Lechevalier et Lechevalier, 1980).

- Les ménaquinones sont des lipides ayant dans leur structure un noyau quinone

méthylé et une chaîne carboné aliphatique composée d’unités isoprènes. Ils sont classés

suivant le nombre de ces unités et le degré d’hydrogénation (saturation) de la chaîne (Collins

et al., 1977).

Par exemple, le genre Planomonospora se caractérise par une ménaquinone MK9

(H2): ménaquinone avec neuf unités isoprènes dont deux hydrogénées.

� Les acides gras ont des chaînes qui peuvent être droites ou ramifiées, saturées ou

insaturées. Le nombre d’atomes de carbone est caractéristique du genre. Les acides gras

rencontrés chez les Actinomycètes sont, soit des molécules de 12 à 20 atomes de carbone, soit

un groupe d’acides mycoliques de 20 à 90 atomes de carbone, caractéristique des genres tels

que Mycobacterium, Nocardia et Rhodococcus.

I.5. Les Actinomycètes: producteurs d’enzymes de biodégradation

Deux des propriétés les plus significatives des Actinomycètes sont leur capacité à se

développer sur les substrats les plus divers et leur aptitude à synthétiser des enzymes qui,

après les antibiotiques, sont les produits les plus importants des Actinomycètes (Lopes et al.,

1999).

I.5.1. Enzymes de biodégradation des composés organiques naturels

Les Actinomycètes sont des microorganismes saprophytes qui jouent un rôle dans la

dégradation de la matière organique naturelle comme la cellulose, la lignocellulose, la pectine.

� Les cellulases

Les Actinomycètes, en particulier les espèces thermophiles et les Streptomyces,

secrètent des enzymes qui dégradent la cellulose (Sanglier et al., 1993; Mason et al., 2001).

Ces enzymes sont classés en trois types: endoglucanases, exoglucanases ou

cellobiohydrolases et cellobiases (Klemm et al., 2002).


18

D’autres espèces d’Actinomycètes produisent des enzymes qui dégradent

l’hémicellulose (Rivas et al., 2003).

� Les ligninases

Beaucoup d’espèces d’Actinomycètes telles que Streptomyces thermoviolaceus,

Streptomyces viridosporus, Streptomyces fusca ont la capacité de produire l’ hémepéroxidase,

enzyme qui dégrade la lignine (Mason et al., 2001).

� Les pectinases

Différents genres d’Actinomycètes tels que: Micromonospora, Microbispora,

Actinoplanes, Streptosporangium et les Streptomyces ont une activité pectinolytique (Demain

et Solomon, 1985; Sanglier et al., 1993).

I.5.2. Enzymes de biodégradation des composés organiques de synthèse

Les capacités biodégradatrices des Actinomycètes ne se limitent pas seulement aux

composés organiques naturels mais concernent également des composés organiques plus

difficiles à dégrader comme les hydrocarbures (chaînes hydrocarbonées), les phénols et

d’autres composés récalcitrants (Kimura et Urushigawa, 2001; Lin et al., 2005).

Parmi les Actinomycètes, le sous-ordre Corynebacterineae constitue la majorité des

microorganismes dégradant les xénobiotiques, les genres mieux connus sont Gordonia,

Rhodococcus et Mycobacterium (Bell et al., 1998; Arenskötter et al., 2004; Larkin et al.,

2005).

Matériels et méthodes

19

II.1. MATERIELS

II.1.1. Echantillonnage du sol

Les échantillons de sol rhizosphérique sont prélevés dans trois points différents du site

d’étude situé dans la région Vakinakaratra plus précisément dans le massif de l’Ibity par la

technique de Pochon et Tradieux (1962). Le massif de l’Ibity est une zone essentiellement

couverte de savanes et de fourrés avec des surfaces réduites de forêt humide de moyenne

altitude. La figure 5 montre la cartographie et la localisation de la collecte des échantillons.

Figure 5 : Situation géographique et vue d’ensemble de la forêt du Massif

Ibity (Source: Missouri Botanical Garden, Décembre, 2007)


20

Six (6) échantillons de sol sont collectés à une profondeur de 10 à 20 cm à raison de

deux échantillons par point de prélèvement selon le tableau 7. Pour chaque échantillon, une

quantité suffisante de terre (environ 100g) est prélevée, puis déposée à l’aide d’une spatule

dans des sachets de prélèvement stériles. Les échantillons sont conservés à la température

ambiante jusqu’au laboratoire.

Tableau 7: Codification des échantillons

II.1.2. Milieux d’étude

La composition de chaque milieu de culture est donnée en annexe 1.

II.1.2.1. Milieu d’isolement

� Milieu AS1 (Antibiotic selection 1)

Il s’agit d’un milieu solide utilisé pour isoler et purifier les souches d’Actinomycètes à

partir des échantillons de sol.

Ce milieu est additionné de 3 antibiotiques pour l’isolement des Actinomycètes:

- La triméthoprime (inhibiteur des bactéries)

- Le cycloheximide (inhibiteur des champignons)

- L’acide nalidixique (inhibiteur des bactéries à Gram négatif)

SITE Code des échantillons

Forêt de Tapia Tf1, Tf2

Savane Sa1, Sa2

Forêt galerie Gf1, Gf2


21

II.1.2.2. Milieu de préparation des inocula pour les tests de biodégradation et de

pré-identification

� ISP3 (International Streptomyces 3)

Il correspond à un milieu solide contenant de la solution d’avoine. Il est utilisé pour la

préparation des inocula des souches d’Actinomycètes pour les tests de biodégradation et de

pré-identification.

II.1.2.3. Milieu pour les tests de biodégradation

i. Milieu pour la biodégradation de la cellulose


Milieu solide utilisé pour mettre en évidence la biodégradation de la cellulose par les

souches d’Actinomycètes.

ii. Milieu pour la biodégradation de pectine

� Pectine Agar

Milieu solide utilisé pour mettre en évidence la biodégradation de pectine par les

souches d’Actinomycètes.

iii. Milieu pour la biodégradation de 2,5-xylénol et 2,6-xylénol

� Milieu minimum

Milieu solide utilisé pour mettre en évidence la biodégradation de 2,5-xylénol et 2,6-

xylénol par les souches d’Actinomycètes.

iv. Milieu pour la tolérance au 2,5-xylénol et au 2,6-xylénol

� Amidon caséine

Milieu contenant de la caséine. Il est utilisé pour voir la tolérance des souches

d’Actinomycètes au 2,5-xylénol et au 2,6- xylénol.

II.1.2.4. Milieu d’identification

i. Milieu d’identification macroscopique


Milieu de culture solide contenant comme source de carbone le glucose. Il est

habituellement utilisé pour l’identification macroscopique des souches d’Actinomycètes.


22


Milieu solide contenant de l’amidon soluble. Il est employé pour identifier

macroscopiquement les souches d’Actinomycètes.


Milieu solide contenant du glycérol. Il est aussi utilisé lors de l’identification

macroscopique des souches d’Actinomycètes.

ii. Milieu pour la détermination des pigments mélanoïdes et des pigments diffusibles


Milieu solide à base de peptone utilisé pour déterminer la présence de pigments dans

les souches d’Actinomycètes.


Milieu solide contenant comme source de carbone le glycérol. Il est aussi utilisé pour

déterminer la présence de pigments dans les souches d’Actinomycètes.

iii. Milieu pour la détermination des caractères biochimiques

• Recherche de nitrate réductase

� Bouillon nutritif

Le bouillon nutritif est un milieu utilisé pour rechercher la présence d’enzyme nitrate

réductase.

iv. Milieu pour la détermination des caractères physiologiques

• Détermination de la température optimale de croissance

� Sporulation Agar

Milieu solide contenant de l’extrait de levure et de l’extrait de viande, il est utilisé

pour déterminer la température de croissance optimale des souches d’Actinomycètes.

• Détermination du pH optimal

� CYD (Casamino acids Yeast extracts D-glucose)

Milieu solide mis au point par Crawford en 1993 pour déterminer le pH optimum de

croissance des souches d’Actinomycètes.


23

• Milieu pour la détermination du type respiratoire

� Viande Foie (VF)

Milieu de culture contenant un gradient de pression partielle en dioxygène, il est utilisé

pour l’étude du type respiratoire d'une bactérie.

• Milieu pour la détermination de la mobilité

� Mannitol mobilité

Milieu semi-solide permettant de mettre en évidence la réduction du nitrate par les

bactéries et leur mobilité à partir de la ligne d’ensemencement.

II.2. METHODES

II.2.1. Isolement de souches d’Actinomycètes

II.2.1.1. But

Le but de cette étape est d’isoler et d’obtenir le maximum de souches d’Actinomycètes

contenues dans les échantillons de sol. La technique d’isolement des souches

d’Actinomycètes est celle proposée par le Laboratoire de Daw Agro Sciences (DAS) aux

Etats Unis (Don Hann, 2007).

II.2.1.2. Principe

Trois méthodes d’isolement sont utilisées pour isoler les Actinomycètes à partir des

échantillons de sol: la sélection par antibiotiques, le traitement à 100°C et le sol aérosolisé.

Un prétraitement des échantillons de sol est entrepris avant l’isolement.

II.2.1.3. Techniques d’isolement

Une semaine avant l’isolement des souches d’Actinomycètes, les échantillons de sols

sont distribués dans des boîtes de Pétri, puis séchés dans un dessiccateur sous vide contenant

du silicagel qui absorbe l’humidité.

• Sélection par antibiotiques

Pour chaque échantillon, 1g de sol est dilué dans 9ml d’eau distillée stérile, puis agité

au vortex. Cette suspension constitue la dilution 10-1.

Une série de dilutions décimales (jusqu’à 10-3) est effectuée pour chaque échantillon. Pour

cela, 0,1ml de chacune des dilutions 10-2 et 10-3 sont ensuite étalées à l’aide d’un racloir


24

stérile sur le milieu AS1 solide contenant les 3 antibiotiques (triméthoprime, cycloheximide,

acide nalidixique). Les boîtes de Pétri sont ensuite incubées à 30°C pendant 7 à 28 jours.

• Traitement à haute température

Un gramme (1g) de chaque échantillon de sol est placé dans une étuve à 100°C

pendant une heure. Ensuite, le principe est le même que pour l’isolement par antibiotiques.

• Sol aérosolisé

Un gramme (1g) de l’échantillon de sol est placé dans le récipient Grayson Aerosol

Sampler (GAS) stérile. Le récipient est ensuite fermé et agité vigoureusement et laissé reposer

pendant une heure. Après une heure, le couvercle et le bouchon de la boîte de GAS sont

retirés, et une boîte de Pétri contenant le milieu AS1 est placée en position renversée à 1cm de

l’ouverture de la GAS. En utilisant un petit tuyau et une poire, de l’air est produit par

pompage disséminant ainsi les spores dans le GAS vers le milieu solide. Les boîtes de Pétri

sont ensuite incubées à 30°C pendant 4 semaines.

II.2.1.4. Prélèvements des colonies d’Actinomycètes

Dans un premier temps, les colonies d’Actinomycètes sont repérées d’après leur aspect

macroscopique caractéristique (colonies dures incrustées dans la gélose). Puis par leur aspect

microscopique (colonies circulaires constituées d’hyphes), par observation directe sous

microscope optique (grossissement × 10). Pour une observation plus claire, une colonie

entière est placée sur une lame stérile et après élimination du maximum d’Agar, elle est

légèrement écrasée avec une lamelle et observée sous microscope optique (grossissement

×40), (Suzuki, 2001).

II.2.1.5. Coloration de Gram

Elle est effectuée selon la méthode classique (Marchal, 1985; Singleton, 1999). Des

frottis de colonies répondant aux caractéristiques macroscopiques et microscopiques des

Actinomycètes sont préparés, colorés puis observés sous microscope optique (grossissement

×100). Les colonies Gram positif sont toutes repiquées sur le milieu AS1.

II.2.2. Conservation de souches d’Actinomycètes isolées et purifiées

A partir d’une culture pure, quelques colonies d’Actinomycètes sont prélevées à l’aide

d’une oëse stérile puis mises en suspension dans un cryotube stérile contenant 1ml de glycérol

30% (v/v). Les cryotubes sont immédiatement placés dans un congélateur à -80°C.


25

II.2.3. Préparation des inocula pour les tests de biodégradation et de pré-

identification

Des tubes contenant le milieu ISP3 gélosé incliné sont ensemencés par les souches

d’Actinomycètes isolées et purifiées puis incubées pendant 21 jours à 28°C. La surface des

colonies est raclée et une suspension dense de fragments mycéliens et de spores est préparée

en eau physiologique stérile, et constitue l’inoculum (Shirling et Gottlieb, 1966; Suutari et al.,

2002).

Pour chaque souche, l’inoculum est préparé de telle manière à obtenir une densité optique

égale à 0,1 pour une longueur d’onde de 660 nm ce qui correspond à 105 UFC/ml.

II.2.4. Mise en évidence de la biodégradation des composés organiques complexes

naturels

Deux composés sont étudiés: la cellulose et la pectine.

II.2.4.1. Biodégradation de la cellulose (activité cellulolytique)

Cette étude est réalisée sur le milieu de base ISP9 (International Streptomyces Project)

contenant la cellulose cristalline (Sigmacell, type 101) à une concentration de 1% (p/v)

comme seule source de carbone et d’énergie.

Pour chaque souche, deux boîtes sont ensemencées en surface. La lecture est effectuée après

21 jours d’incubation à 30°C.

L’utilisation de la cellulose est appréciée en comparant les cultures avec la croissance obtenue

sur le milieu ISP9 sans source de carbone servant de contrôle négatif et avec le milieu ISP9

additionné de glucose servant de contrôle positif (Pridham et Gottlieb, 1948; Wink et al.,

2003; Lekchiri et al., 2006).

II.2.4.2. Biodégradation de la pectine (activité pectinolytique)

Les souches sont ensemencées sur le milieu Pectine Agar. Après incubation à 30°C

pendant 5 jours, les boites sont recouvertes par une solution de CTAB (bromure d’héxadecyl

triméthyl ammonium) à 1% (p/v) et laissées à température ambiante pendant quelques

minutes, puis lavées à l’eau distillée stérile.

L’activité pectinolytique est mise en évidence par l’apparition de zones claires autour des

colonies (Hankin et al., 1971; Nicemol et al., 2006 ).


26

II.2.5. Mise en évidence de la biodégradation des composés organiques de

synthèse

Deux polluants organiques sont étudiés, le 2,5-xylénol et le 2,6-xylénol.

II.2.5.1. Biodégradation de 2,5-xylénol et du 2,6-xylénol

Les souches d’Actinomycètes isolées sont ensemencées en surface sur un milieu

minimum contenant le 2,5-xylénol ou le 2,6-xylénol comme unique source de carbone et

d’énergie à une concentration de 0,2 g/l (Alexander et Lustigman, 1966). Pour chaque souche,

deux boites sont ensemencées et incubées à 28°C pendant 21 jours.

La biodégradation est appréciée en comparant les cultures avec la croissance obtenue

sur le milieu minimum sans source de carbone servant de témoin négatif et avec le milieu

minéral additionné de glucose servant de contrôle positif.

II.2.5.2. Tolérance au 2,5-xylénol et au 2,6-xylénol

Comme pour la technique de diffusion sur gélose ou méthode des disques servant à

déterminer l’activité d’un antibiotique sur des bactéries, le degré de tolérance des souches

dégradant les deux types de xylénols est vérifiée de la même façon.

Pour ce faire, les inocula des souches dégradant les deux types de xylénols sont

ensemencés par inondation sur le milieu Amidon Caséine. Après séchage pendant 30 minutes,

des disques de papier filtre Whatman n°1 de 4mm de diamètre chargés de différentes

concentrations (500, 1000, 2000, 3000 mg/l) de 2,5-xylénol et de 2,6-xylénol (à raison de 20

µl par disque) sont déposés sur la surface de la gélose. Un disque sans xylénols sert de témoin

négatif. Pour chaque substrat et chaque souche, deux boites sont préparées (Labrecque, 2003).

Les disques diffusent alors les xylénols qui inhibent ou non la croissance des souches autour

des disques. La croissance des souches sur géloses est suivie pendant 7 jours à 30°C.


27

II.2.6. Pré-identification des souches actives

La pré-identification des souches actives est basée sur trois caractères: culturaux,

biochimiques et physiologiques (figure 6).

Figure 6: Pré-identification des souches d’Actinomycètes actives

II.2.6.1. Aspect macroscopique

L’aspect macroscopique des différentes souches actives est déterminé sur les milieux

International Streptomyces Project : ISP2, ISP4 et ISP5 recommandés par Shirling et Gottlieb

(1966).

Les milieux stériles sont repartis en boîtes de Pétri stérile 24 heures avant l’utilisation, puis

ensemencés en stries à partir d’une à deux gouttes de l’inoculum.

L’aspect macroscopique (couleur, forme, etc.) des colonies est observé après 21 jours

d’incubation à 30°C (Shirling et Gottlieb, 1966; Mocheva et al., 2002; Oskay et al., 2004).

La couleur du mycélium du substrat n’est pas toujours claire. Pour la déterminer, une parcelle

de la gélose est découpée à partir des cultures matures, puis déposée sur un support désinfecté.

L’excès de la gélose est éliminé par une lame de rasoir et la couleur est notée (Shirling et

Gottlieb, 1966).

Aspect

macroscopique

Aspect

microscopique Coloration Ziehl-

Nielsen, nitrate

réductase, β-D-

galactosidase

Culture sur

milieu solide,

pigment soluble

Culture sur

lamelle

Détermination:

température, pH, type

respiratoire, mobilité

Caractères

physiologiques

Caractères

culturaux

Caractères

biochimiques

Pré-identification des souches d’Actinomycètes


28

II.2.6.2. Détermination des pigments mélanoïdes et des pigments diffusibles

La mise en évidence des pigments mélanoïdes produits par les souches actives est

réalisée sur les milieux ISP6 et ISP7 en gélose inclinée. Un tube non ensemencé sert de

témoin. L’observation de la couleur brun-noire caractéristique des pigments mélanoïdes se

fait au 2ème et au 4ème jusqu’au 7ème jour, en comparant les tubes ensemencés avec le témoin

(Shirling et Gottlieb, 1966; Mocheva et al., 2002).

S’il y a production de pigments de couleurs différentes, autre que la couleur brun-noire

caractéristique des pigments mélanoïdes, la couleur est notée (Shirling et Gottlieb, 1966).

II.2.6.3. Aspect microscopique

L’observation de la morphologie des chaînes de spores du mycélium aérien et du

mycélium du substrat est effectuée selon la technique de culture sur lamelle.

Cette technique consiste à insérer délicatement une lamelle stérile dans un milieu

gélosé ISP2, ISP4 ou ISP5, de telle sorte qu’elle forme un angle de 45°C avec la surface de

celui-ci. Une goutte de l’inoculum est déposée contre la lamelle en contact avec le milieu.

Après 14 jours d’incubation à 30°C, la lamelle est retirée soigneusement de la gélose

entraînant avec elle des fragments du mycélium du substrat et aérien, elle est ensuite déposée

sur une lame puis examinée au microscope optique (grossissement ×100).

II.2.6.4. Détermination de l’acido-alcoolo-résistance

Coloration de Ziehl-Nielsen

La coloration de Ziehl-Nielsen est une méthode permettant l’identification des

Mycobactéries, et met en évidence l’acido-alcoolo-résistance de ce genre d’Actinomycètes.

Des frottis de colonies d’Actinomycètes sont préparés, puis couverts d’une solution de

fuschine phéniquée pendant 10 minutes, puis rincés à l’eau de robinet. Les lames sont ensuite

recouvertes d’une solution d’acide sulfurique concentré diluée au ¼ pendant 3 minutes, puis

rincées à l’eau de robinet. Les frottis subissent alors l’action de l’alcool éthylique 90º pendant 5

minutes. Les lames sont alors rincées à l’eau de robinet, puis les frottis sont recolorés avec une

solution de bleu de méthylène pendant 30 secondes à une minute puis ils sont rincés

abondamment. Une fois séchées, les lames sont examinées sous microscope optique à l’aide de

l’objectif à immersion (x100).


29

Les cellules des Mycobactéries qui sont acido-alcoolo-résistantes apparaissent en rouge, alors

que celles des Actinomycètes prennent la coloration bleue (Larpent et Larpent-Gourgaud,

1985b; Hamid et al., 2001).

II.2.6.5. Caractéristiques biochimiques

i. Recherche de la catalase

La catalase est une enzyme qui catalyse la dégradation de l’eau oxygénée en oxygène

et en eau selon la réaction suivante:

2H2O2 → O2 + 2H2O

Elle est mise en évidence par contact de la culture avec une solution fraîche d’eau

oxygénée. Pour chaque souche, une goutte d’eau oxygénée est placée sur une lame stérile sur

laquelle quelques colonies sont réparties. Un dégagement gazeux abondant sous forme de

mousse ou de bulles d’air traduit la décomposition de l’eau oxygénée sous l’action de la

catalase.

ii. Recherche de la Bêta Galactosidase

La bêta- Galactosidase est une enzyme qui permet l’hydrolyse du lactose en glucose et

galactose. Elle est recherchée par l’utilisation de l’ONPG (Orthonitophènyl-Bêta-

Galactoside), un substrat synthétique incolore de structure proche de celle du lactose, et

donnant en présence de bêta- Galactosidase l’ONP (Orthonitophènol) de couleur jaune. La

technique est réalisée selon le protocole de Flores et al. (1990). Les souches d’Actinomycètes

acido-alcoolo-résistantes sont d’abord cultivées sur gélose à la cervelle et au cœur de veau

pendant 5 jours. A partir de ces cultures, une suspension épaisse est préparée dans 0,5ml

d’eau distillée stérile dans laquelle un disque d’ONPG est introduit. Après incubation de 18

heures à 30°C, l’apparition d’une coloration jaune est notée.

iii. Recherche de la Nitrate-Réductase

La Nitrate-Réductase est une enzyme qui catalyse la réduction des nitrates NO-3 en

NO-2 (nitrite) ou en N2. Elle est mise en évidence selon le protocole de Gordon et Smith

(1953). Dix millilitres de bouillon nutritif contenant 0,1% de nitrate de potassium sont

ensemencés par les souches d’Actinomycètes puis incubés à 30°C. Aux 5ème, 10ème et 14ème

jours d’incubation, 3 gouttes de chacun des réactifs de Griess І (acide sulfanilique) et Griess II

(α−naphtylamine) sont ajoutées.


30

La réduction des nitrates en nitrites est mise en évidence par l’apparition d’une couleur

rouge orangée.

II.2.6.6. Caractères physiologiques

i. Détermination de la température optimale de croissance

Les souches actives sont ensemencées en surface sur le milieu de culture sporulation

Agar, à raison de 2 boites de Pétri par souche pour chaque température d’incubation. La

croissance est estimée visuellement à 28°C, 30°C, 37°C, 45°C, 55°C après incubation pendant

21 jours (Chun et al., 1998).

ii. Détermination du pH optimal de croissance

Les souches actives sont ensemencées sur le milieu CYD, tamponné à différents pH

(5,5, 6,0, 6,5, 7, 7,5, 8). Le pH final est ajusté juste avant stérilisation.

La croissance des souches est estimée visuellement après 21 jours d’incubation à 30°C

(Crawford et al., 1993).

iii. Détermination du type respiratoire

Elle est réalisée selon le protocole de Guiraud (1998). La gélose profonde viande foie

(VF) répartie en tube est régénérée par un chauffage au bain marie bouillon pendant 30

minutes. Elle est ensuite refroidie jusqu’à 45°C et ensemencée à l’aide d’une pipette pasteur

qui est plongée au fond du tube, puis remontée en décrivant une spire, de façon à ensemencer

uniformément le milieu. Après refroidissement et solidification du milieu, les cultures sont

incubées à 35°C pendant 21 jours. Plus les souches poussent en haut du tubes, plus elles ont

besoin d’oxygène. Plus les bactéries poussent en bas du tubes, moins elles ont besoin

d’oxygène.

iv. Détermination de la mobilité

Elle est réalisée sur le milieu semi solide de mannitol-mobilité (Guiraud, 1998),

l’ensemencement est réalisé par piqûre centrale. Après incubation pendant 7 jours à 30°C, la

mobilité se traduit par l’envahissement du milieu à partir de la piqûre d’inoculation.

Résultats

31

RESULTATS

III.1. Isolements des souches d’Actinomycètes

Trente six (36) souches d’Actinomycètes sont isolées à partir de 6 échantillons de sol

prélevés dans les trois points différents du site d’étude de la forêt du Massif Ibity. Les 36

souches sont reparties comme suit:

• 15 souches d’Actinomycètes sont obtenues sur les échantillons de la forêt sous

Tapia,

• 12 souches à partir des échantillons de la savane,

• 9 souches isolées des échantillons de la forêt galerie.

Le tableau 8 et la figure 7 montrent le nombre de souches isolées à partir des 3 méthodes

d’isolement dans les 6 échantillons de sol différents.

Tableau 8: Nombre de souches d’Actinomycètes isolées selon la technique d’isolement et le

point de prélèvement

Traitement

Site

Séléction par

antibiotique

Traitement à haute

température Sol aerosolisé

Forêt tapia 9 4 2

Savane 7 3 2

Forêt galerie 5 3 1

Figure 7: Histogramme montrant le nombre de souches d’Actinomycètes isolées par chaque

point de prélèvement et méthodes d’isolement

9

7

5

4

3 3

2 2

1

0

2

4

6

8

10

forêt tapia savane forê galerie

No

mb

re d

e s

ou

che

s

d'A

ctin

om

ycè

tes

iso

lée

s

sélection par antibiotiques

Traitement à haute température

Sol aerosolisé

Résultats

32

III.2. Biodégradation des composés organiques complexes naturels

III.2.1. Biodégradation de la cellulose (activité cellulolytique)

Parmi les trente six (36) souches d’Actinomycètes isolées, douze (S3, S6, S8, S14,

S16, S18, S21, S22, S26, S29, S31 et S33) présentent une bonne croissance sur le milieu ISP9

contenant de la cellulose cristalline (Sigmacell, type 101) comme seule source de carbone et

d’énergie, tandis que les autres présentent une croissance presque nulle ou absente. Les

résultats des activités cellulolytiques des souches d’Actinomycètes sont présentés dans le

tableau 9.

Tableau 9: Croissance des souches d’Actinomycètes sur le milieu de base ISP9 contenant la

cellulose cristalline (Sigmacell, type 101) comme unique source de carbone et d’énergie.

Souches Croissance sur le milieu

ISP9+cellulose cristalline * Souches Croissance sur le milieu

ISP9+ cellulose cristalline * S1 - S19 -

S2 - S20 -

S3 + S21 +

S4 - S22 +

S5 ± S23 -

S6 + S24 -

S7 - S25 -

S8 + S26 +

S9 ± S27 ±

S10 - S28 -

S11 - S29 +

S12 - S30 -

S13 - S31 +

S14 + S32 ±

S15 - S33 +

S16 + S34 ±

S17 ± S35 -

S18 + S36 -

(–) : Pas de croissance, (±) : Croissance très faible, (+) : Bonne Croissance

* : Croissance appréciée par rapport au témoin positif (ISP9 contenant le glucose comme

seule source de carbone et d’énergie) et le témoin négatif (ISP9 sans source de carbone et

d’énergie).

Résultats

33

III.2.2. Biodégradation de la pectine (activité pectinolytique)

Parmi les 36 souches d’Actinomycètes isolées, 16 sont actives (S2, S3, S6, S7, S8,

S13, S14, S16, S18, S19, S21, S22, S26, S29, S33 et S35). Cette activité est mise en évidence

par la présence d’une zone claire autour des souches. Par contre, pour les 20 autres souches,

aucune zone claire n’est observée. Les résultats de l’activité pectinolytique des souches

d’Actinomycètes sont présentés dans le tableau 10.

Parmi les seize (16) souches actives, trois (S2, S14, S21) présentent des zones claires les plus

importantes ayant 20 millimètres de diamètre (figure 8).

Tableau 10: Diamètres des zones claires résultant de la dégradation de la pectine par les

souches d’Actinomycètes

Souches Diamètres des zones

claires (mm) Souches Diamètres des zones

claires (mm)

S1 0 S19 18

S2 20 S20 0

S3 14 S21 20

S4 0 S22 15

S5 0 S23 0

S6 8 S24 0

S7 16 S25 0

S8 15 S26 12

S9 0 S27 0

S10 0 S28 0

S11 0 S29 10

S12 0 S30 0

S13 15 S31 0

S14 20 S32 0

S15 0 S33 12

S16 18 S34 0

S17 0 S35 18

S18 12 S36 0

Résultats

34

Figure 8: Diamètres des zones claires résultant l’activité pectinolytique

III.3. Biodégradation de composés organiques de synthèse (le 2,5-xylénol et le 2,6-

xylénol)

Parmi les trente six (36) souches d’Actinomycètes, cinq (S13, S16, S23, S31 et S35)

présentent un bon développement sur le milieu minimum contenant le 2,5-xylénol comme

seule source de carbone et d’énergie, tandis que les autres présentent un développement faible

ou absent. Parmi ces cinq souches actives, deux (S23 et S31) tolèrent le 2,5-xylénol jusqu’à

une concentration de 3000 mg/l, deux souches (S13 et S35) tolèrent une concentration de

2000 mg/l et une souche seulement (S16) tolère une concentration de 1000 mg/l.

Concernant le 2,6-xylénol, neuf souches (S3, S8, S13, S14, S16, S19, S21, S23 et S31)

présentent une bonne croissance sur le milieu minimum contenant de 2,6-xylénol comme

unique source de carbone et d’énergie. Parmi celles-ci, quatre (S8, S13, S19 et S31) tolèrent

ce substrat jusqu’à une concentration de 3000 mg/l, deux (S14 et S21) à une concentration de

2000 mg/l et trois (3) autres (S3, S16 et S23) à une concentration de 1000 mg/l.

Les résultats de l’utilisation du 2,5-xylénol et du 2,6-xylénol et de la tolérance vis-à-

vis de ces mêmes composés organiques par les souches d’Actinomycètes sont présentés dans

les tableaux 11 et 12.

0

5

10

15

20

25

S2 S3 S6 S7 S8 S13 S14 S16 S18 S19 S21 S22 S26 S29 S33 S35

diam

ètre

s de

s zo

nes

clai

res

(mm

)

souches pectinolytiques

Résultats

35

Tableau 11: Croissance des souches d’Actinomycètes sur milieu minimum contenant le

2,5-xylénol et le 2,6-xylénol comme seule source de carbone et d’énergie

Souches

Croissance sur le milieu minimum

plus* Souches

Croissance sur le milieu minimum

plus*

2,5-xylénol

2,6-xylénol

2,5-xylénol

2,6-xylénol

S1 - - S19 - +

S2 - - S20 - -

S3 ± + S21 - +

S4 - - S22 - -

S5 - - S23 + +

S6 - - S24 ± -

S7 - - S25 - -

S8 - + S26 - -

S9 - - S27 - -

S10 - ± S28 - ±

S11 - - S29 - -

S12 - - S30 ± ±

S13 + + S31 + +

S14 - + S32 - -

S15 - - S33 - -

S16 + + S34 - -

S17 - - S35 + -

S18 ± - S36 - -

(–) : Pas de croissance, (±) : Croissance très faible, (+) : Bonne croissance.

*: Croissance appréciée par rapport au témoin positif (milieu minimum + glucose comme

seule source de carbone et d’énergie) et le témoin négatif (milieu minimum sans source de

carbone et d’énergie)

Résultats

36

Tableau 12: Tolérance des souches actives aux 2,5-xylénol et 2,6-xylénol.

Tolérance au 2,5-xylénol (mg/l) Tolérance au 2,6-xylénol (mg/l)

500 1000 2000 3000 500 1000 2000 3000

S3 / / / / + + - -

S8 / / / / + + + +

S13 + + + - + + + +

S14 / / / / + + + -

S16 + + - - + + - -

S19 / / / / + + + +

S21 / / / / + + + -

S23 + + + + + + - -

S31 + + + + + + + +

S35 + + + - / / / /

(+): souche tolérante (pas de zone d’inhibition), (–): Souche intolérante (présence de zone

d’inhibition), (/): souche non active sur le substrat.

Figure 9: Tolérance de la souche S31 au 2,5-xylénol et au 2,6-xylénol jusqu’à une

concentration de 3000 mg/l (technique des disques).

2,6-xylénol 2,5-xylénol

2000

500

1000

3000

500

1000

2000

3000

Résultats

37

Le tableau 13 ci-dessous résume les activités des souches d’Actinomycètes sur les composés

organiques étudiés.

Tableau13: Résultats récapitulatifs des souches actives sur les composés organiques étudiés

III.4. Pré-identification des souches d’Actinomycètes actives

III.4.1. Aspect macroscopique

Pour toutes les souches, les colonies commencent à apparaitre au bout de deux jours

d’incubation. Les premières colonies apparentes ont toutes un aspect pâteux. Ce n’est qu’à

partir de 14ème jour que certaines souches donnent des colonies poudreuses (par exemples les

souches S3, S14, S21) alors que d’autres restent toujours pâteuses (par exemples les souches

S29, S33, S35). Les souches atteignent le stade de maturation au 21ème jour.

Souches

Composés

organiques

S2 S3 S6 S7 S8 S13 S14 S16 S18 S19 S21 S22 S23 S26 S29 S31 S33 S35

cellulose - + - - + - + + + - + + - + + + + -

pectine + + + + + + + + + + + + - + + - + +

2,5-xylénol - - - - - + - + - - - - + - - + - +

2,6-xylénol - + - - + + + + - + + - + - - + - -

Résultats

38

Tableau 14: Aspect macroscopique des souches d’Actinomycètes actives

ISP2 ISP4 ISP5

Souches Couleur

du MA

Couleur

du MV

Aspect de

la colonie

Couleur

du MA

Couleur

du MV

Aspect de

la colonie

Couleur

du MA

Couleur

du MV

Aspect de

la colonie

S2 Gris Beige Poudreux Gris Beige Poudreux Gris Beige Poudreux

S3 Blanc Blanc Poudreux Blanc Blanc Poudreux Blanc Blanc Poudreux


S7 Gris Blanc Poudreux Gris Blanc Poudreux Gris Blanc Poudreux

S8 Gris Gris Poudreux Gris Gris Poudreux Gris Gris Poudreux

S13 Blanc Blanc Blanc Blanc Blanc Blanc

S14 Blanc Blanc Poudreux Blanc Blanc Poudreux Blanc Blanc Poudreux


S18 Gris Marron Poudreux Gris Marron Poudreux Gris Marron Poudreux


S21 Rose Blanc Poudreux Rose Blanc Poudreux Rose Blanc Poudreux



S26 Gris Marron Poudreux Gris Marron Poudreux Gris Marron Poudreux

S29 Blanc Beige Pâteux Blanc Beige Pâteux Blanc Beige Pâteux

S31 Gris Beige Gris Beige Gris Beige Pâteux

S33 Jaune Jaune Pâteux Jaune Jaune Pâteux Jaune Jaune Pâteux

S35 Beige Beige Pâteux Beige Beige Pâteux Beige Beige Pâteux

MA: mycélium aérien MV: mycélium végétatif

III.4.2. Détermination des pigments mélanoïdes et diffusibles

Deux souches seulement (S18 et S19) produisent des pigments mélanoïdes (figure 10)

et trois autres souches (S14, S23 et S26) produisent des pigments diffusibles. Le tableau ci-

dessous résume les résultats obtenus.

Résultats

39

Tableau 15: Détermination de pigments mélanoïdes et diffusibles chez les souches

d’Actinomycètes

Souches S14 S18 S19 S23 S26

Pigments

mélanoïdes

- + + - -

Pigments

diffusibles

Jaune - - Jaune Marron

+ : présence de pigments mélanoïdes - : absence de pigments mélanoïdes

A: témoin négatif

Figure 10: Production de pigment mélanoïdes

III.4.3. Aspect microscopique

Toutes les souches développent un mycélium aérien formé d’hyphes dressés sur le

mycélium du substrat. Ces hyphes portent des chaînes de spores de forme spirale (S3, S18,

S26, S33) ou recti-flexible (S6, S19, S23, 35). Certaines souches présentent des spores de

forme arrondie (S7, S14, S16, S21) et d’autres cylindriques (S2, S13, S22, S29).

Les résultats de l’étude microscopique des souches d’Actinomycètes actives sont

rassemblés dans le tableau 16.

B: production de pigment mélanoïde par la

souche S19

Résultats

40

Tableau 16: Aspect microscopique des souches d’Actinomycètes actives

Souches Forme de chaînes de spore Forme de la spore

Droite RF spirale Cylindrique Arrondie

S2-S6-S22-S23-S29-S31 - + - + -

S7-S8-S14-S19-S35 - + - - +

S3-S16-S18-S21 - - + - +

S13-S26-S33 - - + + -

RF: recti-flexible

III.4.4. Coloration et caractéristiques biochimiques

III.4.4.1. Coloration de Ziehl-Nielsen

Après coloration de Ziehl-Nielsen, toutes les souches apparaissent sous forme de

filaments bleus, elles sont donc toutes non acido-alcoolo-résistantes. Ces résultats permettent

alors de supposer qu’aucune des souches n’appartienne au genre Mycobacterium.

III.4.4.2. Caractéristiques biochimiques

En ce qui concerne la détection de β-galactosidase, pour toutes les souches, une

coloration jaune est notée. L’enzyme est donc présente chez toutes les souches.

Pour la nitrate réductase, le réactif de Griess prend une teinte rouge et cela pour toutes

les souches. Ces dernières possèdent donc toutes une nitrate réductase.

En contact d’eau oxygénée, pour toutes les souches, un dégagement de dioxygène se

manifeste par une effervescence, ceci est le signe de la présence de catalase.

III.4.5. Caractères physiologiques

Les résultats obtenus montrent que toutes les souches sont aérobies, immobiles et

présentent un optimum de croissance à des températures comprises entre 26 à 30°C et à des

pH allant de 6,5 à 8.

Les caractères physiologiques des souches d’Actinomycètes actives sont résumés dans le

tableau 17.

Résultats

41

Tableau 17: Caractères physiologiques des souches d’Actinomycètes actives

Souches Température pH Type

respiratoire Mobilité

S16-S33 26 7,5

Aérobie

Immobile

S7-S8-S19-S31 28 7

S6-S23-S26 28 7,5

S14-S22 28 8

S29-S35 30 6,5

S2-S13 30 7

S3-S18-S21 30 7,5

Discussion

42

DISCUSSION

L’objectif de cette étude est (i) d’isoler les souches d’Actinomycètes à partir du sol

forestier du Massif Ibity, et de mettre en évidence leur capacité à dégrader les composés

organiques complexes, naturels (cellulose, substances pectiques) ou xénobiotiques (2,5-

xylénol, 2,6-xylénol), puis (ii) de pré-identifier les souches d’Actinomycètes ayant les

capacités de biodégradation au moins sur l’un des substrats étudiés.

A partir de 6 échantillons de sol rhizosphérique répartis dans 3 points différents du site

d’étude, 36 variétés de souches d’Actinomycètes ont été isolées, elles sont repérées d’après

leur aspect macroscopique (colonies dures incrustées dans la gélose). Le prétraitement du sol

c'est-à-dire le séchage des échantillons de sol permet déjà de sélectionner les Actinomycètes

car ces derniers sont plus résistants à la dessication par rapport aux autres microorganismes

présents dans le sol.

Un excès de substrat favorise les champignons et les bactéries à croissance rapide et empêche

de ce fait un isolement facile des Actinomycètes qui ont un temps de génération relativement

long (Williams et. Wellington 1982; Crawford et al., 1993).

Les meilleurs milieux de culture pour l’isolement des Actinomycètes sont ceux contenant de

l’amidon, du glycérol ou de la chitine comme source de carbone, la caséine, l’asparagine ou

l’arginine comme source d’azote organique (Burman, 1973; Williams et al., 1993; Hilali et

al., 2002).

Pour cela, le milieu AS1 est choisi car il contient des substrats sélectifs pour la croissance des

Actinomycètes (l’amidon, l’arginine et l’asparagine). Ce milieu est surtout utilisé pour

l’isolement des souches d’Actinomycètes telluriques. Il est utilisé par le Laboratoire de Daw

Agro Sciences (DAS) aux Etats Unis pour l’isolement des souches d’Actinomycètes à partir

du sol (Don Hann, 2007).

Plusieurs techniques sont utilisées pour l’isolement sélectif des Actinomycètes. Elles reposent

essentiellement sur le traitement à la chaleur des échantillons et l’addition aux milieux

d’isolement des antibiotiques inhibant la croissance des germes indésirables (Larpent et

Sanglier, 1989; Ouhdouch et al., 2001; Hilali et al., 2002; Jung, 2002). En revanche Dulaney

et al. (1955); Williams et Davies (1965) recommandent l’utilisation d’un mélange

d’antifongiques et d’antibactériens pour l’isolement des Actinomycètes. Dans cette étude,

trois antibiotiques sont utilisés: l’acide nalidixique qui inhibe les bactéries Gram négatif

(Takizawa et al. 1993), le cycloheximide qui est un antifongique le plus utilisé comme additif

Discussion

43

dans le milieu d’isolement d’Actinomycètes (Wang et al., 1999) et la triméthoprime qui est un

inhibiteur des bactéries à croissance rapide (Labeda et Shearer, 1990).

L’addition d’antibiotiques dans le milieu d’isolement n’a pas inhibé la croissance de quelques

petites colonies de champignons et des bactéries à Gram positif qui ne peuvent pas être éliminées

et envahissent la gélose, gênant ainsi la croissance des Actinomycètes.

La mise en évidence de biodégradation de la cellulose par les souches isolées repose

sur l’utilisation de ce dernier comme unique source de carbone et d’énergie dans le milieu

ISP9. Les souches incapables d’utiliser ce substrat présentent une croissance faible ou nulle

qui est un indice d’absence d’enzymes cellulolytiques. Dans le cas contraire, les souches

présentant une bonne croissance sont capables de dégrader la cellulose et produisent ainsi des

enzymes cellulolytiques (Cellulases).

Cette méthode est utilisée par Lekchiri et al. (2006) comme test préliminaire pour la mise en

évidence de l’activité cellulolytique des champignons filamenteux. Selon ces auteurs, les

souches présentant une bonne croissance sur le milieu cellulose-Agar sont les meilleures

souches productrices d’enzymes cellulolityques.

La méthode utilisée pour la mise en évidence de l’activité pectinolytique est une

technique semi-quantitative qui permet d’estimer l’activité pectinolytique des souches en

comparant les diamètres des zones claires autour des colonies actives. Le principe de cette

méthode est la précipitation de la pectine non hydrolysée sous l’action de CTAB dans le

milieu gélosé. La pectine hydrolysée par les enzymes secrétées (pectinases) ne précipite pas,

et conduit à l’apparition des zones claires autour des colonies actives (Biely et Slavikova,

1994).

Les diamètres des zones claires autour des colonies actives sont différents d’une souche à une

autre selon sa capacité d’hydrolyser la pectine. Ainsi, plus la capacité pectinolytique de la

souche est importante, plus le diamètre de la zone claire augmente, ce qui est le cas des

souches S2, S14 et S21 qui sont les souches les plus performantes.

Cette méthode est utilisée par Biely et Slavikova (1994) pour la recherche de levures

pectinolytiques. Elle est utilisée également par Aysha et al. (2006) pour la mise en évidence

de la biodégradation de la pectine par les bactéries endophytiques et par Brizzio et al. (2007)

pour la mise en évidence de l’activité pectinolytique des levures isolées à partir des eaux

glaciales.

Discussion

44

La mise en évidence des souches d’Actinomycètes capables de dégrader le 2,5-xylénol

et le 2,6-xylénol est appréciée par leur capacité de se développer sur un milieu minimum

contenant l’un de ces substrats toxiques comme unique source de carbone et d’énergie.

Ainsi, les souches capables d’utiliser le 2,5-xylénol (S13, S16, S23, S31 et S35) et le 2,6-

xylénol (S3, S8, S13, S14, S16, S19, S21, S23 et S31) comme unique source de carbone et

d’énergie présentent un bon développement sur le substrat correspondant, et celui-ci est un

indice de la présence d’enzymes spécifiques pour attaquer ces substrats chez ces souches.

Cette méthode est utilisée par Westerberg et al. (2000) pour la mise en évidence de la capacité

d’une souche d’Actinomycète isolée du sol d’utiliser le 4-chlorophénol, par Evgenia et

Victoria (2004) pour tester la capacité de souches d’Actinomycètes isolées des sols

d’Antarctique de croître sur milieu minéral contenant le benzène, le toluène ou le naphtalène

comme unique source de carbone et d’énergie, par Jens et al. (1989) pour l’isolement à partir

de sol contaminé par le benzène de souches d’Actinomycètes dégradant le 2,6-xylénol et par

Jung et al. (2000) pour l’isolement à partir de sol des Actinomycètes dégradant le 2,4-

dinitrophénol.

Les souches présentant un développement très faible ou nul sur ces substrats ne sont pas

forcément dépourvues d’enzymes spécifiques pour attaquer ces composés. Il est très possible

que le composé en question ne puisse être dégradé que par un consortium microbien. En effet

El Aalam et Lebeault (1993) isolent quatre souches de bactéries capables de dégrader le

styrène lorsqu’elles sont regroupées mais, individuellement, seulement deux souches croissent

avec le styrène en tant qu’unique source de carbone. Les deux autres souches sont impliquées

dans la dégradation de sous-produit de styrène. Ainsi, un organisme dégrade le composé

initial en sous-produits servant alors à l’autre organisme comme source de carbone et ainsi de

suite jusqu’à la minéralisation complète du polluant.

La tolérance des souches actives aux deux substrats toxiques est démontrée par la technique

des disques. Les disques diffusent alors les xylénols qui inhibent ou non la croissance des

souches. Ainsi, les souches sensibles au substrat étudié sont entourées d’une zone d’inhibition

mais dans le cas d’absence de cette zone, les souches sont considérées comme tolérantes.

Pour caractériser les genres d’Actinomycètes, trois caractéristiques sont largement

utilisées: caractéristiques morphologiques, caractéristiques microscopique et macroscopique.

Selon Shirling et Gottlieb (1976), l’identification des Actinomycètes est basée sur les

caractéristiques morphologiques qui sont considérées comme des caractères stables. Les

Discussion

45

critères de détermination utilisés dans cette étude sont ceux de la classification «Taxonomy

Outline of The Procaryotes, Bergey’s Manual of Systematic Bacteriologie, 2004». D’autres

critères sont pris à partir de «Bergey’s Manual of Systematic Bacteriologie, 1994».

Pour toutes les souches, il existe un développement des colonies au bout de 48 heures. Il

s’agit là d’une caractéristique des Actinomycètes à croissance rapide. En effet, selon

Nodwel et Losick (1998) la colonie de Streptomyces coelicolor développe des hyphes aériens

en 24 heures. Ces souches à croissance rapide peuvent donc être rapprochées du genre

Streptomyces.

La croissance des souches d’Actinomycètes sur les différents milieux débute par l’apparition

des colonies pâteuses, correspondant à un mycélium de substrat. Certaines souches, par

exemple les souches (S29, S33 et S35), gardent cet aspect pâteux tandis que les autres (S2,

S16, S18, S23, S29 et S33) développent un aspect poudreux correspondant au mycélium

aérien.

Parmi les dix huit (18) souches actives, trois produisent de pigments diffusibles et d’après

Margalith (1992), ces pigments peuvent être des substances bioactives.

Seules les souches S18 et S19 secrètent un pigment brun noir qui est la mélanine. Shirling et

Gottlieb (1972) considèrent la production des pigments mélanoïdes comme une

caractéristique très importante pour la classification des Streptomyces. La biosynthèse de la

mélanine se fait par la voie de Raper-Mason avec la tyrosine comme substrat. La tyrosinase

catalyse la réaction d'oxydation de la tyrosine en DOPA (dihydroxyphénilalanine) et en

dopaquinone. Après une série de réaction d'auto-oxydation, le produit final est l'acide 5,6

dihydroxyindol coloré en jaune qui se condense pour donner la mélanine caractérisée par la

couleur brun-noir.

En ce qui concerne les caractéristiques physiologiques et biochimiques, les souches

d’Actinomycètes actives présentent un optimum de croissance entre 26 à 30°C, avec un pH

optimal allant de 6,5 à 8. Elles sont toutes aérobies, immobiles, non acido-alcoolo-résistantes,

catalase positif, et possèdent une nitrate réductase. Selon Michel et Thierry (1994); Shiroza et

al., (1982); Suutari et al., (2001) ces caractères sont exclusifs des Streptomycètes.

Conclusion générale et perspectives

46

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

Le travail portant sur « l’étude des caractéristiques culturales des Actinomycètes

impliqués dans la biodégradation de la cellulose, des substances pectiques et des composés

organiques de synthèse », nous a permis de:

• Maîtriser les techniques usuelles en microbiologie ;

• Apporter des informations sur la distribution et l’abondance des souches

d’Actinomycètes dans les sols de forêt du Massif Ibity ;

• Disposer d’une collection de souches d’Actinomycètes telluriques utilisable dans les

recherches à venir ;

• Mettre en évidence l’activité enzymatique des Actinomycètes telluriques sur les

composés organiques complexes naturels et composés organiques de synthèse de la

forêt du Massif Ibity ;

• Mettre en évidence les caractéristiques culturales et biochimiques des souches

d’Actinomycètes actives.

Cependant, cette étude est loin d’être finie et dans l’avenir, nous envisagerons

d’entreprendre les travaux de recherches sur:

• La caractérisation moléculaire des souches d’Actinomycètes actives par PCR des

gènes 16S ribosomal.

• L’extraction des enzymes issues des souches d’Actinomycètes actives.

• L’étude des propriétés physico-chimiques et la cinétique de ces enzymes.

• L’utilisation de ces enzymes dans les domaines de biotechnologie (industrie

alimentaire, textile, dépollution biologique,...).

• L’isolement d’autres microorganismes (bactéries et champignons) ayant la capacité de

dégrader les composés organiques étudiés.

• L’étude de la capacité de ces souches actives à dégrader d’autres composés organiques

comme la dextrine, la chitine,…

Références bibliographiques

47

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(Zerizer Habiba) Mémoire de Magister.

• Zaitlin B., Watson S.B., Ridal J., Satchwill T. and Parkinson D. (2003).

Actinomycetes in lake Ontario: Habitats and geosmin and MIB production. Res. J.

Can. 95 (2), 113-118.

• Zykwinska A.W., Ralet M.C.J., Garnier C.D. and Thibault J.F.J. (2005).

Evidence for In Vitro Binding of Pectin Side Chains to Cellulose. Plant Physiology.

Annexes

Annexe1

Compositions des milieux de culture

AS1 (milieu d’isolement des Actinomycètes)

Extrait de levure 1g

Arginine 0,2g

Alanine 0,2g

Asparagine monohydrate 0,5g

Amidon soluble 5g

NaCl 2,5g

Sulfate de sodium anhydre 10g

Eau distillée 1000ml

Agar 20g

pH = 7,0

Les antibiotiques

Pour 500ml de milieu AS1, on ajoute:

- 5ml de Cycloheximide (0,05g dilué dans 5ml d’ED)

- 5ml de Triméthoprime (0,02g dilué dans 5ml de DMSO)

- 5ml d’acide nalidixique (0,05g dilué dans 5ml d’ED)

ISP2 (pré-identification de souches/Aspect macroscopique)

Extrait de levure 4 g

Extrait de malt 10 g

Glucose 4 g

Eau distillée 1000 ml

Agar 20 g

pH = 7,3

Annexes

ISP3 (milieu de préparation des inoculums pour les tests de biodégradation et de

préidentification)

Solution d’avoine 1000ml (Annexe2)

Solution d’oligo-éléments 1ml (Annexe2)

Agar 20g

pH = 7,2

ISP4 (Pré-identification des souches/Aspect macroscopique)

Amidon soluble 10 g

K2HPO4 1 g

MgSO4 7H2O 1 g

Na Cl 1 g

(NH4)2SO4 2 g

CaCO3 2 g

Solution d’oligo-éléments 1 ml (Annexe2)


Agar 20 g

pH = 7,0-7,4

ISP5 (Pré-identification des souches/Aspect macroscopique)

Glycérol 10 g

L-Asparagine 1 g



Agar 20 g

pH = 7,0-7,4

Annexes

ISP6 (Détermination des pigments mélanoides et des pigments diffusibles)

Peptone 15 g

Proteose-Peptone 5 g

Citrate de fer ammoniacal 0,5 g

Thiosulfate de sodium 0,08 g


K2HPO4 1 g


Agar 20 g

pH = 7,0-7,2

ISP7 (Détermination des pigments mélanoïdes et des pigments diffusibles)

Glycérol 15 g

L-Tyrosine 0,5 g

L-Asparagine 1 g

K2HPO4 0,5 g

MgSO4 7H2O 0,8 g

Na Cl 0,5 g

FeSO4 7H2O 0,01 g



Agar 20 g

pH = 7,2-7,4

ISP9 (mise en évidence de la biodégradation de la cellulose)

(NH4)2SO4 2,64 g

KH2PO4 2,38 g

K2HPO4 3H2O 5,65 g

MgSO4 2H2O 1 g

Solution saline 1 ml (Annexe2)


Agar 20 g

pH = 6,8-7,0

Annexes

Pectine Agar (mise en évidence de la biodégradation de pectine)

Pectine 5 g



Agar 20 g

pH = 7,0

Milieu minimum (mise en évidence de la biodégradation 2,5-xylénol et 2,6-xylénol,

Alexander and Lustigman, 1966)

K2HPO4 2,1 g

KH2PO4 0,4 g

NH4NO3 0,5 g

MgSO4 7H2O 0,2 g

CaCl2 2H2O 0,023 g

FeCl3 6H2O 0,002 g


Agar 20 g

pH = 7,0

N.B : 0,2g/l du 2,5-xylénol ou du 2,6-xylénol est utilisé comme unique source de carbone et

d’énergie.

Amidon-Caséine (tolérance au 2,5 xylénol et 2,6-xylénol)

Amidon soluble 10 g

Caséine 1 g

K2HPO4 0,5 g


Agar 20 g

pH = 7-7,5

Annexes

Mannitol-Mobilité (détermination de la mobilité, Guiraud 1998)

Peptone 20 g

Nitrate de potassium 1 g

Mannitol 2 g

Rouge de phénol 40 mg


Agar 4 g

pH = 8,1

Sporulation Agar (détermination de la température optimale de croissance)


Extrait de viande 1 g

Tryptose 2 g

FeSO4 7H2O Traces

Glucose 10 g


Agar 20 g

pH = 7,2

CYD (détermination du pH optimum de croissance)

Casamino acids 0,5 g

Extrait de levure 0,3 g

D-Glucose 0,4 g

K2HPO4 2 g

Eau distillée 1000ml

Agar 20 g

pH = 7,2

Annexes

Gélose viande foie (Détermination du type respiratoire)

Extrait de viande 10 g

Peptone 20 g


Glucose 5 g


Agar 20 g

pH = 7,6

Bouillon nutritif (Recherche de la Nitrate-Réductase)

Peptone 10 g


NaCl 5 g


Gélose au cervelle et au cœur de veau (recherche de la Bêta –Galactosidase)

Protéose peptone 10 g

Infusion de cervelle de veau 12,5 g

Infusion de coeur de boeuf 5 g

NaCl 5 g

Phosphate disodique 2,5 g

Glucose 2 g


Agar 20 g

pH = 7,4

Annexes

Annexe2

Solutions et colorants

Solution d’oligo-éléments

FeSO4 7H2O 0,1 g

MnCl2 4H2O 0,1 g

ZnSO4 7H2O 0,1 g


Solution saline

CuSO4 5H2O 0,64 g

FeSO4 7H2O 0,11 g

MnCl2 4H2O 0,79 g

ZnSO4 7H2O 0,15 g


Solution d’avoine

Grains d’avoine 20 g


*Faire bouillir pendant 20 minutes, filtrer sur gaze et réajuster le volume à 1000ml.

Carbolfuchsine de ziehl (solution A)

Fuchsine basique 3 g

Alcool éthylique à 95% jusqu’à 100 ml

* Colorant à filtrer avant utilisation

Solution aqueuse de phénol (solution B)

Phénol 5 g

Eau distillée jusqu’à 90 ml

* le phénol est liquéfié dans un flacon par un chauffage léger au bain marie.

Annexes

Fuchsine phéniquée de ziehl

Solution A 10 ml

Solution B 90 ml

Name: RAMASINDRANO

Surnames: Aina Tantely Arisoa

Title: Cultural characteristics of Actinomycetes implied in the biodegradation of

cellulose, pectic substances and synthetic organic compounds.

ABSTRACT

Thirty six varieties of Actinomycetes strains have been isolated from 6 soil

rhizospheric samples of Ibity Massif forest using three isolation methods. Of these 36 strains,

15 were isolated from tapia forest; 12 from the savannah and 9 from the gallery forest.

Pure isolates were tested for their ability to degrade some natural organic compounds

(cellulose and pectic substances) or xenobiotics (2,5-xylenol and 2,6-xylenol). Of all the 36

isolates, 18 strains were active on at least one of tested substrates. One strain metabolizes the

four tested substrates.

Among the active strains, 12 were cellulolytics, 16 were pectinolytics, 5 and 9 strains

use, respectively, 2,5-xylenol and 2,6-xylenol which two tolerate high concentration of 2,5-

xylenol (up to 3000mg/l) and four tolerate high concentration of 2,6-xylenol (up to 3000mg/l).

Morphological, physiological, biochemical and cell strains allow bringing the 18

active strains to the genus Streptomyces.

Key words: Actinomycetes, biodegradation, cellulose, pectic substances, xylenol.

Advisors: Dr RASOLOMAMPIANINA Rado

Dr RAMAMONJISOA Daniel

Nom: RAMASINDRANO

Prénoms: Aina Tantely Arisoa

Titre: Etude des caractéristiques culturales des Actinomycètes impliqués dans la

biodégradation de la cellulose, des substances pectiques et des composés

organiques de synthèse.

RESUME

Trente six variétés de souches d’Actinomycètes ont été isolées à partir de 6

échantillons de sol rhizosphérique de la forêt du Massif Ibity en utilisant trois méthodes

d’isolement. Parmi ces 36 souches, 15 ont été isolées à partir de la forêt tapia; 12 à partir de la

savane et 9 à partir de la forêt galerie.

Les souches isolées et purifiées sont testées pour leur capacité de dégrader certains

composés organiques naturels (la cellulose et les substances pectiques) ou xénobiotiques (le

2,5-xylénol et le 2,6-xylénol). Sur l’ensemble des trente six souches isolées, dix huit souches

sont actives sur au moins l’un des substrats étudié. Une seule souche métabolise les quatre

substrats étudiés.

Parmi les souches actives, douze sont cellulolytiques, seize sont pectinolytiques, cinq

et neuf souches utilisent, respectivement, le 2,5-xylénol et le 2,6-xylénol dont deux tolèrent de

fortes concentrations de 2,5-xylénol (jusqu’à 3000mg/l) et quatre tolèrent de fortes

concentrations de 2,6-xylénol (jusqu’à 3000mg/l).

L’étude des caractéristiques morphologiques, physiologiques, biochimiques et les

colorations cellulaires ont permis de rapprocher ces dix huit souches actives au genre

Streptomyces.

Mots clés: Actinomycètes, biodégradation, cellulose, substances pectiques, xylénol.

Encadreurs: Dr RASOLOMAMPIANINA Rado

Dr RAMAMONJISOA Daniel

etudes des caractéristiques culturales des actinomycètes

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