Identification et taxonomie des streptocoques

Loubinoux Julien

Déclaration conflits d’intérêt

•  Nom prénom : LOUBINOUX Julien •  Fonction : MCU-PH, Service de Bactériologie et CNR

Streptocoques, Hôpital Cochin, Paris

•  Conflits d’intérêt :

- Bio-Rad (2012) : frais déplacement et congrès RICAI + ECCMID

Congrès  SFM  2014   Taxonomie  des  streptocoques  –  Session  DPC  –  31/03/2014  

Importance d’une bonne identification

Espèce bactérienne

Habitat = porte d’entrée

Profil de sensibilité aux antibiotiques = traitement

Caractères généraux des streptocoques

•  Cocci à Gram positif en chaînettes •  Immobiles, asporulés

•  Catalase négative •  Pas de métabolisme respiratoire

•  Anaérobies aéro-tolérants (croissance avec 5% CO2)

•  Culture sur milieux gélosés enrichis (5% sang)

Type d’hémolyse

Classification des streptocoques

•  Streptocoques β-hémolytiques Streptococcus pyogenes (groupe A) Streptococcus agalactiae (groupe B) Streptococcus dysgalactiae (groupes C, G) Streptococcus anginosus/constellatus/intermedius (« S. milleri ») Streptococcus canis/porcinus/equi subsp. zooepidemicus/suis

•  Streptocoques non β-hémolytiques Groupe anginosus : Streptococcus anginosus/constellatus/intermedius Groupe mitis : Streptococcus pneumoniae/pseudopneumoniae/mitis/oralis Groupe sanguinis : Streptococcus sanguinis/parasanguinis/gordonii Groupe mutans : Streptococcus mutans Groupe salivarius : Streptococcus salivarius Groupe bovis : Streptococcus gallolyticus/pasteurianus/lutetiensis/infantarius

Taxonomie des streptocoques 104 espèces en 2014

Streptocoques non β-hémolytiques •  Groupe mitis (S. pneumoniae) •  Groupe bovis

Espèces très proches, les plus difficiles à identifier Echanges génétiques par transformation

Habitat des streptocoques

Peau et muqueuses de l’homme ou de l’animal Nature du prélèvement aide à l’identification

•  Peau S. pyogenes, S. dysgalactiae

•  Gorge/muqueuses respiratoires S. pyogenes, S. dysgalactiae, S. anginosus,

S. mitis, S. pneumoniae, S. sanguinis, S. mutans, S. salivarius

•  Muqueuses génitales femme S. agalactiae

•  Muqueuses digestives/selles S. bovis

« Streptocoques oraux »

« Streptocoques fécaux »

Identification phénotypique des streptocoques

•  Gram, catalase - Aspect et taille colonie et caractères culturaux - Aspect et taille hémolyse - Atmosphère de croissance

•  Groupe de Lancefield (streptocoques β-hémolytiques)

•  Gélose Granada, hippurate, CAMP test (SGB)

•  Bacitracine (SGA), pyrrolidonyl arylamidase (SGA, entérocoques)

•  Bile esculine, milieu hypersalé (NaCl 6,5%) (SGD, entérocoques)

•  Optochine (CO2 ± O2) (Pneumocoque)

•  Profil biochimique (Galeries, automates) •  Profil de résistance aux antibiotiques •  Profil protéique (Spectrométrie de masse MALDI-TOF) +++

Difficultés d’identification (certains streptocoques non β-hémolytiques) Databases incomplètes, peu de caractères biochimiques différentiels, variabilité et mauvaise reproductibilité de certains caractères biochimiques

Sérogroupage des streptocoques

–  Basé sur la c lass i f ica t ion de Lancef ie ld qui repose sur les caractères antigéniques du polyoside C et des acides téchoïques

–  18 Groupes : A à V –  Les s t reptocoques dépourvus

d’antigène de groupe sont dits non groupables

–  Technique d’agglutination sur lame : s é r o g r o u p a g e d e s p r i n c i p a u x antigènes (A, B, C, D, F, G)

plusieurs réactifs commercialisés (bioMérieux, BioRad, Wellcome, Oxoid)

–  Existence de réact ion croisée (pneumocoque et groupe C)

Identification des streptocoques β-hémolytiques

Sérogroupage

PYR +

S. pyogenes

B

Camp test + Hip +

S. agalactiae S. porcinus

C, G colonies taille normale

S. dysgalactiae S. canis S. equi subsp. zooepidemicus

C, G, F colonies punctiformes

Streptocoque du Groupe C ou G

Streptocoque du Groupe anginosus

S. anginosus S. constellatus S. intermedius

A

Test PYR

–  Recherche de pyrrolidonyl arylamidase –  Test rapide sur disque –  SGA et entérocoques : PYR + –  SGB et autres streptocoques : PYR -

Identification des streptocoques β-hémolytiques

« B »,

* *

*

* * *

*

(Zone d’hémolyse très petite)

(Zone d’hémolyse grande)

Identification des streptocoques non β-hémolytiques

B,

Si identification phénotypique mauvaise ou non fiable Spectrométrie de masse MALDI-TOF ou biologie moléculaire (sodA)

β-hémolytique sang cheval / α-hémolytique sang mouton (méningites et septicémies)

« Streptocoques oraux »

* *

* *

S. pseudopneumoniae Décrit en 2004

•  Pas de capsule •  Résistant à l’optochine (< 14 mm) sous 5% CO2

•  Sensible à l’optochine (> 14 mm) sous air ambiant •  Non soluble dans la bile

Le test de solubilité dans la bile est plus spécifique que l’optochine pour l’identification de S. pneumoniae

•  GenProbe AccuProbe S. pneumoniae positif

Identification par spectrométrie de masse MALDI-TOF

Constitution d’une base (profils protéiques) propre au CNR-Strep (n=457)

•  Identification de toutes les souches par tests phénotypiques conventionnels et par biologie moléculaire (séquençage de sodA)

•  113 souches types de collection •  344 souches cliniques

Identification fiable au niveau de l’espèce de la quasi totalité des espèces du genre Streptococcus

Amélioration par rapport à la base existante Bruker : meilleure identification des streptocoques des groupes mitis et bovis

Base du CNR-Strep (n=457)

S. mitis/S. oralis S. pneumoniae S. pseudopneumoniae S. Salivarius groupe Milleri S. mutans…

Evaluation de la base Identification de souches cliniques (n=2987)

S. pneumoniae (n=90)

–  82 souches (91%) identifiées sans ambiguïté en tant que S. pneumoniae •  1er choix: S. pneumoniae •  2ème choix: S. pneumoniae •  Scores > 2

–  8 souches (9%) identifiées en tant que S. pneumoniae •  1er choix: S. pneumoniae •  2ème choix: S. mitis ou S. pseudopneumoniae •  Scores > 2 et Δscore = 0 ou 0,01 •  Analyse des profils = profil spécifique S. pneumoniae

Résultats Streptocoques du groupe mitis

Souches cliniques d’endocardites Identification MALDI-TOF vs séquençage sodA

Species (n) Commercial db1,2 Average score CNR db1,3 Average score

S. gallolyticus (55) 54 (99%) 2,23 55 (100%) 2,52

S. pasteurianus (7) 7 (100%) 2.26 7 (100%) 2,51

S. infantarius (6) 0 (0%) 2,23 6 (100%) 2,53

S. lutetiensis (3) 2 (66%) 2,01 3 (100%) 2,52

Overall (71) 63 (88%) 2,16 71 (100%) 2,52

1 MALDI-TOF MS matching sodA identification

2 Commercial database (Bruker)

3 CNR-Strep database

Résultats Streptocoques du groupe bovis

•  Identification parfaite avec la base de données du CNR contrairement à la base commerciale

•  Tous les scores étaient > 2

•  88 souches cliniques identifiées •  AXIMA Confidence instrument (Shimadzu, Japan) •  100% d’identifications correctes

Résultats Streptocoques du groupe bovis

Identification moléculaire des streptocoques

•  PCR spécifique (espèces les plus pathogènes) S. pyogenes speB (Streptococcal pyrogenic exotoxin B) S. agalactiae - cfb (Camp factor) - Xpert® GBS GeneXpert® (Cepheid)

S. pneumoniae lytA (Autolysine) et ply (Pneumolysine) •  Amplification et séquençage de gènes d’intérêt

ARNr 16S, sodA, rpoB, gdh, ddl ARNr 16S insuffisant pour les espèces très proches > 99% homologie entre S. pneumoniae et S. mitis Intérêt de gènes plus variables d’une espèce à l’autre (sodA)

Le gène sodA, une cible utile pour l’identification moléculaire des cocci et des

bacilles à gram positif

•  Cible monocopie

•  Petit gène (606 nt)

•  Divergence entre les espèces supérieure à celle des

ADNr 16S

•  Avec une paire d’oligonucléotides dégénérés

amplification de 72% du gène (fragment sodAint)

sequençage de l’amplicon

Identification par séquençage de sodA (Superoxyde dismutase Mn dépendante)

Kawamura et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 1995 / Poyart et al., J. Clin. Microbiol. 1998

ADNr 16S sodA

Conclusions Identification des streptocoques

•  Streptocoques β-hémolytiques Peu de problèmes d’identification Attention au sérogroupage isolé

•  Streptocoques non β-hémolytiques

Groupe mitis (sauf S. pneumoniae) Groupe bovis Intérêt des techniques les plus récentes - Spectrométrie de masse MALDI-TOF - Techniques moléculaires (sodA)