4.8 Les marqueurs génétiques moléculaires (ou anonymes)

- La cartographie génétique jusqu'en 1980 : les gènes sont cartographiés en utilisant comme repères (marqueurs) d'autres gènes préalablement cartographiés → efficace pour des espèces comme la drosophile, la levure, certaines plantes, … mais non applicable aux mammifères, et à l’homme en particulier.

48

- D. Botstein et al. (1980) : " n’importe quelle séquence polymorphe d’ADN peut potentiellement servir de marqueur génétique "  (= marqueur moléculaire) → un gène peut donc être cartographié en utilisant comme repères ces marqueurs moléculaires.

-> développement d’un nouveau type de carte génétique, applicable à n'importe quelle espèce, y compris les mammifères et l’être humain !! (appliqué à une époque où les génomes n’étaient pas séquencés)

David Botstein

RFLP : restriction fragment length polymorphism (2 allèles / RFLP)

allèle 1

allèle 2

1,1 2,2 1,2 génotypes

GATTTC CTAAAG amorces PCR

1) PCR 2) Restriction EcoRI 3) électrophorèse

4.8.1 Exemples de marqueurs génétiques moléculaires

= GAATTC = site de coupure par l’enzyme de restriction EcoRI

49

SNP :

?

GAATTC CTTAAG

Test expérimental pour génotyper un individu pour ce RFLP :

SSLP : simple sequence length polymorphism → séquence répétée en tandem → microsatéllite (répétitions en tandem d’une séquence 2 à 4 pb) → minisatéllite (répétitions en tandem d’une séquence de 5 à 25 pb) (n allèles / SSLP qui diffèrent au niveau du nombre de répétitions)

allèle 1

allèle 2

allèle 3 1,3 2,2 génotypes

- PCR - électrophorèse

paire d’amorces PCR spécifiques

50

Un type particulier de SSLP (ex. microsatellite de type CA) se rencontre typiquement en de très nombreux exemplaires au sein des génomes des espèces complexes (ex. vertébrés). Et on peut assez aisément les identifier.

Exemple : SSLP à 3 allèles

51

rem. : les “ tests ADN “  ou empreintes génétiques (police scientifique, tests de paternité, ..) : basés sur l’analyse simultanée d’une dizaine de SSLPs Ex. aux USA > combined DNA index system (CODIS) : analyse de 13 SSLPs, plus un gène AML (-> amélogénine) pour renseigner le sexe. En Europe, système similaire (SGM+, second generation mix +) basé sur l’analyse de 10 SSLPs et du gène AML. La probabilité pour deux individus choisis au hasard d’avoir le même profil génétique est de 10-13.

Pour visualiser les fragments après électrophorèse, on utilise des couples d’amorces marqués par une molécule fluorescente, chaque amplicon est ainsi fluorescent. Pour ne pas confondre certains amplicons de tailles proches, trois fluorochromes différents (3 couleurs) sont utilisés. Une quatrième molécule fluorescente (rouge) est utilisée pour le marqueur de poids moléculaire (non illustré ici).

SGM+ : 10 SSLPs + AML

Electrophérogramme : tailles des bandes PCR (3 couleurs) après séparation sur gel

4.8.2 Comment établir une carte génétique ?

52

souris

rat

poisson zèbre a) Définition de deux lignées consanguines suffisamment polymorphes

Méthode du inbreeding : croisement d’un couple suivi de croisements successifs d’un mâle et d’une femelle de chaque descendance (intercross F1 x F1, F2 x F2, …Fn x Fn). Au bout de n croisements, les individus sont homozygotes pour quasi tous les loci génétiques = la lignée consanguine

X X X

A1 B2 C1 A2 B3 C1

A1 B1 C2 A2 B1 C3

A2 B2 C3 A2 B2 C3

F1 F2 Fn

X X X

A1 B1 C3 A3 B3 C2

A3 B4 C1 A2 B1 C4

A3 B1 C2 A3 B1 C2

F1 F2 Fn

Lignée A

Lignée B

(par ex.)

(par ex.)

ex. carte de SSLPs chez la souris

ADN ADN

A B

SSLP polymorphe (allèles A et B

différents)

SSLP non polymorphe

(allèles A et B identiques)

Dans chaque puit, il n’y a qu'une seule bande car les

souris A et B sont homozygotes

b) Recherche de marqueurs génétiques polymorphes entre les lignées A et B

Ex. marqueurs SSLP:

Certains marqueurs SSLP (dont on ignore la localisation au sein du génome) présentent un polymorphisme entre les lignées A et B , d’autres pas. On recherchera et retiendra un

maximum de marqueurs qui sont polymorphes. 53

PCR et électrophorèse (p. 50) illus-trés ici pour deux SSLP. Un seul des deux SSLP est polymorphe, on le désigne "marqueur n°1", à deux allèles (M1A et M1B). Le génotype de A est M1A et celui de B est M1B M1A M1B

A B

A B

A B

on espère que pour chaque SSLP testé, A et B seront polymorphes (allèles différents)

54

c) Cartographie des marqueurs - Croisement entre deux individus A et B → F1 hétérozygotes pour tous les marqueurs - Test cross (backcross) et génotypage de la descendance F2 :

X

A B

M1A M1A M2A M2A M3A M3A

MxA MxA

. . .

M1B M1B M2B M2B M3B M3B

MxB MxB

. . .

F1

M1A M1B M2A M2B M3A M3B

MxA MxB

. . .

X

A

M1A M1A M2A M2A M3A M3A

MxA MxA

. . .

F2

M1A M1A ou B? M2A M2A ou B? M3A M3A ou B?

MxA MxA ou B?

. . .

génotypage M1

génotypage M2

génotypage M3

génotypage Mx

55

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ... yM1 A B B A B A A A B A B B A B ... AM2 B B A A A B A A B B A B B A ... BM3 A A B B B A B A A B A A B B ... A...

M137 B B A A A B A A A B A B B B ... B...

M398 A A B B B B B A A A A A A B ... A...

allèle transmis par le parent F1 hétérozygote

Analyse :

- pour chaque M, env. 50% des F2 a reçu du parent F1 l’allèle A et 50% l’allèle B (1ère loi) - M1, M2 et M3 ne sont pas liés (ségrégation indépendante, 2de loi) - M2 et M137 sont fortement liés génétiquement (et faible fréq. de recombinants) - M3 et M398 sont également liés, mais la distance qui les sépare est plus grande (plus de recombinants)

Après analyse de tous les marqueurs dans un max. d’individus F2 :

- inventaire de tous les marqueurs liés et estimation des distances génétiques à partir des PR - répartition des marqueurs sur n groupes de liaison (n = nombre de chromosomes) - carte idéale : haute densité et répartition homogène des marqueurs

x marqueurs

y souris F2

2A

2B

A B

137A

137B

3A

3B

A B

398A

398B

F1 :

56

Carte de SSLPs de la souris

- 20 chromosomes - somme des d = ∼ 1630 cM - Taille : ∼ 2.5.109 pb

donc taux de recombi-naison moyen = ∼ 0,65

cM / Mpb chez la souris

57

Carte génétique du poisson zèbre (zebrafish)

- 25 chromosomes - somme des d = ∼ 2700 cM - Taille : ∼ 1.7.109 pb

taux de recombinaison = ∼ 1,60 cM / Mbp

-> permet la cartographie rapide d'un gène d’intérêt

dm

DM

A B

?A

?B

?A

?B

On va rechercher les marqueurs génétiquement liés au locus dm.

Ces marqueurs auront tendance à être

de type A dans les gamètes de F1 portant dm et de type B dans les

gamètes de F1 portant DM

58

Ex. : un mutant homozygote "dm" (dysfonctionnement moteur) a été isolé à partir de la souche consanguine A. Pour cartographier ce gène, on commence par croiser cette souris dm/dm avec la souris de la lignée polymorphe B :

X

A B F1

M1A M1A M2A M2A

MxA MxA

. . .

M1B M1B M2B M2B

MxB MxB

. . .

M1A M1B M2A M2B

MxA MxB

. . .

dm dm

DM DM

dm DM

4.8.3 Utilité d’une carte génétique

59

X X

A B A F1 F2

M1A M1A M2A M2A

MxA MxA

. . .

M1B M1B M2B M2B

MxB MxB

. . .

M1A M1B M2A M2B

MxA MxB

. . .

M1A M1A M2A M2A

MxA MxA

. . .

M1A M1A ou B? M2A M2A ou B?

MxA MxA ou B?

. . .

dm dm

DM DM

dm DM

dm dm

50% [dm] 50% [DM]

dm dm

dm DM M1A M1A ou B? M2A M2A ou B?

MxA MxA ou B?

. . .

Pour examiner les gamètes produits par les souris F1 hétérozygotes, on réalise un test-cross, cad qu’on les croise avec la souris A dm/dm (back-cross) et on trie les souris F2 selon leur phénotype. Ces souris F2 sont ensuite génotypées (M1, M2, ..) pour savoir quelle allèle (A ou B) a été transmis par la souris F1 hétérozygote :

test cross

60

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ... pM1 B A B A A A A B B A B A B B ... AM2 A B A A A B A B B A A B B A ... BM3 A A B B A A B A B B B A B B ... A...

M84 A A A A A A A A A B A A A A ... A...

M227 A A B A A A A A B A A A A A ... A...

allèle transmis par le parent F1 hétérozygote

x marqueurs

p souris F2 [dm] (phénotype dm)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ... qM1 A B B A B A A A B A B B A B ... AM2 B B A A A B A A B B A B B A ... BM3 A A B B B A B A A B A A B B ... A...

M84 B B B A B B B B B B B B B B ... B...

M227 B B B B B A B B B B B B A B ... B...

x marqueurs

q souris F2 [DM] (phénotype DM)

Le gène DM n’est pas lié à M1, M2, M3, ... Il est par contre proche de M84, et aussi de M227 (avec plus de recombinants dans ce cas). Or, on sait où se trouvent M87 et M227 sur la carte (p 56), ils sont dans la région ... du chr... Le gène dm est ainsi cartographié.

dm

DM

A B

227A

227B

84A

84B

Une fois cartographié, un gène peut être plus facilement identifié (cloné), en s'aidant de la "carte physique" du génome :

chr.

carte physique

carte génétique

Etablir la carte physique d’un génome, c’est cloner (par ex. dans une bactérie E. coli) un ensemble de fragments d’ADN recouvrant la longueur complète de chaque chromosome. La position de ces fragments les uns par rapport aux autres et par rapport aux marqueurs de la carte génétique est connue. La cartographie physique est souvent une étape préalable au séquençage d’un génome (cf. chap. I).

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Une fois le gène cartographié, il devient maintenant possible de l’identifier : nature du gène ? séquence du gène ? protéine codée par ce gène ? C’est le but ultime visé. Comment procéder ?

a) Approche suivie avant le séquençage du génome :

chr.

zone cartographiée : le gène DM se trouve dans cet intervalle génétique

Le gène "DM" se trouve donc sur ces fragments d’ADN. Séquençage de ces fragments d’ADN pour identifier les différents gènes présents dans la zone cartographiée (1) Application d’autres techniques pour déterminer lequel des gènes ainsi identifiés dans cette zone correspond à DM. Une fois le gène DM identifié, on peut déduire la séquence d’aa de la protéine -> rôle ? Autre question d’intérêt: cette protéine de souris est-elle conservée chez l’être humain ?

(1) Chez le Zebrafish, 1 cM ≅ 625.000 pb et il y a en moyenne 1 gène (codant une protéine) tous les 100.000 pb

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63

b) Approche suivie après le séquençage et l’annotation du génome :

analyse bioinformatique (par ex. NCBI)

Les gènes dans la zone cartographiée ont été identifiés. Réalisation d’autres expériences pour déterminer lequel de ces gènes correspond à DM.

1 M pb

chr.