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Tests génétiquesdans les

Maladies génétiques constitutionnelles

Génétique L3Cours du 18 novembre 2019

Pr E. Tournier-Lasserve

•  Nature des tests génétiques ?

•  Sensibilité et spécificité d’un test génétique ?

•  Indications d’un test génétique ?

•  Interprétation d’un test génétique ? Pathogénicité d’un variant ?

•  Quel est l’encadrement légal de la prescription d’un test ?

•  Qui peut ou ne peut pas prescrire un test selon les situations ?

•  Quel est le bon test à prescrire ?

•  …

Tests génétiques Questions abordées dans le cours

•  Tests cytogénétiques basés sur l’analyse du nombre et de la forme des chomosomes: analyse du caryotype.

•  Tests moléculaires basés sur l’étude de l’ADN ou de l’ARN, de nature très diverse selon ce que l’on sait ou ne sait pas de l’anomalie moléculaire en cause et de sa nature: –  séquençage d’un gène à partir de l’ADN génomique par Sanger, –  recherche de délétion / duplication par analyse quantitative de l’ADN

génomique (PCR quantitative ou semi-quantitative)–  test génotypique indirect–  analyse du cDNA obtenu par transcription inverse de l’ARN–  séquençage d’un panel ciblé de gènes par séquençage « haut débit »–  séquençage de l’exome entier dans certaines indications

•  Mais aussi des approches moléculaires en cytogénétique: CGH array, FISH

•  Le diagnostic de certaines maladies génétiques peut être basé sur des analyses autres que celles des chromosomes de l’ADN ou de l’ARN

•  Attention! On ne recherche pas une mutation ponctuelle avec un caryotype

Très grande diversité des tests génétiques

Mise en évidence d’une trisomie 21 sur un caryotype

Mise en évidence d’une mutation ponctuelle Par séquençage Sanger de l’ADN génomique

Mise en évidence d’une mutation ponctuelle Par séquençage Sanger de l’ADN génomique

Exemple de mise en évidence d’un variant de séquence isosémantiqueGGA GGT (Gly Gly) / variant non pathogène

Analyse des conséquences d’une mutation d’épissage Séquençage Sanger d’un ADNc obtenu par transcription inverse de l’ARN

•  Patient atteint d’ angiomes caverneux cérébraux multiples

•  Mutation intronique dans le gène CCM1: variant pathogène ou variant de séquence bénin ?

•  Extraction de l’ARN à partir des globules blancs / Transcription inverse / Séquençage du cDNA

•  Conséquence sur le cDNA?

Analyse des conséquences d’une mutation d’épissage Séquençage Sanger d’un ADNc obtenu par transcription inverse de l’ARN

•  Mutation intronique dans le gène CCM1: variant pathogène ou variant bénin ?•  Extraction de l’ARN à partir des globules blancs / Transcription inverse / Séquençage du cDNA•  Mise en évidence d’une anomalie d’épissage avec insertion dans l’ARNm d’un pseudo-exon entrainant un changement du cadre de lecture et un codon stop prématuré, pathogène

De nouvelles approches « haut débit »CGH array et séquençage haut débit (NGS)

Puces ADN haute densité Séquençage haut débit

•  CGH array pan génomique, hybridation comparative pan-génomique pour la recherche d’anomalies de structure: exemple d’application diagnostique quotidienne dans le retard mental syndromique

•  Séquençage de panels de plusieurs dizaines de gènes en même temps (maladies génétiquement hétérogènes) ou d’un exome entier pour certains groupes de maladies très hétérogènes telles que les déficiences intellectuelles ou les maladies neuro-musculaires où plusieurs centaines de gènes ont été impliqués

•  Sensibilité et spécificité des tests: variables selon les connaissances disponibles sur le / les gènes en cause, la nature des mutations et les technologies utilisées pour mettre en évidence ces mutations

•  Savoir distinguer un variant pathogène d’un variant non pathogène

•  Connaître cette sensibilité et cette spécificité est important pour une bonne interprétation des résultats d’un test et de ses limites

•  Pouvoir prédictif d’un test / Le plus souvent élevé dans les maladies monogéniques / très limité dans les maladies multifactorielles

Tests génétiques moléculaires Sensibilité, spécificité, interprétation

Indications et interprétation des tests génétiques

•  Affirmer ou confirmer le diagnostic d’une maladie génétique suspectée chez un sujet symptomatique ou établir son caractère génétique

•  Evaluer le risque de développer la maladie chez un individu asymptomatique, apparenté d’un sujet malade

•  Evaluer le risque de transmission d’une maladie génétique dans la descendance d’un sujet asymptomatique, à risque du fait d’un antécédent familial (par ex: femme conductrice pour une maladie liée à l’X)

•  Proposer aux couples ayant un risque de donner naissance à un enfant atteint d’une maladie d’une particulière gravité un diagnostic prénatal ou préimplantatoire

•  Plus rarement identification de facteurs de risque génétiques prédisposant à une maladie multifactorielle ou de variants génétiques conditionnant la réponse à un traitement (pharmacogénomique)

Indications des tests génétiques

1- Affirmer le diagnostic d’une maladie génétique suspectée chez un sujet symptomatique

Exemple de la maladie CADASIL •  Age moyen de début: 45 ans •  Infarctus cérébraux, démence vasculaire•  IRM évocatrice d’une maladie des petites artères cérébrales•  Autosomique dominant mais notion familiale inconstamment retrouvée•  CADASIL ? Ou bien autre maladie des petites artères ? Forme sporadique ?•  Indication: éviter l’errance diagnostique et les faux diagnostics (par exemple

le diagnostic de sclérose en plaques) et un traitement inadapté

2 3 4 5 6 7 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 22 2423 27268 211 28259 29 30 31 32 33

Motifs EGFR ankyrin

Muté

Normal 6 cysteines

7 cysteines

1, 3 ou 5 cysteines

CADASIL: mutations stéréotypées du gène Notch3

Notch 3proteine

NOTCH3gene

•  Toutes les mutations rencontrées dans cette affection entrainent un nombre impair de cystéines dans l’un des motifs EGF de Notch3: grande sensibilité et spécificité du test

•  Indication: tableau clinique et IRM évocateur d’une maladie des petites artères sans cause retrouvée

•  Séquençage Sanger du gène NOTCH3: test diagnostique de CADASIL très spécifique et très sensible, permettant d’affirmer le diagnostic, d’éviter l’errance diagnostique et une prise en charge inadéquate

•  Ou bien séquençage NGS en une seule fois des différents gènes connus dans les maladies des petites artères

•  Chez un sujet symptomatique, le test peut être prescrit par le neurologue en charge du patient comme par le généticien

CADASIL: expérience acquise dans le cadre du diagnosticRéaliser un test pour éviter l’errance diagnostique

•  Hu … / Homme né en 1957

•  Avril 2008, à 51 ans, vision double

•  Aucun atcd vasculaire personnel

•  Pas de facteur de risque

•  Mère en vie et en bonne santé

•  Père décédé à 45 ans (chute d’un toit)

•  Une soeur 49 ans, en bonne santé

•  IRM: lacunes + atteinte de la substance blanche

•  Cause de cette maladie vasculaire ?

•  Mutation pathogène identifiée dans NOTCH3

CADASIL: expérience acquise dans le cadre du diagnosticRéaliser un test pour éviter l’errance diagnostique

•  Femme née en 1939•  Plusieurs hospitalisations pour dépression sévère entre 28 ans et 40 ans•  A 68 ans, aggravation de la depression, ralentissement idéeomoteur•  Adressée au neurologue•  Aucun atcd personnel d’AVC, pas de facteur de risque•  Mère, 90 ans, détérioration cognitive depuis 2 ans•  Père décédé à 90 ans, atcd psychiatriques (la patiente ne l’a pas connu)•  IRM: lacunes + leucoaraiose•  Mutation identifiée dans le gène NOTCH3

2- Détection d’une anomalie génétique chez des sujets asymptomatiques, à risque du fait de leurs antécédents familiaux, pour évaluer le risque de transmission d’une

maladie génétique à leur descendance

2a- Exemple d’une maladie autosomique récessive, l’amyotrophie spinale infantile

Importance des tests moléculaires pour le conseil génétique

Amyotrophie spinale infantile

•  Dégénérescence des neurones de la corne antérieure de la moelle épinière•  Paralysies flasques avec amyotrophie (atteinte des muscles proximaux)•  Abolition des réflexes ostéotendineux •  Maladie très sévère •  Electromyogramme et vitesses de conduction nerveuse •  Confirmation du diagnostic par le test moléculaire (important car nouveaux traitements disponibles ++) •  Importance du conseil génétique

Amyotrophie spinale infantile Mutations du gène SMN

•  Localisation du gène sur le chromosome 5 en 1990

•  Région contenant une duplication inversée > 500 Kb

•  2 gènes SMN: SMN1 (télomérique) et SMN2 (centromérique)

•  SMN1 et SMN2 : homologie de 99 %

•  Délétion homozygote du gène SMN1: 95% des cas +++++

•  Délétion hétérozygote de SMN1 et mutation ponctuelle sur

l’autre allèle SMN1 dans 5 % des cas

•  Détecter les couples ayant un risque élevé d’avoir un enfant atteint de SMA +++

•  Rassurer les couples n’ayant « pas » de sur-risque (risque < 1/ 1000) +++

•  Situation d’un couple ayant déjà eu un enfant SMA

•  Situation d’un couple dont un des 2 membres a un apparenté atteint de SMA

Amyotrophie spinale infantile Objectifs du conseil génétique

•  Risque théorique à priori d’un couple ayant eu un premier enfant atteint de SMA d’avoir un autre enfant atteint ?

•  Risque a priori d’être hétérozygote pour un sujet sain dont un apparenté est atteint de SMA ?

•  Risque a priori d’avoir un enfant atteint de SMA pour un sujet sain dont un apparenté est atteint de SMA ?

•  Que peuvent apporter les tests ? Chez qui doivent ils être faits ?

Amyotrophie spinale infantile Risque à priori / Apport des tests / Risque a posteriori

Rappel: Transmission d’une maladie autosomique récessive

Risque d’un couple ayant déjà eu un enfant SMA, lors d’une prochaine grossesse

1 / 4

SMA: calcul du risque « a priori » pour un couple d’avoir un enfant atteint en fonction du degré de parenté avec

l’index atteint de SMA

?

SMA: calcul du risque a priori pour un couple d’avoir un enfant atteint en fonction du degré de parenté avec l’index

1 x 1/40 X 1/4

1/160

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2/3 x 1/40 X 1/4

1/240

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1/2 x 1/40 X 1/4

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?1 x 1/40 X 1/2

1/801 x 1/40 X 1/4

1/160

1/2 x 1/40 X 1/4

1/3201/4 x 1/40 X 1/4 1/640

2/3 x 1/40 X 1/4

1/240

•  Préciser le risque

•  Détecter les couples ayant un risque élevé

•  Rassurer les autres couples, en effondrant leur risque après étude de génétique moléculaire

•  Apport très important des tests chez les apparentés (détection des hétérozygotes) pour le calcul du risque et le conseil génétique +++

Apport des tests (1) Calcul du risque « a posteriori »

•  Probabilité d’être hétérozygote pour un sujet sain dont le frère ou la sœur est atteint de SMA: 2 chances sur 3

•  Risque d’avoir un enfant atteint de SMA pour un sujet sain dont le frère ou la sœur est atteint de SMA, hors situation de consanguinité : 1/ 240 (2/3 x 1/40 x 1/4 = 1/240)

•  Tests moléculaires chez l’apparenté et son conjoint

•  Si l’apparenté et le conjoint sont porteurs de la délétion hétérozygote: risque de 1/4 / Proposer diagnostic prénatal à 11 semaines d’aménorrhée

•  Si l’apparenté est hétérozygote pour la délétion et le conjoint est porteur de 2 copies du gène SMN1: risque de 1/ 1600

(1/40x 1/10) x 1/4 = 1/1600). Rassurer +++

Apports des tests pour le conseil génétique (2)

•  Question des apparentés: quel est le risque que nous ayons un enfant atteint ?

•  Que peut on faire pour éviter la naissance d’un enfant atteint de cette maladie très sévère ?

•  Calcul du risque a priori en fonction du lien de parenté avec avec le sujet atteint et de l’incidence de la maladie dans la population

•  Si risque a priori élevé, investigations moléculaires pour préciser ce risque

•  Si les 2 conjoints sont hétérozygotes, le diagnostic anténatal peut être proposé

Tests génétiques et maladie autosomiques recessives Questions des apparentés et conclusions…

Organisation du diagnostic anténatalRègles

•  Maladies d’une particulière gravité•  Centre de diagnostic prénatal agréé par le ministère de la santé•  Consultation multidisciplinaire, généticien, pédiatre, gynéco-obstétricien•  Information des parents, consentement éclairé•  En l'absence de traitement de la maladie chez le foetus, le diagnostic anténatal n'a de sens que si les parents souhaitent une interruption de grossesse en cas de diagnostic positif.•  L'étude de l'ADN du patient index (et des parents) est utile en vue d'un diagnostic anténatal.•  Prélèvement fœtal / analyse de l’ADN•  Rendu du résultat en consultation de conseil génétique

•  Myopathie de Duchenne (exemple vu lors de l’ED)

•  Nouvel exemple: maladie neurovasculaire liée à l’X

2b- Exemple d’une maladie récessive liée à l’X

Détection des mères hétérozygotes qui sont non atteintes mais conductrices et diagnostic anténatal

Détection des hétérozygotes et diagnostic prénatal Exemple d’une maladie neuro-vasculaire récessive liée à l’X

•  Maladie sévère•  Accidents vasculaires cérébraux pouvant débuter dans l’enfance et se répétant tout au long de la vie•  Cardiomyopathie entrainant une insuffisance cardiaque•  Hypogonadisme, petite taille•  Gène situé sur le chromosome X

•  Possibilité de détecter mères hétérozygotes conductrices (cliniquement saines) (femmes 8 et 9 dans la famille F3 par ex ou les éventuelles sœurs du sujet 2 dans la famille F2)

•  Possibilité de diagnostic anténatal pour cette affection sévère

3- Préciser le risque d’un sujet asymptomatique, à risque pour une maladie génétique

2 situations très différentes

•  Maladie avec mesures préventives à mettre en oeuvre (exemples vus lors de l’ED d’ oncogénétique ou de l’ED Maladies dominantes (Ex du cancer du sein ou du colon ou de la maladie de Marfan)

•  Maladie sévère à début tardif sans mesure préventive actuellement: l’exemple de CADASIL ou de la chorée de Huntington

•  Maladie sévère et actuellement sans traitement

•  Diagnostic présymptomatique : PRUDENCE ++++ ETHIQUE

•  Encadrement légal très strict +++

•  Maladie sévère à début tardif et sans traitement actuellement

•  PRUDENCE +++ RESPECT DU DROIT DE NE PAS SAVOIR +++

•  Sujet adulte, à risque, cliniquement indemne, exprimant le souhait de connaître son statut

•  En l’absence de thérapeutique, à ne pratiquer que chez des sujets dont les motivations ont été bien élaborées, dans le cadre d’une consultation multidisciplinaire agréée (neurologue, généticien, psychologue), au cours d’une procédure se déroulant sur plusieurs mois.

•  Aucun bénéfice chez un mineur

•  Faible demande / Certains sujets faisant la démarche en vue d’un test ne vont pas jusqu’à la prise de sang +++ Risque de réaction catastrophique lors de communication du résultat chez porteurs ET non porteurs / Nécessité d’un suivi après résultats

•  Maladie grave à début tardif et sans traitement

•  Maladie débutant à 45-50 ans

•  Le problème d’un futur parent à risque pour l’affection mais ne souhaitant pas connaître son statut

•  Diagnostic prénatal et/ou préimplantatoire possible

•  Quasi aucune demande +++

4a- Un exemple de maladie pouvant toucher tous les âges de la vie et dans laquelle les tests sont importants pour le diagnostic positif et le conseil

génétique

L’exemple des collagénopathies COL4A1

4- Tests génétiques dans plusieurs exemples de maladies mendéliennes

Col4A1: Cas adulte

c.3761G>Ap.G1254E

? ?

? ?

+

37 years

•  Femme de 37 ans

•  Pas de facteur de risque vasculaire

•  A 35 ans hémiplégie gauche de début brutal

•  Pas d’antécédent hormis une hémorragie oculaire post traumatique suivie d’une cataracte de l’oeil droit

•  Aucun apparenté atteint

•  IRM: plusieurs hémorragies cérébrales (macro et micro) et leucoencéphalopathie

•  Test moléculaire ayant permis

•  d’éviter l’errance diagnostique

•  de fournir un conseil génétique

•  d’informer la parentèle du risque génétique

Col4A1: bébé

•  J3 échographie transcranienne: hyperchogénicités cérébrales

•  J8 IRM: plusieurs lésions hémorragiques cérébrales

•  12 mois: -  Crises myocloniques-  Retard developpement-  Cataracte bilatérale-  IRM: dilatation ventriculaire, porencéphalie, hypersignaux de la SB

•  Premier enfant d’un couple non consanguin•  41 semaines / forceps / 2.5 kg / 50cm / Apgar et examen clinique normal à la naissance

•  Col4A1 mutation de novo

•  Importance pour le diagnostic et le conseil génétique

•  Naissance à 33SA•  Retard croissance•  Porencéphalie

•  Naissance à 31SA•  Retard de croissance•  Porencéphalie

•  Mère, 23 ans, asymptomatique•  ATCD chez son père d’ « AVC » 50 ans

Mutation COL4A1

Mère

1er enfant

2è enfant

Importance pour le conseil génétique +++

7S domain Triple helice NC1 domain

•  Variants rares d’interprétation facile du fait de leur nature

•  la majorité des variants sont des variants faux sens, changeant une glycine d’un motif Gly-X-Y de la triple hélice de COL4A1 ou COL4A2

•  une minorité de mutations entrainent l’apparition d’un codon stop n’importe où dans le gène

•  Mais aussi variants rares, variés et non stéréotypés dans le domaine NC1 ou d’autres domaines et pour lesquels d’autres critères sont nécessaires (caractère de novo, fréquence dans bases de données, outils in silico de prediction de pathogénicité ..). Interprétation parfois impossible dans les limites de nos connaissances en 2019

Mutations des régions codantes de COL4A1 ou COL4A2Variants rares souvent de nature stéréotypée mais pas toujours

Tests génétiques COL4A1Diagnostic positif chez un adulte symptomatique

•  Diagnostic positif: important car mesures préventives sujet atteint : éviction

de certaines activités à risque de traumatismes, respect des indications

formelles des anti-coagulants et évaluation bénéfice/risque anti-

thrombotiques / Traitement d’anévrysmes intracrâniens non rompus

•  Conseil génétique: Pour le/la patient (e), le couple, et les apparentés du

couple; possibilité de prénatal

•  Informer la parentèle +++

Tests génétiques Col4A1 Diagnostic positif chez un nouveau né ou un enfant symptomatique

•  Utile pour diagnostic positif: Hémiplégie congénitale, porencéphalie et atteinte de la substance blanche chez enfant / AVC hémorragique du fetus / nouveau-né / enfant / signes associés tels que cataracte congénitale / microphtalmie

•  Attention ! toutes les hémorragies cérébrales du prématuré ou de la période périnatale ne sont pas liées à des mutations de Col4A1 +++

•  Importance pour le conseil génétique (couple et apparentés du parent muté)

4b- Un exemple de maladie pouvant toucher tous les âges de la vie et existant à la fois sous une forme sporadique et sous une forme génétique

Importance des tests pour établir le caractère génétique chez un patient

L’exemple des cavernomes cérébraux

4- Tests génétiques et autres exemples de maladies mendéliennes

Cavernomes cérébraux

•  Malformation des vaisseaux du cerveau

•  Crises d’épilepsie

•  Hémorragies cérébrales

•  Enfant et adulte

Cavernomes cérébrauxCas sporadiques et familiaux

- Une seule lésion - Peu symptomatique

-  Autosomique dominant-  Symptomatique dans 50-70 % cas

80% cas: sporadiques 20% cas: familiaux

•  20 % des cavernomes sont familiaux, autosomiques dominants. Dans ces formes les lésions sont multiples.

•  80 % des cavernomes sont des cas sporadiques. Dans cette forme, les patients n’ont qu’une seule lésion.

•  Existence de cas d’apparence sporadique mais avec lésions multiples

•  Grande variabilité de la maladie au sein d’une même famille ou d’une famille à l’autre (âge début / sévérité). La moitié des sujets porteurs du gène muté sont asymptomatiques toute leur vie. D’autres peuvent être grabataires suite à une hémorragie du tronc cérébral

Cas sporadiques avec lésions multiples Pénétrance incomplète, mutations de novo, autre cause ?

Sain

Hémorragie / épilepsie + cavernomes à l’IRM

Asymptomatique avec lésions IRM

* Porteur de la mutation

*Mutation de novo

*

*

*

Pénétrance incomplète Non génétique ?

Indications et limites des tests moléculairesSensibilité et spécificité de ces tests

Dans les cavernomatoses cérébrales ?

Ch 7

CCM2(15 %)

CCM1(65 %)

CCM3(20 %)

•  3 gènes CCM identifiés

•  Mutations perte de fonction dans l’un des 3 gènes, aboutissant toutes à un codon stop prématuré ou une délétion complète du gène

•  Le criblage des 3 gènes par séquençage et analyse du nombre de copies: test très spécifique et très sensible dans les formes familiales (mutation détectée dans 98 % des cas familiaux), moins sensible dans les formes sporadiques avec lésions multiples (70 %)

•  Intérêt des tests génétiques ?

Indications et limites des tests moléculaires en 20191. Sujets symptomatiques

•  Diagnostic positif dans les cas difficiles seulement (IRM parfois difficile à interpréter)

•  Diagnostic différentiel dans une famille / Ne pas étiquetter cavernome ce qui n’en est pas chez un apparenté d’un sujet porteur de cavernomes

•  Détermination du caractère génétique chez cas sporadiques avec lésions multiples

•  Aucun intérêt des tests dans formes sporadiques avec lésion unique

•  Très bonne spécificité des tests (mutations perte de fonction)

•  Attention ! sensibilité incomplète des tests: dans 30 % des cas sporadiques avec lésions multiples: pas de mutation identifiée dans formes pourtant très

probablement génétiques

Indications et limites des tests moléculaires en 2019 2. Sujets asymptomatiques

•  Mesures préventives simples à conseiller à tous apparentés à risque

•  Pas nécessaire de faire un test moléculaire pour mise en place de ces mesures

•  Attention, on peut être porteur d’une mutation et ne pas développer de troubles cliniques

•  Adultes asymptomatiques à risque: tests possibles mais prudence +++

•  Pas d’indication chez enfants asymptomatiques sauf situation très particulière

•  Exceptionnelles demandes de diagnostic anténatal

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