tp civ 1 tp civ 2 indirecte caulogénèse rhizogénèse...

BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 29.09.11

TP CIV 110-14/10

TP CIV 214-18/11

Bilan TP08/12

Callogénèse Caulogénèse OptimisationOrganogénèseindirecte

Caulogénèse Rhizogénèse OptimisationOrganogénèsedirecte

Callogénèse OptimisationOrganogénèseindirecte

Caulogénèse OptimisationOrganogénèsedirecte

Observations résultatsSemaine du 07/11

N. tabacum, var XanthiPlantes de 6 semaines

N. tabacum, var XanthiPlantes de 12 semaines

Explantsfoliaires

Groupe 1: Stratégie demicropropagation

Optimiser les conditions demicropropagation de N.tabacum, var Xanthien s’aidant de la publication de Ali et al. Tester les conditions optimales de la

publication avec N.tabacum, var Xanthi Variation de la nature et de la

concentration en hormones Variation des éléments minéraux (variation

de type de milieu)

Groupe 1: Conditions effectuéesVariations callogénèse

Milieux MS, MS ½, B5

Hormones Auxine Cytokinine

AIA, NAA, 2,4D BAP

Concentrations hormones Conditions optimales (publication)IAA 2,0 3,0 mMBAP 0,2 0,5 mM

Variations caulogénèse

Milieux MS, MS ½, B5

Hormones Auxine Cytokinine

NAA BAP, kinetin,Thidiazuron?

Concentrations hormones Conditions optimales (publication)


Protocole TP BSNV

Anne-Sophie KirstetterElena Rosa MartinezLeo-Paul TisserantMaxime LestraAntoine VastelYannick Eveno

Groupe IIJulien Delecolle

06/10/2011


• 6 milieux d’Organogénèse indirecte

- NAA 2,0mg/L + BAP 0,2mg/L- NAA 2,0 mg/L + Kinétine 0,2 mg/L- 2,4-D 2,0mg/L + Kinétine 0,2mg/L- 2,4-D 2,0mg/L + BAP 0,2mg/L- IAA 2,0mg/L + Kinétine 0,2mg/L- IAA 2,0mg/L + BAP 0,2mg/L

Milieu: MS, 30g/L sucrose, 8g/L agar


• 8 milieux d’organogénèse directe- BAP 2,0mg/L + NAA 0,2mg/L- BAP 2,0 mg/L + 2,4-D 0,2 mg/L- BAP 2,0mg/L + IAA 0,2mg/L- BAP 2,0mg/L- Kinétine 2,0mg/L + NAA 0,2mg/L- Kinétine 2,0mg/L + 2,4-D 0,2mg/L- Kinétine 2,0mg/L + IAA 0,2mg/L- Kinétine 2,0mg/L

Milieu: MS, 30g/L sucrose, 8g/L agar

Si besoin, plutôt que de tester des milieux comportant uniquementcytokinine, on peut tester milieu B5 & MS ½.

Milieu Type d’auxineType de

cytokinine

Balancehormonale mg/L

(aux/cyt)Stratégie

MS

AIA

BAP

1/0,2

Callogenèse2/0,2

3/0,2

0,2/1

Caulogenèse0,2/2

0,2/3

2,4D

1/0,2

Callogenèse2/0,2

3/0,2

0,2/1

Caulogenèse0,2/2

0,2/3

NAA2/0,2 Callogenèse

0,2/2 Caulogenèse

- - - Témoin

groupe3

TP BSNV :MICROPOPAGATION

Thais Génard Adrien PaoliChristelle Hoefler Vanessa SchmeltzHugues Mandavid Aurore StrugalaJulia Mouton

STRATÉGIE:

Comparer l’effet de différentes hormones sur la callogenèseet la caulogenèse sur N. tabacum variété Xanthi

PLAN D’EXPÉRIENCE

Callogenèse Caulogenèse

1 0,2 mg/L BAP2,0 mg/L NAA




3 0,2 mg/L BAP2,0 mg/L 2,4 D

10 2,0 mg/L BAP0,2 mg/L 2,4 D

4 0,2 mg/L BAP2,0 mg/L IAA

11 2,0 mg/L BAP0,2 mg/L IAA

5 0,2 mg/L K2,0 mg/L 2,4 D

12 2,0 mg/L K0,2 mg/L 2,4 D

6 0,2 mg/L K2,0 mg/L IAA

13 2,0 mg/L K0,2 mg/L IAA

7 0,2 mg/L K2,0 mg/L NAA

14 2,0 mg/L K0,2 mg/L NAA


Groupe 1

Lundi 10/10

8h30-10h30+13h -15h30

Groupe 2

Lundi 10/10

10h30-12h30+ 15h30-18h

Groupe 3

Jeudi 13/10 9h-11h(+ 20min à 13h)+ Vendredi 14/108h-10h

Groupe 4

Vendredi 14/1010h30-12h30+ 14h30-16h30

BAUCHEDavid

KIRSTETTERAnne-Sophie

TEYSSIERLenny

GENARDThaïs

BAYRO-KAISERVinzenz

LESTRAMaxime

AMIRAULTHervé

HOEFLERChristelle

DEBARNOTCéline

TISSERANTLéo-Paul

SARMIENTOAneth

MANDAVIDHugues

ECKERTDoriane

DELECOLLEJulien

BONNEKatia

MOUTONJulia

FAUVELBlandine

EVENOYannick

BREARDDimitri

PAOLIAdrien

GROSSE-HONEBRINKAlexander

VASTELAntoine

CONANCéline

SCHMELTZVanessa

JAEGTiphaine

MARTINEZElena Rosa

DI PASCOLIThomas

STRUGALAAurore

SCHEFFLERSophie


Groupe 3

Jeudi 13/10 9h-11h(+ 20min à 13h)+ Vendredi 14/108h-10h

Groupe 4

Vendredi 14/1010h30-12h30+ 14h30-16h30

TEYSSIERLenny

GENARDThaïs

AMIRAULTHervé

HOEFLERChristelle

SARMIENTOAneth

MANDAVIDHugues

BONNEKatia

MOUTONJulia

BREARDDimitri

PAOLIAdrien

CONANCéline

SCHMELTZVanessa

DI PASCOLIThomas

STRUGALAAurore

Groupe 3 :Préparation milieux :Jeudi 13/10 8h-10h+autoclave => 13h : répartition bdp

+ Lundi 17/10 14-16h : mise en culture

Nouvelle proposition de planning :

Groupe 4 :Préparation milieux :Jeudi 13/10 10h-12h+ Lundi 17/10 autoclave =>13h30 : répartition bdp16-18h : mise en culture


Analyse publismicroprop

Angulo-Berajano &Paredes-Lopez, 2011

Nayak et al., 2010 Rossin & Rey, 2011

Objectifs Ingénierie métaboliqueOpuntia ficus-indica+ micropropagation

Transgénèse Emblicaofficinalis => R/ insectes ouchampignons

Transgénèse Manihotesculenta => R/ froid ,sécheresse ou virus

Stratégie Organogénèse indirecte1: Callo (2x1 mois)2: Caulo (1 mois)3: Rhizo (1 mois)4: Transfert ex vitro/acclimatation

Organogénèse directe1:caulo + 2: multiplication(6 semaines)+ 3: rhizo (3 semaines)+ 4: transfert ex vitro ( 2semaines + 2 mois)

Embryogénèse somatique

Paramètrestestés

BH Age explant (1)BH + nature hormone (2)

CultivarExplant ( feuilles ou bourgeons)Auxine ( 2,4D ou Picloram)

Explant Cladodes régénérées invitro à partir de cladodesstérilisées

Epicotyles de plantulesaxéniques de 1 et 2 semaines

Milieu minéral 1: MS 1+2: MS , 3: MS1/24 : Hoagland

Phytohormones 1: 2,4D 2,26 M/BA2,21 M2: BA 0,5 M3: pas d’hormones

1+2: BA 8,8 M + IAA 1,4 M3: IBA 14,7 M

Picloram 12 mg/l > 2,4D 8mg/lNature explant optimal dépendde cultivar

Autresconstituants

Agar 10g/l, Saccharose50g/lAntioxydantspH 5,7

Saccharose 3%Agar 0,8% - pH5,8


Plante source Molécule(s)Bioactive(s)

Multiplication

Production

Culture in vitro Transgénèse

CIV &Substances naturelles végétales

Micropropagation


Culture in vitro de cellules et tissus végétauxProduction métabolites

- Shikonine / Lithospermum erythrorhizon

- Taxol /Taxus baccata

- Vinblastine / Catharantus roseus

=> Études de cas


Analysepublis

prod MetII

Cai et al., 2011 Cui et al.,2011 Praveen et al., 2011

Objectifs Production de métabolitesIIaires par suspension cellulairede Vitis vinifera

Optimisation culture enbioréacteur (3l) de racinesadventives de Hypericumperforatum pour productionde metII

Optimisation de la productionde MetII par des suspensionscellulaires de Gymnemasylvestre

Stratégie Etude élicitation sur croissancecellulaire et production metII Haute pression 40MPa Streptomycin 28 mg/l Charbon activé 28 mg/l Ethephon 28 mg/l Haute pression + ethephon

Effet inoculum1,5 à 12 g/lintensité aération0,05-0,3 vvm

Effet macroéléments et ratioNH4+ / NO3-

Milieu deculture

Gamborg B5+ NAA 0,1 mg/l+ Kin 0,2 mg/l

MS1/2+ IBA 1 mg/l+ Kin 0,1 mg/l

MS modifié+ 2,4D 2 mg/l+ Kin 0,1 mg/l

Résultats -Pas d’effet des différentstraitements sur croissance-Inhibition de 60% des fortespressions sur productionanthocyanes à 7j-Augmentation (x9) par HP duniveau de production deresveratrol dans milieu (+Ethephon => x15)

Max :3 g/l0,1 vvm

Conditions optimales surcroissance et production métII:NH4NO3 x0.5 / KNO3 x2 /KH2PO4 x2+ Importance ratio NH4+ / NO3-optimal : 7,19mM /18,8 mM


Taxol® (Paclitaxel)

Vinblastine, VincristineSerpentine, Ajmalicine

- Source : écorce d’If du pacifique( Taxus brevifolia)- alcaloïde diterpénique (taxanes)- anticancéreux

- Source : Pervenche deMadagascar (Catharantusroseus)- terpene indole alcaloïdes (TIA)- anticancéreux etreducteurs hypertension

Culture in vitro de cellules et tissus végétauxProduction métabolites – Exemples : Taxol et TIA


Voie de biosynthèse Taxol ®Walker et Croteau (2001) Phytochem. 58 : 1-7

BSNV – Master 2 BVP L.Gondet – 22.09.11Zhong ( 2002) Jal Biosc. Bioeng. 94(6) : 591-599

Culture in vitro de cellules et tissus végétauxProduction métabolites – Exemples : Taxol



Khosroushahi et al., 2006

Contrôle => 2.5 mg/l

B5+ NAA & 2,4D+kin+ antiox



Syklowska-Baranek et al., 2009




Contrôle :Paclitaxel11.6 0.9 g.g-1D.W.40.3 ± 0.6 g.L-1

+ L-Phe 100 M+ MJ 100 M

319.7 ± 14 568.2 ± 34X 28




Contrôle :Paclitaxel11.6 0.9 g.g-1D.W.40.3 ± 0.6 g.L-1

+ PAB100 M+ MJ 100 M

130.5 ± 9 221.8 ± 14X 11


TIA =terpene indole alcaloïdes

Vinblastine, Vincristine,Serpentine, Ajmalicine

Source : Pervenche de Madagascar (Catharantus roseus,Apocynaceae)anticancéreux et réducteurs hypertension

la vinblastine est un agent dépolymérisant, à l'inverse des taxanes quisont des agents polymérisants. ces deux classes de médicaments anti-cancéreux provoquent une inhibition de la dynamique desmicrotubules.

Culture in vitro de cellules et tissus végétauxProduction métabolites – Exemples : TIA


« Feeding »

Effet négatif 2,4DEffet positif méthyl jasmonate




Peebles et al., 2009


Plante source Molécule(s)Bioactive(s)

Multiplication

Production

Culture in vitro Transgénèse

CIV &Substances naturelles végétales

Micropropagation


+ conférence :

S. Miguel (Plant Advanced Technology, Nancy)

=> Lundi 28/11 à 16h (Salle d’Alsace, Bota RDC)

tp civ 1 tp civ 2 indirecte caulogénèse rhizogénèse...

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