DYNAMIQUE DE LA LONGUEUR DESTELOMERES AU COURS DE LA SENESCENCE ET

DE L’IMMORTALISATION DE CELLULESHUMAINES

CEA / DSV / DRR

LABORATOIRE DE RADIOBIOLOGIE ET ONCOLOGIE

13 décembre 1999

Jean-Patrick Pommier

Dynamique de la longueur des télomères etinstabilité chromosomique spécifique

Les télomères :des sabliers mitotiques?

Sénescence in-vivo

Sénescence in-vitro

Cellules primairesTélomérase OFF

Cellules ImmortellesTélomérase ON

Passage P1

Passage Pn

Ensemencement

Confluence

Trypsination

La sénescence réplicative des fibroblastes humains in-vitro

Hayflick et Moorhead (1961)

Explants de tissu

Nombre de passages :•Fini : 40 à 60 DPMs•Variabilité interindividuelle

Localisation des signaux télomériquesHIS sur chromosomes métaphasi ques hum ains, avec une sonde PNA (CCCTAA)3-Cy3

2q13-q14

Yq?

2q13-q14

Organisation génomique des télomères

• Séquences répétées en tandems directs jointifs.

• Localisation terminale, brin G orienté en 3’

•Localisation intrachromosomique : Blocs de tandems inverses (ex HS 2q13-q14) ?

Réplication incomplète des télomères

+

TTAGGG

synthèse continue

synthèse discontinue

3’

5’AATCCC

Progression de la fourche de réplication

amorce ARN

fragment d’Okasaki

(1)-Dégradation amorce ARN(2)-Synthèse ADN(3)-Ligation5’

3’

5’

(1)

(2)

(3)

Dégradation de la dernièreamorce ARN synthétisée

+

Fin du passage de la fourche de réplication

Post-traitement du brin C-Dégradation ou-Structure secondaire ?

100 à 275 bases simples brins

±10 bases simples brins

Fonctions des télomères

• Stabilisation du génome– Supportent la réplication incomplète de l’ADN.

– Blocage des fusions chromosomiques dans les cellulesmitotiques.

• Absence de motifs TTAGGG

– Blocage irreversible en G1/S (sénescence)

– Signal apoptotique

• Topographie des chromosomes interphasiques

– Appariement des homologues dans la méiose

La télomérase est un complexeribonucléoprotéique

5’

3’

AAUCCCAAUCCCAAUCCCTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG 3’ 5’

site catalytique

sous unité catalytique: hTERT (Homme); Est2p (Levure); p123, p133 (Ciliés)

cofacteurs protéiques: p80, p95 (Ciliés)

protéine d’amarrage: Est4 Cdc13 p (Levure)

matrice ARN: hTER (Homme); TLC1 (Levure)

motif télomérique néosynthétisépar la télomérase

TTAGGGAATCCC

Chromatine télomérique des vertébrés

3’AATCCC

TTAGGG

Boucle T

5’

Boucle D

TRF1TRF2

de Lange et al. (1999)

Limitation de la prolifération des fibroblastes parla quantité de motifs TTAGGG présente à chaque

télomère ?• Les fibroblastes primaires n’expriment pas la télomérase.• Les divisions cellulaires générent des télomères avec peu ou

pas de motifs TTAGGG (réplication incomplète, autre(s)mécanisme(s) ?).

• Les télomères privés de TTAGGG sont équivalents à descassures d’ADN double brin:– Blocage constitutif en G1– Réparation par end-joining: Dicentrique ter-ter (fréquence ?).

• Expression ectopique de hTERT dans les fibroblastes :– Immortelles

– Normales : éternellement “jeunes” (Bodnar et al. 1998)

Fusions télomériques dans les fibroblastes sénescents(Benn 1976)

Fibroblastes MRC5 sénescents

0

5

10

15

20

25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y

chromosomes

occu

renc

e

pterqter

Fibroblastes WI38 sénescents

0

5

10

15

20

25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y

Chromosomes

occu

renc

e

pterqter

Hypothèses

• Les dicentriques sont le produit d’une réparationinappropriée des télomères érodés.

• Etat des télomères érodés dans une cellule sénescente?

• Implications de chromosomes spécifiques

• Différence entre donneurs

• Rôle du polymorphisme de longueur des séquencestélomériques?

Support Méthode Sonde Marquage + -ADNgéno mique

SouthernBlot

Telomérique Chaud •Sensibilité : 32

P•Calibration interne•Mesure en Kb

•Quantité ADN•Effet longueur de la cible• Smearing non linéair e•Non télomère spécifique•Subtelo inconnu•Durée•Sensible à la fragmentationde l’ADN•Echantillonage

Métaphase FISH Télomérique(+autres)

Froid •Hybr idation simultanée•Télomère spécifique•Homologue spécifique•Calibration interne.

•Représentativité métaphases/noyaux(Culture cellulaire)•Traitement informatique lourd• Calibration externe pour la longueur ?

Noyaux FISH Télomérique(+autres)

Froid •Hybr idation simultanée•Quantité de cellules

•Calibration externe pour la longueur•Focalisation (100x)

FlowFISH

Télomérique(+alphoïde)

Froid •Rapidité •Cytométr ie en flux

QUANTIFICATION DES SEQUENCES TELOMERIQUES

Analyse de la longueur des FRTsPrincipes

Sonde subtélomérique (minisatellite)S(x)=k•N(x)

Sonde pantélomérique (CCCTAA)n

S(x)=k•N(x)•L(x)

RsaI, HinfIFRT

Digestion enzymatique

Migration électrophorétique(échantillons + calibration)

+Autoradiographie

Dynamique de la longueur des télomères etinstabilité chromosomique spécifique

Les télomères :des sabliers mitotiques?

Sénescence in-vivo

Sénescence in-vitro

Cellules primairesTélomérase OFF

Cellules ImmortellesTélomérase ON

Evolution de la longueur des télomères /immunosénescence

• Modèle in-vivo– Patients HIV+ vs HIV-

• Hypothèse– Augmentation du renouvellement cellulaire

– =>Erosion des télomères dans les lymphocytes?

Southern-Blot Patients VIH+ vs VIH-

Calcul de la longueur moyenne des FRTsBET Autoradiogramme BET

Individus HIV+

23

12111098

7

6

5

4

3

2

1.6

Individus HIV- Plac PYKbλ ladder ladder

6

7

8

9

10

11

12

13

Témoins Patients Groupe A (T8)

Groupe B (B)n=11

n=16 n=6n=10

p=0.0104p=0.0005p=0.0002

Patients

> 200 T CD4+ /µl

n=5

p=0.6917

< 200 T CD4+ /µl

Comparaison de la taille des télomères des CMSPau cours de l'infection à VIH

Long

ueur

moy

enne

des

FR

Ts

(kb)

(Pommier JP ,Gauthier L et al., Virology, 1997)

Immunosénescence in-vivo

• -40 bp/an dans les CMSP (Vaziri et al. 1993)• Patients avec moins de 200 T4/mm3 :

– ∆FRT=-2,78 Kb : vieillissement de 70 ans des CSMP.

– Réduction de la longueur des télomères dans les:• Lymphocytes T8

• Lymphocytes B

• 2 patients avec réduction dans les lymphocytes T4

• Immunosénescence des progéniteurs hématopoétiques parsénescence réplicative ?

• La télomérase est incapable de maintenir la longueur destélomères.

Dynamique de la longueur des télomères etinstabilité chromosomique spécifique

Les télomères :des sabliers mitotiques?

Sénescence in-vivo

Sénescence in-vitro

Cellules primairesTélomérase OFF

Cellules ImmortellesTélomérase ON

SENESCENCE - CELLULES TP

Passage P20 P35 P44 (senescence)Analysed mitosis 50 50 20Abnormal mitosis 0 15 19Dicentrics+rings 0 14 21Rea Chr13 0 13 15

Chromosomes dicentriques dans les fibroblastesTP

Effets à long terme d’une irradiation aux ions lourds.

0

50

100

150

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y

souscultures précocesP ≤ 10

souscultures tardivesP> 10

Réactivation de l’activité télomérase dans lesfibroblastes transformés par SV40.

TSV40

augmentation de l'instabilitéchromosomique

Sénescence (M1) Crise (M2) ImmortalisationDivisions cellulaires supplémentaires

réactivation de la télomerase

Addition de motifs TTAGGG

+

++

+

+-

érosion des télomeres

G1 SG1 S

p53

p21WAF1

p16INK4a

+

-

+

activité télomérase OFF ON

ATM

érosion des télomeres

clone(s) immortalisé(s)

hTERT

Pla

cent

a

Pet

eb

6 8 15 25 33 50 64 78Peteb PB1.2

CRISE

8

12

6

5

4

3

2

Kb

10

Hétérogénéité de la taille des télomères

Pl TP 5 8 10 14 19 29 34 40 45 50 56 65

Passages

Crise

121110987

6

5

4

3

TP15.5

0

100

200

300

400

500

600

700

DIC

EN

TRIQ

UE

S

0 2,5 5 7,5 10

TRF (Kb)

CRISE

CRISE

CRISEMRC5

Peteb PB1.2

TP15.5

Avant crise : corrélation inverse entre la taille moyenne destélomères et le nombre de dicentriques

La longueur télomérique critique est-elle identique pour toutes les lignées ?

HYPOTHESE : Les télomères courts sontinstables

TP15.5, Peteb -> hétérogènes

MRC5-> homogènes

Localisation des points de cassure dans lesdicentriques

centromère-centromèretélomère-centromèretélomère-euchromatine

télomère-télomère

0

25

50

75

100

% de

mito

ses av

ec de

s rem

aniem

ents

chro

mosom

iques

0 5 10 15

passages après transfection par SV40

14

8

6

1

16

13

dic + r

INSTABILITE CHROMOSOMIQUE

Buts

• Relation entre la longueur des télomères et lastabilité des chromosomes.

• Mesure de la longueur des télomères– cellule par cellule et chromosome par chromosome

– Comparaison de la longueur des télomères à l’intérieur d’une mêmecellule.

– Comparaison d’un télomère d’une cellule à l’autre.

L’INSTABILITÉ CHROMOSOMIQUE EST SPÉCIFIQUEQUELQUE SOIENT LES ÉVÈNEMENTS INDUISANT LA PROLIFÉRATION

HYP : CARACTÉRISTIQUE INTRINSÈQUE DES TÉLOMÈRES

Détection des motifs TTAGGG sur chromosomesmétaphasiques

Sondes PNA (CCCTAA)3-FITCPNA (CCCTAA)3-Cy3

Directement f luorescentesSpécificité très grandeStabilité des complexes PNA-DNA

ChromosomesDAPI (Bandes Q)

Acquisition des imagesCCD monochromes

caméra 8bits (256 niveaux de gris)caméra 12bits (4096 niveaux de gris)

Codage des mesures

• Association à chaque mesure d’un code numériquearbitraire précisant:– Le type du signal (paire, non résolu, “orphelin”)

– La localisation (télomère pter ou qter).

– Le chromosome auquelle elle appartient :• “objet chromosome” (1-46)

• caryotype (1-24 avec X=23 et Y=24)

• Etiquetage des particules binaires– spots

– Chromosomes

Mesure des signaux télomériques parsegmentation binaire

0

255 0

255

0

255Soustraction locale du fond

Seuillage

Surface (pixels)

Niveau de grismoyen

Etiquetage des spots binaires

255

0

0

255

255

0

PaireDouble

Orphelin

pter

qter

Localisation(coordonnées cytogénétique)

Type de spot(Etiquettes en type de spot)

Etiquetage des chromosomes

B

★

★

A

★

★ ★

★

C

★

★

D

★

★

F

★

★

E

Construction du tableau Ligne-particule

Volume desspots

Type4 couleurs

Localisation2 couleurs

Objet46 couleurs

Caryotype24 couleurs

Homologue2 couleurs

Standardisation des mesures

• Variabilité des mesures d’intensité des signaux

– D’un champ à l’autre.

– D’une lame à l’autre.

– Selon les expériences

– Biais dans l’analyse des mesures absolues

– Calibration externe, mesures en Kb (Lansdorp)

• Nécessité d’une indépendance des mesures / conditions

– Calibration interne

– Standardisation interne : mesures centrées-réduites

Si , k

* =S

i− S

k

σk

Construction d’un tableau métaphase-ligne

Tableau T1 Variables utilisées

1430

241058

287+94=381

Interface de l’outil Tableau Croisé Dynamique

Tableau T3 : valeurs brutes

Tableau T3 : valeursCentrées-Réduites

0 1500 30000

1500

3000

pter

qter

Les mesures sont ensuitecentrées-réduites

HETEROGENEITE DES INTENSITESSTANDARDISEES DE 10 MÉTAPHASES

-2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

Normalized intensity (p arm)

Nor

mal

ized

inte

nsit

y (q

arm

)

-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Normalized intensity (10 metaphases)C

umul

ated

cou

nts

Sample size=920

? LES TÉLOMÈRES LES PLUS COU RTS SONT-ILS IDENTIQUESPOUR CHAQUE MÉTAPHASE?

Diagramme pter-qterRecherche d’une différence de longueur des télomères entre

les chromosomes homologues: Cas des chromosomes 1 dans les fibroblastes TP (P14).

-2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1pter*

12345678910

1qte

r*

Chromosome 1 (Passage P14)

Métaphase

A

B

Construction d’un tableau métaphase-ligne :Tri des télomères des groupes A et B2 groupes : -> distribution aléatoire?

-> paternel / maternel

Distinction des chromosomes 1 homologues

Association du marquage télomérique fort au marquage hétérochromatique foncé (P=0.08)

Recherche d’hétéromorphismestélomériques

21 22 X Y

32 51 4

6 97 8 10

1211 13 14 15

16 17 18 2019

-2

-1

0

1

2

3

4

-2 -1 0 1 2 3 4 5-2

-1

0

1

2

3

4

-2 -1 0 1 2 3 4 5

-2

-1

0

1

2

3

4 -2

-1

0

1

2

3

4

-2 -1 0 1 2 3 4 5 -2 -1 0 1 2 3 4 5-2 -1 0 1 2 3 4 5

-2

-1

0

1

2

3

4

Recherche du nombre de sous classes delongueur des télomères

1 pa

1 qa

1 pb

1 qb

6 pA

6 qA

6 pB

6 qB

7 pA

7 qA

7 pB

7 qB

11 pA

11 qA

11 pB

11 qB

19 pA

19 qA

19 pB

19 qB

Xp

Xq

Yp

Yq

0

25.1

-0.428 3.35

Classe I

Classe II

Classe I.1

Classe I.2

Classe II.1

Classe II.2

Classe II.1.2

Classe II.1.1

2 134

P<0.0001

P=0.0069

P<0.0001

P<0.0001

1pa = 1qa

Seul 1pa instable

5 sous classes de télomères

confirmation de l’hétérogénéité de longueur des télomères (southern)

Instabilité chromosomique et longueur destélomères

• Differenciation de chromosomes homologues 1, 6, 7, 11, 19, X, Y

• Les chromosomes instables aux passages proches de la sénescence avaientdes petits télomères en P14 (chromosome 1A, 7B ?, 19B ?).

• Les chromosomes avec des petits télomères (11B, 6B) en P14 ne sont pasforcement instables.

• La faible longueur des télomères est nécessaire mais pas suffisante.

Hypothèses• Le taux d’érosion est différent pour chaque télomère ?

• Sélection cellulaire ?

• Effet des séquences flanquantes : recombinaison preférentielle ? (associationspréférentielles : Dic 13-13; Dic 1-13)

Erosion des télomères du chromosome Y aucours de la prolifération cellulaire.

-2 0 2 4 6

-2

-1

0

1

2

3

Yqt

er (i

nten

sité

télo

mér

ique

sta

ndar

disé

e)

P14

P39-1

P39-2

P44

Ypter (intensité télomérique standardisée)

Erosion Yq >> Yp

Hypothèse:dégradation plus élevé

ou recombinaison intratélomérique

->expulsion mini cercle

Dynamique de la longueur des télomères etinstabilité chromosomique spécifique

Les télomères :des sabliers mitotiques?

Sénescence in-vivo

Sénescence in-vitro

Cellules primairesTélomérase OFF

Cellules ImmortellesTélomérase ON

2,5

5

7,5

10

12,5

Tai

lle m

oye

nne d

e té

lom

ères

(Kb

)

0 100 200 300 400

Divisions cellulaires

Après la crise

Juste après la crise

Avant la crise

5

10

15

20

25

Tél

om

ères

lon

gs (K

b)

25 50 75 100 125

Juste après la crise

Avant la crise

Divisions cellulaires

400 pb / division

58 pb / division

110 pb / division

69 pb / division

TP15.5

TP15.5

Corrélation entre l’activation dela télomérase etun ralentissement de la pertedes séquences télomériques

- allongement et dégradation enfaveur d’un raccourcissementtélomérique

- pas d’élongation : latélomérase perturbe lefonctionnement de l’exonucléase

Erosion des télomèrespré et post crise

Le taux d’érosion :équilibre entre élongation et dégradation

la diminution des télomères n’est pas constante

Le taux d’érosion varie en fonction de la longueur des télomères dans le cloneTP15.5

0 100 200 300 4004

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

DPM

Long

ueur

(Kb)

Pic à 21Kb (fibroblastes Primaires TP)

Pic Haut Poids moleculaires (Tp15.5)FRTs moyens ( FRTs homogènes; MPD>200)

Fonction Hyperbolique

0 5 10 15 20 25-400

-350-300

-250-200-150

-100-50

050

100

5Kb’Tau

x dé

rosi

on

Longueur des pics télomériques

autres facteurs influençant la dynamique d’érosion?

TP

TP15.5 p5

TP15.5 p11

TP15.5 p55

Variation de l’hétérogénéité télomérique au cours des passages

Hétérogène

homogénéisation

Relation entre l’instabilité chromosomique, la longueurdes télomères et l’activation de la télomérase

0 10 20 30 40 50 60 70 80 900

2

4

6

8

10

12

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

TP15.5++

0

20

40

60

80

100

120

Nb

Dic

pou

r 10

0 m

itose

s

FR

T m

oyen

s (k

b)

1) érosion des télomèresprécrise télomérase OFF -> instabilité chromosomiquepostcrise télomérase ON -> chromosomes relativement stables2) homogénéisation de la taille des télomères -> évolution autour d’une taille “optimale

CONCLUSIONS• Dans les fibroblastes, les télomères sont hétérogènes en longueur. Certains

chromosomes homologues sont hétéromorphes. Origine de cette hétérogénéité etde cette différence ?– Recombinaison (méiose) ? Différence entre lignée masculine et féminine ?

• En absence de télomérase, la variation de longueur peut être différente d’untélomère à l’autre:– Erosion constante et élevée ou recombinaison mitotique?

• Le taux de variation de la longueur des grands télomères est d’autant plus fortque les télomères sont longs :– Mécanisme coopératif du blocage de l’amarrage de la télomérase aux télomères ?

érosion différentielle ?

• Il y a stabilisation de la longueur des télomères autour d’une valeurs ± constante(homogénéisation)– Facteurs déterminant cette longueur : Contrôle de l’accessibilité des télomères? de

l’efficacité de la télomérase ?

• Stabilité différentielle des chromosomes homologues selon leur télomère?

PERSPECTIVES (1)• Augmenter le nombre de chromosomes homologues différentiables (autres

sondes polymorphes).– Sondes alphoïdes, minisatellites ... en multiFISH.

• Suivi de la longueur des télomères dans des contextes à réarrangementchromosomiques complexes, au cours de la prolifération cellulaire.– Sondes subtélomériques.

• Analyser la distribution de la longueur des télomères des cellules sénescentes(bloquées en G1/S).

– PCC ?

• Mécanismes de réactivation de la télomérase ?

• Rôle de la structure des télomères (protéines spécifiques), absence de latélomérase/ dynamique des télomères (Taux d’érosion ?)

• Automatiser la segmentation des images de cytogénétiques.– Smart Snakes ?

PERSPECTIVES (2)

}

Mutated

Normal

MutatedMutated

No phenotypic effect of LOH Phenotypic effect of LOH

Unstable telomere

Commitment towards immortalization of a specific cell type

Mutated

Normal

Repressed gene Expressed gene

Specific pattern of tissular expression

Whole or partial chromosome lossoriented by telomere loss

Cell proliferation leading to telomere length reduction in somatic cells

A recessive mutation is present in the zygote or is acquired in somatic cells

Biochi mi e (1995) 77, 817-825