Diagnostic Virologique du VIH

Pr S. Fafi-Kremer

Institut de Virologie, CHU de Strasbourg

Séminaire de Formation Jeudi 14 Novembre 2013

1

Objectifs

Comprendre la cinétique des marqueurs de l’infection par le VIH

connaitre les principes généraux des tests de dépistage

conventionnels et des TROD

connaitre et comprendre les performances d’un TROD et ses limites

connaitre l’algorithme de dépistage VIH à partir d’un TROD

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VIH: Structure virale

• Famille Retroviridae- genre lentivirus

• Virus ARN (2 copies), enveloppé

Enveloppe virale:

ARN viral

Protéase (p11)

Intégrase (p32)

RT (p55-p63)

3

gp120

gp41

Capside (p24)

Matrice (p17)

Nucleocapside (P7)

Core:

•Transcriptase inverse: ARN ADN

• Intégration génome cellule hote ADN

proviral

VIH: Diversité et origine

Afrique de l’Ouest

A B C D F G H J K

56 recombinants (CRF 01 à 56)

CRF: Circulating Recombinant Form

Sous-types

4

Marqueurs virologiques de la primo-infection par le VIH en

l'absence de traitement

11-12 14-15 20-21 28-29 Temps (jours)

anti-gp 160

anti-gp 120

anti-gp 41

anti-p24

Contage J 0

taux

des marqueurs

Ag p24

seuil de détection

des marqueurs

Phase d’éclipse Risque majeur de transmission

5

ARN viral

Tests de diagnostic de l’infection par le VIH

6

Diagnostic sérologique: Mise en évidence des anticorps (Ac) anti-VIH et/ou de

l’Ag P24

Tests de dépistage

• Méthode immuno-enzymatique type ELISA

•Tests mixtes: Detection Ac anti-VIH1 et anti-VIH2

•Tests combinés (4ème génération): détection Ac anti-VIH et Ag P24

Tests de confirmation

• Western blot ou Immunoblot

Diagnostic moléculaire: Mise en évidence de acides nucléaires

•Quantification de l’ARN VIH

•Détection et/ou quantification de l’ADN proviral

Tests de dépistage

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Evolution des tests de dépistage ELISA

1ère génération

(1985)

2ème génération 3ème génération 4ème génération

(1990)

cible Virus purifié

Détection

IgG anti-VIH

Protéines d’enveloppe purifiés

Protéines recombinantes

Peptides de synthèse

IgM + IgG anti-VIH IgM + IgG anti-VIH

+ Ag P24

Test ELISA

8

9

Evolution des tests de dépistage ELISA

Branson and Stekler JID 2012

Amélioration progressive des performances:

+ 20 jours entre 1ère et 3ème génération

+ 4 – 5 jours entre 3ème et 4ème génération

Marqueurs virologiques de la primo-infection par le VIH en

l'absence de traitement

11-12 14-15 20-21 28-29 Temps (jours)

anti-gp 160

anti-gp 120

anti-gp 41

anti-p24

Contage J 0

taux

des marqueurs

Ag p24

seuil de détection

des marqueurs

Phase d’éclipse 1ère

génération

2ème

génération

3ème

génération

4ème

génération

10

11

Performance des tests

Spécificité : capacité à donner un résultat négatif lorsque l’infection n’est pas

présente.

Sensibilité : capacité à donner un résultat positif lorsque l’infection est

présente.

Valeur prédictive positive: probabilité pour un individu ayant un

test positif d’être infecté par le VIH

Valeur prédictive négative: probabilité pour un individu ayant

un test négatif de ne pas être infecté par le VIH

Si spécificité faible, risque important de faux positif

Si sensibilité faible, risque important de faux négatif

AMM: 100% (hors per-seroconversion)

AMM: >99,5%

Les limites des tests de

dépistage

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Diversité VIH en France

HIV-1 4 groupes HIV-2

HIV-1 O

HIV-1M

HIV-1N

A

C

virus

mosaïques

B

D (E)

G

H

(I) J

F

A

B C

D E

56 formes recombinantes ou CRFs

K

F

H G

A

B

CRF02

?

HIV-1 P

13

Diversité VIH en France

A. Maillard, Formation SFLS 2012 14

Stade de l’infection

11-12 14-15 20-21 28-29 Temps (jours)

anti-gp 160

anti-gp 120

anti-gp 41

anti-p24

Contage J 0

taux

des marqueurs

Ag p24

seuil de détection

des marqueurs

Phase d’éclipse

4ème génération

Fenêtre sérologique

Test ELISA mixte combiné (4ème génération) un résultat négatif du test 6

semaines après l’exposition peut être considéré comme négatif

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Dépistage de l’infection par le

VIH en pratique

16

17

Diagnostic de l’infection par le VIH

Chez l’adulte et l’enfant >18 mois:

• Test ELISA 4ème génération + test de confirmation

• Confirmation positivité sur 2ème prélèvement

• Charge virale si test sérologique indéterminé

Chez le nouveau-né et le nourrisson <18 mois:

• Charge virale (quantification ADN proviral)

18

A. Maillard, Formation SFLS Rennes

Test ELISA 4ème génération

Spécificité minimale: 99,5%

Sensibilité: 100%

19

VIH 1

VIH 2

Immunoblot

mixte Enveloppe virale:

ARN viral

Protéase (p11)

Intégrase (p32)

RT (p55-p63)

gp120

gp41

Capside (p24)

Matrice (p17)

Nucleocapside (P7)

Core:

• Réalisé en cas de test de dépistage positif

ou douteux

• Spécifique du type de virus (VIH-1 ou VIH-2)

• Mise en évidence spécificité des Anticorps

anti-VIH

Confirmation: Immunoblots ou western blots

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Enveloppe virale:

ARN viral

Protéase (p11)

Intégrase (p32)

RT (p55-p63)

gp120

gp41

Capside (p24)

Matrice (p17)

Nucleocapside (P7)

Core:

• Réalisée sur plasma EDTA si test de confirmation

indéterminé (et avant traitement)

• Très bonne sensibilité, très bonne spécificité

• Test couteux, risque de faux négatif chez les

patients controleurs

Quantification de l’ARN viral = charge virale VIH

ARN viral

21

Barin F et Simon F, Virologie 2013

Tests rapides d’orientation

diagnostique (TROD)

22

23

Tests Rapides d’Orientation Diagnostique VIH

24

Principes généraux des TROD

• Ag HIV1/2 de synthèse fixés sur support

• Détection IgG et IgM (1 seul test détecte Ag P24)

• Contrôle de migration et qualité de l’échantillon (Ac anti Ig

humaines le plus souvent): Positivité du contrôle indispensable à la

validation du test+++

• Révélation du complexe Ag-Ac par colorimétrie

ligne contrôleLigne

du testConjugé avec or colloidal

+proteine A.

Ac anti anticorps humain

Antigene HIV-1/2

Or Colloidal

Conjugé à laProteine A

AC Humains non HIV

Ac HIV-1/2

Prélèvement

Absorbant

Immunofiltration sur membrane

(Through flow) Immunochromatographie

(lateral flow)

Matrices des TROD

• Fluide gingival (créviculaire): Recueil

standardisé entre gencive et face interne

lèvre

Non autorisé en France (arrêté nov 2010)

• Sérum/ plasma: recueil après

centrifugation en milieu spécialisé

• Sang total:sang non décanté avec

globules rouges et plasma

25

Délai de 1ère positivité des TROD

11-12 14-15 20-21 30

Temps (jours)

anti-gp 160

anti-gp 120

anti-gp 41

anti-p24

Contage J 0

taux

des marqueurs

Ag p24

seuil de détection

des marqueurs

Délai de 1ère positivité des TROD

3ème

génération

4ème

génération

Risque majeur de transmission

40 50

Sensibilité équivalente aux tests EIA 3ème génération pour les

TRODs les + performants

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Les tests disponibles en France

Vikia

Biomérieux

Oraquick Advance

Orasure/Orgentec

Determine

Inverness/Alere

INSTI

Nephrotek

• Réalisation simple auprès du patient (pas d’instrumentation)

• Test unitaire

• Lecture subjective visuelle

• Rendu rapide (qq minutes – 30 min) 27

28

Les tests disponibles en France

Pavie et al, PlosOne 2010

TROD: prélèvement sang capillaire

29

Réalisation simple manuelle

30

Réalisation simple manuelle

31

Lecture Subjective Visuelle

Un trait Deux traits

= négatif = positif

32

33

Limites des TROD

- Moins sensible que les tests Elisa (risque de faux négatifs) . Sang total capillaire < sérum

. Pas adapté en primo-infection délai d’apparition Ac VIH : ≈ 21-42 jours

• Variabilité individuelle

• Diversité virale

• Risque de faux positifs nécessité de test de confirmation

• Opérateur dépendant

• Difficulté d’évaluation (contrôle qualité)

• Négligeance des autres IST

34

• Entre 2008-2009, étude comparative 200 patients:

HIV-1 (n=194) 63,3% sous type B ; HIV-2 (n=6); 68, 5% traités par

ARVs; HIV neg (n=20)

Sensibilité des TROD sur sang capillaire et « salive »

Pavie et al, PlosOne 2010

Sang capillaire > salive

Taux Ac dans liquide créviculaire 100 à 1000 fois

inférieur au taux AC dans sérum

35

Pavie et al, PlosOne 2010

Sensibilité combinée sang capillaire + sérum

Sérum> Sang capillaire > salive

• Diminution affinité Ag-Ac à cause de l’hémolyse

• Dilution des Ac dans le sang total

• Durée contact Ag-Ac plus courte sur TROD

• Réaction à température ambiante au lieu de 37°C

Moins adaptés à la primo-infection

Etude comparative

Population étudiée: 64 patients en primo-infection ou infection VIH très récente

Pandori et al, JCM 2009

36

37

Pavie et al, PlosOne 2010

TROD et diversité VIH

La bande contrôle reste bleu

. opérateur dépendant

. contrôle de qualité difficile hors laboratoire

Tests Rapides d’Orientation Diagnostique

40

TROD 4ème génération: Determine Combo(Ac+AgP24 (12,5 – 25 pg/mL)

Laperche et al, JID 2012

Algorithme d’interprétation des TROD

TROD Négatif

VIH négatif

VPN 100% si

exposition > 3mois

TROD Positif ou indéterminé

Nouveau prélèvement

ELISA 4G et WB

ELISA 4G +

WB +

ELISA 4G -

WB + ou -

ELISA 4G +

WB +/- ou -

Réaction non

spécifique

Erreur d’identification

PI probable Infection VIH

Contrôle sérologique

charge virale 41

Attention prise tt

Cas pratiques (A. Maillard, Rennes 2012)

Patient 1

Patient 2

Patient 3

Patient 4

4

4

Patient 5

Patient 6

Délai de 1ère positivité des TROD

11-12 14-15 20-21 30

Temps (jours)

anti-gp 160

anti-gp 120

anti-gp 41

anti-p24

Contage J 0

taux

des marqueurs

Ag p24

seuil de détection

des marqueurs

Délai de 1ère positivité des TROD

3ème

génération

4ème

génération

Risque majeur de transmission

40 50

Sensibilité équivalente aux tests EIA 3ème génération pour les

TRODs les + performants