Diagnostic et dépistagevirologique

• Le dépistage : recherche systématique à l’aided’examens, dans une population, des individus (oudes groupes) atteints par un trouble de santédonné, passé jusque là inaperçu.

• Le diagnostic : identification d’une maladie chezun sujet qui présente des troubles

Un diagnostic est donc mis en œuvre sur dessujets malades (présence de symptômes ou delésions), tandis que le dépistage est appliqué surdes sujets apparemment sains (absence desymptôme et de lésion)

Principales différences entre diagnostic et dépistage

Différence essentielle

En général

Une seulePlusieursNombre d’investigationsmises en œuvre sur chaque

sujet en même temps

PopulationIndividuSujet de l’examen

Indépendant del’état clinique

Conditionné parl’état clinique

Motifde l’examen

DépistageDiagnostic

Toma et al., 2001

Introduction

Les raisons du diagnostic et du dépistage

• Diagnostic– Maladies pour lesquelles la démarche d’un diagnostic

étiologique est nécessaire (mise en place traitement,prophylaxie, pronostic)

– Zoonoses– Maladies pour lesquelles le statut indemne est requis

(commerce, concours, insémination…)– (Maladies émergentes ou ré-emergentes)

•• DDéépistagepistage– Surveillance épidémiologique– Programmes d’éradication– Programmes de contrôle– (Maladies émergentes ou ré-emergentes)

METHODES DIRECTES METHODES INDIRECTES

DIAGNOSTIC DEPISTAGE

Détection du virus Sérologie

Test diagnostic idéal: rapide, simple, sensible,spécifique et bon marché

Rapidité Coût,simplicité

*Méthodes traditionnelles : en général trop lentes pourpermettre une action efficace sur un cas individuel

*Nouvelles méthodes dites rapides : plus adaptées à unemédecine individuelle :

-il existe ainsi de plus en plus de kit commerciauxà la disposition du praticien

-laboratoires équipés pour donner des réponsesrapides

Problématique du diagnostic étiologique

Fonction

1-de l’objectif fixé

2-du virus recherché (cultivable, non cultivable…)

3-du type de prélèvement (richesse en virus)

Stratégie du diagnostic virologique

Méthodes directes de détectionvirale

1- Diagnostic histopathologique

Prélèvement fixés (formol 10%) le plus souvent

Recherche d’ECP caractéristiques

Les méthodes

2- La microscopie électroniqueMéthode directe, spécifique au diagnostic virologique

Les méthodes

Liquide ou tissusPrélèvements

Diagnostic rapide

Virus inconnu

Besoin méthode non sélective

Autres méthodes non disponibles

Indications

Quantité minimale (105 particules/ml)

Sensibilité (opérateur)

appareillage

Limites

Simplicité

Rapidité

Pas besoin de réactifs spécifiques

Avantages

Contraste négatif

2- La microscopie électronique

contraste négatif, immunomicroscopie, détection cytologique (coupemince)

-Aspects généraux des virus en contraste négatif :

*Observation de virus nus : forme régulière, 20 à 90 nm

Virus grande taille (70-80nm) : Reoviridae, Adenoviridae

Virus taille moyenne (40-50 nm) ou petite taille (<40 nm) sontdifficilement identifiables (ex : Papillomaviridae)

Virus toute petite taille (20-30 nm) : pas de caractéristiquesmorphologiques visibles (Parvoviridae, Picornaviridae)

Les méthodes

2- La microscopie électronique

*Observation virus enveloppés :

Membrane lâche le plus souvent, aspect souvent pléiomorphe,

Forme souvent grossièrement globulaire,

Virus lisses ou virus à spicules

Poxviridae : forme de brique (150-350 nm)

Rhabdoviridae : forme allongée

Filoviridae : longueur variable

Herpesviridae: « oeuf au plat »

Coronaviridae: couronne

Les méthodes

2 L’isolement viral

Méthode de référence, originelle

Les méthodes

Liquide ou tissusPrélèvements

Temps

Matériel : cultures cellulaires

Détectabilité/Inefficacité (virus peu résistants ounon cultivables)

Prélèvements

Confirmation : tests immunologiques

Limites

Spécificité et sensibilité (virus dépendante)Avantages

• Indications

– Virus connu : succès isolement fonction• Quantité de virus (phase aiguë)• Caractéristiques intrinsèques au virus (ex BVDV cp

et ncp, VRSB)• Qualité du prélèvement (froid positif ou –80°C,

jamais à –20°C, le plus propre possible)

– Etudes ultérieures– Virus inconnu

Valeur Positive du Diagnostic

• Méthodes

Peu rapide en méthode conventionnelle

Possibilité de méthodes dites de « culture rapide »

*Cellules : Cellules primaires ; lignées (souches) cellulairesdiploïdes ; cellules en lignées continues

(Remarque : culture in ovo)

*Détection des virus : ECP ; hémadsorption/hémagglutination ;techniques immunologiques

3- Détection directe antigènes viraux

Méthodes directes largement utilisées

- Prélèvement cellulaire = immuno-cytodiagnostic:immunofluorescence ou immunohistochimie

- détection antigènes solubles

* ELISA (Labo ou Kits)

* immunodiffusion (RSV)

* immunofiltration (RSV)

* immunochromatographie (Kits FeLV)

* test au latex: agglutination passive (rota, parvo)

Les méthodes

Ex: ELISA de type « sandwich »

Ac spécifique

Echantillon à tester

Ac spécifiques de l’antigènecouplé à une enzyme

Substrat de l’enzyme

Ex d’immunochromatographie appliquée au diagnosticrapide de la grippe chez l’homme

Rapidité

Pas besoin de virus infectieux

Avantages

InconvénientsAvantagesMéthodes

Détectabilité (1 ngantigène/ml prélèvement)

Spécificité (selontechniques)

Automatisation

Kits commerciaux

Quantification ?

Lq et tissus

Lq et tissus

coût

ELISAs

Délai/IFIHC

Microscope à fluorescence

Spécificité ?

IF

4-Détection des acides nucléiques

- Méthode directe, applicable à tous les virus (même inactivé, noncultivable..)

- Ppe: hybridation d’une sonde nucléique spécifique avec les acidesnucléiques correspondants du virus recherché,

- Méthodes anciennes : hybridation (sonde ADN, ARN marquée)

- Méthodes actuelles: amplification in vitro de la réactiond’hybridation (PCR)

- Méthodes en cours d’élaboration : Biopuces (différentiationmutants, souches)

Les méthodes

• Interprétation de la signification à donner à la présence d’ac.nucléiques dépend:

– De l’acide nucléique détecté

– De la présence ou non de l’acide nucléique détecté chez un individu sain(absence de pathologie)

– De la quantité de génome détectée

Sensibilité: contaminations

Spécificité: variantes génétiques virales

Coût

Inhibiteurs

Inconvénients

Sensibilité

Spécificité

automatisation

Avantages

• Les techniques PCR

– trois méthodes classiquement utilisées : PCR simple, nichée, en temps réel

Comparaison différentes techniques PCR

PCR classique PCR nichée PCR temps réel

Sensibilité + ++ ++(fluorescence)

Spécificité + ++ ++

Contamination ++ +++ + (selon système)

Rapidité/Débit ++ (6 heures) + (12 heures) +++ (3 heures)

Automatisation + + +++

Quantification Non Non Oui

Reproductibilité + + +++

Coût/technicité + + +++

Comparaison différentes méthodes

15 min-1 heureGroupe/familleFaible (> 106ml-1)Particule viraleME

2-14 jours (voir 3semaines)

Groupe/familleElevée (1 particuleinfectieuse/essai)

Infectivité et ECP

Particules viralesIsolement

1-3 hType/groupeElevéeAntigène viralIF

4-8 hType/groupe/famille

Elevée (1-50molécules essai)

Génome viralPCR

1-3 hType/groupeElevée (1 ng/ml)Antigène viralELISA

Temps deréalisation

SpécificitéSensibilitéDétectionTechnique

La sérologie

Recherche des anticorps synthétisés par l’hôte enréponse à une infection aiguë, persistante ou ancienne

• Méthodes sérologiques fondées sur le principe dela spécificité de la réaction Ac/Ag

• Nature et qualité des échantillons

– Sérum + liquides biologiques (lait)– Transport sans conditions particulières (décantation 24-

48 h sous conditions normales)– LCR (humaine)

1- Généralités

2- Techniques sérologiques

Techniques immunoenzymatiques (ELISA)

(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)

Principe du test ELISA: Recherche de la présenced’anticorps (Ac) spécifiques

EzEz

Ez

- +

- +

- +

- +

Ag connu spécifique de l’AC recherché

Incubation du sérum à tester

Ajout des AC anti-Fcmarqué par une enzyme

Ajout du substratchromogène de Ez

ColorationPas de coloration

Lavage

Lavage

ELISA Indirect

ELISA indirect

Antigène

Ac de l’échantillon à tester

Ac anti-immunoglobuline del’espèce d’où provient l’échantillon,

couplé à une enzyme

Substrat de l’enzyme

ELISA de blocage

Antigène

Ac de l’échantillon à tester

Ac spécifiques de l’antigène (ousous-unité antigénique) couplé

Substrat de l’enzyme

ELISA de compétition

Antigène

Ac spécifiques de l’antigène (ousous-unité antigénique) couplé

Ac de l’échantillon à testerAc de l’échantillon à tester

Ac de l’échantillon à testerAc de l’échantillon à tester

Ac spécifiques de l’antigène (ou sous-unité antigénique) couplé

Ac spécifiques de l’antigène (ou sous-unité antigénique) coupléAc de l’échantillon à testerAc de l’échantillon à tester

Substrat de l’enzyme

Avantages

-Sensibilité

- Distinction classes d’Ac

-Automatisation et faible volume réactionnel

-Technique facile à utiliser

-Technique qualitative ou quantitative

IgM+/-IgM

IgG

Contamination

Primo-infectionIncubation Ré-infectionRéactivation

Temps3 semaines

à 3mois

Autres techniques

InconvénientsAvantagesTechniques

SpécificitéRapidité

Sensibilité

Agglutination passive

Certains virus

Conditions expérimentales

Moindre sensibilité

Simplicité

Ac potentiellementprotecteurs

Inhibitionhémagglutination

Conditions expérimentales

Virus à ECP

Test référence

Spécificité

Ac protecteurs

Séroneutralisation

Confirmation (Humaine)Spécificité > (ELISA)Western-blot, immuno-blot

Difficulté exploitationId ELISARadio-immunologie

Spécificité

Automatisation

rapiditéIF indirecte

Hémagglutination etInhibition del’hémagglutination

• Détermination du statut immunitaire d’un animalvis-à-vis d’un virus à un moment donné:Dépistage

• Diagnostic d’une infection en cours ou récente

• Evaluation de l’immunité résiduelle aprèsinfection naturelle ou vaccination

3- Circonstances de réalisation et règles d’interprétation

⇒ un seul prélèvement

⇒ Séroconversion : 2 prélèvements (10-20 jours)⇒ Présence d’IgM spécifique: 1 prélèvement

• Interprétation

– Caractère retardé de la réponse humorale– Interférence immunité colostrale– Réactions croisées– Pas de datage de l’infection– Expression variable selon:

• Virus– réponse humorale vs réponse cellulaire– BVDV: IPI

• Laboratoire

Circonstances de réalisation et règles d’interprétation

Rôle du praticien

• Renseignements cliniques

• Prélèvements

• Choix des techniques

• interprétation des résultats

• Renseignements cliniques

• PrélèvementsOù?

• site de réplication du virus (porte entrée-sortie)• pathologie observée et technique utilisée

Quand?• Phase aiguë (le plus tôt possible)• Fenêtre de détection et infection virale

Quoi?fonction de la pathologie observée, du virus suspecté,

de la technique utilisée

Syndrome prélèvement

Respiratoire Ecouvillon nasal/gorge ;aspiration naso-pharyngée

Digestif Fèces

Génital Ecouvillon génital

Oculaire Ecouvillon conjonctival

Cutané Grattage, liquidevésiculaire, biopsie

Nerveux Fèces, écouvillon nasal,LCR

Généralisé Ecouvillon nasal, fèces,leucocytes sanguins

Autopsie/biopsie Selon organe

Toute maladie Sang pour sérologie

- Traitement: selon la technique de laboratoire (fixation pourhistopathologie ; dans milieu de transport, sous couvert dufroid…)

Acheminement le plus rapide possible vers le laboratoire

Ne pas oublier d’indiquer :

date et nature du prélèvement , commémoratifs, diagnosticprésumé, nature de la recherche

•Interprétation des tests

Laboratoire : donne résultats aidant le clinicien à établir sondiagnostic

il ne réalise pas un diagnostic définitif

Lors de diagnostics directs considérer :

-le type de prélèvement d’où a été isolé le virus (+ le contexteclinique)

-les circonstances épidémiologiques accompagnant l’isolement

-le caractère pathogène du virus isolé

Lors de diagnostics indirects considérer :

-la cinétique du titre en anticorps

-la classe d’Ig détectée

-la possibilité de réactions croisées

Dans tous les cas : prendre en compte la sensibilité, laspécificité, et les valeurs prédictives