CLONAGE ET BANQUES DCLONAGE ET BANQUES D’’ADNADN

LE CLONAGELE CLONAGE

1) D1) Dééfinitionfinition2) Principe2) Principe

LES BANQUES DLES BANQUES D ’’ADNADN

3) Les outils3) Les outils4) Les vecteurs4) Les vecteurs5) Les cellules hôtes5) Les cellules hôtes6) Les diff6) Les difféérentes rentes éétapes de rtapes de rééalisation dalisation d’’une banqueune banque

* Les banques d* Les banques d ’’ ADNcADNc* Les banques d* Les banques d ’’expressionexpression* Les banques d* Les banques d ’’ADN gADN géénomiquenomique

GENERALITESGENERALITES

1972 Le pionnier du génie génétique

Le biochimiste américain Paul Berg a conçu une technique, connue sous le nom d'ADN recombinant, qui permet de sectionner la molécule d'ADN à des endroits précis correspondant à une séquence donnée d'ADN ou gène. Il s'agit de la principale méthode utilisée en génie génétique. Pour ce travail de pionnier, Paul Berg a obtenu le prix Nobel de chimie 1980.

LE FLUX DE LLE FLUX DE L’’INFORMATIONINFORMATION

TRANSCRIPTIONTRANSCRIPTIONREPLICATIONREPLICATION

ADNADN ARNARN PROTEINEPROTEINE

TRADUCTIONTRADUCTION

: id: idééal du Biochimiste avant les annal du Biochimiste avant les annéées 70 : GENETIQUE CLASSIQUEes 70 : GENETIQUE CLASSIQUE

: id: idééal du biochimiste apral du biochimiste aprèès les anns les annéées 70 : GENETIQUE INVERSEes 70 : GENETIQUE INVERSE

ggéénnéétique inversetique inverse

ggéénnéétique classiquetique classique

« Revisité »

QUESTIONSQUESTIONS ::

Comment ?Comment ?Comment ?

Récupérer l ’informationL’individualiserLa reconnaîtreL’amplifierL’analyserReproduire la fonction

RRéécupcupéérer lrer l ’’informationinformationLL’’individualiserindividualiserLa reconnaLa reconnaîîtretreLL’’amplifieramplifierLL’’analyseranalyserReproduire la fonctionReproduire la fonction

CLONAGECLONAGE

BANQUEBANQUE

CLONAGECLONAGE

DDééfinitionfinition : : insinséérer un ou des fragment(s) drer un ou des fragment(s) d’’intintéérêt dans lrêt dans l ’’ADNADNggéénomique purifinomique purifiéé dd’’un un éélléément gment géénnéétique tique autorautorééplicatifplicatif (virus ou plasmide)(virus ou plasmide)

ButBut : : grand nombre de copies absolument pures dgrand nombre de copies absolument pures d’’une sune sééquence donnquence donnéée de DNAe de DNA

Sélection d’un clone bactérien recombinant (vecteur + ADN) parmi unensemble de clones bactériens (banque ou « Library »)SSéélection dlection d’’un clone bactun clone bactéérien recombinant (vecteur + ADN) parmi unrien recombinant (vecteur + ADN) parmi unensemble de clones bactensemble de clones bactéériensriens (banque ou (banque ou «« LibraryLibrary »»))

Obtention de l’ADN de l’organisme donneur

A partir de l’ARN:

Principe de la "reversePrincipe de la "reverse

transcription":transcription":

Différents vecteurs de clonage

Taille maximum approximative du fragment d’ADN qui peut être cloné dans chaque vecteur

Typedevecteur ADN clonéenkbPlasmidePhage lambdaCosmidePhageP1BAC(bacterial artificial chromosome)

YAC (yeastartificial chromosome)

1025451003001000

LE CLONAGE :LE CLONAGE :* Les Ingr* Les Ingréédients*dients*

Les fragments dLes fragments d’’acides nuclacides nuclééiques iques àà insinséérerrer«« insertsinserts »» ARN, ADNARN, ADN

1 vecteur1 vecteur

1 souche de cellules hôtes1 souche de cellules hôtes

1 moyen de criblage1 moyen de criblage

• Sonde ANSonde AN•• AnticorpsAnticorps

SCHEMA GENERALSCHEMA GENERALSCHEMA GENERAL

1) PREPARATION DU VECTEUR1) PREPARATION DU VECTEUR

2) PREPARATION DU DNA2) PREPARATION DU DNA«« insertinsert »»

3) ETABLISSEMENT DU RECOMBINANT3) ETABLISSEMENT DU RECOMBINANTVecteur + DNA + LigaseVecteur + DNA + Ligasephage (phage (empaquettageempaquettage ))

4) INCORPORATION A L4) INCORPORATION A L ’’HOTEHOTE

VECTEURSVECTEURSVECTEURS

• PAS DE VECTEUR UNIVERSEL• PAS DE VECTEUR UNIVERSELPAS DE VECTEUR UNIVERSEL

•• CHOIX :CHOIX :f(taille)f(taille)

f(objectifs)f(objectifs)

séquence seulementmécanismeproduction ou non de RNAproduction ou non de protéines

ssééquence seulementquence seulementmméécanismecanismeproduction ou non de RNAproduction ou non de RNAproduction ou non de protproduction ou non de protééinesines

LES VECTEURS DE CLONAGELES VECTEURS DE CLONAGE• LES PLASMIDES•• LES PLASMIDESLES PLASMIDES

-- ADN circulaire double brinADN circulaire double brin-- Taille de 2 Taille de 2 àà 5 5 KbKb-- Certains acceptent un insert jusquCertains acceptent un insert jusqu ’à’à 8 8 KbKb-- UtilisUtiliséés pour les banques ds pour les banques d ’’ADNcADNc-- Surtout utilisSurtout utiliséés en fait pour le s en fait pour le soussous--clonageclonage

• LES PHAGES (famille λ)• LES PHAGES (famille LES PHAGES (famille λλ))

-- ADN linADN linééaire double brinaire double brin-- Taille du phage Taille du phage λλ sauvage : 48 500 sauvage : 48 500 pbpb-- Taille de lTaille de l ’’insert acceptinsert acceptéé ::

* insertion simple : 0* insertion simple : 0--10 10 KbKb* * ddéélléétiontion--remplacement remplacement : 9: 9--23 23 KbKb

-- UtilisUtiliséés pour les banques ds pour les banques d ’’ADNc ADNc ou gou géénomiquesnomiques

• LES COSMIDES•• LES COSMIDESLES COSMIDES-- plasmide + splasmide + sééquence COS du phage quence COS du phage λλ-- taille 8 taille 8 KbKb-- taille de ltaille de l ’’insert acceptinsert acceptéé : 30: 30--42 42 KbKb-- utilisutiliséés pour les banques gs pour les banques géénomiquesnomiques

• Les YAC (Yeast Artificial Chromosome)•• Les YAC (Les YAC (Yeast Artificial Yeast Artificial Chromosome)Chromosome)-- ADN double brinADN double brin-- taille 12 taille 12 KbKb-- contient les scontient les sééquences TEL, CEN, ARSquences TEL, CEN, ARS-- taille de ltaille de l ’’insert acceptinsert acceptéé : 150: 150--1 000 1 000 KbKb

(taille moyenne habituelle 350 (taille moyenne habituelle 350 KbKb))

• BAC (Bacterial Artificial Chromosome)•• BAC (BAC (Bacterial Artificial Bacterial Artificial Chromosome)Chromosome)≅≅ 100100--150 150 KbKb

• PAC (Phage P1 Artificial Chromosome)•• PAC (Phage P1 PAC (Phage P1 Artificial Artificial Chromosome)Chromosome)≅≅ 100100--150 150 KbKb

Exemple de plasmideExemple de plasmide

LES PHAGESLES PHAGESVirus de Virus de bactbactéérierie--infectieux infectieux : Rendement +++: Rendement +++

•• λλ : 48 : 48 KbKb•• Les phages et les bactLes phages et les bactééries hôtes sont gries hôtes sont géénnééralement mutralement mutéées pour es pour ééviterviterle cycle dele cycle de LysogLysogéénienie au profit du cycle lytiqueau profit du cycle lytique..

•• Grande partie non essentielleGrande partie non essentielle

VECTEURSVECTEURS

2 Types :2 Types :

•• Insertion (Insertion (λλ zapzap, gt CHARON , gt CHARON cDNAcDNAFaible capacitFaible capacitéé ≤≤ 10 10 KbKb

•• DDéélléétion : substitutiontion : substitution•• (Charon, EMBL, DASH, FIX(Charon, EMBL, DASH, FIX……))Partie non essentielle Partie non essentielle «« stufferstuffer »» est est ddééllééttéée e et remplacet remplacéée : e : ≤≤ 25 25 KbKb

•• SSéélection spi.lection spi.

Exemple de phageExemple de phage

Chromosome Artificiel de Levure (YAC)Chromosome Artificiel de Levure (YAC)

Origine de réplication CentromCentromèèrere

pYAC2pYAC2

TRP1Site de clonage de Smal

URA3Télomère

BamH1Télomère

BamH1 Clivage par BamH1 et SmalClivage par BamH1 et Clivage par BamH1 et SmalSmal

Bras gaucheBras droit

TRP1 Origine ExtrTRP1 Origine Extréémitmitéé ExtrExtréémitmitéé URA3URA3TTéélomlomèèrere TTéélomlomèèrereCentromCentromèèrere

Ligature avec lLigature avec l ’’ADN ADN éétrangertranger

CLONAGE: LE PRINCIPECLONAGE: LE PRINCIPE

LES PROTOCOLESLES PROTOCOLES

1) AMPLIFICATION de la SOURCE du plasmide non recombin1) AMPLIFICATION de la SOURCE du plasmide non recombinéé

2) LYSE 2) LYSE «« PREPSPREPS »»

SDSSDS

NaOHNaOH

NaOAc NaOAc pH5pH5

3) LINEARISATION, DEPHOSPHORYLATION3) LINEARISATION, DEPHOSPHORYLATION

-- Enzymes de restrictionEnzymes de restriction-- Traitement Traitement àà la phosphatase alcalinela phosphatase alcaline

E.RE.R

ϕϕϕϕ aseasealcalinealcaline

3 ’ OH3 ’ OH

P 5 ’5’P

HO 3 ’HO 3 ’

OHOHOHOHOHOH

OHOHOH OHOHOH

4) CONSTITUTION DE L ’HYBRIDE4) CONSTITUTION DE L4) CONSTITUTION DE L ’’HYBRIDEHYBRIDEVecteur Vecteur ddééphosphorylphosphoryléé

++DNA DNA àà insinséérerrer

++LIGASE (ATP)LIGASE (ATP)

Pas de liaisonPas de liaison

3’OH P OH

POH 3 ’

OH OH5 ’

Liaison Liaison ΨΨΨΨ diesterdiesterRabouttage Rabouttage finale : dans la bactfinale : dans la bactéérierie

OH 5 ’

5) PREPARATION DES BACTERIES RECEPTRICES 5) PREPARATION DES BACTERIES RECEPTRICES (ou bact(ou bactééries compries compéétentes)tentes)

Ca++, Cobalt, RubidiniumCa++, Cobalt, Ca++, Cobalt, RubidiniumRubidinium

6) TRANSFORMATION6) TRANSFORMATION

* Choc thermique * Choc thermique «« heat heat chocchoc »»* Choc * Choc éélectrique lectrique «« éélectroporationlectroporation »»* * «« BombardementBombardement »»

7) SELECTION DES CELLULES TRANSFORMEES 7) SELECTION DES CELLULES TRANSFORMEES (CRIBLAGE)(CRIBLAGE)

Rendement faible :Rendement faible :101066 -- 101099 clones/clones/µµg DNAg DNA

1) ANTIBIOTIQUES1) ANTIBIOTIQUES

--Resistance Resistance aux ATB ( aux ATB ( AmpiAmpi, Kana..), Kana..)

2) OPERON LACTOSE2) OPERON LACTOSEBact Lac (-) ++ plasmide LacZ (ßGal)

Bactérie Lac (++)

IPTG+ milieu (Xgal)

Plasmide nonrecombiné (bleu)

Plasmide recombiné (blanc)

N.B. : LacZ ici : partie N terminale du peptide α + promoteur de laßgalactosidase.

`C ’est un complément de bact Lac--.

En absence d ’IPTGrépresseur

P O lac Z insert lac z

Pas de transcriptionEn présence d ’IPTG

IPTGrépresseur

l ’ITPG se fixe au répresseur

transcription

Synthèse d ’une protéine de fusionll ’’ITPG est un inhibiteur de rITPG est un inhibiteur de réépresseurpresseur

En absence dEn absence d ’’insertinsert

ß galactosidase active

X gal clivé

Colonie bleueEn prEn préésence dsence d ’’insertinsert Lac ZLac Z

ß galactosidase inactive

X gal non clivé

Colonie blanche

QuickTime™ et undécompresseur Animation

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Gélose contenantIPTG + Xgal

Plaques bleues= phages n ’ayant pas

inséré de DNA

Plaques blanches=phages ayant inséré du DNA

Exemple deExemple dell’’insulineinsuline

LES DIFFERENTS CELLULES HOTESLES DIFFERENTS CELLULES HOTES

1) Les hôtes 1) Les hôtes procayotesprocayotes

* Temps de r* Temps de rééggéénnéération (10 ration (10 àà 20 20 mnmn))* Facile * Facile àà maniermanier* Pas ch* Pas chèèresres* Non pathog* Non pathogèènesnes

Res (Res (--), ), RecA RecA ((--) ) Escherichia coliEscherichia coli, , PseudomonasPseudomonas, , bacillus subtilisbacillus subtilis, etc..., etc...

2) Les hôtes eucaryotes2) Les hôtes eucaryotes

Animales, vAnimales, vééggéétales ou levures en culturetales ou levures en culture

Vecteur avec ORI eucaryotesVecteur avec ORI eucaryotes

• Etudes Etudes de rde réégulation gulation «« in vivoin vivo »»•• Modifications postModifications post--traductionnellestraductionnelles

CELLULES HÔTESCELLULES HÔTES

--BactBactééries : E. Coliries : E. Colipremier hôte utilisénombreux vecteurs plasmidiques connus et utilisablesculture en masse dans les fermenteurstaux d’expression élevés (plusieurs g de protéine/litre)

MAIS secrètent mal les protéines : éclatement des bactériespas de modifications post-traductionnelles

--Levure saccharomyces Levure saccharomyces cerevisiaecerevisiaemodifications post traductionnelles

MAIS pas de secrétion, moins bon rendement

--Cellules CHO (Cellules CHO (chinese chinese hamster hamster ovaryovary))culture de masse en bioréacteurs, protéines complexes

MAIS cher et rendement plus faible

LES BANQUESLES BANQUES

1) Banque de 1) Banque de cDNAcDNA

2) Banque d2) Banque d ’’expressionexpression

3) Banque g3) Banque géénomiquenomique

BANQUES de BANQUES de cDNAcDNA

PRINCIPALES ETAPES DE FABRICATION PRINCIPALES ETAPES DE FABRICATION DD ’’UNE BANQUE DE UNE BANQUE DE cDNAcDNA

Extraction des ARN totauxExtraction des ARN totaux

Purification des ARN messagersPurification des ARN messagers

SynthSynthèèse in vitro desse in vitro des cDNAcDNAet du double brin (+adaptateurs)et du double brin (+adaptateurs)

PrPrééparation des recombinants par insertion de chacun des paration des recombinants par insertion de chacun des cDNAs cDNAs dans un vecteurdans un vecteur( plasmides, phages( plasmides, phages……))

Multiplication des recombinants Multiplication des recombinants «« viavia »» une cellule hôteune cellule hôte

Identification du clone contenant le recombinant recherchIdentification du clone contenant le recombinant recherchéé

BANQUES BANQUES DD’’EE��XPRESSIONXPRESSION

BANQUE DBANQUE D ’’EXPRESSIONEXPRESSION

0 19,6 KbLac Z

43,7 Kb

Sens de transcription de Lac Z

Site Eco RI (site unique sur le vecteur)

Digestion Eco RI

AA BBBras gauche Bras droit

Linkers Eco RI

cDNA à insérerLigase

B A B AcDNA inséré Lac Z

Infection des bactéries

Gélose contenantIPTG + Xgal

Plaques bleues= phages n ’ayant pas

inséré de cDNA

Plaques blanches= phages ayant inséré

un cDNA et produisantun hybride β gal-protéine

codé par le cDNA

RECOMBINANT DNA

VECTEUR DVECTEUR D’’EXPRESSION EUCARYOTEEXPRESSION EUCARYOTE

LevuresLevures et bactbactéériesries utilisées comme usines: production d'antibiotiques -pénicilline, tétracycline-, d'enzymes comme lipases -lessives-...

Vaccins : fraction de protéines viralesnécessaire à la production d’AC

Bioréactifs – Enzymes de restrictiondiminution du coût

Autres exemples

Création de plantes transgéniques

An Introduction to Genetic Analysis

Création d’animaux transgéniques

BANQUES GENOMIQUESBANQUES GENOMIQUES

BANQUES PAR DIGESTION MENAGEEBANQUES PAR DIGESTION MENAGEE

GENOMESGENOMES

ReprRepréésentativitsentativitéé ::Nbre Nbre clones = clones = taille du gtaille du géénomenome

taille de ltaille de l ’’insertinsertEx : 3.10Ex : 3.1099/15.10/15.1033

DIGESTION MENAGEE (Enzymes, temps, etcDIGESTION MENAGEE (Enzymes, temps, etc……))

APRES SELECTION DE FRAGMENTS de TAILLE APRES SELECTION DE FRAGMENTS de TAILLE ∼∼ 15 15 KbKb

••Insert grande tailleInsert grande taille moins de clonesmoins de clones••Insert grande tailleInsert grande taille + de chances+ de chancesdd ’’obtenir la sobtenir la sééquence entiquence entièère recherchre recherchééee

CCL = Les banques gCCL = Les banques géénomiques exigent des vecteurs insnomiques exigent des vecteurs inséérant des grandes taillesrant des grandes tailles

* Inconv* Inconvéénients :nients :•• Gd fragment : difficile Gd fragment : difficile àà rréépliquerpliquer•• Gd fragment : recombinaisonGd fragment : recombinaison

Banques classiques : 10 Banques classiques : 10 àà 45 45 KbKb..

Le compromis sera :Le compromis sera :•• QtQtéé de DNA et cible connue ou inconnuede DNA et cible connue ou inconnue•• Le choix du vecteurLe choix du vecteur

Chromosome Artificiel de Levure (YAC)Chromosome Artificiel de Levure (YAC)

Origine de réplication CentromCentromèèrere

pYAC2pYAC2

TRP1Site de clonage de Smal

URA3Télomère

BamH1Télomère

BamH1 Clivage par BamH1 et SmalClivage par BamH1 et Clivage par BamH1 et SmalSmal

Bras gaucheBras droit

TRP1 Origine ExtrTRP1 Origine Extréémitmitéé ExtrExtréémitmitéé URA3URA3TTéélomlomèèrere TTéélomlomèèrereCentromCentromèèrere

Ligature avec lLigature avec l ’’ADN ADN éétrangertranger

AMPAMPRRTELTEL ORIORI TRPTRP ARS1ARS1 URA3URA3 TELTEL

Isertion Isertion (150 1500 (150 1500 KbKb))++

ADNADN ggéénomiquenomique (digestion totale ou partielle)(digestion totale ou partielle)SSéélection des fragment PFGElection des fragment PFGE

SOUCHES DE LEVURE MUTEES SOUCHES DE LEVURE MUTEES ad2ad2--11 pour un gpour un gèène du ne du mméétabolisme de ltabolisme de l’’adadééninenine

COULEUR ROUGECOULEUR ROUGE

GENE SuP4 (GENE SuP4 (tRNAtRNATYRTYR suppresseur) complsuppresseur) compléémente la mutation ad2mente la mutation ad2--11

REC = blancREC = blanc non REC = ROUGEnon REC = ROUGE

Comment définir si une banque est suffisamment grande pour espérer trouver un

fragment d’intérêt?

Calcul afin de définir la probabilité de trouver une séquence donnéedans une banque.

N=ln(1N=ln(1--P)/ln(1P)/ln(1--f) f)

NN::nombre de recombinants nombre de recombinants

PP:: probabilitprobabilitéé ddéésirsirééee

ff:: proportion de gproportion de géénome dans un seul recombinantnome dans un seul recombinant

Ex: Ex: 99% de probabilit99% de probabilitéé dd’’avoir une savoir une sééquence reprquence repréésentsentéée e dans une banque de fragments de dans une banque de fragments de 17kb17kb dd’’un gun géénome nome eucaryote eucaryote (3.10(3.1099pb)pb)

N= ln(1N= ln(1--0.99)/ln(10.99)/ln(1--(1,7.10(1,7.1044/ 3.10/ 3.1099))=8,1.10))=8,1.105 5 coloniescolonies

FINFIN

de de mmééthodologieIIthodologieII