République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’enseignement et de la recherche scientifique

Université de M’Hammed Bougarra de Boumerdès

Département de Biologie

Module   : génomique et protéomique

Thème :

Réaliser par :

ABDELLAOUI F arida ARBANE Nassima CHIBANE Hacina

Année universitaire : 2010/2011.

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Plan de travail :

Introduction I. Historique

II. DéfinitionIII. Les techniques de séquençage de l’ADN 

III.1. La méthode chimique «Maxam &Gilbert » 

III.1.1. Le principe de la méthode chimique

III.1.2. Les étapes de la méthode chimique

III.2. La méthode Enzymatique

III.2.1. Principe de la méthode enzymatique

III.2.2. Les étapes de la méthode enzymatique

III.2.3. Les avantages et inconvénient

Conclusion

 

Introduction :2

La molécule d’ADN est constituée d’une chaine de 4 nucleotides guanine, cytosine,adénine et thymine,dont la succession détermine la séquence des differents génes.le séquençage est une méthode qui consiste a determiné la succession des ces nucleotides sur ADN . ce procédé permrt de determiner les differentes anomalies responsables de maladies génitiques ou de réaliser des études d’épidimiologie moléculaire en microbiologie ou dans t’autre domaines. Deux principales méthodes ont été initialement développées dans ce but : la méthode chimique (Maxam et Gilbert en1977), et la méthode enzymatique (Sanger 1981). D’autres techniques recentes comme le séquençage par hybridation, le pyroséquençage ont eté utilisées et appliquées à l’analyse des génomes.

I. Historique  :

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Le séquençage de l’ADN a permis à la biologie de progresser rapidement dans l’acquisition de nouvelles connaissances.

Il existe deux méthodes complémentaires de séquençage d’ADN :

Méthode chimique Méthode enzymatique

1. Méthode chimique 2. Méthode enzymatique

1977 - génome d’un phage : 5000 bases.

1979 - génome mitochondrial humain : 16000 bases.

1995 - génome de Haemophilus influenzae : 3 106 bases.

1996 - génome de Saccharomyces cerevisiae : 14 106 bases.

1998 - génome de Caenorhabditis elegans : 100 106 bases.

2000 - génome de Drosophila melanogaster : 170 106 bases.

2002 - séquençage du génome humain : 3,5 109 bases.

II. Définition  :

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Walter GILBERT(1932- )

NOBEL 1980

Frederick SANGER(1918- )

NOBEL 1980

En biochimie  :

Le séquençage consiste à déterminer l'ordre linéaire des composants d'une macromolécule (les acides aminés d'une protéine, les nucléotides d'un acide nucléique comme l'ADN, les monosaccharides d'un polysaccharide, etc.).

En génétique  :

Le séquençage concerne la détermination de la séquence des gènes voire des chromosomes, voire du génome complet, ce qui techniquement revient à effectuer le séquençage de l'ADN constituant ces gènes ou ces chromosomes.

III. Les techniques de séquençage de l’ADN   :

Chacune des deux méthodes de séquençage des longues molécules d’ADN (chimique et enzymatique) implique la production d’un lot de molécules de tailles différentes dotées d’extrémité commune, ensuite séparait par électrophorèse sur gel de polyacrylamide(PAGE) pour accéder à la lecture de la séquence.

III.1. La méthode chimique «Maxam &Gilbert   »  :

Cette première méthode exige que le fragment d’ADN à séquencer soit marqué à une extrémité, habituellement en ajoutant un phosphate radioactif à l’extrémité 5’ ou 3’, ou un nucléotide à l’extrémité3’.

III.1.1. Le principe de la méthode chimique :

Cette méthode a été développée au début des années 70. Elle est valable pour l’ADN double brin comme pour l’ADN simple brin et implique des clivages

bases spécifiques qui se déroule en deux étapes. Le principe de la méthode repose :

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sur le marquage radioactif du brin d’ADN à séquencer (Permet une identification par autoradiographie)

de coupures spécifiques mais incomplètes séparation des fragments par électrophorèse (PAGE)

La base est d’abord modifiée par application de produits chimiques spécifiques, puis la piperidine clive le squelette phosphate-sucre de l’ADN au niveau de ce site. En limitant les temps d’incubation ou les concentrations des composes, une gamme de molécules de taille de plus en plus importante est crée, plutôt qu’un clivage complet en courts oligonucléotide. Les réactions de modifications spécifiques de base utilise le diméthyle-sulfate(DMS), pour méthyle les guanines. L’acide formique attaque les purines A et G. l’hydrazine est utilisée pour hydrolyser la pyrimidine(C+T), mais une concentration saline élevée inhibe la réaction avec la thymine.

III.1.2. Les étapes de la méthode chimique :

SEQUENÇAGE D’ADN

Marquage au 32P

Traitement par enzyme de restriction

4 types de traitements chimiques

1. méthylation des G 3. dégradation des pyrimidines T+C

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5’

5’

3’

3’

5’5’3’

3’

32P32P

5’5’3’

3’

32P32P5’

3’ 5’3’

+

G C A T G GG C A T GA G CT32P

2. Dépurination sélective G+A 4. dégradation spécifique C

PIPERIDINE

COUPURE AU NIVEAU DES BASES MODIFIEES OU ABSENTES

Les résultats dans les quatre tubes  :

Les résultats de séquençage d’ADN sur gel de Maxam&Gilbert   :

Quatre pistes sur le gel de séquençage (G.A+G.C+T et C) permettent ainsi de déterminer la séquence.

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NH

GCAT G GG CATGA G CT32P

GCAT G GG CA TA GT32P

GCAT GGA GT32P

GCAT GGAT32P

GCATGAT32P

GCAT32P

32P

GCAT G GG CA TA GT32P

GCAT G GG CA TA GT32P

GCAT GGA GT32P

GCAT GGA GT32P

GCAT GGAT32P

GCAT GGAT32P

GCATGAT32P

GCATGAT32P

GCAT32P

GCAT32P

32P32P

GC32P

GCATG32P

GCAT G GG CA GT32P

GCAT G GG CATA GT32P

GCAT GG A GT32P

GCAT GG AT32P

GCATG AT32P

GCAT32P

32P

GC32P

GGCC32P

GCATG32P

GGCCAATTGG32P

GCAT G GG CA GT32P

GGCCAATT GG GGGG CCAA GGTT32P

GCAT G GG CATA GT32P

GCAT G GG CATA GT32P

GCAT GG A GT32P

GCAT GG A GT32P

GCAT GG AT32P

GCAT GG AT32P

GCATG AT32P

GCATG AT32P

GCAT32P

GCAT32P

32P32P

G32P

GC A32P

GC ATGA32P

GC AT G GGA GT32P

GC AT G GG CAA GT32P

GC AT G GG CATGA GT32P

G32P

GG32P

GC A32P

GGCC AA32P

GC ATGA32P

GGCC AATTGGAA32P

GC AT G GGA GT32P

GGCC AATT GG GGGGAA GGTT32P

GC AT G GG CAA GT32P

GGCC AATT GG GGGG CCAAAA GGTT32P

GC AT G GG CATGA GT32P

GGCC AATT GG GGGG CCAATTGGAA GGTT32P

G32P

GCAT G GGA GT32P

GCAT G GG CA TGA GT32P

G32P

GG32P

GCAT G GGA GT32P

GGCCAATT GG GGGGAA GGTT32P

GCAT G GG CA TGA GT32P

GGCCAATT GG GGGG CCAA TTGGAA GGTT32P

G G+A T+C C

+

Cette méthode a été adaptée pour séquencer l’ADN génomique sans avoir recours au clonage.

III.2. La méthode enzymatique   «   méthode de Sanger   »  :

Dans cette méthode, la polymérisation de l’ADN est initiée par un petit oligonucléotide (amorce) complémentaire à une partie du fragment d’ADN à séquencer. L’élongation de l’amorce est réalisée par la « séquénase » (une ADN polymérase I dépourvue d’activités exonucléasiques 5’→3’et 3'→5', et 100 fois plus rapide que le fragment de Klenow). Les quatre désoxynucléosides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) sont ajoutés, ainsi qu’en faible concentration les quatre 2'-3'didésoxynucléosides (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) marqués par des fluorochromes différents. Ces didésoxynucléosides, une fois incorporés à la nouvelle chaîne synthétisée, empêchent la poursuite de l’élongation. Il en résulte de nouveaux fragments d’ADN de taille variable, qui sont ensuite séparés par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide.

III.2.1. Le principe de la méthode de Sanger :

Cette méthode a également été développée au début des années 70. Le principe de la méthode repose :

sur l’utilisation de l’ADN polymérase I d’un oligonucléotide complémentaire de la partie d’ADN à

identifier (amorce) d’un mélange de dNTPs (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) dont un sera

radioactif (a32P).

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5’

3’GTACGGGTAGTA

C

CG

G G+A T+C C

d’un ddNTP (didésoxyribonucléoside triphosphate)

« Cette méthode a servi au séquençage du génome humain. »

III.2.2. Les étapes de la méthode de Sanger :

La méthode chimique de séquençage de l’ADN a été largement remplacée par la méthode de Sanger, qui utilise quatre didésoxynucléotides spécifique (ddNTP) pour achever les copies de la matrice, synthétisées de manière enzymatique.

Une amorce de séquençage est appariée à une molécule simple brin matrice et l’ADN polymérase prolonge l’amorce en utilisant des ddNTP. La réaction d’extension est scindée en quatre, chaque quatre est terminé séparément avec l’un des quatre ddNTP spécifique, et les échantillons (habituellement radioactifs) sont analysées par PAGE. Les didésoxynucléotides agissent comme des terminateurs de chaine, car ils ne possèdent pas de groupement 3’OH sur le désoxyribose dont a besoin la polymérase pour prolonger la chaine en croissance.

Le marqueur est incorporé durant l’étape de synthèse (exemple : [α-S35] ddATP, ou l’amorce est d’abord marquée à son extrémité par des colorants fluorescents ou radioactifs. Ces derniers sont utilisés dans certaines séquences d’ADN automatiques bien qu’il soit courant d’utiliser des didésoxynucléotides fluorescent.

La méthode originale nécessite une matrice d’ADN simple brin à partir de laquelle s »effectuera la synthèse des copies complémentaires, ce qui signifie que l’ADN doit être cloné dans le phage M13 avant le séquençage. L’ADN simple brin du phage est apparié à une amorce de 15 à 17 nt, complémentaires à la région proche de la jonction insert-vecteur. Toutes les séquences clonées dans ce vecteur peuvent être séquencées en utilisant cette amorce universelle. Outre l’ajout d’une matrice, une ADN polymérase (habituellement l’ADN polymérase de Klenow ou T7) est ajoutée à l’amorce appariée, avec une petite quantité de [α-S35] ATP, où un atome de soufre remplace un atome d’oxygène sur le phosphate α

(si l’amorce n’est pas marquée). Le mélange est ensuite réparti dans quatre tubes, chacun contenant un terminateur de chaine différent mélangé avec ddNTP normaux (c’est-à dire le tube C contient ddCTP, ddATP, ddCTP, ddGTP et

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ddTTP) dans des proportions spécifiques pour assurer seulement une quantité limitée de terminaison de chaine.

Séparation des brins par thermodénaturation

Chauffage

Séquence d’ADN à déterminer

Domaine à séquencer Domaine déjà connu

5’P 3’OH5’P32

Amorce radiomarquée par P 32 en 5’

ADN polymérase, ADN dépendante

L’enzyme (l’ADN polymérase ADN dépendante) polymérise le brin complémentaire à partir du brin à séquencer. Pour se faire, elle utilise comme substrats les quatre nucléotides triphosphates : Ils assurent également l’apport d’énergie nécessaire à la synthèse

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dATP dTTP

dGTP dCTP

Fractionnement de l’échantillon

ADN + amorce + enzyme+ dATP + dGTP + dCTP + dTTP

Tube1 Tube2 Tube3 Tube4

+ddATP +ddGTP +ddCTP +ddTTP

L’analyse des quatre lots de produits de réaction par PAGE conduit généralement à quelques bandes d’artefacts comme avec le séquençage chimique.

Les résultats de tube1 : résultats de tube2

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O O NO

O

OH

OH

O

P N

NN

NH2

OH

P

O

OH

OH P

O

dATP

Résultats de tube3 résultats de tube4

Cette méthode des déoxynucléotides a été améliorée ; elle peut aujourd’hui être pratiquée en utilisant des matrices doubles brin et des produits de PCR.

Résultats de la lecture finale de la PAGE :

La séquence de l’ADN 

III.2.3   : Avantages et inconvénients  :

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CG 5’

dd

CTCG A G 5’

dd

CTC CG A G 5’

dd

CTC CC G A G 5’

dd

CT CTC CCA G A G 5’

dd

CC T T CTC CCG A G A GA 5’

dd

CG 5’

dd

CCGG 5’

dd

CTCG A G 5’

dd

CTCG A G 5’CCTTCCGG AA GG 5’

dd

CTC CG A G 5’

dd

CCTTCC CCGG AA GG 5’

dd

CTC CC G A G 5’

dd

CCTTCC CCCC GG AA GG 5’

dd

CT CTC CCA G A G 5’

dd

CCTT CCTTCC CCCCAA GG AA GG 5’

dd

CC T T CTC CCG A G A GA 5’

dd

CCCC TT TT CCTTCC CCCCGG AA GG AA GGAA 5’

dd

G 5’dd

CTG A G 5’dd

CT T CTC CCG A G A GA 5’dd

G 5’ddGG 5’dd

CTG A G 5’dd

CCTTGG AA GG 5’dd

CT T CTC CCG A G A GA 5’dd

CCTT TT CCTTCC CCCCGG AA GG AA GGAA 5’dd

5’

3’GTACTAC

CC

GTA

C

CG

Avantages inconvénients Méthode enzymatique

(spécifique) Automatisable

Lecture indirecte de brin Dernier nucléotide in

déterminé

Un domaine doit être connu.

Pyroséquençage : (mini-séquençage luminométrique en temps réel) :

Le Pyroséquençage est une technique de séquençage par synthèse directe d’oligonucléotides. Sa réalisation nécessite l’emploi d’une cascade de 4 enzymes :

La taq polymérase pour l’incorporation des oligonucléotides ( dNTP) ; L’ATP sulfurylase pour catalyser le pyrophosphate inorganique (ppi) en énergie,

source d’ATP. La luciférase pour générer la lumière où le signal fluorescent à partir de l’ATP. La pyrase pour dégrader l’ATP et l’excès de nucléotides non incorporés.

A la différence du séquençage automatique par la technique de Sanger, le Pyroséquençage utilise le 2’ déoxyadénosine-5’-o-(1-triphosphate) ou dATPαS à la place du dATP.ce nucléotide est reconnu à la fois par la polymérase et la luciférase, contrairement au nucléotide d’ATP qui est reconnu seulement par la polymérase.les quatres oligonucléotides sont introduit un par un.

Les différentes enzymes utilisées dans la réaction de Pyroséquençage13

Principe :

Le séquençage par Pyroséquençage est réalisé en 5 étapes :

Etape 1 : l’ADN a analysé est amplifié en présence d’une amorce de séquençage. L’ensemble est ensuite incubé en présence des 4 enzymes :

La taq polymérase, l’ATP sulfurylase, la luciférase et l’apyrase, le substrat l’adénosine 5’ phosphosulfate APS est enfin la luciférine.

Etape 2 : le premier des quatres déoxynucléotides triphosphates (dNTP) est ajouté dans la réaction .l’ADN polymérase permet l’incorporation de ce dNTP dans le brin en cours de synthèse, si ce dernier est complémentaire à la base située dans la séquence à analyser .chaque incorporation de dNTP est suivie d’un relargage d’une molécule de pyrophosphate (ppi). La quantité de (ppi) libéré est proportionnelle à celle de dNTP incorporée.

Etape3 : en présence de l’adénosine 5’ phosphosulfate (APS) l’ATP sulfurylase transforme le (ppi) en ATP en quantité équimolaire. Cet ATP sera utilisé comme substrat par la luciférase lors de la transformation de la luciférine en oxyluciférine et permet l’émission d’un signal lumineux dont l’intensité est proportionnelle à la quantité d’ATP. Ce signal lumineux sera détecté par une caméra CCD reliée au séquenceur et visualisé sous forme d’un pic ou pyrogramme.la hauteur de ce pic sera proportionnelle aux nombres de (ppi) libéré qui est elle-même proportionnelle aux nombres de nucléotides incorporés.

Etape 4 : l’excès de dNTP non incorporés ainsi que l’ATP sont dégradés continuellement par la dernière enzyme de la cascade : la pyrase.

Etape 5 : les dNTP sont introduits l’un après l’autre, selon l’ordre établi. Les dNTP ainsi incorporés forment une séquence qui sera déterminée à partir du signal lumineux spécifique de chaque nucléotide puis capté et enregistré sur le pyrogramme.

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avantages Inconvénients :-la rapidité-les appareils de

-limitation en taille des produits à séquencer.(50 a 100

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Pyroséquençage actuellement disponibles permettent l’analyse à grande échelle grâce à leur formats de plaque de 96 puits.

nucléotides).

Les applications de Pyroséquençage : Analyse de séquences : -étude des profits d’expression des gènes.-typage d’agents pathogènes (bactéries, virus et parasites).-identification de séquence.-séquençage de l’ADN cloné.-étude de l’ADN mitochondrial (mtDNA).-étude de microsatellites.

Autres applications :

-détection de mutations et polymorphismes bi-alléliques.

-étude de la méthylation de l’ADN comme de cas des syndromes de Prader Willi et Angelman.

-étude de la perte d’hétérozygotie.

-détection des gènes de résistance aux antibiotiques et aux antiviraux.

-quantification de fréquence allélique (même les faibles fréquences proches de 5%) pouvant être détecté par ce système.

Conclusion :

La méthode chimique de séquençage de l’ADN a été largement remplacée par la méthode de Sanger.

La séquence d’ADN contient l’information nécessaire aux êtres vivants pour survivre et se reproduire. Déterminer cette séquence est donc utile aussi bien pour les recherches visant à savoir comment vivent les organismes que pour des sujets appliqués.

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Bibliographie   :

Les livres  : Biologie moléculaire Génie génétique L’essentiel en biologie moléculaire 1 L’essentiel en biologie moléculaire 2 Biologie moléculaire fondamentale

Site d’internet  : Wikipédia

Biologie.com

ADN séquence

Diaporama séquence d’ADN Encarta 2008

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