méthodes de séquençage d’adn

BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal

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Méthodes de séquençage d’ADN

Rappel : ADN, Clonage, Électrophorèse

Méthode chimique de Maxam et Gilbert

Méthode enzymatique de Sanger

Détails des techniques utilisées au début des années 1990

Séquençage de grands fragments : marche sur le chromosome, sous-clonage, etc.

Automatisation

Méthode Shotgun


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Rappel sur l’ADN

http://www.dgpc.ulaval.ca/bio90192/chap4/notesadn/notesadn1.htm

Base azotéeDésoxyribose Phosphate


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Enzymes de restriction

http://www.dil.univ-mrs.fr/~vancan/optionBio1/documents/1ercours2003_4.pdf


4

Clonage d’ADN

http://www.sesep.uvsq.fr/formation/strucplasm.JPEG


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Clonage d’ADN

http://www.sesep.uvsq.fr/formation/princlon1.JPEG http://www.fhcrc.org/education/courses/cancer_course/basic/approaches/screening.html


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Principe de l’électrophorèse

http://www.inrp.fr/Acces/biotic/biomol/techgen/html/electro.htm


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Exemple d’électrophorèse


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Méthode de Maxam et Gilbert


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ADN polymérase

5’

3’


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http://www.finnzymes.fi/products/pcr/phusion_high_fidelity_dna_polymerase.htm

Méthode de Sanger


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Méthode de Sanger1. Préparation d’une grande quantité d’ADN (~1g via

miniprep)Dénaturation et ajoût de l’amorce, des 4 dNTP (dont 1 radioactif, S35 ou P32) et de l’ADN polyméraseFaire 4 aliquots et mettre un peu de ddNTP dans chaque tubeElongation et terminaison par incorporation de didéoxynucléotides spécifiques


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Méthode de Sanger5. Préparation du gel du

polyacrylamideDénaturation et dépôt sur gelMigration par électrophorèse

ddGddA ddT ddC


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Méthode de Sanger8. Transfert du gel sur papier filtre

(Whatman 3MM)Séchage du gelCassette autoradiographique (+ écran amplificateur)Développement du film autoradiographiqueLecture sur table lumineuseSaisie sur ordinateur

Longueur typique de lecture : 400 nucléotidesDurée totale de l’expérience : environ 3 jours


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Séquençage de grands fragments

Marche sur le chromosome

10 kpb

Synthèse de 2 * 10 amorcesDurée totale du séquençage : > 11 * 3 joursQualité des séquences Lecture double brin ~ 3 mois


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Sous-clonage

10 kpb

~ 5 enzymes de restriction à 6 nucléotides (HindIII, EcoRI, BamHI, PstI, SmaI)Carte de restriction pour décider quelles enzymes retenirSous-clonage avec BamHI des 8 fragments

BamHI PstI BamHI SmaI BamHI PstI BamHI SmaI BamHI BamHI SmaI EcoRI BamHI

Durée totale du séquençage : ~ 5 * 3 jours


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Digestion avec une exonucléase

10 kpb

2 enzymes de restriction (5’ sortant et 5’ rentrant)

PolylinkerInsert

Plasmide

………

Prélévements toutes les ~30’’, ligation, clonage, séquençage ~10 jours


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Étapes limitantes du séquençageTemps, coûts, difficulté de robotiser :

Obtention de l’ADN (miniprep) Autoradiographie : 12h à des jours Couler les gels Détermination et fabrication des amorces

(marche sur le chromosome) Sous-clonage


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Polymerase Chain Reaction PCR

http://www.rit.edu/~gtfsbi/IntroBiol/images/CH11/figure-11-21.jpg


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Utilisation des fluorochromes

http://www.bioteach.ubc.ca/Bioinformatics/GenomeProjects/

Cycle sequencing


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Utilisation des fluorochromes

http://www.genotype.de/d/p/d_gel_plasmid_prep.htm


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Capillaires

http://www.genomenewsnetwork.org/resources/whats_a_genome/Chp2_2.shtml

http://www.aecom.yu.edu/cancer/new/cores/sequencing/abi3700.htm


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Séquençage par shotgun

http://www.kisac.ki.se/education/slides/data/genomedbs/shotgun.html


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Séquençage par shotgun


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Evolution de la vitesse de séquençage

Année #réactions/personne/semaine

Longueur moyenne de

lecture

#nucléotides/personne/semaine

1977 4 50 200

1980 20 100 2 000

1990 60 300 18 000

1997 180 500 90 000

1999 500 650 325 000

2000 5000 600 3 000 000


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Construction d’une carte de restriction

http://www.cbs.dtu.dk/staff/dave/roanoke/genetics980211.html

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