séquençage - institut optique
TRANSCRIPT
Séquençage
2
Définition
§ Le séquençage de l’ADN est la détermination de la succession des nucléotides le composant.
§ C’est aujourd'hui une technique de routine pour les laboratoires de biologie.
§ Cette technique utilise les connaissances qui ont été acquises depuis une trentaine d'années sur les mécanismes de la réplication de l'ADN.
2
3
Acides Nucléique
3
Acide nucléique = polymère de nucléotides
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Bases
Nucléotides (acide nucléique: Friedrich MIESCHER, 1871)
Phoebus LEVENE, 1919
4
ADN et ARN
4
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3.2 Les acides nucléiques
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IV – A. nucléique
Introduction
I- Molécules inorg
II – Protéines
III – Glucides
Cours G. BARTHOLE, ENS Cachan
3’–5 ’
5
Structure secondaire de l’ADN
§ 1947-1950 Erwin CHARGAFF [Nature 165, 756 (1950)] découvre que chez l’homme les proportions Adénine ≈ Thymine (≈30%) Cytosine ≈ Guanine (≈20%) è peut être expliqué par appariement A-T et C-G
§ 1953 Rosalind FRANKLIN, James WATSON & Francis CRICK
5
, James
Pray, L., Nature Education 1, 100 (2008)
Cliché diffraction X (R. FRANKLIN) montrant une croix caractéristique d’une structure hélicoïdale
6
Appariement
6
Liaisons hydrogène
Pray, L., Nature Education 1, 100 (2008)
Extrémité 5’ (relatif à la position de l’atome de C dans le pentose)
Extrémité 3’
Sens de synthèse: 5’ vers 3’
8
Synthèse des protéines
8
Noyau
Membrane cellulaire
Acide aminé
Protéines
Transcription: ADN à ARNm
Traduction: ARNm à protéine
9
SÉQUENÇAGE 1ÈRE GÉNÉRATION : MÉTHODE DE SANGER
1977
10
Technique de Sanger
§ Frederick SANGER (1918-2013) biochimiste anglais qui a reçu
2 prix Nobel de chimie:
– 1958 : structure des protéines (insuline)
– 1980 : pour le séquençage
§ Les ADN polymérases sont capables de synthétiser un brin complémentaire d'ADN à partir d'un brin matrice.
§ Pour le séquençage, des nucléotides légèrement différents sont utilisés : les didésoxyribonucléotides (ddNTP) au lieu des désoxyribonucléotides triphosphates (dNTP).
10
11
dNTP vs ddNTP § Les ddNTP diffèrent des dNTP par l'absence d'un
groupement OH en position 3’.
§ Ainsi lorsqu'une ADN polymérase utilise un ddNTP, elle n'est plus capable de rajouter le moindre nucléotide à sa suite : la synthèse du brin d'ADN s’arrête.
11
5’ CH2-groupement phosphate
O
1’
3’
base
OH OH présent en 3’ :
dNTP
5’ CH2-groupement phosphate
O
1’
3’
base
H
OH absent en 3’ : ddNTP
12
Protocole (Sanger)
12 12 12 12 12
§ Il faut préparer 4 solutions contenant chacune: – le fragment qui doit être séquencé
– un petit morceau d'ADN dont la séquence est complémentaire à l’extrémité 3' du fragment à séquencer = amorce
– les 4 dNTP's (dCTP, dATP, dGTP, dTTP)
– l'ADN polymérase
https://facmed.univ-rennes1.fr/wkf//stock/RENNES20080328110058vdavidSEquencage.pdf
13
Protocole
§ Dans chaque tube, on met de petites quantités d'un ddNTP fluorescent ou radioactif (32P)
§ L’incorporation aléatoire d’un ddNTP stoppe la synthèse
à On obtient donc à la fin des réactions un ensemble de brins d'ADN de tailles variées, selon l'endroit où un ddNTP se sera inséré.
13
http://wwwarpe.snv.jussieu.fr/coursvt/images_10/sangerprinc.gif
14
Protocole (suite)
Synthèse du brin complémentaire è si arrêt par un ddGTP, c'est qu'il y a une Cytosine dans la séquence
14 https://facmed.univ-rennes1.fr/wkf//stock/RENNES20080328110058vdavidSEquencage.pdf
15
Lecture des brins
28
27
26
25
24
23
22
21
lon
gu
eu
r du
fra
gm
en
t
GTAGGCAT
GTAGGCA
GTAGGC
GTAGG
GTAG
GTA
GT
G
ADN à séquencer 5’-ATGCCTAC-3’
Migration électrophorétique (4 colonnes)
Exemple d’auto- radiographie (marquage 32P) d’un gel d’électrophorèse
3’ 5’ ADN
connu ADN à
séquencer
Amorce (connue) 20 nt synthèse de 5’ vers 3’
5’ 3’
16
Lecture optique des brins
§ Marquage de chaque ddNTP avec un fluorophore différent (disjoint spectralement)
§ Electrophorèse capillaire (machine moderne)
16
Chromatogramme
Avantage: séquençage en une seule réaction au lieu de 4.
http://dc202.4shared.com/doc/ICPFo0Ga/preview.html
17 17 Voir aussi une animation « flash » sur http://www.yourgenome.org/teachers/sequencing.shtml
17 17 17 17 17
Automatisation
18
Exemple d’application
18
Cancer des poumons non à petites cellules: recherche de marqueurs génétiques lié au gène ERBB2.
Recherche de marqueurs génétiques de cancers
Normal (wild type)
Malade
Présence d’une région dupliquée [GCATACGTGATG] de ERBB2, apparaissant dans plusieurs séquences è association avec la maladie
Région dupliquée
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Performances & Limitations
Limitations
§ Si amplification (PCR) avant séquençage: des parties de la séquence du vecteur d’amplification sont retrouvées dans le séquençage Sanger.
§ Erreurs en début de séquence: reconnaissance imparfaite de l’amorce
§ Faible pouvoir de résolution entre séquences qui ne diffèrent en longueur que d’un nucléotide
19
Performances des séquenceurs Sanger modernes § plusieurs centaines d’échantillons simultanément et
un séquençage par heure. § Séquences de longueur 300-1000 nucléotides max
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Autre méthode (2ème génération): le pyroséquençage
Extrait du cours de http://gepv.univ-lille1.fr/
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Pyroséquençage
§ Basé sur un principe de séquençage par synthèse, par opposition au séquençage par « terminaison » (méthode Sanger)
§ Séquençage d’un ADN monobrin par synthèse du brin complémentaire, base par base, en détectant à chaque étape l’activité de la polymérase par une autre enzyme chimiluminescente : la luciférase.
21
22
Pyroséquençage
§ Nucléotides (dNTP) ajoutés les uns après les autres (≠séquençage de Sanger)
22
ACCTTGAATTCGTCCTAGGA----- GATCCT--------
ACCTTGAATTCGTCCTAGGA----- GATCCT--------
Polymérase
dNTP
23
Pyroséquençage
§ Nucléotides (dNTP) ajoutés les uns après les autres (≠séquençage de Sanger)
§ Si c’est le bon nucléotide : incorporation et libération d’un pyrophosphate (PPi)
§ Ppi à ATP par action de l’ATP-sulfurylase
§ L’ATP apporte l’énergie nécessaire à la réaction de conversion de la luciférine par la luciférase. Cette réaction génère de la lumière visible dont l’intensité est proportionnelle à la quantité d’ATP.
§ Une Apyrase dégrade les nucléotides en surplus
23
ACCTTGAATTCGTCCTAGGA----- GGATCCT--------
ACCTTGAATTCGTCCTAGGA----- GGATCCT--------
Polymérase
dGTP
PPi
PPi
24
Pyroséquençage
§ Nucléotides (dNTP) ajoutés les uns après les autres (≠séquençage de Sanger)
§ Si c’est le bon nucléotide : incorporation et libération d’un pyrophosphate (PPi)
§ PPi à ATP par action de l’ATP-sulfurylase
24
ACCTTGAATTCGTCCTAGGA----- GGATCCT--------
ACCTTGAATTCGTCCTAGGA----- GGATCCT--------
Polymérase
PPi
ATP
ATP-sulfurylase
dGTP
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Pyroséquençage
§ Nucléotides (dNTP) ajoutés les uns après les autres (≠séquençage de Sanger)
§ Si c’est le bon nucléotide : incorporation et libération d’un pyrophosphate (PPi)
§ PPi à ATP par action de l’ATP-sulfurylase
§ L’ATP apporte l’énergie nécessaire à la réaction de conversion de la luciférine par la luciférase. Cette réaction génère de la lumière visible dont l’intensité est proportionnelle à la quantité d’ATP.
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ACCTTGAATTCGTCCTAGGA----- GGATCCT--------
ACCTTGAATTCGTCCTAGGA----- GGATCCT--------
Polymérase
PPi
ATP
Luciférase
Lumière
ATP-sulfurylase
dGTP
+ Luciférine
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Pyroséquençage
§ Nucléotides (dNTP) ajoutés les uns après les autres (≠séquençage de Sanger)
§ Si c’est le bon nucléotide : incorporation et libération d’un pyrophosphate (PPi)
§ PPi à ATP par action de l’ATP-sulfurylase
§ L’ATP apporte l’énergie nécessaire à la réaction de conversion de la luciférine par la luciférase. Cette réaction génère de la lumière visible dont l’intensité est proportionnelle à la quantité d’ATP.
§ Une Apyrase dégrade les nucléotides en surplus
26
ACCTTGAATTCGTCCTAGGA----- GGATCCT--------
ACCTTGAATTCGTCCTAGGA----- GGATCCT--------
Polymérase
dNTP
Apyrase
dNMP
PPi
ATP
Luciférase
Lumière
ATP-sulfurylase
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Implémentation« technologie 454 »
454 sequencing (Roche Diagnostics)
Intégration de plusieurs techniques de haute technologie:
– pyroséquençage,
– plaques picotitres en fibre optique (1,6 millions de puits)
– PCR en émulsion (emPCR) dans des microréacteurs (300 000 réactions de PCR en parallèle)
– Traitement des images… 27
Pyroséquençage vs. Sanger § 100 fois plus rapide et meilleurs marché. § fragments séquencés plus courts (mais en progression)
28
Emulsion based clonal amplification
28 28 28 28 28 28
http://classes.soe.ucsc.edu/bme215/Spring09/PPT/BME%20215-5.pdf
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Dépôt des billes dans une plaque multi-puits
29
400 000 réactions de séquençage en parallèle
http://www.biopsci.com/2012/02/22/sequencage-de-ladn-la-revolution-est-de-nouveau-en-marche/
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Exemple de machine « 454 » Roche « GS FLX System + »
30
Séquençage de 100 à 400 Mbases en 7 heures (par machine)
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Séquençage du génome complet
31
32
Séquençage d’un génome complet
§ Partie séquençable du génome humain : 2,9 Gpb ! – Impossible à lire en une fois
– Les biologistes ne savent de toute façon pas manipuler des ADN aussi longs
– Cependant, possible de séquencer « assez vite » avec les nouvelles technologies.
Ø Principes de base du séquençage d’un génome : 1. Fragmentation aléatoire en gros morceaux
2. Séquençage des extrémités des morceaux
3. Reconstruction en utilisant des fragments qui se chevauchent
32
33
Parallélisation
33 Nature 409, 860-921(15 February 2001)
Library factory -Whitehead Institute
Sequencing factory -Sanger Institute
« Usine » de séquençage (Sanger Institute, UK)
« Usine » créant une banque de chromosome bactérien artificiel (BAC) au Whitehead Institute (MIT, USA)
Nature 409, 860 (2001)
34
Séquençage aléatoire global
§ Il faut beaucoup de séquences chevauchantes à Certaines régions seront séquencées de nombreuses fois
à Malgré cette redondance, il reste des trous…
§ Génome fragmenté en plusieurs morceaux de petite taille
§ Séquençage des fragments
§ Reconstruction
34
Ex: Haemophilus influenzae (1ère bactérie séquencée)
• 1,8 Mb réduits par cassage mécanique en une banque de fragments de 2000 pb environ
• 20 000 fragments séquencés (à 1 ou 2 extrémités)
• 24 000 lectures retenues dune longueur moyenne de 470 pb
• à 11,6 Mpb séquencées soit 6,3 fois le génome, et il restait des trous !
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Séquençage clone par clone
35
Nature 409, 860 (2001)
Séquençage Sanger
Recouvre-ments
1. Chromosome bactérien artificiel (BAC): clone de 100-200 kb
2. Carte physique ordonnant les clones
3. Séquençage
des petits fragments (100-1000 bp)
Résumé: http://www.snv.jussieu.fr/vie/dossiers/genomes/methodes_resume.htm
37
repères chronologiques
37
1977 ϕ X147 virus bactérien
5386 nt 11 gènes
ADN simple brin circulaire
1984 HIV rétrovirus
1995 Haemophilus influenzae
bactérie 1.8 Mbp 1740 gènes
1997 Saccharomyces cerevisae
levure 13 Mpb 6275 gènes
1997 Escherichia coli bactérie 4,6 Mpb
1998 Caenorhabditis elegans
animal 97 Mpb
2000 Arabidobsis thaliana
végétal 157 Mpb
+ riz plante alimentaire
430 Mpb céréale avec le + petit génome
2002 souris 2,5 Gpb 90% de gènes en commun avec nous
2007 poisson zèbre 1,7 Gpb
38
Projet génome humain
38
1988 Human Genome Organisation
1992 1ere carte du génome humain
1999 séquençage du premier chromosome humain (22)
2001 Achèvement du séquençage brut
2005 Projet métagénome humain
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ZERO-MODE-WAVEGUIDES Pacific Biosciences
39
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Principe
§ Séquençage par détection de l’incorporation de nucléotides fluorescents.
§ Détection à l’échelle de la molécule unique.
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41
Microscopie de fluorescence en molécule unique : microscopie confocale
41
laser d’excitation
scanner (x,y,z)
objectif
miroir dichroique
lentille de tube
photodétecteur
42
Microscopie de fluorescence en molécule unique : TIRFM
§ en réflexion totale (total-internal reflexion fluorescence microscopy ou TIRFM)
42
Objectif ON=1,45
Faisceau d’excitation
Signal de fluorescence
huile lamelle
onde évanescente
fluorescents
43
Microscopie de fluorescence en molécule unique : volumes élémentaires d’excitation
§ en réflexion totale (total-internal reflexion fluorescence microscopy ou TIRFM)
§ confocale
43
Objectif ON=1,45
Faisceau d’excitation
Signal de fluorescence
huile lamelle
onde évanescente
fluorescents
Volume élem. d’excitation 10
0nm
1,22 /ON 1,22 /ON
4n /ON2
Vélem =0,02 fL
ON=1,45 =550nm
Vélem =0,16 fL
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Conséquence sur la concentration en espèces marquées
§ Si plus d’une molécule fluorescente par volume élémentaire d’excitation : on ne voit plus rien
§ Concentrations max atteignables : 100 nM en TIRFM et 10 nM en confocal
§ Concentrations physiologiques: – dATP, 24±22 µM – dGTP, 5.2±4.5 µM – dCTP, 29±19 µM – dTTP 37±30 µM
44
proximating the profile as constant across thediameter of the waveguide thus reduces ouranalysis to a one-dimensional problem interms of the intensity as a function of depthinto the waveguide, I(z).
Although the function I(z) describes howeffectively a fluorophore at a given depth inthe waveguide is excited, the coupling offluorescence back out of the waveguide,where it can be detected, also needs to betaken into account. Finite-element simula-tions of dipoles with horizontal and verticalorientations at various depths within thewaveguide demonstrated coupling efficien-cies that decayed exponentially with increas-ing dipole depth inside the guide. Appropri-ate averaging over all dipole orientationsyields p(z), the dipole coupling efficiency asa function of dipole depth in the waveguide.As with the illumination profile, the couplingefficiency was only a weak function of lateralposition within the waveguide.
Kleppner (23) showed that metal-cladwaveguides used at or above the cut-offwavelength can have a profound effect onradiative rates. This change in radiative ratewill affect the quantum yield of the fluoro-phore and therefore the shape of the observa-tion volume. In general, the radiative rate of adipole is proportional to the density of pho-tonic states available for emission at the ap-propriate frequency (24, 25). A detailed cal-culation of changes to the radiative rate as afunction of position in zero-modewaveguides is beyond the scope of this paper.However, for our current purpose we willmake the approximation that the photon den-sity of states, and hence the radiative rate, isproportional to the output coupling from thewaveguide and therefore proportional to p(z).The fluorescence quantum yield, Q, is a func-tion of the radiative and nonradiative rates ofdipole de-excitation, kr and knr, such that
Q(z) !kr(z)
kr(z) " knr#
p (z)p(z) " C (2)
where C is a constant such that Q(0) equalsthe quantum yield at the entrance of thewaveguide.
Quenching by bare metal could contribute to
knr. However, any oxide layer on the metalsurface, as is expected with aluminum, preventsdiffusing dye from direct contact with the metal.Any quenching of dye is also likely to be inde-pendent of the depth within the waveguide andtherefore would not strongly affect Q(z).
The effective observation profile, S(z), istherefore described by the product of theexcitation and collection efficiencies and thequantum yield as a function of depth in thewaveguide,
S(z) ! I(z)p(z)p(z)
p(z) " C (3)
and the effective observation volume, Veff, isgiven by (26)
Veff !$d 2
4%ʃS% z&dz&2
ʃS 2(z)dz (4)
for a waveguide of diameter d. S(z) decaysfast enough to limit the volume of observa-tion to the first 10 or 20 nm into thewaveguide, depending on the diameter of theguide (Fig. 2B). Veff is shown as a function ofd in Fig. 2C, as well as the correspondingconcentration at which there is, on average,one molecule in the observation volume atany given time. Volumes as small as 10zeptoliters, more than four orders of magni-tude smaller than the diffraction limit, arepossible. Thus, for the smallest waveguides itis possible to work at concentrations as highas 200 'M and still have less than one mol-ecule per volume.
Arrays of zero-mode waveguides weremanufactured as small holes in an 89-nm thickfilm of aluminum on fused silica coverslips(Fig. 3). Holes of various diameters were pat-terned with the use of electron beam lithogra-phy followed by reactive ion etching (22).
FCS was used to characterize the observa-tion volume inside the waveguides and to dem-onstrate their usefulness for high-concentrationFCS and cross-correlation. One-dimensionalFCS curves can be derived from the profile S(z)with the use of either a Fourier (27) or a Laplace(28) transform, assuming nonstick boundaryconditions, resulting in the expression for theautocorrelation function G(()
G%(&)!v
L
* "!S% z&cos%vz&dz# 2
e ! v2D(dv (5)
where D is the diffusion coefficient of thefluorophore and ( is the correlation delaytime. The integration over spatial frequen-cies, +, is conventionally taken from zero toinfinity. However, in this case spatial fre-quencies corresponding to lengths longerthan the length of the waveguide, L, areexcluded, because correlations over thislength scale will not be observed as mole-cules diffuse into the large external volumeoutside of the guide.
FCS curves taken with the use of the fluo-rescently tagged deoxycytidine triphosphateR110-dCTP (Amersham Biosciences) areshown in Fig. 4, A and B. This dye was chosenfrom our ongoing development of a single-mol-ecule DNA sequencing technique. The datashow good signal-to-noise characteristics. Anypotential decrease in the signal-to-noise ratiodue to the short diffusion time has been com-pensated for by the increased number of diffu-sion events at high concentrations. The diffusioncoefficient and quantum yield of R110-dCTPwere found independently to be 2.24 , 10-6
cm2 s-1 and 77%, respectively (22). These pa-rameters were used to derive G(() forwaveguides of various diameters with the as-sumption that the quantum yield at the entranceof the waveguide is the same as that for thefreely diffusing dye. Fits to a 43-nm wave-guide for various concentrations of fluorophoreare shown in Fig. 4A; for comparison, a curvefrom a conventional, diffraction-limited volumeusing a dye concentration of 4 nM is alsoshown. Zero-mode waveguides increasedthe usable concentration range by well overthree orders of magnitude.
The value of G(0) scales as expected withconcentration; however, a nonfluctuatingbackground, B, from the large pool of highlyconcentrated dye on the opposite side of thewaveguide can affect the measured value ofG(0) such that
G(0) !N
(N " B)2
Fig. 3. A fused silica coverslip with zero-mode waveguides arrays. (A) Thecoverslip, with overlying gasket to isolate arrays for individual experi-ments. Successive increases in scale are shown in (B) to (D). A scanning
electron microscope image of an individual waveguide is shown in (D).The bright spots in (C) correspond to defects in the metal film. The largebright pattern in the upper right corner is a coded orientation marker.
R E P O R T S
31 JANUARY 2003 VOL 299 SCIENCE www.sciencemag.org684
Levene, M. J. et al., Science 299, 682–686 (2003).
è Il faut réduire le volume d’excitation ! T. Traut, Mol. Cell.
Biochem.,140,1 (1994)
45
Guide d’onde sans mode (zero-mode wave guide)
45
On montre que pour > c=1.7d
pas de mode propagatif TE11
building “lab-on-a-chip” systems for low-cost, high-throughput analytical biochemistry(16–18). Here, we demonstrate a nanostruc-tured device, the zero-mode waveguide, forhighly efficient single-molecule analysis athigh fluorophore concentrations and its appli-cation to enzyme analysis.
Metal-clad waveguides exhibit a cut-offwavelength above which no propagatingmodes exist inside the waveguide. This cut-off wavelength is related to the shape and sizeof the guide. For a circular guide of diameterd clad with a perfect conductor, light will beabove the cut-off wavelength, !c, for thelowest frequency mode, transverse modeTE11, if d ! 0.586!m, where !m is the wave-length in the medium composing the core ofthe waveguide (19). Longer wavelengths(!m " !c # 1.7d) are evanescent and theirintensity, I(z), decays exponentially along thelength (z) of the guide as I(z) # e$z/%, where
1%
" 2! 1!2 #
1!m
2 (1)
Because no propagating modes exist, werefer to these guides as “zero-modewaveguides.” The rapid decay of illuminationincident to the entrance of such guides canprovide zeptoliter-effective (1 zeptoliter #10$21 l) observation volumes within theguides. Zero-mode waveguides are opticallyefficient compared to NSOM, because theilluminating light is used near the entrance ofthe guide, before substantial attenuation oc-curs, whereas NSOM uses typically 0.1% ofthe incident light because of attenuationthrough the aperture.
A particularly simple implementation of ze-ro-mode waveguides consists of small holes ina metal film deposited on a microscope cover-slip. In this case, the metal film acts as thecladding, and the contents of the hole composethe core of the waveguide. Millions of suchholes can be made on a single coverslip, result-ing in massive parallelism. For direct observa-tion of single-molecule enzymatic activity, en-zymes can be adsorbed onto the bottom of thewaveguides in the presence of a solution con-
taining the fluorescently tagged ligand mole-cules. The coverslip is illuminated through amicroscope objective from below, and the flu-orescence is collected back through the sameobjective (Fig. 1). In this case, the observedsignal consists of fluorescence from the ligandmolecule that is in the active site of the enzyme.This signal must be distinguished from a back-ground of freely diffusing fluorescent ligandwithin the waveguide’s observation volume.The limited dimensions of the observation vol-ume reduce the number of observable diffusingmolecules and the correlation time of the result-ing fluorescence fluctuations, allowing for easydiscrimination of the signal from background.
Zero-mode waveguides can also be usedfor high-concentration FCS and cross-corre-lation experiments. Cross-correlation of thefluorescence from distinctly labeled, freelydiffusing analytes is a powerful technique formonitoring binding efficiencies and for high-throughput drug screening (20, 21). As withconventional FCS, the cross-correlation tech-nique works best with only a few molecules,on average, per observation volume. Zero-mode waveguides would therefore allow thistechnique to be performed at higher, morephysiologically relevant concentrations.
In order to guide the design of zero-modewaveguides and to derive the shape and sizeof their effective observation volumes, it isnecessary to know the intensity distributioninside the waveguide. For waveguides with d&& !m and real metal cladding, the skin depthhas a strong effect on the solution to Max-well’s equations, and numerical solutionsmust be found. Hence, we have performedthree-dimensional finite-element time-do-main simulations of the intensity distributionwithin the guides (22). A cross section of thesimulation results for a 50-nm-diameterwaveguide is shown in Fig. 2A. We foundthat circularly polarized incident light pro-vides a more uniform illumination profileacross the diameter of the waveguide as com-pared to that of linearly polarized light. Ap-
Fig. 1. An apparatusfor single-molecule en-zymology using zero-mode waveguides.
0
-1
-2
-3
-4
-100 -50 0 50 100
0
50
100
150
-50
Fused Silica
Solution
Al Al
nm
nm
CBA
Fig. 2. (A) Three-dimensional finite-element time-domain simulation of the intensity distribution (log scale) for a zero-mode waveguide 50 nm indiameter and 100 nm long. (B) S(z) curves for different waveguide diameter, d. (C) Veff and the corresponding concentration for which there is, onaverage, one molecule in the volume (&N" # 1).
R E P O R T S
www.sciencemag.org SCIENCE VOL 299 31 JANUARY 2003 683
Onde evanescente
d
Aluminium
z
0 I(z) = I0e
�z/⇤
guide d’onde sans mode (50 nm x100 nm)
z
⇤
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Des nanostructures pour confiner le volume d’excitation
46 Levene, M. J. et al., Science 299, 682–686 (2003).
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… au séquençage d’un ADN unique
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… au séquençage d’un ADN unique
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Résumé animé
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https://www.youtube.com/watch?v=WMZmG00uhwU&list=UU2y78sjVOumGc2da1tN629g
SMRT = single molecule real time
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Sources § Merci à François Treussart (ENS Cachan) pour avoir amélioré ce cours
§ Animation séquençage de Sanger : http://www.yourgenome.org/teachers/sequencing.shtml
§ Transparents sur le séquençage de Sanger : http://www.dil.univ-mrs.fr/~vancan/optionBio1/cours.html#htoc15 (cours de Sophie Bleves)
§ Pyroséquençage : voir http://gepv.univ-lille1.fr/
§ technologie 454 : http://classes.soe.ucsc.edu/bme215/Spring09/PPT/BME%20215-5.pdf et http://www.biopsci.com/2012/02/22/sequencage-de-ladn-la-revolution-est-de-nouveau-en-marche/
§ Les technologies de laboratoire n°5 juillet-août 2007 « Evolution des techniques de séquençage » § T4 : photo issue de http://en.wikipedia.org/wiki/Frederick_Sanger
§ T5 : schéma issu de http://www.mun.ca/biology/scarr/iGen3_02-07.html
§ T7 : schéma inspiré de http://www.biology.arizona.edu/biochemistry/problem_sets/large_molecules/06t.html
§ T9 & T11 : schémas issus de https://facmed.univ-rennes1.fr/wkf//stock/RENNES20080328110058vdavidSEquencage.pdf
§ T12 : http://dc202.4shared.com/doc/ICPFo0Ga/preview.html
§ génome humain : http://www.snv.jussieu.fr/vie/dossiers/genomes/methodes_intro.htm
§ T29-30 cf http://www.universalis.fr/encyclopedie/sequencage-d-adn-reperes-chronologiques/
§ zebra fish : http://www.zmescience.com/medicine/mind-and-brain/zebrafish-locomotion-human-evolution-942333/ et Ferris State University
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