lp11 adn recombinant

7/25/2019 LP11 ADN Recombinant

1/12

Capitolu l 11

181

TEHNOLOGIA

ADN RECOMBINANT

Descifrnd enigmele structurii genelor, savanii aunceput s se preocupe de izolarea i sinteza lor. n urm cu 30de ani cei care credeau n reuita acestor deziderate erau puini inimeni nu bnuia explozia actual a ingineriei genetice iconsecinele cu adevrat extraordinare pe care le va avea.

Primii pai au fost fcui deBeckwithi Shapiro, care n1969 au izolat i fotografiat operonul lactozei. Un an mai trziuG. Khorana reuete sinteza artificial a primelor gene de

procariote. Cu aceeai tehnic se sintetizeaz gena ce codificsomatostatinaun hormon hipofizar (1977). Dup descoperireatranscriptazei inverse se reuete sinteza altor gene de mamifere(pentru hemoglobin, ovalbumin, insulin etc.). Geneleobinute nu erau ns active, deoarece nu aveau un sistempropriu de replicare, nici secvenele necesare declanriitranscripiei i apoi a sintezei proteinelor pe care le codific.

Aceste dificulti au fost depite, introducnd genele artificialen plasmidele unor bacterii sau virusuri. Pentru inseria genelorn plasmide se folosesc enzime speciale care taie ADN n locurispecificeenzime de restricie (Premiul Nobel, 1978).

Realizrile ingineriei genetice au un mare interes teoretici practic incontestabil. Izolarea sau sinteza genelor a dus laobinerea artificial a unor produi naturali de mare valoare(insulina, somatostatina, interferonul), dar speranele justificate

11


2/12

Capitolu l 11

182

pe care savanii i le pun n acest domeniu sunt mult mai mari.Nu este vorba numai de o nou industrie farmaceutic care sproduc antibiotice, hormoni, vaccinuri antivirale ci i de

posibilitile reale de a realiza o terapie cauzal terapiegenic, corectnd genele mutante sau nlocuindu-le i rezolvnd,astfel, marea problem a incurabilitii bolilor genetice.

Actualmente exist toate posibilitile tehnice pentrustudierea direct sau indirect a acizilor nucleici purttori aimesajului ereditar. Gena de interes poate fi extras dinorganism, supus unor modificri structurale, introdus n altorganism, poate fi obinut produsul ei proteic. Toate procedeelemanipulrii acizilor nucleici se reunesc n termenul genetic tehnica ADN recombinant.

Pentru studiul acizilor nucleici sunt necesare urmtoareleprocedee:

- extragerea i purificarea moleculelor de ADN (sau ARN)din celule;

- izolarea fragmentului de ADN de interes;

-

multiplicarea fragmentelor izolate;- analiza secvenelor de interes (determinarea succesiunii

bazelor, determinarea expresiei, determinarea poziiei ngenom).

Izolarea acizilor nucleici

Pentru analiza ADN poate fi utilizat orice celulnucleat, indiferent de esutul din care face parte (de ex., la ompot fi folosite celulele dintr-o pictur de snge, din saliv, firede pr, esut epitelial, etc.).

Pentru izolarea fragmentelor de ADN se utilizeazmetode biochimice care includ lizarea celulelor, denaturarea

proteinelor, nlturarea proteinelor prin prelucrarea cu proteaze,centrifugarea difereniat, purificarea cu solveni organici.


3/12

Capitolu l 11

183

Pentru izolarea unei anumite moleculele de ARNm se

utilizeaz celulele esuturilor n care are loc expresia geneirespective (de ex., ARNm pentru insulin poate fi izolat doar din

celulele ale pancreasului; ARNm pentru globinedin celuleleeritroblatilor etc.).

Obinerea fragmentelor de interes

n ADN genomic secvenele codificatoare alterneaz cucele necodificatoare. Pentru izolarea fragmentului ADN de

interes pot fi aplicate dou ci:- direct, prin clivarea enzimatic a moleculelor de ADN

genomic i selectarea fragmentelor de interes;- indirect, prin obinerea ADN complementar (ADNc) pe baza

ARNm.

Restricia ADNClivarea enzimatic a moleculelor de ADN se efectueaz

cu ajutorul unor enzime de restricie (ER) care recunosc

secvene specificedublucatenare, numite situsuri de restricie.

Fig. 11.1. Clivarea ADN cu enzime de restricie. Producerea

fragmentelor cu capete adezive i neadezive


4/12

Capitolu l 11

184

ER sunt enzime ntlnite la procariote care, n natur,sunt responsabile de clivarea ADN-ului exogen (de ex., ADN

virual). SR reprezint nite succesiuni specifice formate, de

regul, din 4-6-8 pb ce formeaz palindroame (fig. 11.1).Secvenele respective n ADN-ul gazdei sunt metilate i nu potfi recunoscute de ER proprii.

Ca rezultat al aciunii diferitor ER se pot obinefragmente de ADN cu capete monocatenare adezive (lipicioase)sau cu capete neadezive.

ADN-ul din genomul eucariotelor (inclusiv genomul

uman) conine diferite SR dispersate la ntmplare de-a lungulmacromoleculei. Utiliznd ER pot fi obinute fragmente deADN cu lungimi diferite. Comparnd fragmentele de restriciese poate construi harta de restricie a moleculei de ADN localizarea SR pentru diferite restrictaze.

Sinteza ADNc

Din esuturi se izoleaz setul de ARNm specific. Pe bazaARNm cu ajutorul reverstranscriptazei (ADN-polimeraza-ARN-dependent) se sintetizeaz molecule complementare deADN (ADNc). ADNc se deosebete de ADN genomic prinlipsa intronilor i este identic cu secvena exonilor.

Sinteza ADN complementar include mai multe etape

(Fig. 11.2):

(1) izolarea ARNm;

(2)

adugarea secvenelor oligo(dT) care servesc n calitatedeprimer pentru polimerizare;

(3) enzima reverstranscriptaza sintetizeaz o catencomplementar de ADN pe baza matriei de ARN;reverstranscriptaza formeaz o bucl la captul 3' al cateneiADNc;

(4) hidroliza ARNm;


5/12

Capitolu l 11

185

(5) sinteza catenei complementare a ADNc, bucla servind ncalitate de primer pentru ADN-polimeraz;

(6) nlturarea buclei cu ajutorul nucleazei S1.

Clonarea ADN

Procesul de obinere a unui numr mare de copii asecvenei ADN de interes cu utilizarea tehnicilor ADNrecombinant poart denumirea de clonare. Procesul poate firealizat att in vivo , ct i in vitro(PCR).

Fig. 11.2. Obinerea ADNc


6/12

Capitolu l 11

186

Clonarea ADN n vivo

Clonarea ADN n vivoconst n izolarea unui fragmentde ADN, introducerea lui prin ligare ntr-un vector i

multiplicarea lui ntr-o celul gazd.Vectorii de clonare sunt molecule de ADN care se

replic independent de cromozomul celular, chiar i atunci cndsunt introduse artificial n structura lor fragmente de ADNstrin. Pentru replicare vectorul are nevoie de dou elemente:punctul ORI de iniiere a replicrii i gena pentru proteinele SSBcare pregtesc matria pentru replicare. n calitate de vectori seutilizeaz plasmidele R, bacteriofagul , virusul simian SV-40,cosmidele, cromozomii artificiali bacterieni (BAC), cromozomii

artificiali ai drojdiilor (YAC), etc. Selectarea vectorului de

clonare se face n funcie de dimensiunile fragmentuluimultiplicat: fragmentele mici de pn la 15 kb pot fi clonate nplasmide, fragmentele cu o lungime de pn la 50 kb ncosmide i bacteriofagi, fragmentele mai mari de 300 kbpot ficlonate n cromozomii artificiali BAC sau YAC.

n calitate de gazd de clonare sunt utilizate: celulabacterian (pentru plasmide, cosmide, bacteriofagi, BAC),celulele drojdiilor (pentru plasmide, YAC), celulele vegetale

(plasmide, virusuri), celulele animale (virusuri). Exist vectoricare se pot replica n mai multe gazde vectorii navet.

Moleculele hibride formate din ADN vector i ADNpentru cercetare poart denumirea ADN recombinant. ObinereaADN recombinant necesit urmtoarele procese (fig. 11.3):-

izolarea ADN pentru clonare (o secven de ADN sau ogen) i selecia vectorului de clonare;

- clivarea ADN de interes i a vectorului cu aceeai enzim derestricie ce produce capete adezive;

- introducerea secvenei de ADN n vector prin ligareafragmentelor rezultate din digestia cu ER cu ajutorul enzimei


7/12

Capitolu l 11

187

ADN-ligaza. ADN-ligaza unete complementar capeteleadezive ale fragmentelor prin legturi fosfodiesterice.

Moleculele recombinate se introduc n gazda de clonare.Dup un anumit timp, datorit replicrii independente avectorului se obin copii numeroase ale genei de interes.Moleculele recombinate sunt izolate din celula-gazd purificate,dup care fragmentul de interes se extrage cu ajutorul aceleai

ER.Clonele ADN obinute pot fi utilizate pentru

determinarea structurii primare, cartarea restrictiv, producereasondelor moleculare, analiza funciei genelor corespunztoare,sinteza proteinelor solicitate (de ex., insulina, somatotropina,

interferonul etc.).

Fig. 11.3. Clonarea fragmentelor de ADN n vectori plasmidici


8/12

Capitolu l 11

188

Amplificarea ADN in vitro

Reacia de polimerizare n lan (PCR Polimerase

Chain Reaction) reprezint tehnica de amplificare in vitro asecvenelor de ADN aplicnd fenomenul de hibridare ADN-ADN i proprietatea de replicare semiconservativ. Hibridarease produce dup recunoaterea specific a unor fragmentenucleotidice de pe o caten a ADN-ului de interes, de ctre nitesecvene scurte de ADN, numite primeri. Primerii iniiazsinteza catenelor complementare de ADN care se realizeaz cu oADN-polimeraz termorezistent (Taq-polimeraza).

PCR decurge prin succesiunea ciclic a urmtoareloretape (Fig. 11.4):

1. denaturarea ADN prin nclzire la o temperatur ~960C;2. legarea primerilor la temperatura de renaturare ~500C;

3. elongarea fragmentelor complementare la temperatura

720C.

Aceste etape se repet de 25-35 ori. Produsele din ciclul

anterior servesc ca matrie pentru sinteza noilor catene (astfel nI ciclu dintr-o molecul de ADN de interes se obin 2 molecule,n ciclul II 4 molecule, n ciclul 3 8 molecule etc., dup 30cicluri se obin peste 1 mlrd copii).

Biblioteci de ADN

Coleciile fragmentelor de ADN clonate dintr-o celul,

esut sau organism formeaz bibl ioteci de ADN. Acestea suntutile pentru identificarea genelor solicitate.

Biblioteca genomicColecia de clone ce conine cel puin o copie a fiecrei

secvene de ADN al genomului se numete bibliotec


9/12

Capitolu l 11

189

Fig. 11.4. Principiul PCR


10/12

Capitolu l 11

190

genomic. O bibliotec genomic este util pentru a gsi i izolao gen de interes prin screeningul cu sonde specifice.

Bibliotecile genomice se obin prin dou tehnici:

1. ADN genomic este digerat complet cu o enzim derestricie, iar fragmentele rezultate sunt clonate fie printr-unvector derivat din bacteriofagul , fie ntr-un vector cosmidic. 2. O alt cale este digestia parial cu ER, care recunoscsecvene de 4 pb. Prin digestie parial doar o parte din SR estetiat de ER.

Biblioteci cromozomiale

Dimensiunea genomului uman este att de mare, nctsunt necesare mii de clone pentru a reprezenta ntregul genom.De aceea sunt obinute biblioteci ADN pentru fiecare cromozomn parte bibl ioteci cromozomiale. Pentru om sunt necesare 24de biblioteci diferite. Deci, dac o gen este localizat pe uncromozom cunoscut cu metode genetice, cercetarea va fi limitat

la biblioteca acelui cromozom.Izolarea cromozomilor este posibil datorit dimensiunii

i morfologiei diferite ale cromozomilor, care pot fi separai cuajutorul citometriei n flux. Acum sunt disponibile bibliotecipreparate din toi cromozomii umani.

Biblioteci de ADNc

Colecia de clone obinute pe baza ADN complementarse numete bibliotec ADNc. Fiind sintetizat pe matriamoleculelor de ARNm, ADNc va corespunde numai genelor

aflate n stare de activitate transcripional, reproducnd doargenele funcionale specifice celulei respective. ADNc esteclonat n vectori plasmidici sau n vectori derivai dinbacteriofagul . Spre deosebire de fragmentele obinute prin


11/12

Capitolu l 11

191

digestie cu ER, moleculele de ADNc nu posed capete adezive,de aceea pentru introducerea n vector la moleculele de ADNc seadaug adaptori care conin capete adezive.

Hibridarea acizilor nucleici

O proprietate natural a acizilor nucleici este capacitateade hibridizare. Hibridrile de acizi nucleici constau di unirea adou fragmente monocatenare n structuri bicatenare stabile ncondiii adecvate de temperatur, concentraie ionic i pH.Hibridarea este condiionat de complementaritatea secvenelorde baze azotate, componente ale celor dou catene. Dincomplementaritate rezult i omologia de mperechere.

Tipuri de hibridare:

1. ADN ADN n care sonda este una dintremonocatenele de ADN;

2. ARNADN unde sonda este reprezentat de una dincele dou catene ale heteroduplexului.

Una din cele mai importante aplicaii ale fenomenului dehibridizare este obinerea sondelor moleculare. Sondelemoleculare sunt fragmente de ADN sau ARN marcate sau nu

(radioactiv), care prin fenomenul de hibridare pot recunoate nmod complementar fragmente de interes, pe o molecul deacid nucleic destinat cercetrii.

Din punct de vedere aplicativ, sondele nucleare

reprezint cile de acces direct la nivelul ADN, acestea putnd

detecta unele gene mutante, chiar n stadiul prenatal.Tipuri de sonde moleculare:

1. sonde calde marcate radioactiv cu izotopi de 32P sau 35Scare sunt foarte sensibile, dar au o durat scurt de via isunt periculoase pentru cei ce le manipuleaz; sevizualizeaz prin autoradiografie (impresie pe filmulfotografic);


12/12

Capitolu l 11

192

2. sondele reci fragmente de acid nucleic, marcate cu unprodus chimic neutru: direct, cu enzime sau fluorocromi sau

indirect, cu biotin. Se vizualizeaz n funcie de tipul de

marcaj. Dei sunt mai puin sensibile, au avantajul de a fiinofensive pentru cercettor.

Verificarea cunotinelor:

1. Definii noiunile: ADN recombinant, clonare, vector declonare, enzim de restricie, situs de restricie, ADNc,bibliotec ADN, fragmente de restricie, sond molecular,hibridare.

2.

Care sunt etapele obinerii genei de interes dintr-o celul?3. Ce proprieti au enzimele derestricie?4. Ce vectori de clonare cunoatei? Prin ce se deosebesc?5. Care sunt etapele obinerii ADNc?6. Ce importan are clonarea ADN?7. Care este destinaia bibliotecilor ADN?8. n ce const hibridarea ADN?

9.

n ce scopuri se utilizeaz sondele moleculare?

lp11 adn recombinant

Documents