les puces à adn

Les Puces a ADN

République Algérienne Démocratique et PopulaireMINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERGHE

SCIENTIFIQUE UNIVERSITE HASSIBA BEN BOUALI CHLEF

Biotechnologie Microbienne L3 Module :Biologie Moléculaire

Présenté par:-BOUREZAK RABIAA-NAWEL-HADJ BEN ELEZAAR ASMA

Dirigé par:-Mm . NAHAL

2015/2016

Introduction

Historique

Définition des puces à ADN

Les différents types de puces à ADN

Principe

Notre plan de présentation

Les étapes de construction

Fonctionnement des puces a ADN

Domaines d’utilisation

Les avantages et les inconvénient

Conclusion

Notre plan de présentation

Le concept de puce à ADN repose sur une technologie multidisciplinaire intégrant la biologie, la nanotechnologie, la chimie des acides nucléiques, l’analyse d’images et la bio-informatique. Grace à cet outil, il est possible de mesurer le niveau d’expression de plusieurs milliers de gènes simultanément et les applications sont en plein essor dans un grand nombre de domaines comme la pharmacologie, la médecine ou l’environnement.

INTRODUCTION

Historique

leur concept date de 1987 « suite logique aux anciennes méthodes de northern blotting.

La technologie des puces à ADN est basée sur le principe d’hybridation développé par southern (1974).

Les premières puces à ADN sont apparues en 1993.

Schena et al 1995

Définition des puces à ADN

Une biopuce, puce à ADN, est un ensemble de molécules d'ADN fixées en rangées ordonnées sur une petite surface

qui peut être du verre, du silicium ou du plastique.

Ploy-lysin

puces à gènes

micromatrice d'ADN

puce à ADN

Une biopuce

biochip

Cette biotechnologie récente permet d'analyser le niveau d'expression des gènes (transcrits) dans une cellule, un tissu, un organe, un organisme ou encore un mélange

complexe, à un moment donné et dans un état donné par rapport à un échantillon de référence.

Microarray:lame en verre

-plus miniaturisé-utilise les

produit PCR-200-400 microns-cibles marquées par fluorescence

Macroarray:-utilise des clones

d’ ADNc .

-disposés sur une membrane de

nylon.

-associés avec des cibles

Radioactives.

Oligonucléotides:Affimetrix-synthèse chimique

d’oligonucléotides In-situ

-sur surface solide

- un procédé de photolithographi

e

http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf

Les différents types de puces à ADN


Source : The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc

Fabrication de la puce

.

Préparation de la cible

Hybridation

Lecture

Analyse des données

Regroupement des profils d’expression

Les étapes de construction

Microarrays

Macroarrays

Puces à oligonucléotides


La Fabrication

Les fragments d'ADNc amplifiés par la technique de PCR sont déposés sur une lame de verre par adressage mécanique.

L’accrochage de la molécule d’ADNc se fait grâce à (la poly-lysine).

L’ADN est lié de manière covalente au support par une exposition aux UV.

Un Support idéal, c’est lui qui permet : L’immobilisation efficace des sondes sur la surface. L’hybridation robuste de la sonde avec la cible.


Microarrays

Macroarrays



Préparation de la cible

-Les ARNm sont extraits des deux cultures dont on veut comparer leurs expressions.

-Les ARNm sont ensuite transformés en ADNc monocaténaires par transcription inverse RT-PCR.

-L’ADN de la première culture est marqué avec un fluorochrome vert, et l'ADN de la seconde culture estmarqué en rouge.

-Mélange des deux ADNc (vert et rouge) : c’est la cible.


Microarrays

Macroarrays



L’Hybridation

1-Le mélange est placé sur la matrice d'ADNc monocaténaire

(la sonde).

2-La puce est alors incubée une nuit à 60 degrés. A

cette température, un brin d'ADN qui rencontre son

complémentaire s'apparie pour donner de l'ADN

double brin.

65c° PENDANT UNE NUIT


MODE DE FIXATION des sondes:séchage 12H /fixation des ADN par

cuisson à 80c° / lavage

Microarrays

Macroarrays



La lecture

1-La puce est placée sous un

scanner éléctronique.

2-Des résultats obtenus par des logiciels

informatiques

3-Superposition des images vertes et rouges : le vert , c’est seulement l'ADN de la

première condition qui est fixé ; le rouge c’est seulement l'ADN de la seconde

condition qui est fixé)*Schena M. et al, TIBTECH. 1998, July; vol 16: pages 301-306Microarrays: biotechnology’s discovery platform for functional genomics


Domaine d’utilisation

Microarrays

Macroarrays



Analyse des données

*On calcule le ratio des intensités= fluorescence rouge / fluorescence verte.

Si ce ratio > 1 (la couleur estrouge), le gène est plus exprimé, si ce ratio < 1 (la couleur est verte), le gène

est moins exprimé.

*On suppose alors que la quantité d'ADN fluorescent fixée est proportionnelle à la quantité d’ARNm correspondante dans la

cellule de départ

*On mesure la quantité de signal dans la longueur d'onde d'émission du fluorochrome (vert et rouge)

pour chacun des spots


Microarrays

Macroarrays



ARNm présent seulement dans les cellules normales

ARNm présent seulement dans les cellules cancéreuses

ARNm présent en quantité égale dans les cellules normales et dans les cellules cancéreuses


Microarrays

Macroarrays



Regroupement des profils d’expression

2- On représente ensuite les ratios grâce à une échelle de couleur du vert (gènes

réprimés) au rouge(gènes induits).

1-Dans cette étape ,on essaye de regrouper des gènes ayant le même

profil d'expression sur plusieursexpériences ayant un rapport biologiques


On réalise une synthèse chimique d’oligonucléotides représentative des génes de l’organisme étudié,directement sur une lame de verre, par un procédé photolithographique .

1- Les lames sont activées (traitées par des espaceurs) de manière à fixer des nucléotides.

2- Les extrémités libres des espaceurs sont protégées par des groupements photholabiles pour empêcher la fixation des nucléotides au hasard.

3-Nous utilisons ensuite un jeu de masque photolithografique (protection contre les rayons « UV »).Comme ,dans le cas de notre ADN, l’adénine doit apparaître à la 4eme et la 6eme place sur la lame , le masque doit protéger toutes les places à l’exception de la 4ème et la 6ème .

4-On procède à l’Insolation par des rayons « UV » qui vont détruire les groupememts photolabiles de la 4ème et la 6ème place.

5- Puis la lame est trempée dans une solution contenant un nucléotide protégé portant la base « A »Adénine. Ce nucléotide va se fixer à la 4ème et à la 6ème place.

3-Réseaux d’oligonucléotides : synthèse d’oligonucléotides in situ (sur une surfase)

Généralement, quand la limite d’un ratio est > 2 ou <0,5 » on considère qu’un gène est respectivement sur exprimé ou sous- exprimé, dans une des cibles par rapport à l’autre.

Source : Le principe des puces à ADN (Cours ENS)

Figure 03:(Intensité dans le rougeCY5) = f(intensités dans le vertCY3).

Domaine d’utilisation parallèlement à l’analyse des profils d’expression, les puces à ADN offrent la possibilité de réaliser des études très diverses.

- La cancérologie :l’approche de puce à ADN a permis d’améliorer la classification des tumeurs.

-Le criblage médicamenteux : les puces à ADN permettent de découvrir de nouveaux médicaments plus rapidement et d’en réduire le coût grâce a leur vitesse d’analyser des milliers de molécules.

-L’environnement: L’applications des puces à ADN, notamment pour la détection rapide et à bas coût de substances organiques, principalement des agents pathogènes dilués dans l’environnement.-Les applications dans le domaine de la guerre bactériologique ou chimique: En déterminant par avance les modifications du fonctionnement génétique des cellules immunitaires occasionnées par des agents toxiques.

Domaine d’utilisation Avantages Inconvénients

Étude simultanée des profilsd’expression de plusieurs millierde gènes.

Les données sont cumulables.

Les groupes de gènes affichent des comportements identiques dans une situation biologique donnée.

La technique est assez lourde à mettre en place.

L’équipement de départ est d’un coût relativement élevé.

Le grand nombre de résultats obtenu très rapidement nécessite un traitement informatique et statistique non négligeable.

conclusion

-Les biopuces se présentent comme une réelle révolution autant au point de vue technologique qu’applicatif. En effet, les procédés de fabrication et d’exploitation nécessitent la participation de sciences à vocations différentes qui deviennent ici complémentaires : d’un côté des technologies relevant des télécommunications telles que l’électronique, l’optique et l’informatique, et d’autre la biologie.

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