Bio57 Séance de Révision 9 décembre 2011

1. La transgenèse/KO souris2. Les plantes transgèniques3. Les techniques de blotting

4. Les puces ADN

La Transgenèse

Knockout Mice et Les Cellules Souches

Gene Targeting

Exemples des souris knockout

1. Le gène Sry

2. Le gène p53

3. Le gène Myo D et la redondance

Cre-lox recombinaison

•Le système cre-lox :1.Est important pendant l’épissage chez les eucaryotes2.Est un système de recombinaison3.Est utilisé toujours pour effacer les promoteurs des gènes4.Peut être utilisé avec un promoteur inductible

•Les étapes suivantes sont essentielles pendant la production d’une souris transgénique :

1.Injection du transgène après la première division cellulaire2.Incubation des embryons injectés à 37°C pendant la nuit après les injections3.Accouplement des femelles avec des mâles vasectomisés 4.Injection des femelles avec un œstrogène

•Pour faire une souris knock-out il faut :1.injecter un gène dans un ovocyte2.utiliser des cellules germinales3.toujours effacer tous les exons du gène ciblé4.utiliser G418 pour sélectionner pour la présence du gène Neo

Smith et Townsend montrent en 1907 que le crown-gall est causé par unebactérie Agrobacterium tumefaciensComment la bactérie entraîne une multiplication incontrôlée des cellules végétales ?Réponse trouvée par la découverte des hormones végétales et de l’utilisation de la technique de culture in vitroDeux familles d’hormones permettent aux cellules végétales de se multiplierindéfiniment en culture in vitroLes auxines et les cytokinines

Les agrobactéries hébergent de très grands plasmides (200 kb) nécessaires à laformation des tumeurs

ADN circulaire extrachromosomique, autonomie de réplication, plusieurs exemplaires par cellule, plasmide appelé Ti pour Tumor inducing

Les Plantes Transgèniques

Rôle des auxines et des cytokinines dans l’organogenèse

Le rapport auxines / cytokinines détermine le devenir des tissus en culture

Notion de balance hormonaleEn concentrations égales division de cellules indifférenciées = cals

Auxine formation de racines

Cytokinines bourgeons

Un vecteur binaire ( version modifiée du plasmide Ti) est utilisé pour transformer l’ Agrobactérium.

Les gènes qui produisent des hormones-qui donnent les cals-ne sont plus présents. Remplacés par le gène qu’on veut

mettre dans les plantes.Il faut des gènes de sélection:

1. sélection pour les Agrobacterium transformés et 2. pour les cellules des plantes qui ont été transformés par le

plasmide.Donc:

1. Transformation d’agrobactérium avec le vecteur binaire: sélection avec des antibiotiques

2. Transfer du plasmide vers les cellules des plantes: sélection avec un herbicide ou un antibiotique

Intégration du gène dans le génome du plante est aléatoire

Nombreux domaines d’applicationAgriculture

Agroalimentaire

Industries

Environnement

Santé-pharmacieIntroduction de caractéristiques nouvelles et production de molécules d’intérêt

Le code génétique est universel, pas de barrière d’espèces

AgricultureRésistance aux stress (chaleur, froid, sécheresse et salinité)Permettre la culture en conditions environnementales non favorablesRésistance aux insectes…AgroalimentaireIntroduction de caractères pour obtenir des avantages nutritionnels, gustatifsRiz doré (golden rice) carence en vitamine A(antioxydant), 400 millions de personnes (cécités,sensibilité accrue aux infections)Introduction de 4 gènes synthèse de B-carotène (précurseur de la Vit A)

IndustrieIndustrie papetière, papier à partir de cellulose du bois,Présence de lignine, imperméable et inextensible très coûteux àéliminer et source de pollution (utilisation de chlore et consomme unetrès grande quantité d'eau)Diminution du taux de lignine par transgénèse

Biocarburants

VaccinsEt plus……..

•Lors de la transgénèse végétale :1.on réalise une co-culture des cellules végétales et d’agrobactéries2.100% des cellules végétales sont infectées par les agrobactéries3.on utilise des hormones végétales4.on utilise des anti-fongiques

•La galle du collet •est une infection virale qui provoque une chlorose chez les plantes •pose des problèmes en sylviculture •correspond à l'obtention de cellules végétales transgéniques •est une infection bactérienne qui produit une tumeur chez les plantes

•Lors de la régénération de plantules à partir de cals :•un excès d'auxines par rapport aux cytokinines entraine la formation de bourgeons • un excès d'auxines par rapport aux cytokinines entraine la formation de racines •un excès de cytokinines par rapport aux auxines entraine la formation de bourgeons• une concentration équivalente de cytokinines et d'auxines stimule la division cellulaire

Principe de fonctionnement Le concept de biopuce (= puce à ADN) est né dans les années 1990. Le principe de la puce à ADN est basé sur la technique d' hybridation .

Immobilisés sur un support solide (matrice), des oligonucléotides (simples brins) spécifiques de différents gènes ou ADNc connus constituent les sondes dont le rôle est de détecter des cibles marquées complémentaires , présentes dans le mélange complexe à analyser ( ARNm extraits de cellules, tissus ou organismes entiers et convertis en ADNc).

Les sondes sont soit greffées sur le support, soit synthétisées in situ. Les signaux d'hybridation sont détectés selon le type de marquage, radioactivité ou fluorescence, par mesure radiographique ou par fluorescence, et quantifiés.

Les Puces d’ADN

Les puces d’ADN

•L'analyse de mutationsA côtéde la séquence sauvage (sonde de référence), on utilise plusieurs sondes identiques àune mutation prés. l•Le séquençage par hybridationL'analyse procède par lecture de petits blocs. L'analyse porte sur des sous-séquenceschevauchantes qui sont lues et réassembléesau moyen d'un programme informatique qui reconstitue la séquence étudiée. •Le diagnostic des maladies génétiques•Le diagnostic des maladies infectieusesDétection de microorganismes (présence, mutations, capacité à résister à certains antibiotiques ou à des inhibiteurs d'enzymes). •La pharmacogénomiqueIdentification de cibles pour la recherche thérapeutique.•La toxicogénomiqueDans le cas de l'analyse de la réponse toxicologique àl'aide de puces àADN, on doit au départ faire l'hypothèse que l'effet toxicologique, direct ou indirect, d'une substance résulte de la modification de l'expression de certains gènes. •L'agro-alimentaire Contrôle des microorganismes utilisés dans certaines fabrication (ferments lactiques, levures, mycélium, etc...), •L'environnementAnalyse bactérienne de l'eau de consommation, détection des agents infectieux dans l'alimentation, l'air ou l'eau (Salmonella, Listeria, Legionnella).

Vous cultivez des bactéries en présence ou en absence de lactose. Vous réalisez une hybridation sur puce à ADN en ayant préalablement marqué les ADNc des bactéries ayant poussé sans lactose avec un fluorochrome vert, et les autres avec un fluorochrome rouge.

•les spots correspondant aux gènes exprimés dans les deux conditions seront colorés en jaune•les spots correspondant aux gènes non exprimés seront colorés en jaune•les spots correspondant aux gènes exprimés qu’en présence de lactose seront colorés en vert•les spots correspondant aux gènes exprimés qu’en absence de lactose seront colorés en rouge

•Les puces à ADN permettent de :•étudier le protéome•étudier l’expression des gènes•étudier le transcriptome•diagnostiquer certaines maladies

Blotting

• Northern blotting: expression des gènes; taille des transcrits, nombre de transcrits: sonde normalement ADNc

• Southern blotting: organisation de l’ADN ( plasmides ou ADN génomique) et sites de restriction: sonde normalement ADNc

• Western blotting: absence ou présence des protéines dans un extrait des cellules. Peuvent aussi faire la différence entre les formes modifiées ( avec ou sans phosphate par exemple). Sonde toujours des anticorps

• La stringence: les conditions d’hybridation: concentration de sel, température, présence de formamide.

• Stringence forte: sel faible, température élevée• Stringence faible: sel fort, température bas

Northern blot

Southern Blotting

Western BlottingLes protéines sont séparées sur un gel d’acrylamide, elles sont

transférées sur une membrane utilisant un courant et elles sont détectées par des anticorps

•Un Northern blot :•permet de déterminer la présence d’un ARN messager.•permet de déterminer si l’expression d’un ARN messager est soumise à des régulations.•peut-être réalisé indifféremment avec une sonde ARN ou une sonde ADN.•est couramment utilisé pour mettre en évidence des réarrangements chromosomique

•On souhaite réaliser un western blot pour détecter la protéine mGluR (un récepteur humain du neurotransmetteur glutamate) :

•Dans les premières étapes de l’expérience, on doit purifier des protéines à partir de cerveau, les dénaturer avec du SDS, puis les faire migrer sur gel d’agarose.•Lors de l’étape de transfert des protéines, on réalise le sandwich dans l’ordre suivant « papiers buvards humides, gel, membrane de nitrocellulose, papiers buvards humides » puis on place l’électrode négative du côté de la membrane et la positive du côté du gel.•Après l’étape de transfert on peut saturer efficacement la membrane en l’incubant dans une solution contenant du lait.•Pour détecter mGluR, il nous faudra produire des anticorps spécifiques en injectant le récepteur humain mGluR dans un lapin

•Vous réalisez la mise au point de l’étape d’hybridation d’un Southern blot :

.L’ADN sur le blot et l’ADN utilisé pour préparer la sonde proviennent des espèces différents donc il faut réduire la stringence•Si vous obtenez un fort bruit de fond (bandes aspécifiques) vous pouvez augmentez la stringence en augmentant la température.•Pour augmentez la stringence vous pouvez aussi augmenter la concentration en sel (tampon SSC).•Si vous n’obtenez aucun signal cela peut signifier que vous avez choisi des conditions trop stringentes