transgenèse végétale et applications

7/21/2019 Transgense vgtale et applications

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Transgense vgtale et

applications

Sommaire

Introduction! 2

1 - Une nouvelle approche: la transgnse vgtale! 2

2- Les diffrentes tapes de la transgnse! 3

3 - La construction gnique! 3

a - Gne d'intrt 4

b - Marqueur de slection 4

4 - Mthodologies de transfert de l'ADN chez les vgtaux! 5

a - Transfert indirect 5

b - Vectorologie et protocole de transformation 7

c - Transfert direct 8

5 - Quelques applications! 9

a - Rsistance aux insectes 9

b - Tolrance aux herbicides 10

c - Ramolissement des fruits 12

d - Riz enrichi en -carotne 12

e - Modification de l'amidon 14

f - Production de molcules d'intrt pharmaceutique 15

Biotechnologies animales et vgtales

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Introduction

Amlioration des plantes:

* Domestication des plantes sauvagesL'homme la pratique depuis trs longtemps

* Amlioration des plantes

* Critres de slectionAugmentation du rendement, de la qualit. Rsistance des stress bioti-

ques et abiotiques

Mais il y a des limites:

* Barrires interspcifiques

* Gnes intressants lis d'autres gnes prsentant des caractres non dsirs

* Caractre polygnique

1 - Une nouvelle approche: la transgnse vgtale

* OGM: organisme dont le matriel gntique est modifi d'une manire qui ne s'effectue

pas naturellement par multiplication et/ou par recombinaison naturelle

* Transfrer une squence connue la plante

Cette squence va tre introduite dans le gnome de la plante. On connat au pralable

la squence qu'on introduit

* Intgration de manire stable dans le gnome de la plante

Obtenir des nouvelles varits avec des fonctions prdfiniesApporter des fonctions nouvelles

La transgense est possible, car tous les organismes vivants et les virus possdent lemme systme de codage et d'expression de l'information gntique


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Les cultures transgniques ont surtout des rsistances aux insectes et des tolrances aux

herbicides

Les 4 plantes les plus concernes par les OGM:

- Coton- Soja

- Maize

- Canola

Les tats-Unis remportent la palme du pays qui ralise le plus dOGM

2- Les diffrentes tapes de la transgnse

1re tape: identifier le gne d'intrt On connait la squence, la fonction et ce que cela peut

apporter la plante

2me tape: raliser une construction gnique3me tape: transformation de la plante et rgnration par culture in vitro

4me tape: Caractrisation des transformants. Tri des individus ayant les meilleurs ca-

ractristiques. Transfert et analyse en serre et au champ. Demande d'autorisation. La ca-

ractrisation passe par une analyse molculaire

3 - La construction gnique

* Gne d'intrt fonction

On part d'un eucaryote, on utilise l'ADNc (copie d'ADN double brin partir d'un ARNm).

On utilise pour cela une enzyme (ADN polymrase ARN dpendante) qui va induire une

"reverse transcription". On utilise l'ADNc, car il n'y a plus de squence intronique donc il

est plus facile manipuler ou transfrer. Il n'y aura plus besoin d'pissage, car il pour-rait tre aberrant sil a lieu dans un organisme autre que celui normalement destin

* Marqueur de slection slection des cellules, tissus transforms

Il faut trs vite slectionner les tissus transforms, car si on repique des plantes non

transformes, les coups seront trs chers (main d'oeuvre)

* Diffrentes parties sont clones dans un vecteur (E.Coli)

- Enzymes de restriction, PCR...

- Ligature dans un vecteur

- Transformation de cellules E.Coli comptentes

- Analyse des recombinants E.Coli


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! ! a - Gne d'intrt

* Squence codante

* Promoteur fort et constitutif Constitutif: sera actif dans tout les organes de la plante

Exemple d'un promoteur fort : 35S du Virus de la Mosaique du Chou-fleur (trs utilispour la transformation de dicotyldones). C'est un virus ADN qui attaque les crucifres.

Pour la multiplication, le virus passe par un intermdiaire ARN

Promoteur d'un gne actine ou ubiquitine.: ce sont des promoteurs fort pour les mono-

cotyldones

On peut avoir des promoteurs tissu spcifique, qui vont tre exprim que dans certains

endroits de la plante (que dans le tubercule pour la pomme de terre par exemple)

* Squence de terminaison

* Peptide signal...

On utilise un peptide signal si on veut adresser une protine un compartiment donn

lorsque c'est ncessaire

! ! b - Marqueur de slection

* Promoteur, squence codante, squence de terminaison* Gne de rsistance un antibiotiqueExemple : nptII (nomycine phosphotransfrase) dtoxifie des antibiotiques de la famille

des aminoglycosides. Transfert d'un groupement phosphate sur l'antibiotique et lorsqu'il est phos-

phoryl, il n'a plus d'action. Il n'est plus utilis aujourd'hui, car on a peur des transferts de gnes dans

le tractus digestif du btail du gne chez les bactries

* Gne de tolrance un herbicide* Marqueur de slection positive

Exemple: manA (phosphomannose isomrase). On met du mannose dans le milieu de culture,

le mannose est absorb par la cellule et est transform en mannose-6-phosphate par l'action d'unehexokinase, mais l'inconvnient ensuite c'est que le man-6-phosphate, mais les plantes qui poss-

dent le gne de la phosphomannose isomrase vont le mtaboliser en fructose-6-phosphate quisera assimilable par l'organisme


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4 - Mthodologies de transfert de l'ADN chez les vgtaux

Transfert direct ou transfert indirect

! ! a - Transfert indirect

* Bactrie- Agrobacterium tumefaciens

- Agrobacterium rhizogneprovoque un chevelu racinaire (hairy root). Utilisation de raci-

nes transformes scrtant molcules d'intrt

* Virus

Agrobacterium thumefaciens: provoque la formation de tumeur

Bactrie phytopathogne tellurique de la famille des Rhizobiaces (elle infecte plus de 90

familles de dicotyldone, peu de monocotyldones)

Le pouvoir pathogne est situ sur le plasmide pTi (Tumeur indicing):- Il se trouve en 1 ou 2 copies dans chaque bactrie

- Il est trs grand 200 400 Kpb

On distingue plusieurs rgions:

ADN-T: le T pour transfert, car c'est cette rgion qui va tre transfr depuis la

bactrie jusqu' l'ADN du noyau vgtal. Il n'y a aucune fonction qui permet le

transfert sur l'ADN vgtal et donc il est a distinguer d'un transposon

25 bp repeats (FD et FG) : ce sont les frontires gauche et droite par rapport

l'ADN-T. Ce sont des squences rptes imparfaites de petite taille (25 pb) qui

dlimit l'ADN-T et donc c'est ce qu'il se trouve entre ces frontires qui va tretransfr la cellule vgtale


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Gnes de virulence: il se trouve soit sur le chromosome ou la rgionVir

Ce sont eux qui permettent le transfert de l'ADN-T dans la cellule vgtale

L'ADN-T contient des oncognes

* Gnes de synthse d'auxine (iaaM et iaaH)La synthse d'auxine se fait partir du tryptophane, grce au iaaM, le tryptophane donnera indolac-

tamide qui subit l'indolactamide hydrolase et le gne iaaH pour donner l'acide indolactique

* Gne de cytokinine (ipt) ipt: isopentmyltransfrase

* Gnes modulant l'effet de l'auxine et/ou des cytokinines

* Gnes de synthse d'opinesOn les retrouve que chez les organismes infects par les Agrobactrium. On classe les Agrobacte-

riums en souche selon le type d'opine qu'elles sont capables de faire exprimer la plante infecte

Suite une blessure de la plante, A.tumefaciens transfre l'ADN-T dans le noyau de la

cellule vgtale

Le transfert de l'ADN-T s'effectue grce aux gnes de virulence

* L'ADN-T ne porte aucune fonction permettant son transfert vers la cellule vgtale

* Les gnes de virulence sont localiss sur:

- Le chromosome- La rgion Vir

Le transfert de l'ADN-T

Initi lorsque la bactrie peroit des composs phnoliques (substances chimiotactiques;

actosyringone) et des sucres relargus par les cellules vgtales blesses. La bactries'attache la cellule vgtale grce un rseau de fibres de cellulose (synthtis par la

bactrie)

Transduction du signal et induction des gnes de virulence

* VirA est un chimiorcepteur membranaire de composs phnoliques s'autophospho-ryle

* VirA phosphoryle phosphoryle VirG

* VirG phosphoryle induit sa propre expression et celle des autres gnes de virulence

Formation d'un complexe multiprotique VirD4 et VirB1-11 qui constitue une structure en

forme de pilus qui assure le transport de l'ADN-TLes protines VirD1 et VirD2 coupent l'ADN-T au niveau des frontires droite et gauche

La protine VirD2 se lie de manire covalente l'extrmit5' du monobrin d'ADN-T


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L'ADN-T est transfr la cellule vgtale sous forme de monobrin

La bactrie gauche et la cellule vgtale droite

Les protines Vir E2 se lient sur toute la longueur de l'ADN-T, dans les cellules vgtalesLes gnes situs sur l'ADN-T sont exprims dans la cellule vgtaleLes protines Vir D2 et Vir E2 permettent l'entre de l'ADN-t

! ! b - Vectorologie et protocole de transformation

Systme binaire

* Clonage (dans E.Coli) du gne d'intrt et du marqueur de slection dans un vecteur

d'expression contenant les squences frontire droite et gauche

* L'agrobactrie contient un plasmide pTi dsarmsans l'ADN-T qui cause le cancer chez les

plantes, mais qui conserver les gnes de virulence qui permettent le transfert de l'information gn-

tique dans la cellule vgtale* Le vecteur d'expression est transfr de E.Coli jusqu' l'agrobactrie (conjugaison, lec-

troporation)

* Les protines Vir agissent sur l'ADN-T situ sur le vecteur d'expression et permettent

son transfert vers la cellule vgtale


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La transformation par Agrobactries

* Agrobactries en prsence des explants vgtaux (actosynragone)

* Transfert sur milieu de culture in vitro adapt la plante

* Coculture, car milieu de culture adapt la plante et/ou pousse aussi la bactrie

* Transfert sur un milieu de slection contenant un antibiotique pour liminer les agrobac-tries et l'agent de slection

* Rgnration de plantules par culture in vitro en prsence de l'agent de slection

* Contrle de la transformation, est-ce que le transgne est prsent ? Est-ce qu'il s'exprime? Est-ceque la protine attendue est elle exprime? Quels sont les individus avec les meilleures caractristiques?

! ! c - Transfert direct

* L'lectroporationElle est pratique sur des protoplastes. Ces protoplastes sont mis en prsence de l'ADN

qu'on souhaite transfrer on place ensuite les protoplastes dans une cuvette d'lectro-

poration strile on place cette cuvette dans l'lectroporateur ensuite on fait de laculture in vitro formation de cals indiffrencis rgulateurs de croissance : auxine,

cytokine rgnration in vitro de plantules

* Impulsions lectriques (plusieurs centaines de volts, quelques millisecondes)

* Diffrence de potentiel dsorganisation de la membrane* L'ADN pntre par les pores forms dans la membrane plasmique

* L'ADN s'intgre au hasard dans le noyau

*La biolistique

Utilisation d'un canon particules. Bombardement de billes de tungstne ou d'or qui sontrecouvertes de l'ADN qu'on souhaite transfr la cellule vgtale

Le bombardement sous un flux d'hlium sous vide partiel pour ne pas que les billes soient freines par l'air.

L'avantage c'est qu'on peut utilis directement des explants vgtaux (feuilles, tiges...) et non pas forcement

des protoplastes qui ne se rgnrent parfois pas en plantule

Les particules pntrent dans la cellule, plus ou moins profondment. L'ADN s'intgre

dans le noyau. Rgnration de plantes in vitro


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5 - Quelques applications

! ! a - Rsistance aux insectes

La chenille de la pyrale du mas: mise en vidence d'une endotoxine de Bacillus thurin-giensis lorsque la bactrie sporule. Protines Cry (endotoxine) spcifique des colopt-

res, lpidoptres et diptres

Mode d'action de l'endotoxine : La protine est ingre par l'insecte et dans le tube di-

gestif se lient un rcepteur membranaire des cellules pithliales de l'insecte. La pro-

tine Cry sera active par une protase et suite cette activation, elle forme la formation

de pore dans les membranes de ces cellules pithliales. La consquence c'est que l'in-secte perde l'apptit et l'insecte meurt

*Risques

* Flux de gne: dissmination non contrle des transgnes (pollen, semence) donc risque

pour l'environnement* Choix de l'agriculteur et du consommateur pour la culture conventionnelle, OGM ou bio-

logique

* Toxicit vis--vis d'insectes non ciblsLe papillon monarque est un emblme aux tats-Unis.

On remarqu que le pollen de mas transgnique venait se poser sur d'autres plantes que venait

butiner cet insecte, et il mourait*Apparition de rsistance chez les insectesLes plantes transgniques n'auraient plus d'effet

*Comment retarder l'apparition de rsistance?

* Utilisation d'une varit conventionnelle sur une partie des surfaces cultives de mas Bt

zone refuge: rservoir d'insectes sensibles

* Si refuge: insectes SS du refuge descendance SS ou SR tue dans champs transg-

niques (S = sensible ; R = rsistance)* Absence de refuge : individus SR et RR s'accouplent entre eux -> descendance SR et

RR. Mais Bt sans effet !

*Bilan

* Hutchinson et al., 2010 (Science)* volution populations de pyrales et bnfices agricoles en 1996 et 2009

* Culture du mas Bt profite aux agriculteurs n'ayant pas choisi mas transgnique, car le

fait qu'il y a moins d'insectes, les plantes non transgniques ne se font plus dtruire par


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les insectes et ces semences non transgniques coute moins cher donc c'est plus ren-

table, mais ceci est grce aux agriculteurs qui ont fait de l'agriculture transgnique

! ! b - Tolrance aux herbicides

Qu'attend-on d'un herbicide?Il doit tre efficace

Peu de risque pour l'environnement

Il faut qu'il soit spcifique (pas comme le round-up qui tue tout)

Tolrance au glyphosate (round up)

Tolrance au glufosinate

*Tolrance au glyphose

* Le glyphosate inhibe la 5-nol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) Le

EPSPS intervient dans la synthse des acides amins aromatique

* Enzyme chloroplastique code par un gne nuclaire (plantes) L'enzyme est synthtis

dans le cytoplasme, mais est adress au chloroplaste

* Mutant de Salmonella typhimurium tolrant au glyphosateMutation qui donne une protineEPSPS qui montre une affinit moins grande pour le glyphosate

Affaiblir la sensibilit de la plante l'herbicide

Mas GA21 (Syngenta Seeds):* mEPSPSynthase de mas (99,3% d'homologie avec le gne sauvage)

* Promoteur d'un gne d'actine du riz; squence d'adressage au chloroplaste; squence

de terminaison: nos 3'

* Bombardement de particules (fragment 3,4 kb)

* Aucun marqueur de slection on applique directement le round up

Mas NK603 (Mas Roundup Ready):

EPSPS de A.tumefaciens : squence modifie pour contenir codons prfrentiellementutiliss par la plante

2 cassettes d'expression: Promoteur 35 S avec rgion activatrice duplique; intron HSP70 de mas;

peptide signal d'adressage au chloroplaste de EPSPS d'A.thaliana; nos 3' Promoteur d'actine 1 de riz avec intron associ; peptide signal de EPSPS

d'A.thaliana; nos3'

La transformation s'est faite par biolostique. Autorisation pour importation pour UE. Inter-

dit la culture en UE


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tude toxicologique:

Sralini et al, 2012. Food and Chemical Toxicology (available 19 semptember 2012 on

line)

Dispositif exprimental:

100 rats mles, 100 rats femelles rpartis en 10 groupes de 10 animaux 1 lot: nourris avec mas non OGM et eau du robinet

3 lots nourris avec 11, 22 ou 33% de mas OGM trait avec Roundup

3 lots nourris avec 11, 22 ou 33 % de mas OGM non trait avec Roundup

3 lots nourris avec mas non OGM et eau avec 3 concentrations diffrentes deRoundup

Dure de l'exprimentation : 2 ans. valuation de mortalit, pathologies, caractres bio-

chimiques

Des rsultats et des critiques:

- Augmentation de la mortalit

- Dveloppement de tumeurs mammaires

- Congestion, ncrose du foie, pathologies rnales chez mles

Perturbations hormonales dues au Roundup et mas OGM

Mais:

- Faiblesse des tests statistiques, nombre d'animaux utiliss

- Choix de la ligne de ratsligne de rat qui a tendance dvelopper des tumeurs

*Tolrance au glufosinate

* Analogue du glutamate

* Bialaphos (phyn, antibiotique produit par Streptomycesviridochromogenes. Inhibe laglutamine synthtase enzyme qu'on trouve chez les bactries, seul enzyme qui permet de m-

taboliser l'ammonium. Cela dit l'excs d'ammonium est toxique donc la plante meurt

* Gne-bar (bialaphos rsistance) codant une phosphinotricine actyltransfrase (permet

de transfrer un groupement sur la phosphinotricine qui ne peut plus inhiber la gluta-mine synthtase* Phosphinotricine actyle est inactive sur le plan herbicide

dtoxification de l'herbicide

Risques:

* Flux de gnes entre plantes transgniques et non transgniques dans parcelles voisines

coexistence OGM, plantes conventionnelles ou bio

* Flux de gnes vers les plantes adventices, autres espces

* Repoussesi on change de culture, l'ancienne rsistante ne pourra plus tre limin avec l'insecti-cide

* Apparition de rsistance de ces plantes vis--vis de l'herbicide


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! ! c - Ramolissement des fruits

* Tomates Flavr Savr ou Mac Gregor (1994)premier aliment transgnique mis sur le march

* Cible: polygalacturonas produite au moment o le fruit commence murir. Elle dpoly-

mrise les pectines et le fruit ramollit* Approche anti-sens

* Tomate reste ferme (stockage, transport...)

Production des lycopnes le transgne n'agit que sur le ramollissement du fruit

! ! d - Riz enrichi en -carotne

* Envisag pour la dficience en vitamine A-carotne prcurseur de la vitamine A* Enrichir le riz en provitamine A* Approche impossible par slection classique

* Riz ne contient pas de -carotne, mais contient son prcurseur (granyl-granylpyro-

phosphate)

Biosynthse des carotnodes:


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Un prototype: synthse de -carotne dans l'endosperme de riz

2 x Granyl-granyl pyrophosphate (phytone synthase) Phytone (Phytone dsa-

turase) -carotne (Lycopne -cyclase) carotne (1,6microgramme de carot-

nodes/g)

Amliorations du prototype:

* Augmenter la quantit de -carotne

* Enlever le gne de rsistance l'antibiotique

* optimiser le choix des gnes* Validation dans d'autres varits de riz

* Laboratoires publics et privs (Syngenta, Zeneca)

Du prototype au Golden Rice I et II:

Analyse de diffrents gnes psy dans cals de mas:


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Analyse de gnes psy dans le riz:

Essai aux champs (Louisiane) en 2004 et 2005 Rtrocroisements GR1 et GR2 dans le

riz indica. Avril 2008: essai au champ aux Philippines

e - Modification de l'amidon

Amylose (20 30%): chaines linaires de glucose relies par des liaisons alpha-1,4 glu-

cosidiques

Amylopectine (70 80%): chanes ramifies (liaisons alpha-1,6 glucosidique)

*Biosynthse de l'amidon

AGPase : ADP-glucose pyrophosphorylase

amidon synthase (SS)

enzyme de branchement (SBE)

amidon synthase lie au grain (GBSS)

* Utilisations: colles, glifiants, textiles, emballages, produits cosmtiques, enrobage des

comprims* Diffrentes approches:

- Augmentation de la quantit d'amidon (surexpression de AGPase)- Enrichissement en amylose ou en amylopectine (en utilisant l'approche antisens)

Pomme de terre "Amflora"

* BASF Plant Science

* Pomme de terre fculire Prvalent. EH92-527-1* Amylopectine: 98 % ; amylose: 2%

* Autorisation de la commission europenne le 2 mars 2010 pour

- Utilisation des co-produits pour l'alimentation animale


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- Culture et utilisation industrielle

Construction et transformation:

* ARN antisens de BBSS. Provoque dgradation de lARNm

* Rsistance kanamycine

* Transsformation par A.tumefaciens* Protine GBSS non dtectable

* Protine NPTII non dtectable dans amidon, ni bouilli 1 minute

valuation de l'impact sur la sant humaine:

* Risque associ NPTII:

- Souris: administration de dose leve

- Milieu digestif de ruminants

- Simulation milieu digestif humain

* Risque associ au transfert de rsistance NPTII

- NPTII ubiquitiste (tube digestif de l'Homme et animaux, environnement)

- Ncessit de franchissement de barrire gntique bactrienne

- Systme d'expression eucaryote

f - Production de molcules d'intrt pharmaceutique

* Demande croissante de protines humaines, molcules d'intrt pharmaceutique, anti-

corps...* Production dans les microorganismes, mais certaine modifications post-traductionnel

sont diffrentes chez certaines bactries

* Production dans les animaux transgniques ou cultures cellulaires animales mais les

cots sont exorbitant et on n'est jamais l'abri de contaminer la culture par des virus,

prions* Production dans les plantes, une alternative intressante, car pas de pathogne ani-

maux chez les vgtaux (plus au niveau de la scurit sanitaire)

Quelques exemples:

* Avidine* Trypsine: protase utilise dans l'industrie pharmaceutique

* Lipase gastrique (Meristem therapeutics): lipase recombinante canine

Planticorps (anticorps) :

Diffrents types: igG, igA scrtoire...

Pour avoir les 2 chaines. On transforme une plante qui synthtise la chaine lourde, uneautre la chaine lgre ensuit on croise les 2 plantes


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Production dans les plantes, mais...:

* N-glycosylation (diffrente entre les protines des animaux et les protines des vg-

taux). Elles sont ralises dans le rticulum endoplasmique qui sont communes aux 2

rgnes. C'est dans la dernire phase de l'appareil de Golgi que les 2 voies divergent. A

partir de la N-actylglucosamine transfrase que les voies diffre

Prsence d'oligosaccharides typiquement vgtaux

Diffrences au niveau des N-glycosylations:

* Addition de (1,2)-xylose et alpha (1,3)-fucose (alpha (1,6) fucose chez les mammifres)

* Absence d'acide neuraminique chez les vgtaux (rsidu terminal fix sur galactose

chez les mammifres)

Quels risques?

* Quelle utilisation de la protine recombinante?

* Allergnicit

Quelles solutions?* Modifier la squence peptidique pour supprimer les N-glycosylations

* Retenir les protines au niveau du rticulum endoplasmique (KDEL, HDEL)

* Inhiber la N-actylglucosaminyltransfrase

* Exprimer de nouvelles glycosyltransfrases pour "humaniser" les protines produites

dans les plantes (ex: galactosyltransferase animale)


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