Chapitre 11: La technologie de l'ADN recombinant

Objectifs :Connaître et être capable « d'appliquer » les techniques de l'ADN recombinant

Contenu :Les enzymes de restrictionElectrophorèse de l'ADNRéaction de polymérase en chaîneSéquençage des gènesLes cartes de restrictionClonage des gènesUtilisation des gènes comme sondes

Nombre de bases dans un gamète humain = 3 x 109

Nombre de bases dans une cellule somatique = 6 x 109

Distance entre deux bases = 3.4 x 10-10m6 x 109 X 3.4 x 10-10m = 2m !

Nombre de cellules dans un humain = 1013

1013 X 2m = 2 x 1013 m = 20 x 109 kmDistance moyenne Terre-Soleil = 15 x 107 km

Réplication

Chez les bactéries: ADN polymérase I, II et III impliquées dans la synthèse et la réparationChez les eucaryotes: ADN polymérase , , , et … aussi impliquées dans la synthèse et la réparationADN ligase = liaison covalente entre deux bases consécutives (fragments d'Okazaki)

Les activités des ADN polymérases

1) Polymérase 5‘ - 3' = Synthèse5' - TAACA -> - 3'3' - ATTGTCATC - 5'

2) Exonucléase 3‘ - 5' = Correction des erreurs de synthèse

5' - TAACC - 3'3' - ATTGTCATC - 5'

5' - TAAC - 3'3' - ATTGTCATC - 5'

5' - TAACA -> - 3'3' - ATTGTCATC - 5'

3) Exonucléase 5' 3' = Dégradation des amorces d'ARN (et des bouts d'ADN) ARN

5' TAGCCGATAAUGGCA3' ATCGGCTATTACCGTCAG 5'

5' TAGCCGATAATGGCAG-> 3'3' ATCGGCTATTACCGTCAG 5'

Chez E. coliActivités 1 et 2 sur le "Gros fragment" de l'ADN polymérase = fragment KLENOW

Activité 3 sur le "Petit fragment" de l'ADN polymérase

1 et 2

3

Que peut -on faire avec de l’ADN?

Purifier l’ADN en le séparant du reste des constituants de la cellule: protéines, membranes, ARN etc…

Visualiser l’ADN en utilisant le bromure d’ethidium…

Couper l’ADN en fragments pour isoler un gène particulier…

Amplifier par PCR un gène spécifique (réaction de polymérase en chaîne)…

Déterminer la séquence en bases azotées d’un fragment d’ADN

On peut aussi faire du clonage de gènes!

Purification de l’ADN

Lyse des cellules: tampon contenant un détergent et de la protéinase K (RNAse)

Déprotéinisation par phénol:chloroforme

Précipitation de l’ADN avec de l’ethanol et des sels et centrifugation

Solubilisation du culot d’ADN dans de l’eau ou du tampon Tris: EDTA

Le bromure d'éthidium s’intercale entre les bases de l'ADN. Le bromure d'éthidium absorbe la lumière ultraviolette et émet de la lumière visible: L’ADN devient ainsi visible sous les UV.

Visualisation de l’ADN

Comment couper l’ADN en fragments?

En utilisant les ultra-sons: par sonification, les morceaux sont obtenus par fragmentation aléatoire.

En utilisant les enzymes de restriction, qui coupent à des sites bien spécifiques de l’ADN.

Fractionnement de l'ADN par

électrophorèse

Séparation de molécules chargées dans un champ électrique

– L'ADN est chargé négativement parce qu’il contient des groupements phosphate (-)

– On peut séparer les fragments d’ADN à l'aide d'un champ électrique si l'électrophorèse est faite dans un gel où les molécules devront "ramper" (comme un reptile) pour se déplacer (la reptation)

– Les petits fragments vont plus vite que les gros

Enzymes de restriction

Fonction: Constituent le mécanisme de défense "immunitaire" des bactéries contre leur phages– E. coli produit EcoRI (GAATTC)

Les bactéries protègent leur propre ADN en méthylant certaines bases– E. coli GAmATTC

Les phages peuvent échapper aux enzymes de restriction des bactéries en:– Méthylant les mêmes bases– En n'ayant pas le site

Pour qu'un site de restriction soit protégé contre l'action des enzymes de restriction, il suffit qu'un seul des deux brins complémentaires de l'ADN soit méthylé

– Hémi-méthylation

Sinon les brins nouvellement répliqués pourraient être coupés avant d'être méthylés

GAmATTCC T TAAG

Palindromes : ELU PAR CETTE CRAPULE

Chromosome = 50 à 1000 millions de basesGène = environ 1 250 paires de bases (pb)Fréquence de coupure 1/46 = 1 / 4096 pb, 1/ 44 = 1 / 256Dans un individu donné (avec 1013 cellules), toutes les copies d'un gène ont la même séquence. Donc, toutes les copies d'un gène particulier seront coupées aux mêmes endroits et seront sur un fragment d'ADN ayant une taille particulière E 1 250 nucléotides E

= Gène sur morceaux d'ADN ayant la même taille

Utilité des enzymes de restriction

Cartes de restriction

Enzyme #1 =

3 - 6 - 8

6 - 3 - 8

6 - 8 - 3

Enzyme #2 =

7 - 10

10 - 7

Enzymes #1 et #2 = 6, 1, 2, 8

Isolement d’ADN complémentaire chez les eucaryotes

La transcription reverse permet d’obtenir un fragment d’ADN d’un gène à partir des molécules d’ARN messager (on obtient ADN complémentaire qui est sans introns). Cet ADN peut être cloné directement dans un vecteur d’expression.

Coupure des vecteurs de clonage

Construction de plasmides chimériques avec une enzyme de restriction

Clonage de l'ADN génomique

Réaction de polymérase en chaîne (PCR)

Amplification d'un gène à l'aide d'amorces spécifiques (oligonucléotides)

cycle 0= 1 copie, cycle 1= 2 copies, cycle 2= 4 copies, cycle 3 = 8 copies, cycle 25 = 225 copies

La PCR nécessite : ADN (matrice par exemple l’ADN génomique)Deux amorces (2 oligonucléotides)Un mélange en excès des quatre nucléotidesDe l'ADN polymérase thermorésistante TaqUn tampon avec du MgCl2

Programme thermique utilisé pour la PCR

Dans une machine à PCR:

1 - Dénaturation à 94oC, 1 minute2 - Hybridation à de 37oC à 65oC, 1 minute3 - Extension à 72oC, 1 minute4 - Revenir à l’étape 1 : 40 fois (41 cycles)5 - Extension finale à 72oC, 10 minutes6 - Garder à 4oC

L'ADN polymérase Taq

Isolée à partir de la bactérie Thermus Aquaticus

Cette bactérie vit à une température moyenne de 86oC– Geysers du parc Yellow Stone

Son ADN polymérase est stable à 95oC pour 1 heure– Les enzymes "habituelles" sont inactivées

après environ 5 min à 65oC

La méthode enzymatique de séquençage, dite de (Sanger;

didésoxy)

Méthode de synthèse partielle basée sur l'arrêt de la synthèse par l'incorporation de didésoxynucléotides

Nécessite:Brin simple matriceAmorceADN polymérase (Klenow)DéoxynucléotidesDidéoxynucléotides

d                                                                                                                            

Le séquençage automatique