développement de méthodes d'analyse de l'adn par clivage d'une

Developpement de methodes danalyse de lADN par

clivage dune chimere ARN/ADN et par spectrometrie

de masse MALDI-TOF

Florence Mauger

To cite this version:

Florence Mauger. Developpement de methodes danalyse de lADN par clivage dune chimereARN/ADN et par spectrometrie de masse MALDI-TOF. Genetique. Universite Pierre et MarieCurie - Paris VI, 2012. Francais. .

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Submitted on 12 Jun 2013

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THESE DE DOCTORAT DE LUNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE

Spcialit Chimie Molculaire ED406

Prsente par

Florence Mauger

Pour obtenir le grade de Docteur de luniversit Pierre et Marie Curie

Dveloppement de mthodes danalyse de lADN

par clivage

dune chimre ARN/ADN

et par spectromtrie de masse MALDI-TOF

Soutenue le 10 Juillet 2012 devant le jury compos de :

Mme. Jeanine Tortajada Universit EVRY Val dEssonne Rapporteur

M. Codjo Hountondji Universit Pierre et Marie Curie Rapporteur

M. Christian Rolando Universit Lille 1 Examinateur

M. Germain Trugnan Universit Pierre et Marie Curie Examinateur

M. Jean-Claude Tabet Universit Pierre et Marie Curie Directeur de thse

M. Ivo Gut CNAG Barcelona co-Directeur de thse

Remerciements

2

Remerciements

Ce projet de thse prsent dans ce mmoire a t ralis au Laboratoire de Dveloppement et

de Production au sein du CEA/DSV/Institut de Gnomique/Centre National de Gnotypage. Il

a t effectu sous la direction du Professeur Jean-Claude Tabet, Professeur mrite de

lUniversit Pierre et Marie Curie et du Docteur Ivo Gut, Directeur du Centro Nacional de

Analisis Genomico Barcelona et responsable du projet READNA.

Je tiens remercier le Docteur Mark Lathrop, ancien Directeur du CNG, et les membres de la

commission de formation du CEA pour mavoir permis deffectuer cette thse dans le cadre

dune formation professionnelle. Je tiens plus particulirement remercier le Professeur Jean-

Claude Tabet et le Docteur Ivo Gut davoir accept dtre mes directeurs de thse, pour le

temps quils ont consacr mes recherches et pour leurs disponibilits.

Je remercie vivement la Professeur Jeanine Tortajada et le Professeur Codjo Hountondji

davoir accept dtre rapporteurs ainsi que le Directeur de recherche Christian Rolando et le

Professeur Germain Trugnan davoir bien voulu tre examinateurs du jury de cette thse.

Je tiens galement remercier le Docteur David Gelfang, le Docteur Keith Bauer et le

Docteur Thomas Myers, de la socit ROCHE MOLECULAR pour leur collaboration

essentielle concernant le dveloppement des ADN polymrases.

Je remercie galement Jrmy Semhoun pour llaboration du logiciel de calcul des masses,

Caroline Horgues, Steven Mcginn, Jorg Tost et Alexandre How Kit pour leur collaboration

sur le projet de lanalyse de la mthylation de lADN et Ekatherina Darii pour son aide pour

les expriences par ESI-ITMSn. Je tiens galement remercier, Cline Besse, Christian

Daviaud, Cline Lacrouts davoir eu la gentillesse et la patience de corriger mon mmoire.

Enfin, je remercie la Communaut europenne pour le financement de cette tude au sein du

projet READNA 2008-2012.

Sommaire

3

Sommaire

Remerciements 2

Sommaire 3

Abrviation 11

Introduction gnrale 12

1. Les modifications de lADN 13

1.1. LADN 13

1.2. Les modifications de lADN 15

1.2.1. Les modifications de la squence 15

1.2.2. Les modifications pigntiques 16

2. Les mthodes danalyse de lADN 17

2.1. Le squenage de premire gnration 18

2.1.1. Le squenage de Sanger 18

2.1.2. Le squenage de Maxam et Gilbert 20

2.2. Le squenage de seconde gnration 20

2.2.1. Le squenage sur phase solide 20

2.2.2. Le squenage par hybridation sur puce 21

2.2.3. Le squenage cyclique sur puce 22

2.2.4. Le squenage par microlectrophorse 23

2.2.5. Le squenage par nanopore 23

2.3. Le squenage de nouvelle gnration NGS 24

3. Les mthodes danalyse de lADN par spectromtrie de masse 25

3.1. La spectromtrie de masse ESI-IT et MALDI-TOF 25

3.1.1. La spectromtrie de masse ESI-IT 25

3.1.2. La spectromtrie de masse MALDI-TOF 31

3.2. Les mthodes danalyse de lADN 42

3.2.1. Les mthodes directes 43

3.2.2. Les mthodes indirectes 45

Sommaire

4

4. Dveloppement de mthodes danalyse de lADN par clivage dune chimre

ARN/ADN et par spectromtrie de masse MALDI-TOF 47

4.1. Le principe 47

4.1.1. La chimre ARN/ADN 48

4.1.2. Le clivage de la chimre ARN/ADN 49

4.1.3. Lanalyse par MALDI-TOF MS 50

4.2. Les mthodes 51

4.2.1. Les mthodes actuelles 51

4.2.2. Le dveloppement de nouvelles mthodes 53

Chapitre 1. Analyse de la chimre ARN/ADN par spectromtrie de masse en tandem 55

1. Introduction 56

2. Matriels et Mthodes 58

2.1. Matriels 58

2.2. Mthodes 60

2.2.1. Le clivage 60

2.2.2. Le dessalage 60

2.2.3. Lanalyse par spectromtrie de masse MALDI-TOF/TOF 60

2.2.4. Lanalyse spectromtrie de masse ESI-IT 61

2.2.5. Les ions fragments 61

3. Rsultats 62

3.1. La chimre ARN/ADN 62

3.1.1. La formation de la chimre ARN/ADN 62

3.1.2. La nomenclature des ions fragments 62

3.1.3. Le seuil de dtection des chimres ARN/ADN par MALDI-TOF/TOF 63

3.2. Lanalyse des chimres ARN/ADN de 4-mer par MALDI-TOF/TOF 65

3.2.1. Les fragmentations en mode CID des chimres avec une base B4(A) 65

3.2.2. Les fragmentations en mode CID des chimres avec une base B4(C) 69

3.2.3. Les fragmentations en mode CID des chimres avec une base B4(G) 72

3.2.4. Les fragmentations en mode CID des chimres avec une base B4(U) 74

3.2.5. Le bilan des fragmentations en mode CID 76

Sommaire

5

3.3. Les fragmentations en phase gazeuse de la chimre GCTA 79

3.3.1. Limpact de la fluence du laser 79

3.3.2. Les fragmentations en mode CID par MALDI-TOF/TOF 83

3.3.3. Les fragmentations en mode CID par ESI-ITMSn 84

3.3.4. Le bilan des fragmentations en mode CID 95

3.4. Les fragmentations en mode CID des chimres ARN/ADN suprieures 4-mer par

MALDI-TOF/TOF 97

3.4.1. Les fragmentations en mode CID des chimres ARN/ADN de 5-mer 97



4. Discussion 106

4.1. Les conditions exprimentales 106

4.1.1. La prparation de la chimre ARN/ADN 106

4.1.2. Lanalyse par MALDI-TOF/TOF 107

4.2. Les fragmentations par MALDI-TOF-TOF de la chimre ARN/ADN 109

4.2.1. La dtection des ions 109

4.2.2. Les fragmentations en mode CID 110

4.2.3. Le squenage 114

4.3. Les fragmentations en mode CID de la chimre GCTA 114

4.3.1. Lanalyse par ESI-ITMSn 115

4.3.2. Les ions multichargs 115

4.3.3. Les fragmentations par spectromtrie de masse en tandem 116

5. Conclusion 117

Chapitre 2. Multiplex microhaplotypage par clivage dune chimre ARN/ADN simple-

brin et par MALDI-TOF MS 120

1. Introduction 121


2.1. Matriels 123

2.2. Mthodes 125

2.2.1. PCR 125

Sommaire

6

2.2.2. Llongation linaire par lADN polymrase G46E CS6R 126



2.2.5. Lanalyse par spectromtrie de masse MALDI-TOF 127

3. Rsultats 127

3.1. La PCR 128

3.2. La chimre ARN/ADN simple-brin 129

3.3. Le clivage de la chimre ARN/ADN 130

3.4. Le dessalage des fragments de clivage 130

3.5. Lanalyse des spectres de masse MALDI-TOF 130

3.5.1. La matrice HCCA 131

3.5.2. Les paramtres danalyse 131

3.5.3. Les microhaplotypes 131

3.5.4. Le microhaplotype ASTW du locus HLA-DRB1-227 132

3.5.5. Les microhaplotypes HCACH du locus HLA-A-98 et MGAR du locus HLA-A-453 134

3.6. Lanalyse des individus 135

4. Discussion 137

4.1. La PCR 137

4.2. La chimre ARN/ADN simple-brin 138

4.2.1. LADN polymrase G46E CS6R 138

4.2.2. Les amorces 138

4.3. Lanalyse des microhaplotypes 139



4.3.2. Lanalyse par MALDI-TOF MS 140

4.3.3. Les caractristiques de la mthode 140

5. Conclusion 141

Chapitre 3. Analyse de la mthylation de lADN par clivage dune chimre ARN/ADN

simple-brin et par MALDI-TOF MS 143

1. Introduction 144

Sommaire

7


2.1. Matriels 146

2.2. Mthodes 148

2.2.1. La conversion au bisulfite 148

2.2.2. Les mlanges dADN 149

2.2.3. La PCR 149

2.2.4. La purification de la PCR 150

2.2.5. Llongation linaire par lADN polymrase KB17 150




3. Rsultats 153

3.1. Le principe de la mthode 153

3.1.1. La conversion au bisulfite 154

3.1.2. La PCR 154

3.1.3. Llongation linaire par lADN polymrase KB17 155

3.1.4. Les fragments de clivage des CpGs 157


3.1.6. Lanalyse de la mthylation de lADN 162

3.2. Lanalyse du locus CDKN2A-msp1 163

3.2.1. Les fragments de clivage du locus 163

3.2.2. Llongation linaire ATP 166

3.2.3. Llongation linaire GTP 168

3.3. La quantification de la mthylation de lADN 169

3.3.1. La courbe dtalonnage du locus CDKN2A-msp1 170

3.3.2. La courbe dtalonnage du locus CDKN2A-msp3b 171


3.4.1. Les loci des gnes CDKN2A et RASSF1A 175

3.4.2. Lanalyse des loci des gnes CDKN2A et RASSF1A 175

Sommaire

8

3.4.3. Le pourcentage de mthylation de lADN des loci CDKN2A-msp1et msp3b 176

4. Discussion 178

4.1. La conversion au bisulfite 179

4.2. La PCR 179

4.2.1. Les amorces 179

4.2.2. Le biais de PCR 179

4.3. Lanalyse de la mthylation de lADN 181

4.3.1. Le re-squenage 181

4.3.2. Lanalyse des CpGs 182

4.3.3. La quantification de la mthylation de lADN 183


4.5. Lavantage de cette mthode 186

5. Conclusion 187

Chapitre 4. Re-squenage de lADN par clivage dune ribo-PCR et par MALDI-TOF

MS 189

1. Introduction 190


2.1. Matriels 192

2.2. Mthodes 193

2.2.1. La ribo-PCR par lADN polymrase KB17 193




3. Rsultats 196

3.1. La ribo-PCR par lADN polymrase KB17 197

3.2. Les fragments de clivage 197


3.3.1. Lanalyse du locus NOS1 201

3.3.2. Lanalyse du locus H19 204

3.3.3. Lanalyse du duplex des loci NOS1 et H19 207

Sommaire

9

3.3.4. Lanalyse du locus SLCO1B1 208


4. Discussion 213

4.1. LADN polymrase KB17 213

4.1.1. Les proprits 213

4.1.2. La squence spcifique damplification 213

4.1.2. Le multiplexage des ribo-PCRs 214

4.2. Lanalyse par MALDI-TOF MS 215

4.2.1. Le mode linaire 215

4.2.2. Ltalonnage 215

4.2.3. Lanalyse du double-brin 216

4.2.4. La dtection des fragments de clivage 216

4.3. Les avantages de la mthode 217

5. Conclusion 218

Chapitre 5. Multiplex allle-spcifique gnotypage par clivage dune riboPAP-PCR et

par MALDI-TOF MS 220

1. Introduction 221


2.1. Matriels 223

2.2. Mthodes 225

2.2.1. La riboPAP-PCR par lADN polymrase FP-1 225




3. Rsultats 227

3.1. Le principe de la mthode 227

3.2. La riboPAP-PCR par lADN polymrase FP-1 229

3.3. Les fragments de clivage 230


3.4.1. Lanalyse du locus NOS1 232

Sommaire

10

3.4.2. Lanalyse du locus H19 234

3.4.3. Lanalyse du duplex des loci SLCO1B1 235

3.4.4. Les flags du duplex des loci SLCO1B1 236


4. Discussion 244

4.1. La raction PAP 245

4.2. Les amorces 245

4.3. LADN polymrase FP-1 246

4.4. Les tags et les flags 247

4.5. Lavantage de la mthode 248

5. Conclusion 248

Conclusion gnrale et perspectives 250

Annexes 259

Annexe 1. SNP genotyping using alkali cleavage of RNA/DNA chimeras and MALDI-TOF

MS 260

Annexe 2. DNA sequencing by MALDI-TOF MS using alkali cleavage of RNA/DNA

chimeras 271

Annexe 3. Ribo-PCR. A facile method for the preparation of chimeric RNA/DNA applied to

DNA sequencing 283

Annexe 4. Ribonucleotide tag nucleic acid detection 297

Annexe 5. High specificity single tube multiplex genotyping using ribo-PAP PCR, tag

primers, alkali cleavage of RNA/DNA chimeras and MALDI-TOF MS 319

Rfrences bibliographiques 331

Abrviations

11

Abrviations

A : Adnine

ADN : Acide dsoxyribonuclique

ATP: Adnosine5triphosphate

ARN : Acide ribonuclique

C : Cytosine

CMe

: 5-mthylecytosine

CDKN2A :cyclin-dependent kinase inhibitor 2A

CpG : dinuclotide cytosine guanine

CEPH : Centre dEtude du polymorphisme Humain

- Fondation Jean DAUSET

CID : Collision-induced dissociation

CMH : Complexe dhistocompatibilit chez

lhumain

CTP : Cytidine 5triphosphate

Da : Dalton unit de masse molculaire des

biologistes

dATP : dsoxyadnosine 5triphosphate

dCTP : dsoxycytidine 5triphosphate

dGTP : dsoxyguanosine 5triphosphate

dNTP : dsoxynucloside 5 triphosphate

dTTP : dsoxythymidine 5triphosphate

ESI : dsorption/ionisation par lectronbulisation

Flag : brin dADN complmentaire de la Tag

G : Guanine

GTP : Guanosine 5triphosphate

H : Adnine ou Cytosine ou Thymine

H19 :gne situ sur le chromome 11

HCCA : acide -cyano 4-hydroxycinnamique

HLA : Antigne des leucocytes humains

HPA : acide 3-hydroxypicolinique

IT : Trappe ionique

kV : kilovolt

M : Adnine ou Cytosine

MALDI : Matrix-assisted laser

desorption/ionization

MS : Spectromtrie de masse

MS/MS : Spectromtrie de masse en tandem

NTP : ribonucloside 5triphospahte

NOS1 :oxyde nitrique acide neuronale

PAP : Polymrisation active par

pyrophosphorolyse

Pb : paire de bases

PCR : Raction de polymrisation en chane

R : Adnine ou Guanine

RASSF1A :Rass association domain-containing

protein 1

riboPAP-PCR : PCR active par

pyrophosphorolyse de chimre ARN/ADN

ribo-PCR : PCR de chimre ARN/ADN

S : Cytosine ou Guanine

SCLO1B1: Solute carrier organic anion transporter

family member 1B1

SNP : Single nucleotide polymorphisms

T : Thymine

Tag: squence rptitive

THAP : Trihydroxyactophnone

TOF : Time of Flight : temps de vol

Tris : tris(hydroxymethyl)aminomethane

U : Uracile

UMe

: 5-mthyluracile

UNG : Uracile-N-glycosylase

UTP : Uridine 5triphosphate

W : Adnine ou Thymine

Y : Thymine ou Cytosine

Introduction gnrale

12

Introduction gnrale

Introduction gnrale

13

Introduction gnrale

En 1990, le projet du gnome humain a eu pour but le squenage du gnome entier. Il sest

achev en 2004 grce un consortium public international (Lander et al. 2001) et une

compagnie prive Celera Genomics (Venter et al. 2001). Il a permis ltude de linformation

gntique porte par lensemble du gnome humain qui contient environ 20 000 gnes.

Depuis, les projets de recherche se focalisent sur lanalyse des modifications de la squence

de lADN, notamment ltude des polymorphismes ou de la mthylation de lADN. Les

mthodes de squenage actuellement dveloppes visent au re-squenage de lADN afin

dtudier les polymorphismes pouvant servir de marqueurs pour didentification de maladies

hrditaires. Le dveloppement de nouvelles mthodes efficaces, rapides, rentables, est donc

une ncessit pour lavance de la biologie molculaire.

Les travaux raliss au cours de ce projet de thse ont pour but la mise au point de mthodes

danalyse de lADN par clivage dune chimre ARN/ADN et par spectromtrie de masse

MALDI-TOF. Ce projet rentre dans le cadre du projet europen, READNA (REvolutionary

Approaches and Devices for Nucleic Acid analysis), 2008-2012, visant dvelopper de

nouvelles mthodes danalyse de lADN.

Tout dabord, les modifications de lADN seront exposes. Puis, les principales mthodes

danalyses de lADN et celles par spectromtrie de masse MALDI-TOF seront dcrites.

Enfin, le principe de ce travail, qui est le dveloppement de mthodes danalyse des

modifications de lADN par clivage chimique dune chimre ARN/ADN et par spectromtrie

de masse MALDI-TOF sera dtaill.

1. Les modifications de lADN

1.1. LADN

LADN est une macromolcule qui est compose de nuclotides. Sa structure a t dcouverte

en 1953 par Watson et Crick (Watson et Crick. 1953). LADN gnomique humain est

constitu de 23 paires de chromosomes et contient 3,3 milliards de nuclotides.

Introduction gnrale

14

Les nuclotides sont composs dun groupement phosphate (ou acide phosphorique), dun

aldopentose (2-doxy-D-ribose pour lADN et D-ribose pour lARN) et dune base

htrocyclique azote (purine ou pyrimidine).

La molcule dADN est constitue de quatre bases. La cytosine (C), la thymine (T) (pour

lADN et luracile (U) pour lARN) drivent de la pyrimidine tandis que ladnine (A) et la

guanine (G) drivent de la purine (figure 1).

Figure 1 : Les diffrentes bases de lADN: ladnine, la guanine, la thymine (luracile pour lARN) et

la 5-mthylcytosine et la 5-hydroxymthylcytosine qui drivent de la cytosine.

De plus, chez les mammifres, la cytosine adjacente base guanine formant ainsi un

dinuclotide CpG, peut tre mthyle. La 5-mthylcytosine est considre comme tant la

cinquime base mais sa frquence dans le gnome humain nest que denviron 1%. Enfin, la

5-hydroxymthylcytosine a t rcemment dcouverte dans les neurones et les cellules

Introduction gnrale

15

souches embryonnaires de mammifres et elle est synthtise partir de la 5-mthylcytosine

par une raction doxydation catalyse par la protine TET (Kriaucionis et Heintz. 2009;

Tahiliani et al. 2009).

Les bases sont relies par la liaison entre la liaison N osidique entre le 9-N des purines ou 1-

N des pyrimidines et le 1- du sucre. Une liaison ester relie le groupement phosphate au sucre

en position 3. Les nuclotides sont lis entre eux par lintermdiaire du groupement

phosphate en position 5 du nucloside adjacent.

LADN est compos dun double-brin formant une hlice. Ces deux brins, orients dans le

sens 5 vers 3, sont relis entre eux par des liaisons hydrognes entre les bases purines dun

brin et les bases pyrimidines de lautre brin. Les bases sont complmentaires deux deux,

deux liaisons hydrognes relient ladnine et la thymine tandis que trois liaisons hydrognes

relient la cytosine et la guanine. Les deux brins sont complmentaires et antiparallles.

1.2. Les modifications de lADN

La nature, lordre de la squence des bases A, C, G, T constitue un code gntique qui

dtermine le caractre phnotypique de chaque individu. Il existe deux catgories de

modifications de lADN : des modifications de la squence et les modifications pigntiques.

1.2.1. Les modifications de la squence

Tout dabord, un SNP (Single Nucleotide Polymorphism) est une modification dun

nuclotide une position donne du gnome, comprenant en gnrale deux allles. Il

reprsente la forme la plus abondante de variations gntiques : sa frquence est suprieure

1 % dans la population et il est prsent environ toutes les 1000 pb dans le gnome humain. Il

est considr comme un marqueur idal pour tudier la diversit des populations, les maladies

et le traitement adquat administrer au patient.

Un microsatellite est une squence rptitive de 2 10 nuclotides. Un motif donn peut tre

prsent des milliers dexemplaire dans le gnome. Il est prsent dans tout le gnome et le

plus frquemment au niveau des introns et des exons du gne. La localisation des squences

tant bien conserve, le nombre de rptition constitue un marqueur gntique.

Introduction gnrale

16

Il peut y avoir galement une dltion ou insertion dun ou plusieurs nuclotides.

Enfin, les mutations dune ou plusieurs bases sont gnralement spontanes mais des facteurs

mutagnes, comme la radioactivit, lenvironnement et certains produits chimiques peuvent

les provoquer. Leurs frquences sont infrieures 1 % dans le gnome.

1.2.2. Les modifications pigntiques

1.2.2.1. La mthylation de lADN

LADN peut tre galement modifi autour de sa squence, cest une modification

pigntique. Ces modifications interviennent sur la structure de lADN et nimpliquent

aucun changement de la squence primaire. Ces mutations pigntiques sont plus frquentes

que les mutations classiques de lADN.

Dans le gnome humain, lADN est mthyl sous la forme de la 5-mthycytosine dun

dinuclotide CpG. Cette modification post-rplicative, est un transfert, par lADN

mthyltransfrase (DNMT), du mthyle de la S-adnosyl-L-mthionine (SAM) alors convertie

en S-adnosylhomocystine (SAH) sur une cytosine dun dinuclotide CpG (Smith et al. 1992;

Svedruzi 2008).

1.2.2.2. Les lots CpGs

De 60 90% des dinuclotides CpGs sont mthyls et sont localiss dans les rgions de

chromatines condenses. Ils sont par consquent inaccessibles au processus de transcription.

Cependant, des regroupements de dinuclotide CpGs denvirons 1 4 kb, sont appels lots

CpG et constituent des marqueurs pigntiques.

Les lots CpGs ont une teneur en dinuclotide CpGs de plus de 50%, une longueur suprieure

200 pb et un ratio suprieur 0,6 du nombre observ de dinuclotides CpG par rapport au

nombre de bases C et G prsentes dans le segment (Gardiner-Garden et Frommer. 1987). Ils

sont concentrs en majorit dans les rgions promotrices et celles du premier exon de la

plupart des gnes. Environ 30 000 lots CpG, se rpartissent en moyenne tous les 100 kb

recouvrant ainsi environ 1 2 % du gnome (Antequera et Bird. 1993). 75 % des sites de

Introduction gnrale

17

transcription et 88 % des promoteurs actifs sont associs des lots CpGs et pourraient tre

rguls par la mthylation de lADN.

Les rgions diffrentiellements mthyles (DMR) vont essentiellement agir sur la rgulation

de lexpression du gne. Elles peuvent se produire spontanment ou en rponse

lenvironnement et conduisent des changements des tats dactivation ou dinhibition des

gnes. Leurs tudes suscites depuis plusieurs annes un grand intrt car elles permettent

notamment ltude de maladies comme les syndromes lis la perte dempreinte parentale et

certains cancers dtiologie non identifis (Robertson 2005).

1.2.2.3. Les marqueurs pigntiques potentiels

Par ailleurs, les rgions situes proximit (environ 2 kb) des lots CpGs qui contiennent une

plus faible densit sont appels lots CpG Shore. Ils seraient en relation dans certains cancers

avec les DMR (Irizarry et al. 2009). Ces rgions prsentent une forte corrlation inverse entre

la mthylation et l'tat de l'expression des gnes. Les DMR associs ces lots CpGs Shore

peuvent distinguer diffrents types de cancers (Hansen et al. 2011).

Ltude des marqueurs pigntiques pourrait donc tre tendue ltude du mthylome

entier, plutt de se concentrer que sur ltude seule des lots CpGs. Le mthylome contient des

rgions de moins en moins denses dlots CpGs : les lots CpGs Shore (adjacents aux lots

CpGs), les lots CpGs Shelf (adjacents aux lots CpGs shore) et les lots Open-sea ou Ocean

(isols dans le gnome).

Enfin, des tudes rcentes suggrent que la 5-hydroxymthylcytosine pourrait tre galement

un marqueur pigntique (Ruzov et al. 2011) et avoir un rle biochimique en tant

qu'intermdiaire dans le procd de dmthylation de l'ADN (He et al. 2011; Maiti et Drohat

2011).

2. Les mthodes danalyse de lADN

Diffrentes mthodes de squenage de l'ADN ont t dveloppes : le squenage de

premire gnration : par la mthode de Sanger et par la mthode de Maxam et Gilbert ; le

squenage de deuxime gnration : sur phase solide, par hybridation, par spectromtrie de

Introduction gnrale

18

masse (partie 3.2), cyclique sur puce, par microlectrophorse et par nanopore et le

squenage de nouvelle gnration NGS (Next Generation Sequencing) est galement en

cours de dveloppement car ce domaine est en pleine mutation (Shendure et al. 2011).

Par ailleurs, il est difficile d'affirmer avec certitude quelle sera la mthode la plus adapte

pour une problmatique donne. Toutefois, certains paramtres sont importants pour le choix

de la mthode adquate, comme le cot, l'exactitude des donnes, la fiabilit de la mthode, la

capacit haut-dbit et la longueur des squences. Le dveloppement de protocoles robustes,

simples pour la construction de bibliothque et la cration d'outils bio-informatiques pour

l'interprtation des quantits massives de donnes sont des dfis majeurs pour lessor de

nouvelles mthodes danalyse de lADN.

2.1. Le squenage de premire gnration

Dans les annes 1970, les deux premires mthodes de squenage de lADN ont t

dveloppes indpendamment. Lapproche de Sanger est une synthse enzymatique tandis

que celle de Maxam et Gilbert est une dgradation chimique. Frederik Sanger et Walter

Gilbert ont obtenus le prix Nobel de chimie en 1980 pour cette dcouverte.

2.1.1. Le squenage de Sanger

Le squenage par didsoxy de Sanger ou squenage enzymatique (Sanger et al. 1977;

Sanger et al. 1977; Sanger 1988) implique une ADN polymrase , ADN dpendant,

synthtisante une copie complmentaire du simple-brin d'ADN partir de lextrmit 3 de

lamorce. Le principe de la mthode est illustr dans la figure 2.

http://fr.wikipedia.org/wiki/Prix_Nobel_de_chimie

Introduction gnrale

19

Figure 2 : Schma de principe du squenage didsoxy de Sanger, reproduit et modifi dApplied

Biosystems ladresse internet suivant : (http: // www3.appliedbiosystems.com/ cms/ groups/

mcb_support/ documents/ generaldocuments/ cms_041003.pdf).

Lors de llongation linaire, le dsoxynuclotide ajout est complmentaire du nuclotide du

brin d'ADN. La cration d'un pont phosphodiester entre le groupement 3-OH de l'extrmit

de l'amorce et le groupement 5-phosphate du dsoxynuclotide incorpor allonge la chane.

Les quatre dsoxyribonuclotides (dATP, dCTP, dGTP et dTTP) sont ajouts, ainsi quune

faible concentration de l'un des quatre didsoxyribonuclotides (ddATP, ddCTP, ddGTP ou

ddTTP). Les didsoxyribonuclotides incorpors dans le brin synthtis empchent la

poursuite de llongation. La faible concentration du didsoxynuclotide par rapport au

dsoxynuclotide entrane statistiquement un mlange de fragments dADN de tailles

diffrentes se terminant tous par un didsoxynuclotide. Cette terminaison permet didentifier

la position de la base du nuclotide dans la squence dADN. Plusieurs longations sont

ralises en parallle avec les quatre didsoxynuclotides diffrents.

Ces fragments sont ensuite spars par lectrophorse sur gel de polyacrylamide ou sur

squenceur capillaire. La dtection des fragments est ralise par lintermdiaire dun

marqueur radioactif ou fluorescent. Le marqueur radioactif (isotopes 32

P, 33

P ou 35

S) est port

http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/generaldocuments/cms_041003.pdfhttp://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/generaldocuments/cms_041003.pdfhttp://fr.wikipedia.org/wiki/DNTPhttp://fr.wikipedia.org/wiki/Did%C3%A9soxyribonucl%C3%A9otidehttp://fr.wikipedia.org/wiki/Did%C3%A9soxyribonucl%C3%A9otidehttp://fr.wikipedia.org/wiki/%C3%89lectrophor%C3%A8se_sur_un_gel_de_polyacrylamide

Introduction gnrale

20

par le dsoxynuclotide ou le didsoxynuclotide (Tabor et al. 1987). Le marqueur

fluorescent est fix soit sur lamorce soit sur les didsoxynuclotides.

Le squenage enzymatique a t le plus rpandu pendant de nombreuses annes et a permis

le squenage du projet du gnome humain.

2.1.2. Le squenage de Maxam et Gilbert

La mthode de Maxam et Gilbert est une mthode de dgradation chimique de lADN.

Chaque base A, C, G et T possdent des ractivits diffrentes et peuvent donc tre modifies

afin dtre clives slectivement (Maxam et Gilbert 1977). La squence du brin dADN est

dtermine laide de lassemblage de lordre de coupure des bases des fragments de clivage.

Cette mthode est constitue de 6 tapes. Un marquage radioactif par le 32

P est ralis sur les

extrmits des deux brins d'ADN. Le fragment dADN tudier est alors slectionn et les

deux brins dADN sont ensuite spars. Les bases dADN sont modifies spcifiquement et

paralllement : les bases G sont alkyles, les bases A et G sont dpurines et les bases C et T

sont hydrolyses. La pipridine permet alors de cliver le brin dADN aprs chaque base

modifie. Lanalyse des fragments de clivage est similaire celle de la mthode de Sanger.

Les fragments dADN sont spars par lectrophorse capillaire afin de reconstituer la

squence dADN.

Les inconvnients de cette mthode sont lanalyse de fragments d'ADN de moins de 250 pb et

lutilisation de ractifs chimiques toxiques.

2.2. Le squenage de seconde gnration

2.2.1. Le squenage sur phase solide

Linnovation de cette mthode est de gnrer des simple-brins dADN (Hultman et al. 1989;

Jones et al. 1991; Kaneoka et al. 1991; Zimmerman et al. 1992.) par la capture sur une phase

solide. Un des deux brins d'ADN est biotinyl via une raction de PCR pour laquelle une des

deux amorces est biotinyle. La molcule d'ADN hmi-biotinyl est alors fixe sur des billes

http://fr.wikipedia.org/wiki/Did%C3%A9soxyribonucl%C3%A9otide

Introduction gnrale

21

magntiques de streptavidine, formant un complexe spcifique avec la biotine. Les brins sont

spars par lavage des billes par une solution basique. Les brins biotinyls sont alors spars

par lintermdiaire dun aimant. Les ractions de squenage peuvent tre effectues

indpendamment : par le brin biotinyl, par le brin non biotinyl ou par les deux.

Le squenage chimique sur phase solide par capture au niveau des terminaisons

didsoxynuclotides limine les inconvnients du marquage chimique de l'amorce et des

terminaisons, les amorces fluorescentes tant couples la phase solide par capture des

terminaisons didsoxynuclotides (Ju. 1999). Aprs la raction de squenage, les fragments

d'ADN biotinyls sont capturs par les billes magntiques recouvertes de streptavidine, tandis

que les autres composants de la raction de squenage sont lavs. Seuls les brins constitus

de la terminaison didsoxynuclotide sont librs des billes magntiques et donc squencs.

Cette mthode permet dviter llongation possible de lautre brin complmentaire de lADN

par lamorce et ainsi damliorer la fiabilit des rsultats.

2.2.2. Le squenage par hybridation sur puce

Le principe du squenage par hybridation (SBH) repose sur lutilisation de puces ADN.

Elles sont constitues de multiples sondes, utilises pour dcoder la squence d'ADN. LADN

est fractionn en de multiples fragments et hybrid sur la puce laide de sondes

complmentaires. La puce dADN est ensuite analyse par la dtection des oligonuclotides

hydrids. Lanalyse par informatique des diffrentes portions de la squence dADN permet

ensuite de reconstituer la squence entire de lADN.

Le principal avantage de cette approche est le re-squenage du gnome de lindividu par la

comparaison de sa squence avec celle dune squence de rfrence. Le mme concept est

utilis par plusieurs plates-formes de gnotypage (Affymetrix et Perlegen-Pfizer) sur puce

mais seuls les polymorphismes prdfinis peuvent tre dtects alors quavec cette mthode

tous les polymorphismes sont identifis.

Labsence de recouvrements redondants de la squence pour assurer la fiabilit des analyses

contrairement dautres mthodes de squenage constitue une limitation de cette mthode. Il

peut en rsulter un taux lev de faux positif (3 %) (Patil et al. 2001).

Introduction gnrale

22

Cette mthode est trs prcise pour ltude de petits gnomes haplodes (Gresham et al. 2006)

contrairement ltude des grands gnomes diplodes du fait de leur htrognit. Une

approche en deux tapes a t dveloppe pour ltude des gnomes bactriens (Albert et al.

2005; Herring et al. 2006) : la dcouverte de lemplacement approximatif des mutations et

suivie de la cartographie plus prcise des mutations.

2.2.3. Le squenage cyclique sur puce

Les plates-formes actuelles de squenage (de 454/Roche, Illumina, Applied Biosystems / Life

Technologies, Dover, Helicos Biosciences, et Ion Torrent-Life Technologie) ne reposent pas

sur le squenage de Sanger mais sur le principe dun squenage cyclique sur puce (figure 3)

( Shendure et Ji 2008; Metzker 2009).

Figure 3 : Schma de principe du squenage cyclique sur puce, reproduit et modifi du site internet

ladresse suivante : http:/ /www.currentprotocols.com/protcol/mb0701.

Il permet de faibles cots par le dcodage bidimensionnel sur puce de millions

(potentiellement de milliards) de bases de diffrents fragments dADN. Ces fragments

dADN, de squences individuelles, peuvent tre squencs.

Le squenage est clonal car chaque fragment contient une seule espce d'ADN (une seule

molcule ou plusieurs identiques) immobilise sur la puce. Les fragments peuvent tre

disposs de faon ordonn ou alatoire. Chaque squence d'ADN comprend gnralement une

squence inconnue d'intrt corrle avec celles des adaptateurs universels. Un point

important de cette approche est de pouvoir utiliser un volume de ractif unique sur la puce et

de tout raliser en parallle grce aux fragments analyss sur une mme surface.

Introduction gnrale

23

Le squenage est cyclique car chaque cycle une tape enzymatique identifie la nature et la

position de la base de chaque squence en parallle. Lidentification seffectue par

fluorescence dun groupement fix, ou par la mesure de la libration de proton. la fin de

chaque cycle, les donnes sont acquises par un capteur CCD (Charged Coupled Device) ou

par une puce semi-conducteur agissant comme un pH-mtre (Torrent Ion). Les cycles

suivants dterminent les positions des bases. Une squence pour chaque fragment d'ADN peut

tre dtermine par l'analyse de la srie complte des donnes couvrant sa position.

Les diffrentes plates-formes du squenage cyclique sur puce reposent sur le mme principe

de base mais diffrent par la mthode utilise pour gnrer les fragments d'ADN, par la

biochimie utilise pour effectuer le squenage cyclique et par la mthode de dtection.

2.2.4. Le squenage par microlectrophorse

Le squenage classique de Sanger est ralis avec des volumes de ractifs de lordre du

microlitre. Un des objectifs de la microlectrophorse est lutilisation de la miniaturisation

dveloppe dans l'industrie des semi-conducteurs pour permettre une miniaturisation du

squenage classique didsoxy (Paegel et al. 2003). Par exemple, une nanolectrophorse sur

gel par canaux sur la surface d'une plaquette de silicium (Emrich et al. 2002) a t

dveloppe.

Lobjectif le plus important est l'intgration d'une srie dtapes de squenage lies (par

exemple, l'amplification par PCR, la purification du produit, et le squenage) dans un lab-on-

a-chip (Blazej et al. 2006; Forster et al. 2008.).

Lavantage de cette approche est lapplication du squenage classique ayant prouv sa

robustesse et son efficacit pour des squences de plus de 1000 bases. Cependant, le

squenage par microlectrophorse peut s'avrer critique pour la poursuite de la tendance

la rduction des cots.

2.2.5. Le squenage par nanopore

Une nouvelle approche de squenage, initialement propos dans les annes 1980, consiste

dans le passage dun seul brin dADN travers un nanopore (Deamer et Akeson 2000) (figure

4).

Introduction gnrale

24

Figure 4 : Image dun nanopore reproduite avec laccord dOxford Nanopore Technologies.

Un nanopore est une protine membranaire : l'-hmolysine (Kasianowicz et al. 1996), la

MspA (Mycobacterium smegmatis porin A) (Derrington et al. 2010) ou une protine

synthtique (Fologea et al. 2005). Il est modifi chimiquement par fixation covalente dune

cyclodextrine sur sa surface intrieure. Cette modification constitue un site de liaison pour les

bases de l'ADN simple-brin et permet une mesure prcise de son passage travers le

nanopore.

Deux mthodes sont en cours de dveloppement, une mthode exonuclase (Hornblower et al.

2007) et une mthode de polymrisation (Lieberman et al. 2010). Les quatre nuclotides

obstruent le nanopore de manire spcifique. La variation de la conductance travers le

nanopore peut alors tre mesure pour en dduire la squence d'ADN.

Le squenage par nanopore prsente un grand potentiel dans le squenage rapide et rentable

de mlanges dADN par lintermdiaire de prparations dchantillons relativement simple.

Cependant, le dveloppement technologique de cette mthode sera ncessaire pour garantir

l'exactitude de lanalyse de grandes squences dADN partir d'un mlange complexe

d'ADN.

2.3. Le squenage de nouvelle gnration NGS

Introduction gnrale

25

De nouvelles mthodes sont en cours de dveloppement. Il s'agit notamment du squenage

par microscopie lectronique transmission (TEM) (Thomas et al. 2008.; Tanaka et Kawai

2009) et du squenage optique (Xiao et Kwok. 2008; Zhou et al. 2008).

Dans la mthode de squenage TEM, de longs fragments d'ADN sont disposs sur les grilles

des puces ayant incorpors diffrents nuclotides contenant un nombre diffrents de protons.

Le diffrentiel de charge est dtect et analys.

Dans le squenage optique, de grands fragments d'ADN sont disposs sur des lames de verre.

Des tapes enzymatiques permettent la cration de trou de 20 50 pb dans l'ADN ou l'ADN

peut tre galement tendu en raison de son lasticit. Les trous peuvent tre combls par une

ADN polymrase et des nuclotides marqus par fluorescence qui sont ensuite analyss par

microscopie.

3. Les mthodes danalyse de lADN par spectromtrie de masse

Au cours de la dernire dcennie, la spectromtrie de masse s'est impose pour lanalyse du

domaine mergeant de la protomique mais elle est galement utilise dans le domaine de la

gnomique.

Les acides nucliques, sont des biopolymres polaires et sont analyss notamment par une

source ESI (Electrospray Ionization) ou par une source MALDI (Matrix-Assisted

Desorption/Ionisation). Ces deux techniques dionisation/dsorption permettent danalyser

des molcules de quelques dizaines de femtomoles quelques picomoles. Les

oligonuclotides sont plus difficiles analyser que les protines. Tout dabord, ils ont

tendance former des adduits cationiques avec les ions sodium ou potassium prsents dans

lchantillon, formant des liaisons ioniques avec les groupements phosphodiesters. De plus,

ils ont tendance se fragmenter facilement en perdant les bases nucliques. La stabilit des

oligonuclotides est plus importante par ionisation MALDI que par ionisation ESI. Enfin, les

oligonuclotides peuvent tre analyss en mode positif et ngatif mais, en mode ngatif, le

pouvoir rsolutif et la sensibilit sont bien meilleurs surtout par ESI.

3.1. La spectromtrie de masse ESI-IT et MALDI-TOF

3.1.1. La spectromtrie de masse ESI-IT

Introduction gnrale

26

La source ESI est gnralement couple un analyseur pige ionique (ou trappe) (IT : Ion

Trap) (figure 5).

Figure 5 : Schma de principe dun Esquire

TM ESI-ITMS

n reproduit et modifi de Bruker Daltonics

.

3.1.1.1. La source ESI

La source ESI a t dveloppe par Fenn (Yamashita et Fenn 1984; Fenn et al. 1989). Elle

permet danalyser des macromolcules telles que les polymres et les biopolymres mais

aussi des petites molcules polaires. Elle est la plus rpandue car elle est trs sensible et

quelle peut-tre couple la chromatographie liquide ou llectrophorse capillaire

permettant ainsi ltude de mlanges complexes.

3.1.1.1.1. Le principe

Lors de lionisation/dsorption par ESI, une diffrence de potentiel de 3 6 kV entre le

capillaire et la contre-lectrode, spars de 0,3 2 cm, gnre un champ lectrique. Ce champ

est appliqu, pression atmosphrique, sur une solution nbulise partir dun tube capillaire

faible dbit (1 100 L/min). Il engendre une accumulation de charges la surface du

liquide lextrmit du capillaire, produisant ainsi un brouillard (ou spray) (Yamashita et

Fenn 1984; Smith et al. 1990; Loo et al. 1989; Ikonomou et al. 1990).

Lorsque la tension lectrique est faible les gouttelettes semblent sphriques mais lorsque la

force exerce est suprieure la tension superficielle, la surface se rompt pour former un cne

de taylor et un spray de gouttelettes. Fortement charges, elles sont constitues notamment de

Introduction gnrale

27

lanalyte et de llectrolyte de la solution introduite dans le capillaire et des ions en excs. La

charge de ces ions dpend du potentiel appliqu au capillaire par rapport la contre-lectrode

(ions positifs correspond une diffrence de potentiel positif) et des proprits des

solvants.

Lvaporation du solvant de chaque gouttelette provoque leur rtrcissement et augmente leur

densit de charge jusqu leur explosion coulombienne conduisant la dsorption des ions

(Kebarle et Tang 1993). Ces ions solvats possdent un grand nombre de charges, dpendant

des sites ionisables de la molcule qui permettent les changes de protons ou la formation

dions cationiques ou anioniques.

Le flux dions produit dans llectrospray doit tre compens par un courant dlectrons au

niveau du capillaire (Kebarle et Tang 1993). Llectrospray est donc un processus

lectrochimique qui produit un courant doxydation ou de rduction lextrmit du capillaire

permettant ainsi de fixer la quantit dions forms. Le courant ionique total atteint

gnralement environ 1 A.

3.1.1.1.2. Les facteurs influenant lionisation/dsorption ESI

Llectrospray est une source dions courant constant (Van Berkel et Zhou. 1995). Le

courant est donc partag par tous les constituants de la solution engendrant ainsi une

diminution du signal de lanalyte. Par consquent, la solution doit tre dessale afin de

permettre une meilleure ionisation.

Le flux et la concentration dions doivent tre suffisants afin dassurer un courant ionique

constant. Si le flux nest pas suffisant, il faudra produire plus dions par oxydation (en mode

positif) ou par rduction (en mode ngatif). Sil est trop important, le signal diminue car le

courant est constant et il devient difficile de maintenir un bon spray dans ce cas.

Le courant d lanalyte varie linairement avec sa concentration jusqu se rapprocher de

celui du courant constant. Comme le courant reste constant, le courant de lanalyte rentre en

comptition avec celui des autres ions pour le partage de ce mme courant cause du facteur

cintique de chaque espce. Le courant des autres ions va donc dcrotre quand la

concentration de lanalyte augmente.

Introduction gnrale

28

De plus, sil y a comptition entre deux espces, celle qui est la plus hydrophobe permet une

meilleure dsorption. Il peut en rsulter une disparition dune des deux espces du spectre de

masse mais en diminuant la concentration elle pourra tre de nouveau dtectable.

Ce mme phnomne de comptition entre deux espces est observ en maintenant la

concentration mais un trs faible flux (nanospray).

3.1.1.1.3. Les ions multichargs

Lionisation/dsorption par ESI de grosses molcules possdant des sites ionisables produit

des ions multichargs (une charge pour environs 500 Da). La formation de ces ions de rapport

m/z faible permet damliorer la sensibilit et ainsi analyser des masses molculaires trs

importantes allant au-del des limites en masse (m/z avec z=5) de linstrument.

Les spectres de masse ESI de grosses molcules correspondent gnralement une

distribution de pics conscutifs caractrisant des espces molculaires multicharges par

protonation (M+zH)Z+

ou dprotonation ( M-zH)Z+

de rapport m/z. Les rapports m/z de deux

ions dune mme molcule, multicharge mais qui diffrent par un tat de charge, permettent

de dterminer la masse de la molcule. Des algorithmes permettent la dconvolution du

spectre de masse en transformant les pics des ions qui correspondent aux molcules

multicharges en formes molculaires monocharges afin den dterminer la masse

molculaire.

De plus, seuls les mlanges simples peuvent tre directement analyss cause des nombreux

ions multichargs qui se superposent et rendent le spectre de masse ininterprtable. Seuls les

instruments trs hautes rsolutions permettent de lever les ambiguts. Les mlanges plus

complexes sont analyss par couplage avec la chromatographie liquide afin de sparer les

diffrentes molcules.

3.1.1.2. Lanalyseur pige ionique

Il existe trois types danalyseur pige ionique (ou trappe) : le pige ionique classique (ou

3D), le pige ionique linaire (ou 2D) et le pige ionique quadrologarithmique transforme

de Fourrier (FT) lectrostatique (ou orbitrap).

Introduction gnrale

29

3.1.1.2.1. Le pige ionique classique

3.1.1.2.1.1. Le principe

Le pige ionique classique, 3D, est le plus ancien et le plus rpandue. Il est constitu dune

lectrode circulaire ferme aux extrmits par deux calottes sphriques (Stafford et al. 1984)

(figure 5). La superposition de tensions continue et alternative (RF) permet de crer un champ

quadripolaire trois dimensions o les ions sont pigs sur des trajectoires complexes (3 D).

Tous les ions prsents simultanment dans le pige ionique, sont ensuite jects en fonction

de leur masse par augmentation de lamplitude de la tension RF. Ljection rsonante des ions

se fait par application sur les calottes de la frquence de lion. Lamplitude du mouvement de

lion augmente donc jusqu absorber une quantit dnergie suffisante pour tre ject du

pige ionique. Lors de lenregistrement du spectre de masse, les ions sont toujours jects

une frquence rsonante qui correspond un champ particulier. Pour une faible gamme de

rapport m/z, ils sont jects au champ quadripolaire qui correspond en gnrale la moiti de

la frquence de la tension RF tandis que pour une gamme de rapport m/z plus leve, ils sont

jects au champ hexapolaire qui correspond une frquence djection plus faible.

Deux approches mathmatiques complmentaires sont proposes pour expliquer le

fonctionnement du pige ionique. Lapproche base sur la recherche des solutions de

lquation de Mathieu qui conduit aux quations suivantes (valables si =2

:

az

qz

Une autre approche mathmatique base sur les mthodes de Floquet et de Fourrier dcrit le

mouvement des ions laide dun terme e (avec =+i) pour trouver les conditions dune

trajectoire stable. Les conditions =0 et compris entre 0 et 1 ( nombre non entier pour

maintenir les ions dans le pige ionique) doivent tre remplies simultanment suivant r et z. Si

=1, cest ljection quadripolaire.

3.1.1.2.1.2. La source ESI et le pige ionique 3D

Introduction gnrale

30

Lutilisation dune source ESI et de ljection rsonante permet danalyser des ions de

rapports m/z maximum de 6000 Th pour un EsquireTM

de Bruker et dtudier les

fragmentations en phase gazeuse des ions par expriences MSn

squentielles.

Pour que les ions restent stocks dans le pige ionique, ils doivent tre ramens au centre du

pige ionique malgr les rpulsions coulombiennes au sein du nuage dions. Si les ions sont

trop loigns du centre, la rencontre de rsonance non linaire apparait et conduit ljection

non contrle des ions. Le gaz, dhlium est introduit dans le pige ionique pour engendrer de

multiples collisions avec les ions afin de les ramener au centre du pige ionique par une

relaxation cintique.

La prsence dhlium dans le pige ionique permet galement dexister un ion donn en lui

appliquant sa frquence propre au niveau des calottes. Lamplitude des ions augmentent sans

modifier leur frquence permettant ainsi daugmenter leur nergie cintique. Les ions

acquirent donc de lnergie interne afin de favoriser le processus CID (Collison Induced

Dissociation).

En les expulsant slectivement, lanalyse MS/MS dun ion de rapport m/z par processus

conscutifs choisis est ralise. Des ions prcurseurs peuvent tre slectionns. La

spectromtrie de masse en tandem est donc ralise par squences temporelles et pas dans

lespace comme pour lanalyseur temps de vol ou multiple quadriple.

3.1.1.2.2. Les autres piges ioniques

Le pige ionique linaire ou 2D est constitu de 4 barres analogues celle dun quadriple,

ferm par des lectrodes dentre et de sortie permettant de repousser les ions vers lintrieur

du quadriple afin de diminuer les rpulsions coulombiennes (Douglas et al. 2005). Il possde

les mmes caractristiques que le pige ionique classique avec quelques modifications des

tensions dentre et de sortie afin dviter les effets de champs aux limites (fringe fields).

Lorbitrap est compos dune lectrode externe en forme de tonneau qui est spare par un

espace troit en deux parties gales (Makarov. 2000). Llectrode centrale a une forme de

fuseau. Les ions sont injects dans le pige ionique au niveau dune des extrmits par un

champ quadrologarithmique. Ce champ conduit la rotation des ions autour du fuseau avec

un mouvement axial daller et retour formant ainsi une spirale. Pour une gamme de rapport

Introduction gnrale

31

m/z leve, la spirale est constitue dun grand rayon et dune faible amplitude tandis que

pour une gamme de rapport m/z faible, la spirale possde un plus faible rayon et une

amplitude plus grande. Les ions de rapport m/z faible ont donc une frquence plus grande que

ceux de rapport m/z plus levs.

Le signal est analys au niveau du signal transitoire. Le signal transitoire doit durer le plus de

temps possible afin dobtenir une meilleure rsolution. Le pouvoir rsolutif, aprs transforme

de fourrier, peut tre suprieur 100000 Rs. Ce pige ionique, peu sensible aux effets de

charge de lespace permet danalyser un grand nombre dions.

3.1.2. La spectromtrie de masse MALDI-TOF

La source MALDI est une dsorption-ionisation laser assiste par matrice (Karas et al. 1985;

Karas et al. 1987; Karas et Hillenkamp 1988; Karas et Bahr. 1990). Historiquement, elle est

principalement associe un analyseur temps de vol (TOF) car il ncessite une source

dionisation pulse.

Cette technique de dsorption et dionisation douce permet lanalyse des biomolcules

(oligonuclotides, peptides, protines et oligosaccharides) de haute masse molculaire (MDa)

(Tanaka et al. 1988). Facile mettre en uvre, elle prsente une certaine tolrance aux sels et

aux tampons utiliss en biologie molculaire. Elle est donc adapte ltude de biomolcules

comme lADN et aux mlanges.

Le spectromtrie de masse MALDI-TOF se compose: dune source MALDI produisant les

ions en phase gazeuse, dun analyseur temps de vol sparant les ions en fonction de leur

rapport m/z, dun dtecteur convertissant un signal ionique en signal lectrique et du

traitement du signal pour obtenir un spectre de masse des ions en fonction du rapport m/z

(figure 6).

Figure 6 : Schma de principe de la spectromtrie de masse MALDI-TOF.

Introduction gnrale

32

3.1.2.1. La source MALDI

Le principe de lionisation/dsorption MALDI repose sur le mlange en solution de lanalyte

et de la matrice. La matrice, molcule organique de faible masse molculaire, absorbe la

longueur donde du laser utilis. Le mlange est dpos sur une cible mtallique sur laquelle

le mlange sche afin de co-cristalliser (figure 7).

Figure 7 : Schma de principe de la source MALDI (Livadaris 2002).

La cible est ensuite place dans la source MALDI, sous vide (10-6

10-7

torr). La matrice et

lanalyte sont irradis par un court impact (environ 5 ns) dun faisceau laser impulsion afin

de les dsorber de la surface de la cible et de les jecter en phase gazeuse. Il se forme alors, en

phase gazeuse, des agrgats de molcules de matrice et danalyte appel panache au sein

duquel se forment les ions. Lanalyte est donc ionis, sous forme protone ou dprotone ou

de cations alcalins. Il se forme majoritairement des ions monochargs.

3.1.2.1.1. La matrice

La matrice est un lment essentiel car elle intervient dans le processus de formation des ions

en phase gazeuse. Elle absorbe la longueur donde du laser par excitation lectronique

laide dun rayonnement avec un laser ultraviolet dimpulsion ou par excitation vibrationnelle

par utilisation dun laser infrarouge. Le choix de la matrice approprie est fonction de

lanalyte tudier car les interactions matrice-analyte jouent un rle dans le processus

dionisation et de dsorption.

Introduction gnrale

33

Le choix de la matrice repose sur diffrents critres empiriques. Elle doit absorber la

longueur donde du laser, tre chimiquement inerte et ne doit pas sublimer dans les conditions

de vide pouss. La prparation du mlange matrice-analyte est aussi trs importante afin

dobtenir une bonne cristallisation. Lanalyte doit tre dilu dans une grande quantit de

matrice (rapport molaire de matrice/analyte de 103 10

5) afin que les interactions entre les

molcules danalyte soient rduites, facilitant ainsi leur transfert en phase gazeuse (Horneffer

et al. 2006). Elle doit possder une fonction acide permettant le transfert de proton dans

ltape dionisation.

La matrice peut jouer un rle plus ou moins important dans la fragmentation des ions

mtastables mode PSD (Post Source Decay) (Karas et al. 2000). Il existe des matrices

dites froides induisant facilement des fragmentations faible fluence du laser et des matrices

dites chaudes induisant peu de fragmentation (Karas et al. 1995; Luo et al. 2002).

Le choix de la matrice la mieux adapte lanalyte tudi est crucial. Elles peuvent tre

solides, solides ioniques ou liquides. Les matrices solides sont les plus utilises. Ce sont des

composs simples de petite taille portant un chromophore UV et qui possdent le plus souvent

des groupements aromatiques. Cependant, elles engendrent une mauvaise reproductibilit du

spectre de masse entre deux impacts du laser conscutifs d la cristallisation du dpt. Il est

donc trs important de choisir la mthode de prparation de lchantillon la mieux adapte. De

plus, les dpts ont une trs courte dure de vie. Les matrices solides ioniques sont constitues

dune matrice solide et dune base organique comme la pyridine (Armstrong et al. 2001; Li &

Gross 2004; Tholey & Heinzle 2006). Les solutions de matrice sont donc plus homognes que

celles des matrices solides, permettant ainsi une meilleure reproductibilit des spectres de

masse obtenus entre deux impacts du laser sur le mme dpt. Les matrices liquides montrent

galement une bonne reproductibilit des spectres de masse obtenus entrent deux impact de

laser conscutifs. Cependant, elles nabsorbent pas ou peu dans lultraviolet et le visible, elles

sont donc utilises avec un laser absorbant des longueurs dondes infrieures 300 nm.

Les matrices utilises pour lanalyse des oligonuclotides ne le sont gnralement pas pour

lanalyse des peptides et protines et des polymres de synthse (tableau 1).

Introduction gnrale

34

Matrices Abrviations

Acide-3 hydroxypicolinique HPA

2,4,6 trihydroxyactophnone THAP

Acide anthranilique AA

Acide picolinique PA

Acide nicotinique NA

-cyano-4-hydroxycinnamoate de mthyle CNMeAcide 2,5-dihydroxybenzoque DHB

Acide quinaldique QA

3,4-diaminobenzophenone DABP

Acide 5-methoxysalicylique MSA

6-aza-2-thiothymine ATT

3-Hydroxycoumarin 3-HC

Acide -cyano-4-hydroxycinnamique HCCA

Tableau 1 : Quelques matrices utilises en MALDI-UV pour lanalyse des oligonuclotides (Wu &

McLuckey 2004; Tang et al. 1993; Krause et al. 1996; Zhang et al. 2006; Song 2003; Fu et al. 2006;

Distler & Allison 2001).

Pour lanalyse des oligonuclotides, les matrices 3-HPA et THAP sont les plus utilises. Les

acides nucliques, tant riches en groupements phosphodiester, favorisent la formation

dadduits de mtaux alcalins (Na+, K

+ par exemple) perturbant la mesure de la masse de

loligonuclotide. Pour parer ce phnomne, les solutions de matrice contiennent

gnralement un additif (par exemple le citrate dammonium) afin damliorer la dtection

des ions. Lion ammonium permet dune part, de dessaler lanalyte et dautre part, de

rgnrer les formes protones dans lagrgat.

3.1.2.1.2. La prparation de lchantillon

La prparation de lchantillon est donc une tape cruciale lors de lanalyse par MALDI-TOF

MS. Elle dpend de la nature de lanalyte, de la sensibilit requise et du type dinformation

recherch. Le choix de la matrice, des solvants et du type de dpt, doivent donc tre

optimiss pour chaque prparation dchantillon. Diffrentes mthodes de prparation existent

selon la matrice et lanalyte : la mthode de la goutte sche, la mthode de la couche mince

et la mthode du dpt en sandwich.

Lors de la mthode de la goutte sche, la matrice est solubilise le plus souvent dans

lactonitrile. La solution de matrice est ensuite mlange lchantillon et une goutte de

cette prparation est dpose sur la surface de la cible mtallique. Le mlange est soit ralis

Introduction gnrale

35

au pralable (pre-mix), soit effectu sur la cible elle-mme. La cristallisation obtenue par

schage de la goutte temprature ambiante peut-tre acclre par chauffage, ventilation

force ou aspiration sous vide. Cette mthode est la plus simple mettre en uvre et fournit

de bons rsultats pour de nombreux types dchantillons, en particulier pour lanalyse des

oligonuclotides, peptides et protines. Le principal inconvnient de cette mthode de dpt

est le phnomne de sgrgation. La distribution irrgulire des cristaux la priphrie de la

goutte, effet Marangoni (Amado et al. 1997) conduit une grande variabilit des ions dtects

sur le dpt. Lacclration du schage sous vide permet de rduire leffet de sgrgation en

rduisant la taille et en augmentant lhomognit des cristaux.

Lors de la mthode de la couche mince, la matrice est solubilise dans un solvant volatil

(actone ou mthanol) (Vorm et al. 1994). Une goutte de solution de matrice est dpose sur

la cible et lvaporation rapide du solvant produit une couche mince et homogne de cristaux.

Puis, lchantillon est dpos sur cette prparation, permettant ainsi un dpt de faible

dimension. Les cristaux de matrice de la premire couche servent ainsi de site de nuclation

pour lchantillon dpos ensuite. Ce type de dpt peut tre lav afin dliminer les

contaminants (sels, dtergents..). Un solvant aqueux est ajout sur le dpt et rapidement r-

aspir laide dune pipette. Cette mthode permet dobtenir des cristaux plus petits et plus

homognes que ceux de la mthode de la goutte sche (Dai et al. 1996; Onnerfjord et al.

1999). Cette homognit permet une meilleure reproductibilit (sensibilit, rapport signal sur

bruit, rsolution) des analyses. Cependant, la couche mince de matrice et dchantillons est

rapidement dtruite aprs quelques tirs du laser. La reproductibilit des dpts dchantillons

est rendu difficile par lutilisation de solvants volatiles.

Lors de la mthode du dpt en sandwich, une premire couche de matrice est dpose selon

la mthode de la couche mince ( Li et al. 1996) . Une goutte danalyte est dpose sur la

couche mince et enfin une goutte de solution de matrice est dpose sur la deuxime couche.

Le dpt est alors sch temprature ambiante. Un lavage du dpt peut galement tre

effectu avec ce type de mthode. Lanalyte se retrouve dispos entre deux couches de

matrice.

3.1.2.1.3. Le laser

Introduction gnrale

36

Le laser le plus rpandu est un laser azote mettant 337 nm. Les autres lasers les plus

courants sont les lasers Nd :YAG (1060mm, frquence triplet, 353 nm) et les lasers

infrarouges comme celui dioxyde de carbone 10,6 m ( Zenobi & Knochenmuss 1998).

Comme les matrices absorbent gnralement moins bien dans linfrarouge, la puissance du

laser IR applique lanalyte doit tre plus importante que pour celle dun laser UV. Les

spectres de masse obtenus par un laser IR ou UV sont globalement similaires. Le laser IR

montre juste une plus grande tendance former des ions multichargs et des adduits.

Limpact du laser sur lanalyte ntant que de quelques nanosecondes, le phnomne de

dsorption/ionisation dpend donc de la fluence du laser (J/cm2) (Zenobi & Knochenmuss

1998; Dreisewerd et al. 1995).

3.1.2.1.4. Les modles dionisation

Le mcanisme de formation des ions issus dune source MALDI est compos de deux tapes :

la dsorption et lionisation. Tout dabord, labsorption de photons du laser par le mlange co-

critallis de matrice et danalyte entrane la dsorption. Il se forme alors un panache par

dcompression du solide vers la phase gazeuse. Puis, les molcules danalyte et la matrice

sionisent. Lionisation MALDI reste encore un phnomne mal connu aujourdhui car il ne

peut sexpliquer par un phnomne unique. Un grand nombre de paramtres exprimentaux

influencent la formation des ions tels que la longueur donde du laser, les conditions de

prparation des chantillons (et la cible), la nature de lanalyte, le mlange de matriceanalyte

et le mode de dtection des ions (positif ou ngatif).

Trois modles dcrivent le processus MALDI. Le premier modle est celui du contrle

thermodynamique de Zenobi et Knochenmuss (Zenobi & Knochenmuss 1998; Breuker et al.

2003; Knochenmuss et al. 2000.; Knochenmuss 2002; Knochenmuss 2003; Knochenmuss &

Zenobi 2003). Lionisation est compose de deux vnements distincts : lionisation primaire

et secondaire o se droulent diffrentes ractions ion-molcule. Les processus en phase

gazeuse ont lieu un quilibre thermodynamique au sein du panache aprs un dlai de

plusieurs centaines de nanosecondes dexpansion de celui-ci.

Le second modle, est celui propos par Karas, du Lucky Survivor Ions (Karas et al. 2000;

Karas et al. 2003; Karas & Krger 2003; Krger & Karas 2002; Glckmann et al. 2001). Il est

Introduction gnrale

37

le premier considrer les agrgats comme des prcurseurs des ions forms en MALDI. Les

espces sont des survivants de processus de neutralisation par capture dlectrons.

Le troisime modle, est celui propos par le groupe Tabet, des espces agrgats

prcurseurs, proche de celui de Karas mais qui prsente une analogie avec les processus

dionisation ESI (Fournier et al. 2002; Fournier et al. 2003; Livadaris et al. 2000). Ce modle

considre des ractions de dsolvatation par perte de matrice neutre ou charge.

Lensemble de ces modles, surtout les deux derniers, impliquent un processus de production

dagrgats qui dsorbent de la surface au moins pendant les premires 6 nanosecondes de la

fluence du laser. La taille de ses agrgats est variable mais elle peut grossir ou se former dans

le panache aprs limpact laser. Les ions issus de ces agrgats apparaissent donc des temps

et des endroits diffrents de la source. Il en rsulte une perte du pouvoir rsolutif de

linstrument. Les ions nont pas exactement la mme nergie cintique (dpend de leur

position dans la source) et peuvent tre dcals dans le temps car ils sont mis des temps

diffrents partir de la surface. Lnergie interne des ions ainsi libre dpend de la taille des

agrgats. Plus la taille des agrgats est grande plus lnergie sera relaxe. Si cette nergie

interne est suffisante, elle peut tre la cause de fragmentation. Comme il sagit de distribution

de lnergie des ions, les ions riches en nergie vont conduire des fragmentations promptes

dans la source tandis que les ions de plus faible nergie se dcomposent dans la rgion de

libre champ du tube de vol.

3.1.2.2. Lanalyseur temps de vol

La source MALDI est le plus gnralement couple un analyseur temps de vol. Cependant,

elle peut tre galement couple un pige ionique (Jonscher & Yates 1997), un analyseur

rsonnance ionique cyclotronique transforme de Fourier ( Li et al. 1994) ou un analyseur

secteur magntique (Bordoli et al. 1994). Il existe aussi des instruments hybrides :

quadriple/TOF, pige ionique/TOF ou TOF/TOF.

Le principe de lanalyseur temps de vol (TOF Time-of-Flight) a t dcrit par Stephens en

1946 et largement tudi par la suite par Cotter (Stephens 1946; Cotter 1989; Cotter 1992;

Cotter 1999).

Lanalyseur temps de vol mesure la dure de transfert des ions aprs le tir du laser pour

arriver au dtecteur au travers de la rgion libre de champ. Le rapport m/z est donc

Introduction gnrale

38

directement dduit de la dure de vol de lion. Lutilisation dune impulsion laser permet

lmission dions trs localiss dans lespace et le temps. Le couplage du MALDI avec

lanalyseur de temps de vol est donc ida

développement de méthodes d'analyse de l'adn par clivage d'une

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