Marius TELETIN

Facultéde médecine

Manipulation du génome animal

Service de Biologie de la Reproduction.

CHU de Strasbourg

IGBMC

La transgenèse

La mutagenèse dirigée

Le clonage

Les transchromosomes

Les cellules souches

Organismes génétiquement modifiés (OGM)-Bactéries -Levures-Animaux

-Mammifères-Oiseaux-Poissons

-Plantes

Transgénèse=

Transfert d’un ADN recombinant dans un organisme par intervention humaine

Transgénèse chez la souris(pourquoi la souris?)

Un model animal: un model de petite taille, d’élevage facile, avec une génétique connue

et qui a une physiopathologie proche de la physiopathologie humaine.

La souris

•Mammifère de petite taille: 20-40g

•Gestation de courte durée (19-20 jours)

•Puberté précoce (6 à 8 semaines)

•Longue période de fertilité (jusqu’à 2 ans)

•Docile et facile a manipuler

•Placentation et développement similaire avec l’homme

•Portées de grande taille (15nn par portée)

•Synténie avec le génome humain

La souris: synténie avec le génome humain

Conserved synteny between the human and mouse genomes

Homme Souris

1 2 43

Un Transgène

1 2 43promoteur

Un Transgène

Codon d’initiation ATGSéquence de Kozac

1 2 43promoteurenhancer

Un Transgène

Codon d’initiation ATGSéquence de Kozac

1 2 43promoteur polyAenhancer

Un Transgène

Codon d’initiation ATGSéquence de Kozac

Production de souris transgéniquesMicroinjection de l’ADN dans le pronucleus male

Le transgène

-intégration aléatoire

-taux de succès relativement bas (a partir de 10 % d’ovocyte injectés)

-intégration au stade de zygote 80% et stade ultérieur 20% (mosaïcisme)

-profil d’expression variable en fonction de : - type de construction

- nombre de copies intégrées (1 à 100copies)

- environnement la chromatine

-l’intégration peut altérer un ou plusieurs gènes de l’animal

-plusieurs lignées indépendantes à caractériser

Limitations

-Intégration du transgène mais pas d’expression

-Expression du transgène dans un tissu autres que celui choisi

Intérêts-Sur-exprimer une protéine

-Exprimer un variant Dominant Négatif

-Complémenter une autres mutation

-Etudier le profil d’expression d’un gene (promoteur-raporteur)

Transgène à expression inductible

1 2 43promoteur polyAenhancerinductible

Transgène àexpression inductible

Tetracycline-controlledtransactivator(tTA)Doxycyline (Dox)

Lewandoski, 2002

E. ColiTransactivation domain

Ex:

Shachaf2004 Nature

Expression inductible dans un tissu donné+ DOX + DOXsans DOX

-La-sur expression inductible de MYC dans le foie induit l’apparition d’un carcinome

hépatocellulaire

-La suppression de d’expression de MYCc induit la régression de la tumeur

Vecteurs

Plasmide Cosmide BAC PAC YAC

10-20kb 30-45kb 300kb 300kb 100kbà

2Mb

BAC = (Bacterial Artificial Chromosome)PAC (P1-derived Artificial Chromosome)YAC = (Yeast Artificial Chromosome : Chromosome artificiel de levure)

Utilisation de lentivirus comme vecteur dans la transgenèse

La mutagenèse dirigéeA) Les cellules souches embryonnaires ESB) La recombinaison homologueC) La mutagenèse dirigée

1) « Classique »2) Hit and run3) Le système Cre/loxP

Manipulation du génome animal

Making Model Mice

The elevation of the humble mouse to become many scientists' experimental animal of choice has been one of the scientific phenomena of the last two decades. Today, genetically-altered mice are an essential component of the experimental toolkit, with thousands of varieties contributing to research in laboratories around the world. Their existence stems from discoveries made in the 1980's by this year's Nobel Laureates in Physiology or Medicine.Mario Capecchi and Oliver Smithies were both seeking ways of specifically altering the mammalian genome, Capecchiwith a view to inserting new genes into cells and Smithies in the hope of correcting genetic defects that lead to disease. Working against a background of skepticism, they independently discovered that they could use a natural mechanism, revealed decades before by Joshua Lederberg in bacteria, to introduce short sequences of manipulated DNA into the chromosomes of mammalian cells growing in the laboratory. The technique allowed them to target individual genes with exquisite precision, producing the genetic alterations they sought, but only at the cellular level. Happily, the embryonic stem cell cultures that Martin Evans was then developing provided the necessary vehicle for taking such gene manipulations from the Petri dish into the whole animal. Combining the two, by modifying genes in embryonic stem cells and then injecting those cells into fertilized mouse eggs, made it possible to rear mice with discrete genetic modifications that would be inherited between generations. The so-called 'Knock-out mouse' was born. Knock-out (and knock-in) mice, the workhorses of many a laboratory today, allow researchers to study the effects of removing (or inserting) a single gene. Genetically-modified mice have therefore frequently helped to reveal a gene's function and, since mice and humans share a remarkable genetic similarity, they also serve as models of many human diseases.

Hypoblaste

Epiblaste

Le blastocyste

Production de souris chimériques

Replacement

1 2 4

1 2

neo

3

neo

4

1 2 4G418 R

La recombinaison homologueRemplacement (le « knock out »)

RH

Incidence des tumeurs hépatiques chez les

souris TIF1αααα-/-

WT TIF1α−/−

WTTIF1α-/-

Tumeurs hépatiques chez les souris TIF1αααα-/-

Khetchoumian K, Teletin M et al , Nature Genetics 2007

Caractéristiques du vecteur pour modifier les ES

• La taille de la région d’homologie avec le locus à cibler doit être comprise entre 3 et

10kb de chaque coté de la modification à intégrer

• L’ADN utilisé pour fabriquer le vecteur de ciblage doit être isogénique

• Les clones de cellules ES doivent être identifies par Southern blot d’ADN génomique

• Les sondes pour tester le locus ciblé doivent être localisées à l’extérieur des régions

utilisées pour fabriquer le vecteur de ciblage (pour éviter la détection des intégrations

aléatoires)

Ciblage d’un locusGènes de sélection positive: résistance des cellules ES à un antibiotique

-Utilisation de gènes codant pour la néomycine phsopho-transferase

(néoR) et l’hygromycine B phsopho-glycerate(hygroR)

-ils confèrent la résistance pour à la Généticine (G418) ou à

l’hygromycine, respectivement

- Le gène de sélection doit être exprimé dans les cellules ES

Replacement

1 2 4

1 2

neo

3

neo

4

1 2 4G418 R

La recombinaison homologueRemplacement par un autre gène (le « knock in »)

2 LacZ

LacZ

Stop

Stop

Le vecteur ADN pour cibler un locus dans les cellules ES

Limitations

-Le vecteur de ciblage ne doit dépasser 15kb (pas de possibilités de

réaliser des grandes délétions ou translocation chromosomiques)

-Il faut construire plusieurs vecteurs pour introduire de mutation

ponctuelle

-Le gène de sélection peut s’avérer « toxique » pour la physiologie de

l’animal (d’où l’utilité de l’exciser)

Hit and Run I

Recombinaisonhomologued'insertion

G418R - GANCS

2

1 2 3

1 2 tk-néo 3

tk-néo

2

Hit and Run II

G418R - GANCS

1 2 tk-néo 32

Recombinaisonhomologue

intrachromosomique

G418S - GANCR

2

2

3

2 31 31

tk-néo

2

1

Mutagenèse inductibleSystème Cre/loxP

Problèmes de la mutagenèse dirigée

• Létalité embryonnaire.

• Compensation fonctionnelle durant le développement.

• Difficulté de déterminer la fonction d’un gène «plét orique» au niveau d ’un tissus ou d ’un type cellulaire.

• Création de modèles murins de maladies humaines causé es par des mutations somatiques (cancérologie).

Souris normales

Mutagenèse classique (mutation germinale)

Sites loxP(34 pb)

5’-ATAACTTCGTATA ATGTATGCTATACGAAGTTAT-3'3'-TATTGAAGCATAT TACATACG ATATGCTTCAATA-5’

13pb

13pb

Recombinaison site spécifique basé sur larecombinase Cre du bactériophage P1

Recombinase Cre38.5 kDa

loxPloxP

+

sites tête à queue loxP

loxPloxP

sites loxP tête à tête

G418R

GANCS

Recombinaisonhomologue

G418S

GANCR

tk-néo

tk-néo

Cre

Mutation ponctuelle

G418S

GANCR

G418R

GANCStk-néo

tk-néo

Recombinaisonhomologue

Cre

Vecteurs inductibles à deux sites loxP

Recombinaisonhomologue

tk-néo

G418R

GANCStk-néo

Cre

tk-néo

G418R

GANCSG418S

GANCRG418S

GANCR

Vecteurs inductibles à trois sites loxP

CreCre

Recombinase Cre dépendante d’un ligand(CreERT)

recombinase Cre CreCre

1 343

Récepteur aux eostrogèneshumain(ER) A/BA/B CC DD EE FF

1 180 263 302 553 595

DBD LBD

recombinase Cre-ER T

chimérique CreCre

1

DD EE FF

ER (282-595)Cre (1-343)

660G521R

Contrôle spatio-temporel de la mutation

Souris ayant un gène floxé

EE

EE

CreERCreERTTPP

CreERCreERTTPP

Souris exprimant de façon spécifique le gène CreERt

CreERCreERTTPP

CreERCreERTTPP

Apparition spatio-temporelle d ’une mutation somatique

EE

CreERCreERTTPP

CreERCreERTTPP

Recombinaison sous contrôle de Cre après administration de TAM

Not I Not I

CreERCreERT2T2PsaPsa

La technologie CreERT2

Modèle murin de cancer de la prostate par invalidation de PTEN

Prostate murine -aspect macroscopique

Contrôle Ptenpe-/-

8 mois après Tam

Ratnacaram CK *, Teletin M * et al PNAS 2008

D ’autres applicationsdu

Système Cre/loxP

3’-MTel

Ch ATel

Ch A

5’-MTel

ChBTel

Ch B

Cre

M -

M +

A

B

Cen

Cen

Tel

ChATel

Ch BA BCen

5’-MTel

ChBTel

Ch A3’-MCen

Sites lox incompatibles Hoess et al., 1986

ATAACTTCGTATATATTGAAGCATAT

TATACGAAGTTATATATGCTTCAATA

GTATACATCATATGTA

loxP

lox511

ATAACTTCGTATATATTGAAGCATAT

TATACGAAGTTATATATGCTTCAATA

GCATACATCGTATGTA

Principe du système Flip/FlopThe Fl ip-Ex cision system (FlEx)

DNA 2 DNA 2

DNA 1

inversion using loxP

DNA 2DNA 2

DNA 1

inversion using lox511

DNA 2DNA 2

DNA 1

loxP

lox511

excision using lox511 excision using loxP

DNA 2DNA 2

DNA 1

CreE1E1 E2E2

LacZ LacZ

E3E3 E1E1 E3E3LacZLacZ

CreE1E1 LacZLacZ

E2E2

E3E3 E1E1 E3E3E2E2

CreE1E1 E2E2

E2m E2m

E3E3 E1E1 E3E3E2mE2m

CreE1E1 E2E2

cDNA cDNA

E3E3 E1E1 E3E3cDNAcDNA

Applications possibles du sytèmes Flip/Flop

CreE1E1 E3E3LacZLacZ E1E1 E3E3CreCreCreCre+

Le clonageA) DéfinitionB) PrincipeC) Possibilités

Manipulation du génome animal

Le clonageDon d ’ovocytes

Don de cellules

Énucléation

Transfert d ’unnoyau

Développement

Transfert

Clones

Résultats

Intérêts

Scientifiques:Reprogrammation du génomeInteractions cytoplasme/noyauDifférenciation cellulaire

Thérapeutiques: Clonage thérapeutique

Intérêts

Agro-alimentaire: Manipulation génétique d’espèces

Environnementaux: sauvegarde d’espèces

Les transchromosomes

Manipulation du génome animal

Transfert de chromosomes par l’intermédiaire de microcelluleMicrocell mediated chromosome transfer

Technique utilisant les cellules ES comme matériel de transfert

Création d’un modèle de T21 chez la sourisO’Doherty et al Science vol 309 pp 2033-2037

LES CELLULES SOUCHES

Qu’est-ce qu’une cellule souche?

Une cellule souche a la capacité unique de:

� s’auto-renouveler de manière prolongée voir indéfiniment

� produire différentes cellules spécialisées (différenciées)

Une cellule souche pluripotente

-Unipotentes(spermatogonie A0)

- Embryonnaires ou adultes ?

Les différents types de cellules souches

-Unipotentes(spermatogonie A0)

- Embryonnaires ou adultes ?

-Multipotentes(hématopoiétique)

Les différents types de cellules souches

Les différents types de cellules souches

- Embryonnaires ou adultes ?

-Pluripotentes(embryonnaire)

-Unipotentes(spermatogonie A0)-Multipotentes(hématopoiétique)

Production de souris chimériques

Formation in vivo de tératomesLes tératomes présentent des dérivés tissulaires des trois types: Ectoderme, Mésoderme, Endoderme

A – neural tissueB – neuronal ganglionC – epidermis(keratin differentiations)

D – gut-like epitheliumE – cartilage

Les différentes sources de cellulespluripotentes

ES EG EC

Cellules pluripotentesCapable de donner in vitro et in vivoTous les types cellulaires adultes

PHYSIOLOGIE

MORPHOGENÈSE

RENOUVELLEMENT

RÉPARATION

RÉGÉNÉRATION

PATHOLOGIE

TUMEURS BÉNIGNES

TUMEURS MALIGNES (CANCER)

TOXICOLOGIE

THÉRAPEUTIQUE

PHARMACOLOGIE

THÉRAPIE CELLULAIRE

THÉRAPIE GÉNIQUE

LES CELLULES SOUCHES

INTERETS

AUTOGREFFES (SOI)

ALLOGREFFES (MEME ESPECE)

XENOGREFFES (AUTRE ESPECE)

TRANSPLANTATION

•CELLULES SOUCHES EMBRYONNAIRES

•CELLULES SOUCHES GERMINALES

•CELLULES SOUCHES ADULTES

LES CELLULES SOUCHES

EMBRYONNAIRES

Le développement embryonnaire

Hypoblaste

Epiblaste

Le blastocyste

CELLULE SOUCHE EMBRYONNAIRE (cellule ES)

• capacité d’auto-renouvellement

• pluripotente (capacité à générer tous les

types de cellules spécialisées)

Source : Blastocyste«Bouton Embryonnaire - Inner Cell Mass»

IntérêtObtention d’une lignée de cellules embryonnaires

Différenciation en cellules spécialisées pour réparer une fonction

• CAPACITE ILLIMITE DE MULTIPLICATION

• CAPACITE DE DIFFERENCIATION MODULABLE

MAIS

• ORIGINE DES EMBRYONS ?

• REJET ?

• HOMOGENEITE DU PROCESSUS DE DIFFERENCIATION ?

• STABILITE DE LA DIFFERENCIATION ?

• TUMEUR (TERATOME) ?

INTERET DES CELLULES SOUCHES EMBRYONNAIRES

SANG

PEAU CORNEE

CARTILAGE OSMUSCLES TENDONS

PANCREAS FOIE

MUSCLE CARDIAQUE

NEURONES

APPLICATIONS THERAPEUTIQUES DES CELLULES SOUCHES

Le clonage thérapeutique

La Recherche 2001

LE TRANSFERT NUCLEAIRE

Published by AAAS

J. B. Gurdon et al., Science 322, 1811 -1815 (20 08)

Fig. 1. Designs of nuclear transfer experiments (A) to unfertilized eggs (second meiotic metaphase) of frogs or mammals or (B) to first meiotic frog oocytes

Published by AAAS

J. B. Gurdon et al., Science 322, 1811 -1815 (20 08)

Fig. 2. Nuclear transfer success decreases as donor cells differentiate (3, 8)

Published by AAAS

J. B. Gurdon et al., Science 322, 1811 -1815 (20 08)

Fig. 5. Four experimental routes for nuclear reprog ramming

Les étapes initiales du clonage thérapeutique et du clonage reproductif sont identiques :

TRANSFERT DU NOYAU D’UNE CELLULE SOMATIQUE ADULTE DANS UN OVOCYTE ENUCLEE

Dérivation d’une lignée de cellules souches embryonnaires=Clonage thérapeutique

Implantation du blastocyste chez une mère porteuse en vue de la naissance d’un être vivant =Clonage reproductif

TRANSFERT NUCLEAIRE(CLONAGE THERAPEUTIQUE - CLONAGE REPRODUCTIF)

But : obtention d’un blastocyste

Les différentes sources de cellulespluripotentes

ES EG EC

Cellule de la peau(ou autre cellule

différenciée)

iPS(induced pluripotentstem cell)

Utilisation clinique Utilisation industrielle

Cellules pluripotentesCapable de donner in vitro et in vivoTous les types cellulaires adultes

MALADIES DU SANG

MYOPATHIES

PERTE DE CARTILAGE, PERTE OSSEUSE

CANCER

APPLICATIONS THERAPEUTIQUES DES CELLULES SOUCHES

THERAPIE CELLULAIRE

DIABETEBRULURES

MALADIE DE PARKINSONINFARCTUS DU MYOCARDE

THERAPIE GENIQUE

• Pharmacologie

• Étude de pathologies génétiques rares

• Thérapie cellulaire et génétique

Autres possibilités d’utilisation thérapeutiques des cellules souches

ESES cell bankcell bank

Read-out definition

Drug screening

hES

Pharmacologie

Étude de pathologies génétiques rares

Couple à risque

Fécondation in vitro

Jour 0

Transfert

Jour 4

Analyse Génétique

BiopsieEmbryonnaire

Jour 3

Diagnostic pré-implantatoire

Affected Affected ESES cell cell lineline

ESES cell bankcell bank

Read-outRead-out definitiondefinition

Drug screeningDrug screening

hEShES

mESmES

La recombinaison homologue chez le rat

Letter Nature 467, 211-213 (9 September 2010) |; Accepted 26 July 2010; Published online 11 August 201

Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cellsChang Tong, Ping Li1, Nancy L. Wu, Youzhen Yan & Qi-Long Ying

AbstractThe use of homologous recombination to modify genes in embryonic stem (ES) cells provides a powerful means toelucidate gene function and create disease models1. Application of this technology to engineer genes in rat s has not previously been possible because of the absence of germline-competent ES cells in this species .We have recently established authentic rat ES cells . Here we report the generation of gene knockoutrats using the ES-cell-based gene targeting technology. We designed a targeting vector to disrupt the tumour suppressor gene p53 (also known as Tp53) in rat ES cells by means of homologous recombination. p53 gene-targeted rat ES cells can be routinely generated. Furthermore, the p53 gene-targeted mutation in the rat ES-cell genome can transmit through the germ line via ES-cell rat chimaeras to create p53 gene knockout rats. The rat is the most widely used animal model in biological research. The establishment of gene targeting technology in rat ES cells, in combination with advances in genomics and the vast amount of research data on physiology and pharmacology inthis species, now provide a powerful new platform for the study of human disease.

Transgenèse en immunologie

1. Recherche fondamentale :

Génération des animaux KO, afin d’étudier les gènes

impliques dans des processus immunitaires

2. Recherche appliquée : génération des anticorps humains

chez l’animal (souris ou bovins, par ex)Ex : Anticorps anti-EGFR (utilisés contre le cancer du colon)

Anticorps and-CTLA-4 (mélanome)

Anticorps anti-RANKL (ostéoporose)

Anticorps anti-CD4 (lymphome)

Bibliographie

Lewandoski, Nat Rev Genet. 2001

Gurdon et Melton, Science 2008

Yamanaka, Cell Prolif. 2008