Antibiotique ou Probiotique

dans les pathologies

inflammatoires chroniques ?

Prof.Jacques DAELE

CHR Citadelle DPT ORL – CCF

LIEGE BELGIUM

Pathogènes, vous avez dit Pathogène ?

• Corps humain : 10 000 milliards de cellules

humaines et 100 000 milliards de microbes (500

espèces différentes)

• 10 fois plus de bactéries que de cellules humaines

• 90% de notre corps ne nous appartient pas

• Rôle important dans le maintien en bonne santé

Phylogenetic tree of the most important microbial taxa

in the human intestinal tract, along with their relative

contributions.

AberrationMost relevant observations

and potential correlationReferences

Crohn's diseaseDiversity decrease – reduced F.

prausnitzii

Kaser et al. 201051; Sokol et al. 200952; Willing et al.

201053

Ulcerative colitisDiversity decrease – reduced A.

muciniphila

Png et al. 201054; Kaser et al. 201051 ; Lepage et al.

201155

Irritable bowel syndromeGlobal signatures –

increasedDorea and Ruminococcus

Salonen et al. 201036; Saulnier et al. 201156; Rajilić-

Stojanović et al. 201113

Clostridium

difficile infection

Strong diversity decrease –

presence of C. difficileGrehan et al. 201057; Khoruts et al. 201058

Colorectal cancerVariation in Bacteroides spp. –

increased fusobacteria

Sobhani et al. 201159; Wang et al. 201260; Marchesi et al.

201161

Allergy/atopyAltered diversity – specific

signatures

Stsepetova et al. 200762; Bisgaard et al. 201163; Storrø et

al. 201164

Celiac diseaseAltered composition, notably in small

intestine

Nistal et al. 201265; Di Cagno et al. 201166; Kalliomäki et

al. 201267

Type 1 diabetes Signature differences Vaarela 201168; Giongo et al. 201169; Brown et al. 201170

Type 2 diabetes Signature differencesLarssen et al. 201071; Wu et al. 201072; Kootte et al.

201273

ObesitySpecific bacterial ratios

(Bacteroidetes/Firmicutes)

Ley et al. 200674; Turnbaugh et al. 200910; Musso et al.

201175

Intestinal microbiota-associated diseases, syndromes, or other aberrations, with

summaries of multiple studies that support an association between the microbiota and

the indicated aberration.

Disease or aberration Type of support Reference*

Alzheimer's diseaseMicrobiota in a mouse model of

Alzheimer's diseaseKarri et al. 2010103

Atherosclerosis Analysis of plaques in humans Koren et al. 2011104

Autistic spectrum disordersAnalysis of mucosa in children with

autism spectrum disordersWilliams et al. 2011105

Chronic fatigue syndromeCultured microbiota in patients with

chronic fatigue syndromeSheedy et al. 2009106

Colic babiesLongitudinal analysis of colic babies

cohortde Weerth et al. 2012

Cardiovascular diseaseCardiovascular-diseased mice and

microbial metabolismWang et al. 201148

Depression and anxiety Probiotic intervention in stressed mice Bravo et al. 201134

Frailty Analysis of elderly and high frailty scores van Tongeren et al. 2005107

Graft-vs-host diseaseReview of human data on graft-vs-host

diseaseMurphy et al. 2011108

Multiple sclerosisInvolvement of microbiota in mice with

multiple sclerosisBerer et al. 2011109

Nonalcoholic fatty liver disease Effect of choline depletion in humans Spencer et al. 2011101

Parkinson's disease

Role of enteric nervous system and

review of Parkinson's disease

development

Braak et al. 2003110

Rheumatoid arthritisMicrobiota as predisposing factor in

rheumatoid arthritisScher and Abramson 2011111

Retrovirus infectionMouse retrovirus infection relies on

microbiotaKane et al. 2011112

Poliovirus infectionMouse microbiota promotes poliovirus

infectionKuss et al. 2011113

Indications for associations between the microbiota and health aberrations, provided as an alphabetical listing of

the aberrations suggested to be associated with the intestinal microbiota, along with support for such an

association.

http://nutritionreviews.oxfordjournals.org/content/70/suppl_1/S45.long#fn-1

Microbiome

Microorganismes : virus, bactéries, moisissures

Planctonique (1%)

mobile

Biofilm (99%)

Communauté de microorganismes adhérents

Matrice extra-cellulaire polymérique

Métaboliquement inactif (quiescent) : peu de réponse aux AB Bacteries et fungi

Intracellulaire

Biofilms

Biofilms

• Formation du Biofilm1. Implantation

2. Adhérence

3. Agrégation

4. Croissance et maturation

5. Détachement

• Plusieurs structures différentes• Réponse des microorganismes à l’environnement

• Programme génétique bactérien

• Matrice : Extracellular Polymeric Substance (EPS)• Polysaccharides, protéines, nucléotide, AND extracellulaire

• Canaux de transport des fluides et des nutriments (concentration des nutriments, communication inter-cellulaire)

Biofilms

SUPERANTIGEN

Up to 30% of patients’T-

cells may be

nonspecifically stimulated

by superantigen binding

compared with

stimulation of only 0,1%

of T-cell population via

the conventionnal

antigen-specific MHC

restricted activation

SuperantigSuperantigèènesnes

Healthy mucosa (SEM)

Cryofixation SEM : biofilm

Biofilms mediated Infections

Chronic

Rarely resolved by host defences

Resistant to directed antibiotics

Acute exacerbation

Microbial Community is difficult to define

and culture

Require surgical removal to be resolved

Microbiome

Microorganismes : virus, bactéries, moisissures

Planctonique (1%)

mobile

Biofilm (99%)

Communauté de microorganismes adhérents

Matrice extra-cellulaire polymérique

Métaboliquement inactif (quiescent) : peu de réponse aux AB Bacteries et fungi

Intracellulaire

S.A25%-30% permanent carrier in the nostrils/

Intracellular

75% monoclonal

20% Of all human Staph. Inf. are

autogenous

60% intermittent carrier

20% almost never carrier( Compétition)

71% carrier in N. Polyposis

0% SAE IgE in controls

50% SAE IgE in N.Polyposis

Monoclonal S.A. In 75% N=37From Lacroix S.

Same serotypes in healthy and diseased

TO 100%

T10 63%

T3O 70%

T240 73%

Méthodes Culture dépendante

Isolement et Culture avant identification morphologique ,biochimique ou génétique.

99% des MO observable ds la nature ne sont pas cultivables par des techniques standards

Méthodes culture dépendante

• Biais des milieux enrichis ou appauvris

• Absence de croissance si disparition des biofilms ou des relations symbiotiques

Méthodes Culture dépendante

Pourquoi non cultivable?

T°, pH, sources de nutriment, communauté complexe et dynamique de polymicrobisme, biofilms, réaction immunologique de l’hôte

MO à croissance rapide « étouffe « les c. lentes

Techniques moléculaires

• Analyse directe du DNA / RNA bactérien sans culture

• Capable de caractériser les assemblages microbiens complexes

• Détecte le matériel génétique de MO non viables

Méthode non culture dépendante PCR

L'amplification en chaîne par polymérase ou réaction en chaîne par polymérase (PCR polymerase chainreaction) est une méthode de biologie moléculaired'amplification génique in vitro, qui permet de dupliquer en grand nombre (avec un facteur de multiplication de l'ordre du milliard) une séquence d'ADN ou d'ARN connue, à partir d'une faible quantité (de l'ordre de quelques picogrammes) d'acide nucléique (séquence spécifique d’ADN (l’Amplicon)) et d'amorces spécifiques constituées d'oligonucléotides de synthèse de 20 à 25 nucléotides).

http://fr.wikipedia.org/wiki/Biologie_mol%C3%A9culairehttp://fr.wikipedia.org/wiki/ADNhttp://fr.wikipedia.org/wiki/ARNhttp://fr.wikipedia.org/wiki/Acide_nucl%C3%A9iquehttp://fr.wikipedia.org/wiki/Amplicon

DENATURATION

HYBRIDATION

HYBRIDATION

ELONGATION

DENATURATION

HYBRIDATION

DENATURATION

HYBRIDATION

Polymerase Chain Reaction

Pyrosequencing

Fluorescence In Situ Hybridation

Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time Of Fly

Universal Biosensor Ibis T 5000

Méthodes

Le pyroséquençage est une technique qui permet d’effectuer un séquençage rapide et à moindre coût. En effet, cette technique ne nécessite pas de clonage (donc gain de temps et d’argent), et permet une lecture directe de la séquence obtenue après le séquençage.

http://fr.wikipedia.org/wiki/S%C3%A9quen%C3%A7agehttp://fr.wikipedia.org/wiki/Clonage

Les nucléotides ne sont pas ajoutés tous ensemble comme dans une réaction de séquençage normale mais l’un après l’autre. Si le nucléotide ajouté dans le milieu réactionnel correspond à celui attendu par la polymérase, il est incorporé dans le brin en cours de synthèse (d’élongation) et libère un pyrophosphate. Une ATP sulfurylase vient alors transformer ce pyrophosphate (PPi) en ATP qui est alors utilisé, couplé à une luciférine, par une luciférase. On a alors production d’oxyluciférine et d’un signal lumineux (une apyrase dégrade les nucléotides en surplus).

C’est le séquenceur ou plus précisément un capteur CCD (Charge-Coupled Device) qui va capter ce signal lumineux et le reproduire sous forme d’un pic sur le pyrogramme. La hauteur de ce pic est fonction de l’intensité du signal lumineux, elle-même proportionnelle au nombre de nucléotides incorporés en même temps.On peut donc déduire la séquence à partir de la taille des pics obtenus. Par ailleurs, en cas de mélange de nucléotides à une même position (polymorphisme de séquence), la taille des pics permet d'avoir une quantification de la proportion de brins porteurs de l'un ou l'autre des nucléotides.

http://fr.wikipedia.org/wiki/Nucl%C3%A9otidehttp://fr.wikipedia.org/wiki/Milieu_r%C3%A9actionnelhttp://fr.wikipedia.org/wiki/Polym%C3%A9rasehttp://fr.wikipedia.org/wiki/Pyrophosphatehttp://fr.wikipedia.org/wiki/Lucif%C3%A9rinehttp://fr.wikipedia.org/wiki/Lucif%C3%A9rase

Technique de l'hybridation fluorescente in situ. En A : sonde. B : sonde colorée à l'aide d'un flurochrome C : hybridation avec l'ADN nucléaire. D : apparence du chromosome

métaphasique où la sonde s'est fixée.

Technique d’ identification de pathogènes dans des prélèvement cliniques ou environnementaux.

Ibis T 5000 associe l’amplification en chaine par polymerase (PCR) avec la spectrometrie de masse sur un materiel biologiques ionisés par electrospray et l’analyse des bases puriques ou pyrimidiques. Ce système permet l’identification et la quantification d’un large éventail de pathogènes incluant toutes les bactéries connues, les principaux groupes de moisissures pathogènes ,la plupart des familles virales responsables de maladies chez l’homme ou l’animal ainsi que leur degré de virulence et leur résistance au A.B.

(Dpt de la défense USA TIGER Triangulation Identification for the Genetic Evaluation of

Risks)

Ibis T5000Universal Biosensor

The T.I.G.E.R. concept of operation. In Step #1, nucleic acid extracts from the sample of interest (e.g., air sample, clinical specimen,food product) are extracted and amplified with broad-range PCR primers. Step #2 is mass spectrometry based analysis of PCR derivedamplicons. Signal processing in Step #3 yields unambiguous base composition signatures from multiple genomic regions that arein turn used to identify the microbe(s) in the sample.

IBIS T 5000New approach to the sensitive and specific identification of bacteria, viruses, fungi, and protozoa based on broad-range PCR and high performance mass spectrometry. The Ibis T5000 is based on technology developed for the Department of Defense known as T.I.G.E.R.

(Triangulation Identification for the Genetic Evaluation of Risks) for pathogen surveillance. The technology uses mass spectrometry derived base composition signatures obtained from PCR amplification of broadly conserved regions of the pathogen genomes to identify most organisms present in a sample. The process of sample analysis has been automated using a combination of commercially available and custom instrumentation. A software system known as T-Track manages the sample flow, signal analysis, and data interpretation and provides simplified result reports to the user. No specialized expertise is required to use the instrumentation. In addition to pathogen surveillance, the Ibis T5000 is being applied to reducing health care associated infections (HAIs), emerging and pandemic disease surveillance, human forensics analysis, and pharmaceutical product and food safety, and will be used eventually in human infectious disease diagnosis. (JALA 2006;11:341–51)

MALDI-TOFMatrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectometry.

La spectrométrie de masse MALDI-TOF permet l’identification des bactéries par analyse de leurs protéines totales (protéines ribosomales et protéines associées aux membranes). Selon les études, les résultats d’identification obtenus avec la spectrométrie de masse (95 % - 97,4 % d’identifications correctes) sont comparables, voire meilleurs, à ceux des systèmes automatisés utilisant des méthodes conventionnelles (75,2 % - 92,6 %). La qualité de l’identification est fonction de la richesse de la banque de spectres enregistrés. Outre l’identification des micro-organismes, il est possible de réaliser du génotypage de polymorphismes ponctuels (SNPs). La spectrométrie de masse devient une alternative au séquençage standard des gènes 16S rDNA.

Identifying biofilms

Imaging

Scanning Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy

Confocal Laser Scanning Microscopy

Imaging adjuncts (with CLSM)

LIVE/DEAD Stain-BacLight Bacterial

Viability Kit

Fluorescent In Situ Hybridation with

species specific probes

Confocal Scanning-Laser

MicrographBacterial cells

PMN cells

Channels

Microbiome différent dans la CRS?

• Méthodes de détection

• Culture

• Observation directe

• Microscopie optique / colorations

• Microscopie électronique

• Détection de l’ADN ou de l’ARN bactérien

• après amplification (PCR)

• détection directe (FISH)

• Screening (pyroséquençage, PCR couplée

à spectrométrie de masse)

spécificité

sensibilité

Microbiome différent dans la CRS?Auteur, année Sujets

CRS/N

Prélèvement Technique

1 Ramakrishnan 2013 0/28 Ecou. MM qPCR 16S/rRNA/pyrosequencing

2 Aurora 2013 30/12 Lavage MM 16S rRNA pyrosequencing

3 Boase 2013 38/6 Ecou. MM Culture Ibis T5000

4 Abreu 2012 10/10 Bross.Sinus Max PhyloChip analysis

5 Feazel 2012 15/5 Ecou.MM culture 16S rRNA,

Pyrosequencing

6 Stressmann 2011 43/0 Biops. Inf T/Poly 16S rRNA/pyrosequenc/ T-RFLP

7 Frank 2010 26/16/5 Ecou. Narine 16S rRNA pyrosequencing

8 Stephenson 2010 18/9 Biop.Muqueuse 16S rRNA pyrosequencing

9 Healy 2008 11/3 Biop.Muqueuse FISH DNA probes (HI,SP,SA,PA)

10 Sanderson 2006 18/5 Biop.Muqueuse FISH DNA probes (HI,SP,SA,PA)

11 Lina 2003 0/216 Ecou.Vestibule N Culture

12 Rasmussen 2000 0/10 Lavage nasal Culture/Capillary sequencing

13 Choi 2014 8/3 Lavage nasal Pyrosequencing

Microbiome différent dans la CRS?N N

1 Aureobacterium 15 Helicobacter

2 Alicycliphilus 16 Lachnospira

3 Burkholderia 17 Lactobacillus

4 Carnobacterium 18 Micrcoccus

5 Citrobacter 19 Moraxella

6 Cloacibacterium 20 Mycobacterium

7 Corynebacterium 21 Neisseria

8 Curtobacterium 22 Pediococcus

9 Cyanobacterium 23 Peptoniphilus

10 Diaphorobacter 24 Propionebacterium

11 Enterobacter 25 Pseudomonas

12 Enterococcus 26 Rhodococcus

13 Fusobacterium 27 Staphylococcus

14 Haemophilus 28 Stenotrophomonas

29 Steptococcus

Microbiome différent dans la CRS?N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1

011

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

1 X X X x x x x x x x

2 x X X X X

3 x x

4 x x X X x x x x x x

5 X

6 x x x x x

7 x X X x x

8 X x x

9 x x x x

10

11 X x x x

12 X x x

13 x x

• Sujets sains

• Actinobactéries (Propionibacterium, Corynebacterium)

• Firmicutes (Staphylocoque), Proteobacteria

(Enterobacter)

• Patients CRS

• Plusieurs microbiomes différents

• Diminution de la diversité

• Staphylococcus aureus

Microbiome différent dans la CRS?

Exemple: Choi et al. 2014

Allergy. 2014 Apr;69(4):517-26

Exemple: Abreu et al. 2012

Sci Transl Med. 2012 Sep 12;4(151)

Analyse comparative de la communauté bactérienne

Nicole A. Abreu et al., Sci Transl Med 2012;4:151ra124

Published by AAAS

14 sujets

7 Controles 7 CRS

10 Controles/ 10 CRS

Exemple: Abreu et al. 2012

Sci Transl Med. 2012 Sep 12;4(151)

Corynebacterium Tuberculostearicum

+

Lactobacillus Sakei

Exemple: Aurora et al. 2013

JAMA Otolaryngol. 2013 Dec;139(12):1328-38.

DYSBIOSE

• ABONDANCE

• DIVERSITE

• STAPH AUREUS

• BACTERIES « Acide Lactique »

• PROPIONE BACTERIUM ACNES

• CORYNEBACTERIUM TUBERCULOSTEARICUM

• LACTOBACILLUS SAKEI

• Prevotella

Antibiotique ?

Antibiotique ?

• Liu et al., 2013

• 6 patients

• Prélèvement maxillaire, analyse ADN (pyroséquençage) avant et arpès traitement médical maximal (4 semaines, cefuroxime, moxifloxacine)

• Amélioration endoscopique

• Réduction de la diversité du microbiome.

Int Forum Allergy Rhinol. 2013 Oct; 3(10): 775–

781.

Probiotique

• Traitements probiotiques utilisés pour réduire le

nombre d’infections des voies aériennes

supérieures

• Effet positif validé chez les patients sensibles par

une revue Cochrane, puis chez les volontaires sains

(West et al. 2013 ; Bifidobacterium lactis)

Probiotique

Auteur, année Méthode Probiotique Résultat

Abreu, 2012 Souris, CorynebacteriumTuberculostearicum

Lactobacillus Sakei

c. Caliciformes (inflammation)

Cleland, 2014 Souris,Staph. Aureus

Staph. Epidermitis

c. Caliciformes (inflammation)

Probiotique

Auteur, année Méthode Probiotique Résultat

Abreu, 2012 Souris, CorynebacteriumTuberculostearicum

Lactobacillus Sakei

c. Caliciformes (inflammation)

Cleland, 2014 Souris,Staph. Aureus

Staph. Epidermitis

c. Caliciformes (inflammation)

Auteur, année sujets Probiotique Résultat

Mukerji, 2009 77 CRS Lactobacillus Rhamnosus p.o.

Pas d’amélioration du SNOT-20

Modification du Milieu

• Eradication du biofilm in vitro

• Antibiotiques

• Soda cafféiné sucré

• Peptides salivaires

• Probiotiques

• Traitements physiques (lavages, flux d’air, lumière, laser)

• Antiseptiques

• Mucolytiques

• Surfactants

• Lait fermenté

• Furosémide

• Acide citrique

• Dexamethasone

• Bleu de méthylène

• Violet de gentiane

• Citrate d’ammonium

• Miel

Modification du Milieu

• Eradication du biofilm chez l’animal

• Antibiotiques

• Acide citrique

• Surfactant

• Hydrodebrider

• Nitrate de Gallium

Modification du Milieu

• Eradication du biofilm chez l’homme

• Antibiotiques

• Irrigation de mupirocine et doxycycline

• Irrigation de surfactant « baby shampoo »

• Injection IM thiamphenicol glycinate acetylcysteinate

Interaction Hôte-

Microorganismes

Hôte

Composition du Mucus

Anomalies ciliaires

Déficit de l’im. Humorale

Anomalies de l’im. Innée

Allergie

Déficits enzymatiques

Microorganismes

Diversité Quantité

Biofilms

Staphylocoques aureus

Pseudomonas

Moisissures

Modification de l’Immunité

• Anticorps monoclonaux

• anti-interleukin-5 (Mepolizumab)

• anti-immunoglobulin E (Omalizumab)

• anti-interleukine 4 et 13 (Dupilumab)

En Conclusion

1. Le microbiome est différent selon la pathologie

• Quantité

• Diversité

2. Le microbiome a une impact clinique

3. La réponse immunitaire locale est altérée

4. Stratégie thérapeutique ?

• Antibiotique / Probiotique

• Modification du Milieu / de l’Immunité (cytokines)

Probiotique

• Dysbiose

• Microbiome très différent selon les patients

• Abondance

• Diversité

• Staphylococcus aureus, Proteobacteria (Enterobacter)

• Actinobactéries (Propionibacterium, Corynebacterium)

• Compétition

• Staphylococcus epidermitis Staphylococcus Aureus

• Lactobacillus Sakei Corynebacterium Tuberculostearicum

Probiotique in CRSAuthors A N Method Result Bact

S.S Mukerji 2009 77 CRS QoL No improvement L.Rhamnosus

E.J.Cleland 2014 Mouse ModelS.Aureus

+ S. Epidermidis

L.Q. Swandt 2011 18 ENT biofilms

Beneficials effects on eradicing Biofilm

Biofilm

Q.Hoa(ReviewCochrane)

2011 Rev. URTI Episodes infectieux / AB ds URTI

L.Casei

N.P. West 2013 464 URTIEpisodes infectieux

B.lactis

N.A. Abreu 2012 Mouse Model Protectif v/ CorynebacteriumTuberculostearicum

L. sakei