NOUR BEN ABDALLAH

ISOLEMENT ET CARACTERISATION DE BACTERIES A FORT

POTENTIEL PROBIOTIQUE À PARTIR DU TRACTUS

GASTROINTESTINAL DE VOLAILLE

Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval

dans le cadre du programme de maîtrise en Microbiologie agroalimentaire pour l'obtention du grade de maître es sciences (M.Sc)

DEPARTEMENT DE SCIENCE ET TECHNOLOGIE DES ALIMENTS FACULTÉ DES SCIENCES DE L'AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATION

UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC

2010

© Nour Ben Abdallah, 2010

.

À mes parents Majid et Raja

RESUME

Les souches bactériennes à Gram négatif sont répertoriées comme étant celles qui causent

le plus de toxi-infections alimentaire au Canada. Parmi les aliments incriminés, la viande

de volailles demeure le plus connu des véhicules de transmission de ces pathogènes. Le

contrôle de la flore pathogène chez la volaille consiste non seulement de réduire le taux

de mortalité en élevage mais également d'assurer une meilleure qualité microbiologique à

l'arrivé aux abattoirs et par conséquent de produire des denrées salubres sans danger

pour le consommateur.

L'antibiothérapie et « l'antibioprévention » sont actuellement les seuls moyens utilisés

pour contrer les problèmes sanitaire et économique liés aux pathogènes aviaires.

Cependant le recours aux antibiotiques a connue ses limites, en raison de l'émergence de

nouvelles souches pathogènes multi-résistantes causée par l'utilisation abusive de ces

composés dans le secteur avicole. Récemment, de nouvelles stratégies de prévention ont

été proposées comme alternatives aux antibiotiques pour réduire l'incidence des

pathogènes entériques chez la volaille. Parmi ces stratégie, le recours aux probiotiques

semble offrir les résultats les plus prometteurs.

L'objectif général de ce projet de recherche était d'isoler et de caractériser à partir du

microbiote colique de la volaille des souches ayant un fort potentiel d'utilisation comme

probiotique en aviculture. Plusieurs isolats provenant de contenus intestinaux de volailles

ont été isolées et caractérisées sur le plan microbiologique et biologique. Parmi ces

isolats, vingt quatre isolats ayant démontré une activité inhibitrice contre des pathogènes

Gram négatifs ont été utilisées. Sept de ces souches ont été retenues par la suite en raison

de leur forte activité inhibitrice. Une caractérisation préliminaire des substances

inhibitrices produites par ces souches a permis de retenir trois isolats produisant des

composés de nature protéique, thermostable et de faible poids moléculaire très apparentés

à des bactériocines.

I I

AVANT-PROPOS

Ce mémoire comporte une introduction générale et trois chapitres. Dans l'introduction, le

contexte, la problématique de recherche, l'hypothèse de même que les objectifs

spécifiques poursuivis ont été présentés. Le premier chapitre correspond à une revue de la

littérature récente en rapport avec la problématique des pathogènes entérique en élevage

avicole, les moyens couramment utilisés pour réduire leur incidence de même que les

nouvelles alternative dont les probiotiques. Le second, rédigé sous forme d'article

scientifique, porte sur le criblage et la caractérisation de l'activité inhibitrice de souches

intestinales d'origine aviaire vis-à-vis des pathogènes entériques à Gram négatifs. Le

dernier chapitre, rédigé également sous forme d'articles scientifiques a permis

l'identification et la caractérisation des souches intestinales qui ont présenté la meilleure

activité inhibitrice face aux pathogènes entériques incluant Escherichia coli et

Salmonella. Finalement, une conclusion générale incluant des perspectives d'avenir est

présentée.

Ill

REMERCIMENTS

J'aimerai tout d'abord remercier très sincèrement, mon directeur de recherche, le Dr

Ismail Fliss pour la confiance et l'aide très précieuse, qu'il a su m'apporter sous bien des

formes tout au long de ce projet. L'intérêt qu'il a démontré pour l'avancement de mes

recherches et pour tous les conseils et orientations judicieuses prodiguées, qui ont

développé mon esprit scientifique et élargi mes connaissances.

Je voudrais dire un merci tout spécial à Céline Paquin à qui je dois beaucoup pour ses

nombreux avis, sa disponibilité en tout temps, son aide de toute sorte et ses

encouragements très précieux.

Toute ma gratitude va aussi à Nassra Dabour pour son aide et son savoir faire dans la

partie moléculaire.

Je remercie toute ma formidable équipe pour leur soutien et plus spécialement Nadia,

Riadh, Hajer, Benoit et Christophe sans qui le travail dans le laboratoire et mon passage

au Québec n'aurait pas été le même.

Je ne pourrais jamais passer outre cette formidable famille, qui sans le savoir, ma donnée

une chance mon oncle et mon grand frère Lotfi, cette femme formidable Lilia et mes

deux frères que j'aime énormément Hakim et Karim.

Finalement, j'adresse toute ma gratitude et tout mon amour à mes parents, qui m'ont

soutenu tout le long de mes études et qui m'ont toujours encouragé à aller jusqu'au bout

de mes rêves. Je vous serai éternellement reconnaissante pour votre soutien, votre

confiance et votre fierté. Malgré la distance, vous êtes présents à chaque fois que j'ai

besoin de vous. Je remercie aussi ma chère sœur et mon petit frère pour leur soutien, et

leur encouragement. J'ai la chance de vous avoir tous les quatre, je vous aime tant.

IV

TABLE DES MATIERES

RESUME i

AVANT-PROPOS ii

REMERCIMENTS iii

TABLE DES MATIÈRES iv

LISTE DES TABLEAUX vi

LISTE DES FIGURES vii

INTRODUCTION GÉNÉRALE 1

CHAPITRE 1. REVUE DE LITTÉRATURE 4

1.1. Les empoisonnements alimentaires 5

1.2. Le microbiote intestinal chez la volaille 5

1.2.1. Généralités 5

1.2.2. Description du tube digestif chez la volaille 6

1.2.3. Composition et évolution du microbiote colique endogène chez la volaille9

1.2.4. Les pathogènes entériques de la volaille 13

1.2.5. Contrôle des infections entériques chez la volaille 18

1.3. Les probiotiques 25

1.3.1. Définition 25

1.3.2. Critères de sélection 26

1.3.3. Les effets santé associés aux probiotiques 27

1.3.4. Activité antimicrobienne des probiotiques 28

1.3.5. Les bactériocines 29

1.3.6. Les probiotiques en aviculture 35

Hypothèse et objectifs du mémoire 38

CHAPITRE 2. Criblage et caractérisation de l'activité inhibitrice de souches intestinales vis-à-vis des pathogènes entériques gram négatif 39

2.1. Résumé 40

2.2. Introduction 41

2.3. Matériel et méthode 43

2.3.1. Souches bactériennes et conditions de culture 43

2.3.2. Mise en évidence de l'activité inhibitrice 45

2.4. Résultats et discussions 47

2.4.1. Criblage des souches 47

2.4.2. Test de microdilution 53

CHAPITRE 3. Identification et caractérisation de souches à fort potentiel probiotique isolées du tube digestif de volailles 63

3.1. Résumé 64

3.2. Introduction 65

3.3. Matériel et méthode 67

3.3.1. Souches bactériennes et conditions de culture 67

3.3.2. Tests de sérotypage 67

3.3.3. Méthodes moléculaires 67

3.4. Résultats et discusion 70

3.4.1. Analyse microscopique, coloration Gram et galerie API20 70

3.4.2. Tests de sérotypage 70

3.4.3. Analyses moléculaires 71

Conclusion générale 77

Références bibliographique 79

Annexes 88

VI

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1.1 : Composition du microbiote digestif du poulet déterminée par

dénombrement bactériens 10

Tableau 1.2 : Composition du microbiote digestif du poulet déterminée par méthodes

moléculaires 12

Tableau 1.3 : Principaux critères de sélection des probiotiques 26

Tableau 1.4 : Classification des colicines et leurs cibles cellulaires 33

Tableau 1.5 : Les dix microcines découvertes 34

Tableau 2.1 : Souches à fort potentiel probiotique 43

Tableau 2.2 : Souches sensibles 43

Tableau 2.3 : Activité inhibitrice contre Escherichia coli MC4100 du surnageant de

culture de la souche Escherichia coli LR05 cultivée à 37 °C dans le milieu

M63 pendant 18h sous agitation 47

Tableau 2.4 : Évaluation de l'activité inhibitrice (diamètre d'inhibition) contre des

pathogènes à gram négatif des surnageants de culture des 24 souches

intestinales tel que déterminée par le test de diffusion sur gélose optimisé

49

Tableau 2.5 : Évaluation de l'activité inhibitrice des surnageants de culture des souches

après un traitement thermique à 100°C pendant 5 min et/ou une filtration sur

membrane de 0,22nm 50

Tableau 3.1 : Sérotypage des souches 11004,11006 et 11026 69

Tableau 3.2 : Résultats des homologies de séquences entre les souches isolées et les

souches de références répertoriées dans Gen Bank 72

Tableau 3.3 : Les gènes codant pour la septicémie détectés chez les 3 souches 74

Vil

LISTE DES FIGURES

Figure 1.1: Schéma illustrant les caractéristiques physiologiques du tractus digestif chez

la volaille 8

Figure 1.2: Pathogénie de la souche entérohémorragique Escherichia coli 0157: H7

chez l'humain 16

Figure 1.3 : Les principaux effets bénéfiques sur la santé attribués aux

probiotiques 28

Figure 1.4: Mécanismes d'actions proposés des microorganismes probiotiques dans le

traitement des infections entériques 29

Figure 2.1 : Schéma illustrant le principe de test de diffusion sur gélose 44

Figure 2.2 : Suivie de la croissance microbienne sur microplaque 45

Figure 2.3 : Activité du surnageant de la souche Escherichia coli LR05 contre la souche

sensible Escherichia coli MC4100. A : Croissance 8h à 37°C. B : Croissance

18hà37°C 47

Figure 2.4 : Test de diffusion sur gélose montrant l'activité inhibitrice des surnageant de

culture des souches 11006 (A), 11004 (B) et 11026 (C) contre la souche

sensible Escherichia coli MC4100 suite aux différents traitements 51

Figure 2.5 : Courbes de croissance d'Escherichia coli MC4100 en absence et en présence

des surnageants brut des différentes souches intestinales 53

Figure 2.6 : Croissance d'Escherichia coli MC4100 en présences des surnageants des

cultures des souches intestinales dilué 1/2 (A), 1/4(B), 1/8 (C) et 1/16 (D).54

Figure 2.7 : Croissance d'Escherichia coli 0157 :H7 en absence et en présence des

surnageants de culture des différentes souches intestinales 56

vm

Figure 2.8 : Croissance d'Escherichia coli 0157 :H7 en présences des surnageants des

cultures des souches intestinales dilué 1/2 (A) et 1/4 (B) 57

Figure 2.9 : Croissance de la souche Salmonella enteritica en absence et en présence des

surnageants des souches bactériocinogènes 59

Figure 2.10 : La croissance de Salmonella enteritica en présences des surnageants des

cultures des souches intestinales dilué 1/2 (A) et 1/4 (B) 60

Figure 3.1 : Analyse du produit d'amplification du gène d'ARN 16S par électrophorèse

sur gel d'agarose 16S 70

INTRODUCTION GENERALE

Selon le Centre Québécois d'Inspection des Aliments et de Santé Animale (CQIASA,

2008), E. coli 0157.H7 (34%), Salmonelles (28%) et Campylobacter (17%) ont été

identifiées comme étant les agents pathogènes les plus souvent mis en cause dans des

toxi-infections alimentaires rapportées entre le 1er avril 2007 et le 31 mars 2008. De

plus, une augmentation des cas attribuables à Listeria monocytogenes a été signalée en

2009. La filière « Viandes et volailles » a été incriminée dans plus de 40,4 % des cas de

toxi-infections alimentaires rapportés. En ce qui concerne les espèces animales

impliquées, mentionnons les volailles (19,2%), le bœuf (13,1%), le porc (1,5%),

l'agneau (0,5%) et des viandes diverses sans différenciation d'espèce (6,3 %). Ces

résultats sont comparables à ceux de 2006-2007 (CAAAQ 2008).

Selon l'Organisation des Nations Unies pour l'alimentation et l'agriculture, la

production de poulet a enregistré une croissance régulière dans le monde depuis le

début des années 90. De 1985 à 2005, la production mondiale a augmenté de 158 %

alors que la production canadienne s'est accrue de 77 %. La majorité de cette

production (60,1%) se situe en Ontario et au Québec (statistiques Canada). Selon

Statistique Canada la consommation de poulet par habitant a bondi de 136 % au Canada

au cours des 30 dernières années, passant de 13 kg en 1975 à 30,7 kg en 2005 alors que

la consommation de bœuf et de porc a diminué de 35 % et 4 % respectivement durant la

même période. Les volailles sont prédisposées à de nombreuses infections en particulier

celles des systèmes gastro-intestinal et respiratoire. Malgré une amélioration importante

des conditions d'hygiène et de salubrité dans le domaine de la production et de

l'élevage de volailles, les infections entériques chez cette espèce persistent ce qui

causent des pertes économiques importantes pour l'éleveur. Les animaux atteints de

maladies gastro-intestinales manifestent un gain de poids de moins en moins important

ainsi que des signes de faiblesse. Ceux sérieusement atteints peuvent mourir peu de

temps après l'observation des premiers signes cliniques.

Jusqu'à présent la microflore intestinale des oiseaux et ses variations étaient contrôlées

par les antibiotiques qui sont utilisés de façon systématique comme facteurs de

croissance en aviculture. Les antibiotiques sont définis comme des substances d'origine

microbienne, produites par des bactéries du sol et certains champignons et qui, à très

petites doses, agissent sur d'autres microorganismes. Une de leurs caractéristiques est

de ne pas être toxique pour les cellules d'eucaryotes. Cette propriété, associée à la

grande efficacité des molécules, a fait des antibiotiques le remède « magique » du

20lème siècle. Chez la volaille, l'administration quotidienne de faibles doses

d'antibiotiques a permit d'obtenir une croissance accélérée et une consommation

moindre d'aliments en modifiant la flore intestinale et la digestibilité des aliments.

Cependant, avec le temps, leur administration répétée et parfois inappropriée chez

l'homme comme chez l'animal a contribué à l'augmentation de la résistance des agents

pathogènes vis-à-vis des antibiotiques. Face à l'apparition croissante de la résistance

aux antibiotiques conventionnels, à l'émergence de nouveaux agents pathogènes tant

chez l'homme que chez l'animal, à l'augmentation des coûts des traitements, à la baisse

de leur efficacité, les antibiotiques ne garantissent plus une réponse favorable. Avec

leur suppression annoncée en Europe en 2006, des alternatives comme les probiotiques

devront être développées pour mieux maîtriser le microbiote digestif chez la volaille.

Les probiotiques ont récemment été définies par la FAO comme étant des

microorganismes vivants qui lorsqu'ils sont administrés en quantité adéquate, procurent

un effet bénéfique pour la santé de l'hôte (FAO/WHO 2002). Ds sont utilisés au niveau

industriel depuis les années 1960 dans l'alimentation destinée aux élevages d'animaux

et depuis les années 1980 dans certains aliments ou en tant que compléments

alimentaires pour l'homme. Leur efficacité au niveau intestinal est maintenant bien

reconnue. Les probiotiques représentent une approche naturelle d'enrichissement de la

flore intestinale et d'exclusion compétitive pour lutter contre les bactéries pathogènes.

En renforçant l'écosystème microbien des volailles, les probiotiques contribuent à la

défense immunitaire et protègent les poulets contre les conséquences de stress tels que

la vaccination et les changements de températures (Patterson and Burkholder 2003).

Des améliorations en terme de gain de poids et de l'indice de consommation ont ainsi

été observée suite à la consommation de probiotiques (Jin, Ho et al. 1998); (Simon,

Jadamus et al. 2001). Les probiotiques peuvent se comparer à de véritables usines

actives capables de véhiculer des principes actifs qu'ils contiennent comme les enzymes

qui aident à la digestion des fibres, des substances antibactériennes comme les acides

organiques et les bactériocines pour combattre plusieurs micro-organismes pathogènes

(Sreekumar and Hosono 1998); (Fooks, Fuller et al. 1999).

Les bactériocines sont des protéines produites par certaines bactéries et qui sont capable

d'inhiber d'autres bactéries en se fixant sur des récepteurs spécifiques (Joerger 2003).

Parmi celles produites par les bactéries de l'écosystème intestinal, les microcines

représentent une nouvelle catégorie encore peu étudiée et présentant un intérêt majeur.

Ces dernières se caractérisent par leur faible poids moléculaire, leur résistance à la

température et à de nombreuses proteases, et surtout par leur spectre d'action

extrêmement restreint avec une activité dirigé surtout contre les bactéries

phylogénétiquement proches des souches productrices. Les mécanismes de régulation

de la synthèse des microcines sont encore peu connus mais généralement, un milieu

nutritionnel pauvre favorise leur production. Cependant, très peu de travaux ont

clairement démontré la production de bactériocines dans les conditions physiologiques

du tube digestif et l'implication de ces molécules comme mécanisme d'action des

probiotiques contre la flore entérique pathogène.

Le but de cette recherche est d'identifier des souches intestinales de volaille

productrices de substances inhibitrices actives contre des pathogènes entériques

incluant Escherichia coli et Salmonella et de les caractériser clairement pour

d'éventuelle utilisation comme souches potentiellement probiotique pour le contrôle

des microorganismes pathogènes en aviculture.

CHAPITRE 1. REVUE DE LITTERATURE

1.1. LES EMPOISONNEMENTS ALIMENTAIRES

Les empoisonnements alimentaires sont des maladies liées à la consommation

d'aliments contaminés par des germes pathogènes. Leur durée, leur sévérité, ainsi que

leur évolution dépendent beaucoup de l'agent pathogène impliqué. Santé Canada estime

que chaque année environ deux millions de canadiens sont victimes de maladies

d'origine alimentaire et une trentaine d'entre eux en meurent. Selon le bilan annuel du

Centre Québécois d'Inspection des Aliments et de Santé Animale (CQIASA 2008), les

empoisonnements alimentaires les plus répandus sont les salmonelloses, les toxi-

infections à Staphylocoque, la listériose ainsi que le botulisme. Parmi les

empoisonnements alimentaires signalés au MAPAQ en 2007-2008, 47,8 % sont

survenues après la consommation d'aliments à la maison, alors que dans 45,5 % des

signalements, les symptômes sont apparus à la suite d'un repas au restaurant, dans

d'autres catégories d'établissements (4,4 %) ou dans des institutions de restauration

collective (2,3 %).

La filière « Viandes et volailles » a été la plus souvent visée par les déclarations

d'empoisonnement alimentaires (40,4 %). Les agents pathogènes les plus souvent

signalés en 2007-2008 ont été E. coli 0157.H7, Salmonella et Campylobacter. De plus,

une augmentation de cas attribuables à Listeria monocytogenes a été signalée cette

année. Pour l'ensemble des cas rapportés, 25,9 % des signalements, ont été confirmés

par un diagnostic médical, par l'isolement de l'agent causal dans les aliments ou par

une enquête épidémiologique, alors que dans 26,5 % des cas, aucun lien avec

l'alimentation n'a été établi. Sur tout les cas rapportés confirmés ou probables, 91,8 %

sont d'origine microbiologique. Cette donnée est comparable aux résultats des années

antérieures (CQIASA 2008).

1.2. LE MICROBIOTE INTESTINAL CHEZ LA VOLAILLE

1.2.1. Généralités

Selon la définition d'Isolauri et ses collaborateurs, le microbiote intestinale normale est

un consortium complexe et en équilibre de microorganismes qui habitent normalement

le tractus gastro-intestinal et qui remplissent un rôle dans la nutrition, la physiologie et

le fonctionnement du système immunitaire de l'hôte (Isolauri, Sutas et al. 2001). La

composition de ce microbiote intestinal est en équilibre relativement stable dans le tube

digestif. Cet équilibre peut être rompu avec l'âge, les conditions d'hygiène, le stress ou

à la suite d'une agression extérieure comme lors de l'utilisation d'antibiotiques, de

facteurs de croissance (Gabriel, Mallet et al. 2003). Ainsi, on note des populations

microbiennes plus élevées chez des animaux élevés au sol sur litière propre ou litière

contaminée par une bande précédente par rapport à des animaux élevés en cage

individuelle (Gabriel, Mallet et al. 2003). Selon les conditions d'élevage,

l'augmentation de la densité d'élevage ou les stress thermiques semblent globalement

augmenter les bactéries néfastes au détriment des bactéries bénéfiques (Gabriel, Mallet

et al. 2005). Outre ces conditions, la présence de parasites intestinaux comme les

coccidies, peut entraîner la dégradation de la muqueuse intestinale et la production de

nouveaux substrats pour la microflore, modifiant ainsi sa composition (Kimura,

Shiosaka et al. 1976). La flore est modifiée aussi par l'alimentation. Ainsi, le type de

céréales en particulier la présence de polysaccharides non amylacés hydrosolubles

(Mathlouthi, Mallet et al. 2002) ou leur mode de présentation (Gabriel, Mallet et al.

2003) entraînent des changements de la flore. De même, les matières grasses, ou le type

d'amidon peuvent avoir un effet sur la composition du microbiote (Weurding, Enting et

al. 2003).

7.2.2. Description du tube digestif chez la volaille

Le tractus gastro-intestinal présente quelques particularités anatomiques (Figure 1.1).

On distingue différents compartiments ; la cavité buccale ne comprend ni lèvres ni

dents, mais un bec corné qui permet la préhension et une certaine fragmentation des

aliments. Les glandes salivaires sont peu développées. D n'y a ni voile de palais, ni

épiglotte, si bien que la déglutition est un phénomène uniquement mécanique par

redressement de la tête. Dans la bouche, les aliments sont peu fragmentés et

grossièrement insalivès (M. Larbier and Leclercq 1992). L'œsophage contient un

renflement dont l'épithélium est riche en glandes à mucus : le jabot. Cet organe de pH

variant entre 4,47 et 4,54 (Farner 1942) peut entreposer des aliments qui s'y humectent

et s'y ramollissent, il fonctionne chez le poulet alimenté à volonté. Il est le lieu d'une

digestion microbienne et comporte essentiellement des Lactobacilles, d'une partie de

l'amidon (hydrolyse avec formation d'acides lactique) et de formation d'acide gras

volatiles (M. Larbier and Leclercq 1992). Le proventricule est riche en glandes

sécrétoires (acide chlorhydrique et pepsinogène précurseur de la pepsine) et permettant

la digestion chimique : c'est l'estomac chimique. La protéolyse y débute à pH de 3 à

4,5. Dans le gésier et le proventricule, le faible pH fait chuter la population bactérienne

(Farner 1942). Le gésier, estomac mécanique est caractérisé par une couche

superficielle très dure entourée de muscles puissants. Il y règne un pH très bas (2 à 3,5)

et il peut contenir de petits graviers qui sont nécessaires aux animaux consommant des

grains intacts. C'est donc au niveau du gésier que se produit véritablement la protéolyse

sous l'action de la pepsine (Gabriel, Mallet et al. 2005). Dans l'intestin,

l'environnement devient plus favorable à la croissance bactérienne en raison de la plus

faible pression d'oxygène et de la faible concentration en enzyme et en sels biliaires et

d'un pH variant dans le duodénum entre 5,68 et 6,07, dans le jéjunum entre 5,72 et 6,

dans le caecum entre 5,6 et 5,83, l'iléon entre 6,18 et 6,50 et dans le colon entre 6,08 et

6,58 (Farner 1942).

8

Jabot pH = 4,47 - 4.54

Proventricule pH = 4,33 -4,51

Gésier \ ^ f \ pH = 2,46 - 2,79

Duodénum pH = 5,68 - 6,07

Figure 1.1 : Schéma illustrant les caractéristiques physiologiques du tractus digestif

chez la volaille (Farner 1942).

À la naissance les poussins sont axéniques. Le microbiote spécifique commence à se

développer dès les deux premiers jours pour donner lieu à une flore microbienne

environnementale spécifique après trois à six semaines (Methner, Barrow et al. 1997).

En effet, après l'éclosion, la flore augmente rapidement. Ainsi dès le premier jour,

l'iléon et le caeum hébergent 108 et 1010 bactéries par gramme de contenu digestif. Leur

nombre atteint 109 et 10" bactéries par gramme en 3 jours et reste relativement stable

jusqu'à l'âge de 30 jours (Gabriel, Mallet et al. 2005). La flore est composée

essentiellement de bactéries à Gram positif anaérobies facultatives du jabot à l'iléon

terminal, alors que le caecum contient en plus des anaérobies stricts, ces dernières étant

dominantes (Gabriel, Mallet et al. 2005).

D'un point de vue qualitatif, dès le premier jour, les conformes, les streptocoques et les

clostridies colonisent rapidement le tube digestif, du jabot au caecum, alors que les

lactobacilles et les Bactéroïdes ne sont mis en évidence dans le caecum qu'après 3 jours

et 5 jours respectivement (Gabriel, Mallet et al. 2005). Les populations bactériennes

9

présentes dans le tractus digestif représentent une large gamme de types métaboliques

et morphologiques. Leur nombre total est plus important que le nombre de cellules

eucaryotes constituant le corps de l'hôte. On distingue les bactéries dominantes (>106

UFC /g contenu), sous-dominantes (105 à 103 UFC / g contenu), et résiduelles (<103

UFC / g contenu). Chez le poulet, les sites principaux d'activité bactérienne sont le

jabot, le caecum et, dans une moindre mesure, l'intestin grêle (Cole and Fuller 1984).

Ainsi, dans le caecum et l'iléon, on trouve respectivement 1011 et 109 bactéries par g de

contenu (Apajalahti, Kettunen et al. 2004). Les études effectuées sur le microbiote des

oiseaux ont concerné principalement le caecum (Gabriel, Mallet et al. 2005).

1.2.3. Composition et évolution du microbiote colique endogène chez la

volaille

La flore digestive des oiseaux a été très étudiée, et s'avère différente de celle des

mammifères (Smith 1965), probablement du fait de différences anatomiques et

physiologiques. En particulier, les mammifères ont un côlon très développé par rapport

aux oiseaux. Le tube digestif des oiseaux, comme celui des mammifères renferme une

population microbienne extrêmement riche et diversifiée, composés de nombreux

microorganismes différents (Andrieu 1995; Pascual, Hugas et al. 1999).

La colonisation initiale des poussins par des agents inoffensifs prévient l'intrusion

d'agents pathogènes ou indésirables. Ces flores naturelles ne sont pas entièrement

connues, aussi bien en terme de composition bactérienns qu'en terme d'effet induits.

On parle alors de microbiote indéfini. Des nombreuses études effectuées sur le

microbiote digestif des oiseaux depuis les années 1950 ont fait appel aux cultures de

bactéries sur milieu sélectif. Or une proportion très élevée de bactéries, jusqu'à 90%

selon les estimations, n'est pas cultivable (Lan, Hayashi et al. 2002). Pour résoudre ce

problème, des techniques de biologie moléculaire ont été développées. Elles permettent

de mettre en évidence, grâce à leur ADN ribosomal 16 S, les microorganismes quelles

que soient leurs conditions de viabilité (Gabriel, Mallet et al. 2005).

10

1.2.3.1. Données de microbiologie classique

Les méthodes classiques d'identification bactérienne reposent sur la capacité des

cellules de pousser et de former des colonies visibles sur des milieux solides (boites de

Pétri). Ces méthodes montrent que la flore, constituée principalement de bactéries à

Gram positif, est composée essentiellement d'anaérobies facultatives du jabot à l'iléon

terminal, alors que le caecum contiennent en plus des anaérobies strictes, ces dernières

étant dominantes ((Cole and Fuller 1984), Tableau 1.1). Dans le jabot, on trouve

principalement des Lactobacilles qui sont attachés à l'épithélium et forment presque

une couche continue. On trouve aussi des streptocoques, des coliformes et des levures.

Dans le gésier et le pro ventricule, le faible pH (Figure 1.1) fait chuter la population

bactérienne (Gabriel, Mallet et al. 2005). Dans le duodénum, les conditions ne sont pas

propices au développement de la flore : présence de nombreuses enzymes, forte

pression en oxygène, présence de fortes concentrations de composés antimicrobiens tels

que les sels biliaires et mouvements de reflux du jéjunum au gésier entraînant une

modification rapide des conditions de milieu (Gabriel, Mallet et al. 2005). Plus loin

dans l'intestin, l'environnement devient plus favorable à la croissance bactérienne en

raison de la plus faible pression d'oxygène et de la faible concentration en enzymes et

en sels biliaires (réabsorbés par l'hôte et dégradés en partie par la microflore) (Gabriel,

Mallet et al. 2005).

Tableau 1.1 : Composition du microbiote digestif du poulet déterminée par

dénombrement bactériens (Smith 1965).

Groupes majoritaires

Nombre de bactéries viables (log™ UFC / g de contenu) Groupes majoritaires Jabot Gésier Intestin

1(2) Intestin

3 Intestin

5 Intestin

7 Caeca

Lactobacilles Streptocoques Escherichia coli Levures Clostridium welchi Bacteroïdes

8,7 4,0 1,7 2,7 nd nd

7,3 3,7 nd nd nd nd

8,0 4,0 2,0 1.7 nd nd

8,2 4,0 1,7 nd nd nd

8,2 3,7 1,7 1,7 nd nd

8,6 4,2 2,7 nd nd nd

8,7 6,7 5,6 2,0 1,7 8,7

UFC : Unité Formant Colonie.

nd : organisme non détecté, c'est-à-dire quantité dont le log 10 est inférieur à 1,7 /g .

(1) Poulets de chair adulte issue d'un élevage (6 individus), consommant un régime composé de céréales et de farine

de poisson (10-15 %), sans antibiotique.

(2) L'intestin a été divisé en 7 parties : différentes portions ont été étudiées (la lre, la 3e, la 5e et la 7e partie).

11

Les méthodes de cultures conventionnelles ont conduit à l'identification chez le poulet

de 29 genres bactériens, chaque genre étant représenté par 3 à 4 espèces, et chaque

espèce par 3 à 4 types métaboliques différents, ce qui ferait plus de 200 souches

différentes (Mead, Norris et al. 1989). D'autres miroorganismes dont l'activité

métabolique a été mise en évidence n'ont pas pu être isolés et caractérisés du fait de

leur besoin d'anaérobiose stricte ou de l'ignorance des composants nécessaires à leur

croissance (Mead, Norris et al. 1989). Ainsi, seulement 25 % des souches seraient

identifiées.

1.2.3.2. Données de microbiologie moléculaire

Au niveau moléculaire, de nombreuses méthodes ont fait l'objet d'expérimentations, en

particulier à l'aide de méthodes à base de PCR et plus récemment les puces à ADN (Ye,

Wang et al. 2001) ainsi, que les sondes PNA (Stender, Fiandaca et al. 2002). La

majorité des méthodes utilisées actuellement repose sur une amplification pour

augmenter la sensibilité. La PCR est très généralement utilisée (Hellyer, DesJardin et

al. 1999; McKillip, Jaykus et al. 1999) mais on trouve également des méthodes

d'hybridation directe (Meijer, Roholl et al. 2000). Les données présentent après des

tests moléculaires ont confirmé certains résultats obtenus par les méthodes de culture

conventionnelle. Ainsi, la présence majoritaire des bactéries à Gram positif dans le tube

digestif et des Lactobacilles au niveau de l'intestin grêle, ainsi que la diversité plus

importante des populations bactériennes au niveau du caecum sont confirmées par

(Gong, Forster et al. 2002) et (Lu et al. 2003), tel que présenté dans le tableau 2. Les

méthodes moléculaires font aussi apparaître des différences. Ainsi les Clostridiaceae

seraient beaucoup plus importantes quantitativement surtout dans les caecum (Lu, Idris

et al. 2003), tableau 1.2).

12

Tableau 1.2 : Composition du microbiote digestif du poulet déterminée par méthodes

moléculaires (Lu, Idris et al. 2003), (1).

Groupe Classe % de classe (2,3)

Groupe Classe Jéjunum + Iléon Caeca

Gram +, faible G+C Iléon : 94,2 % ; Caeca : 76,9 %

Lactobacillaceae Clostridiaceae (6) Bacillaceae Staphylococcaceae Streptococcaceae Enterococcaceae

68,7 10,8 0.7 1,0 6,6 6,4

8,2 65,6 1,4 0

0,7 1,0

Gram +, fort G+C Iléon : 0,9 % ; Caeca : 13,9 %

Fusobacteriaceae Bifidobacteriaceae

0,7 0,2

13,9 0

Gram - , protéobactéries (4) Iléon : 2,3 % ; Caeca : 2,8 %

2,3 2,8

Gram - (5) Iléon : 0,6 % ; Caeca : 5.2 %

Flavobacteriaceae Bacteroïdaceae

0 0,6

0,2 5,0

(1) Poulets de chair à croissance rapide élevées en conditions commerciales, consommant un régime composé

de maïs et de soja, sans antibiotique.

(2) Valeur moyenne pour des animaux de 3 à 49j (10 individus de 3 et 7j, 5 individus de 14 à 49j).

(3) 614 et 616 séquences pour l'intestin et les caeca respectivement, avec séquençage partiel (350 à 410pb).

(4) Ochrobacterium, Alcaligenes, Echerichia, Campylobacter.

(5) Cytophage, Flexibacter, Bacteroïdes.

(6) Clostridium, Ruminococcus, Eubacterium.

1.2.3.3. Facteurs de variations

La flore luminale dépend des nutriments disponibles, de la vitesse de transit et de la

présence ou non de substances antimicrobiennes (Schrezenmeir and de Vrese 2001). La

flore des muqueuses dépend de l'expression par l'hôte de sites d'adhésion spécifiques

sur les membranes des entérocytes, de la vitesse de production de mucus, de la

production d'anticorps sécrétoires et de l'extrusion du matériel cellulaire de la

membrane (Fréter 2004; Gabriel, Mallet et al. 2005). Chez les volailles, l'inoculation

naturelle se fait à partir du microbiote des adultes ou de celui des aliments. Le

microbiote digestif chez les volailles peut également varier en fonction des individus et

dépend de leur âge (Lu, Idris et al. 2003), de leur alimentation (Mathlouthi, Mallet et al.

2002), de leur milieu d'élevage et de l'environnement (Gabriel, Mallet et al. 2005).

13

1.2.3.4. Fonction du microbiote intestinal

La microflore intestinale exerce de nombreuses fonctions physiologiques dont les

répercussions sur l'hôte sont, pour la plupart, bénéfiques. Parmi les grandes fonctions

du microbiote est sa capacité à convertir une grande variété de substrats (incluant

glucides, protéines et lipides) en substances nutritives. Ces substances génèrent une

diversité d'effets bénéfiques sur la santé de l'hôte, sur la fermentation des substrats

disponibles au niveau du côlon (Gérard and Bernalier-Donadille 2007) et sur le

développement d'une barrière microbiologique contre la colonisation par les micro­

organismes pathogènes. La microflore permet également le développement et la

maturation du système immunitaire intestinal. Cette microflore interagit avec les

cellules épithéliales pour le maintien de la santé de l'hôte (Gérard and Bernalier-

Donadille 2007). La microflore intestinale doit ainsi être considérée dans son contexte

environnemental, incluant l'hôte et l'aliment. Les interrelations entre ces différents

constituants assurent l'homéostasie de l'écosystème microbien digestif. Toute rupture

de l'équilibre entre ces constituants est susceptible de perturber le fonctionnement de

l'écosystème et d'être à l'origine de pathologies digestives (fonctionnelles,

inflammatoires, infectieuses, etc) (Patterson and Burkholder 2003).

1.2.4. Les pathogènes entériques de la volaille

1.2.4.1. Maladies entériques chez la volaille

Les volailles sont prédisposées à de nombreuses infections parasitaires, bactériennes,

mycoplasmiques et virales en particulier celles des systèmes respiratoire et gastro­

intestinal. Les maladies entériques à forte prévalence comme la cryptosporidiose ou la

paratuberculose, conduisent à des pertes économiques élevées dans les élevages. De

nombreuses espèces de Salmonella peuvent attaquer les oiseaux adultes et causer des

taux élevés de mortalité et de morbidité. Une autre problématique liée à la présence de

ces pathogènes dans le tube digestif est la contamination des denrées alimentaires

provenant de la volaille. Les infections par le Welchia sont responsables de l'entérite

nécrosante. Les infections infracliniques résultent dans des performances altérées et des

lésions du foie. La maladie clinique aiguë entraîne une mortalité accrue (Chafai 2006).

14

Le traitement de choix suppose l'utilisation d'antibiotiques, mais ne prévient pas la

récurrence de la maladie après arrêt de la médication. Les mesures de contrôle

consistent en une pratique d'hygiène adéquate dans la chaîne de production et au niveau

du consommateur.

1.2.4.2. Escherichia coli

Escherichia coli est une bactérie fréquente du tube digestif de l'homme et des animaux

à sang chaud. La plupart des souches d'E. coli sont sans danger. Certaines souches,

cependant, comme les souches entérohémorragiques (ECEH), peuvent être à l'origine

de toxi-infections alimentaires (TIA) graves. Son importance pour la santé publique est

apparue en 1982, à la suite d'une flambée de TIA aux États-Unis. ECEH fabrique des

toxines, connues sous le nom de verotoxines ou de toxines de type Shiga en raison de

leur ressemblance avec les toxines élaborées par Shigella dysenteriae.

Les Escherichia coli aviaires, bien que considérés par beaucoup comme pathogènes

secondaires, représentent à l'heure actuelle l'une des plus importantes causes de pertes

économiques dans le secteur avicole. Les Escherichia coli sont des hôtes commensaux

du tractus digestif de la volaille et la plupart des souches ne sont pas pathogènes.

Cependant, un certain nombre de celles-ci appelées « Avian Pathogenic E. coli » ou

APEC et appartenant à des serotypes bien particuliers sont associées au syndrome de la

colibacillose (Stordeur and Mainil 2002). La voie d'entrée principale de l'agent

pathogène est le tractus respiratoire, via l'inhalation de particules de poussières

contaminées par les E. coli excrétées du tractus digestif d'animaux sains. Les intestins

sont, en effet, le réservoir le plus important des E. coli pathogènes aviaires ou APEC.

Après une première multiplication au niveau du tractus respiratoire supérieur, les

bactéries colonisent les voies respiratoires profondes à savoir les sacs aériens et les

poumons. Dans une troisième étape, la bactérie atteint le sang et colonise les organes

internes comme le cœur, le foie et la rate (Jordan and Pattison 1996).

Les colibacilloses sont sans doute les infections bactériennes les plus fréquentes et les

plus importantes en pathologie aviaire. Elles peuvent entrainer de la mortalité, des

baisses de performances et des saisies à l'abattoir (Stordeur and Mainil 2002).

15

Contrairement aux infections des mammifères, les colibacilloses aviaires prennent des

formes générales, avec une voie d'entrée respiratoire ou génitale (Stordeur and Mainil

2002). L'agent étiologique de la colibacillose est la bactérie Escherichia coli. Elle est

caractérisée par les antigènes O (somatique), H (flagellaire), F (pilus) et K (capsulaire),

qui permettent d'identifier plusieurs serotypes. Chez les oiseaux, les serotypes

considérés comme pathogènes sont 01 Kl, 02K1 et O78K80. De nouveaux serotypes

pathogènes (non typables) sont en émergence. Plusieurs facteurs de virulence potentiels

sont identifiés chez les E. coli aviaires : adhésines de fimbriae, protéine à activité

hémagglutinante, système aérobactine de captation du fer, antigène capsulaire

polysaccharidique, résistance au pouvoir bactéricide du sérum, toxines et cytotoxines

(Stordeur and Mainil 2002; Mainil 2003; Mainil 2003; Mainil and Van Bost 2004).

Le jeune âge, le stress, un taux élevé d'ammoniac, une baisse de la température, des

infections concomitantes, favorisent la colibacillose. La contamination est

essentiellement par voie aérienne via des aérosols. Les bactéries sont inhalées et

contaminent les sacs aériens. Ceux-ci peuvent prolonger l'infection aux organes

génitaux par contact. Certains Escherichia coli intestinaux provoquent des infections

après entérite. La transmission verticale est possible mais rare.

Escherichia coli 0157:H7 est un entéropathogène non-invasif, décrite pour la première

fois en 1982, les infections d'Escherichia coli 0157.H7 sont rapidement devenues une

cause majeure de diarrhées et de troubles rénaux aigus chez l'humain (Lamps 2007). Il

possède des facteurs de virulence lui permettant de s'attacher aux cellules intestinales et

de libérer des toxines, connues sous le nom de vérotoxines ou toxines de type Shiga en

raison de leur ressemblance avec les toxines élaborées par Shigella dysenteriae (Figure

1.2). Les vérotoxines jouent un rôle important dans l'apparition des symptômes gastro­

intestinaux mais l'étape cruciale dans la pathogenèse d'E. coli 0157.H7 est

l'attachement aux cellules de l'hôte (LeBlanc 2003). Suite à l'infection, des

hémorragies, de l'oedème et une infiltration de neutrophiles situés au niveau de la

lamina propria peuvent se produire au niveau des cellules intestinales (Nataro and

Kaper 1998).

16

<? estlon <T£. coli pathogènes

Colonisation du gros intestin + attachement

intime aux cellules epltbellales

Diarrhée sanguinolente ♦

insuffisance rénale

Transport des toxines dans la circulation sanguin*

Figure 1.2 : Pathogénie de la souche entérohémorragique E. coli 0157.H7 chez

l'humain. Adapté de Nataro et Kaper (1998)

Le diagnostic chez l'humain s'effectue soit par l'isolation de la bactérie E. coli

0157.H7 ou la détection de la présence des vérotoxines dans des échantillons fécaux ou

la détection d'une augmentation d'anticorps anti-£. coli 0157:H7 dans le sérum

(Nataro and Kaper 1998).

Les Escherichia coli 0157 : H7 sont parfois mortelles, notamment chez les enfants.

Des cas, généralement associés à la consommation de viande, ont été signalés en

Australie, au Canada, au Japon, aux États-Unis, dans divers pays européens et en

Afrique australe (WHO 1997).

1.2.4.3. Salmonella

Plus de 60 % des toxi-infections dans le monde sont dues à Salmonella. Les

salmonelloses sont de ce fait, devenues un phénomène de santé publique ce qui justifie

17

l'implication de l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) dans la lutte contre les

salmonelloses (Salm-Surv 2005).

Les salmonelles appartiennent à la famille des entérobactéries, ce sont des bacilles

mobiles à Gram négatif, aéro-anaérobies facultatifs, mésophiles qui se cultivent

facilement. À nos jours plus de 2300 serotypes différents de salmonelles sont identifiés,

sur le plan épidémiologique et sont classées en fonction de leur potentiel pathogène

pour l'homme ou l'animal. La virulence des salmonelles est une notion complexe,

résultant de nombreux facteurs encore largement étudiés, tant au niveau biochimique

que génétique. Les principaux facteurs de virulence sont la mobilité (reposant sur les

flagelles), l'adhésion par les pili et les fimbriae (phénomène actif de reconnaissance

spécifique entre une adhésine bactérienne et un ligand présent à la surface d'une cellule

hôte), l'invasion (par endocytose pour les entérocytes, par phagocytose pour les

macrophages), la formation de phagosomes spacieux et la fusion avec les lysosomes

(Feuillet 2007).

Actuellement plus de 200 serotypes de salmonelles sont connus chez la volaille.

Salmonella Enteritidis qui infecte les organes profonds (foie, rate, ovaire) est à l'origine

d'infection durable au niveau des troupeaux alors que Salmonella Typhimurium est

actuellement le serotype le plus incriminé dans les salmonelloses aviaires provoquant

les formes cliniques les plus graves, surtout chez les jeunes poussins prenant une allure

septicémique, avec une mortalité brutale dans les jours qui suivent l'éclosion. On

observe également de nombreuses mortalités en coquille. La première étape de

colonisation par les salmonelles est une étape de colonisation intestinale. La bactérie

arrive dans l'intestin grêle, où elle se multiplie en adhérant à l'épithélium, elle pénètre

par un phénomène d'endocytose dans les cellules épithéliales iléales et caecales,

notamment les tissus lymphoïdes incluant les plaques de Peyer, les amygdales caecales

et dans les cellules M. Dans le cas des salmonelles provoquant des maladies

systémiques, le site d'attachement préférentiel se situe au niveau des plaques de Peyer

(Feuillet 2007). L'infection est strictement limitée à la sphère digestive et peut

correspondre à un portage latent avec élimination épisodique des Salmonelles dans les

fèces. Les porteurs latents sont cliniquement et anatomiquement indécelables. Us

18

peuvent excréter des salmonelles de façon continue ou intermittente (Takase,

Nakayama et al. 1999). Ces porteurs sains sont le plus fréquemment rencontrés. Dans

ce cas, les salmonelles sont retrouvées dans différentes portions de l'intestin par culture

sur milieux sélectifs. Les symptômes sont observés essentiellement sur les poussins de

moins de 15 jours et sont rares sur les volailles de plus de 4 semaines (Takase,

Nakayama et al. 1999).

Avant l'abattage, la peau du poulet est contaminée par une flore microbienne mésophile

variée provenant de l'environnement (sol, eau, des abreuvoirs, litières, excrément,

cage...). À l'usine les sources de contaminations peuvent être les volailles elles

mêmes, c'est-à-dire les plumes, la peau, les pattes et l'intestin. Cela peut être dû aux

cages de transport ainsi qu'aux ustensiles et l'équipements de transformation ainsi qu'à

l'environnement générale de l'usine incluant l'eau, les poussières et les aérosols, le

personnel ou encore à des contaminations croisées par contact avec les produits finis ou

au cours de transformation avec les eaux usées, les viscères et autres parties éliminées.

1.2.5. Contrôle des infections entériques chez la volaille

Le recours aux antibiotiques demeure l'approche la plus préconisée pour lutter contre

ces infections. L'utilisation des antibiotiques en alimentation animale s'est progressivement

développée dès le début des années 50 et a permis d'améliorer les conditions sanitaires des

animaux et d'accroître la productivité des élevages en réduisant les coûts de production.

Cependant, l'utilisation abusive de ces antibiotiques qui possèdent beaucoup de

similitudes avec ceux utilisés en médecine humaine a entraîné une augmentation

inquiétante du nombre de souches pathogènes multi-résistantes. En effet, actuellement on

connait une vingtaine de familles d'antibiotiques. Six modes d'actions sont connus à

savoir, l'inhibition de la synthèse des protéines (Gentamicine), l'inhibition de la

synthèse du peptidoglycane (groupe de la pénicilline G), coupure des brins d'ADN et

déroulement de l'ADN (Metronidazole), l'inhibition de la synthèse de l'ADN

(Furazolidone), le blocage de la synthèse de l'acide dihydrofolique (Sulfadiazone) ou

encore le blocage de la synthèse des ARN messagers (Ripampicine).

19

Dès 1945, la pénicilline G a été utilisée pour contrer les infections à Staphylocoques, en

produisaient une enzyme capable de dégrader la pénicilline. En 1980 est apparu le

phénomène de la 1947, on repérait déjà les premières souches de Staphylocoques

résistants. Ces dernières sont multi-résistantes. Un microorganisme peut devenir multi-

résistant lorsqu'il fait l'acquisition de plusieurs gènes codant pour la résistance. Parmi

ces organismes, on compte Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus,

Mycobacterium tuberculosis, Salmonella sp., Campylobacter sp. et Escherichia coli.

Pour contrer l'action des antibiotiques, les bactéries utilisent plusieurs types de

mécanismes. De nos jours, quatre mécanismes de résistances aux antibiotiques sont

connus ; le premier connu sous le nom de « brouillage » dans lequel la bactérie est

capable de produire des enzymes capables d'inactiver les antibiotiques, ces enzymes

sont capables de détruire des liens chimiques nécessaires à l'intégrité fonctionnelle du

médicament. Les bêta-lactames sont un exemple d'enzymes produites par la bactérie

inactivant les p-lactamines telles les pénicillines et les céphalosporines. Le second

connu sous le nom du « blindage et efflux », les microorganismes sont capables dans ce

cas de se rendre imperméable à la pénétration de l'antibiotique ou le rejeter, en effet ce

mécanisme résiste dans le fait de modifié le nombre des porines et/ou la spécificité de

celle-ci. Il s'agit d'un mécanisme de résistance spécifique aux bactéries Gram négatif

puis que sur la membrane de ces bactéries on trouve les porines qui sont une sorte de

protéines qui forment des canaux permettant le passage de plusieurs types de

molécules, dont tire également profit la pénicilline. Le troisième mécanisme de

résistance des bactéries est le « camouflage » qui consiste à modifier la structure des

cibles cellulaires des antibiotiques, puisque pour être efficace, un antibiotique doit se

fixer à une cible cellulaire. Si la bactérie remplace ou modifie cette cible, l'action de

l'antibiotique sera réduite ou totalement inhibé puisqu'il ne pourra plus s'y fixer. Le

dernier mécanisme est « Esquive » ou stratégie de contoumement dans ce cas

l'antibiotique atteint sa cible. Cependant, la bactérie est capable d'utiliser d'autres voies

métaboliques pour exécuter le même travail. Les activités inhibées par l'antibiotique

sont donc remplacées.

Cette situation a conduit l'Union européenne à décréter, en 2006, l'interdiction complète

des antibiotiques à titre de facteurs de croissance dans les aliments pour animaux dont

20

les premières espèces animales touchées par cette interdiction sont les porcs et les

volailles, principales productions à recourir à ce type d'additifs. Au Canada,

l'utilisation des antibiotiques comme facteur de croissance n'est pas formellement

interdit, mais il est déconseillé. Cependant, le Québec jouit d'une réglementation

unique au Canada puisque tous les médicaments destinés aux animaux ne sont

disponibles que sur ordonnance (CAAAQ 2008). De surcroît, aucun producteur ne peut

détenir ou administrer un médicament à un animal de consommation à moins qu'il n'ait

été prescrit par un médecin vétérinaire (selon l'Ordre des médecins vétérinaires du

Québec).

Il est donc clair que la recherche de solution alternative susceptible d'assurer une

succession satisfaisante aux antibiotiques en termes d'effets zootechniques devient une

urgence.

1.2.5.1. Les huiles essentielles

Les huiles essentielles sont des substances odorantes concentrées, obtenues à partir de

plantes par entraînement à la vapeur d'eau, hydrodistillation. Le terme "huile

essentielle" a été inventé au I6lème siècle par le médecin suisse Parascelsus von

Hohenheim pour désigner le composé actif d'un remède naturel. Il existe aujourd'hui

approximativement 3000 huiles, dont environ 300 sont réellement commercialisées,

destinées principalement à l'industrie des arômes et des parfums. La tendance actuelle

des consommateurs à rechercher une alimentation plus naturelle, a entraîné un regain

d'intérêt des scientifiques pour ces substances. Depuis deux décennies, des études ont

été menées sur le développement de nouvelles applications et l'exploitation des

propriétés naturelles des huiles essentielles dans le domaine alimentaire. Les huiles

essentielles et leurs composants, actuellement employés comme arômes alimentaires

sont également connus pour posséder des activités antimicrobiennes et pourraient donc

servir d'agents de conservation alimentaire, et ce d'autant plus qu'ils sont pour la

plupart classés "généralement reconnus comme sains" (Generally Recognized As Safe

GRAS), ou approuvés comme additifs alimentaires par la Food and Drug

Administration. Ils n'ont, par conséquent, pas besoin d'autorisation d'emploi dans les

21

aliments, cependant des études préalables sont nécessaires afin de mieux cerner leur

activité antimicrobienne. Leur activité antimicrobienne varie fonction de leur

composition chimique, et en particulier de la nature de leurs composés volatils majeurs

(Pellecuer, Jacob et al. 1979). Elles agissent en empêchant la multiplication des

bactéries, leur sporulation et la synthèse de leurs toxines (Hulin, Mathot et al. 1998).

Les huiles essentielles possèdent plusieurs modes d'action sur les différentes souches

de bactéries, mais d'une manière générale leur action se déroulent en trois phases : en

premier lieu ils attaquent la paroi bactérienne par l'huile essentielle, provoquant une

augmentation de la perméabilité puis la perte des constituants cellulaires, ensuite

l'acidification de l'intérieur de la cellule, bloquant la production de l'énergie cellulaire

et la synthèse des composants de structure et finalement la destruction du matériel

génétique, conduisant à la mort de la bactérie (Oussalah, Caillet et al. 2006).

Bozkur et ces collaborateurs ont effectué une étude dans laquelle ils ont supplémenté

l'alimentation des volailles avec des huiles essentielles, les résultats de cette étude ont

montré qu'il y avait une amélioration de la fertilité ainsi qu'une augmentation du poids

(Bozkurt, Alcicek et al. 2009), cependant, aucun effet sur l'action antimicrobienne

contre les microorganismes indésirable n'a été observé. Oral et ces collaborateurs qu'on

a eux ont introduit dans l'emballage du poulet frais Y origanum onites qui a permis de

prolongé la durée de conservation (Oral, Vatansever et al. 2009). Les huiles essentielles

ont était utilisé également afin d'inhiber Clostridium perfringens chez la volaille.

Mitsch et ces collaborateurs ont montré qu'un mélange d'huiles essentielles peut

contrôler la colonisation et la prolifération de Clostridium perfringens dans l'intestin

des poulets de chair. (Mitsch, Zitterl-Eglseer et al. 2004).

Certes, les huiles essentielles ont présenté un effet bénéfique pour la santé de volailles.

Cependant, peu d'étude ont visé l'utilisation des huiles essentielles pour contrer les

pathogènes humains présents dans la viande de volaille. Leur action inhibitrice vis-à-vis

à des pathogènes alimentaires reste encore très peu étudiée.

22

1.2.5.2. Les enzymes

Les enzymes existent pratiquement partout et sont essentielles pour tous les organismes

vivants car elles favorisent les réactions chimiques nécessaires à la vie. Un peu plus de

3000 enzymes ont été identifiées et caractérisées. L'enzymologie remonte à la fin du

19ème siècle, époque à laquelle une préparation enzymatique extraite de l'estomac du

veau, appelée présure, a été employée à grande échelle pour la fabrication du fromage.

Depuis lors, cette technologie n'a cessé de croître. Actuellement les enzymes sont

employées dans plusieurs domaines. En alimentation animale, l'usage des enzymes est

par contre beaucoup plus récent et date tout au plus de 20 ans (Boguhn and

Rodehutscord 2010; Jia and Slominski 2010). La raison essentielle de l'utilisation des

enzymes en alimentation animale est d'accroître la valeur alimentaire des aliments en

augmentant l'efficacité de la digestion (vitesse et/ou ampleur) dans le tube digestif des

animaux. En effet, l'efficacité de la digestion affecte grandement les frais

d'alimentation des animaux (Vandeplas, Dauphin et al. 2009).

Vandeplas et ses collaborateurs on ajouté à un régime riche en froment de préparations

enzymatiques à activité xylanasique principale des Lactobacillus plantarum peut

conduire à une augmentation du poids final des animaux consécutivement à une

augmentation de l'ingestion du régime et de la croissance quotidienne. Les ajouts

enzymatiques réalisés dans les régimes riches en froment chez la volaille entraînent une

augmentation de la digestibilité des matières grasses, des protéines et de la cellulose

chez le jeune poulet, avec pour conséquence une augmentation des quantités de

nutriments nécessaires à la croissance de l'animal. L'ajout des Lactobacillus plantarum

quand à lui a permis d'inhiber les Salmonella Typhimurium (Vandeplas, Dauphin et al.

2009). Donc l'effet inhibiteur revient principalement à la présence de probiotiques, les

enzymes ont permis une meilleure digestion.

Les enzymes ajoutées aux aliments des volailles doivent être assimilées à une

amplification du système enzymatique endogène de leur tube digestif. Choisies de

manière pertinente, elles permettent d'inhiber les facteurs antinutritionnels présents

dans les aliments et d'améliorer la disponibilité des nutriments pour l'animal, ainsi que

23

l'amélioration la digestibilité. (Boguhn and Rodehutscord 2010; Jia and Slominski

2010)

Certains résultats ont également mis en évidence l'intérêt des enzymes pour contrôler

la flore entérique des porcs et des volailles ce qui constitue un autre avantage de ces

molécules (Yves Beckers and Piron 2009). La première revendication pour l'utilisation

d'enzymes chez la volaille est une amélioration de la digestibilité, qui se traduit par une

amélioration de l'efficacité alimentaire en relation avec une baisse de la consommation

ou une augmentation de la masse d'œufs produite.

Mori et ces collaborateurs ont rapporté que l'ajout d'enzyme améliore la production

d'œufs et l'efficacité alimentaire chez des poules recevant des régimes à base d'orge,

de blé, de maïs et même de sorgho. Sur l'ensemble des essais présentés, le taux de

ponte a augmenté de près de 2% et l'indice de consommation a été réduit en moyenne

de 3,6% (Mori agnes 2007).

En effet les rôles principaux des enzymes ajoutés aux aliments vont casser les structures

et faire qu'à la fin de l'intestin grêle les substrats pour la flore intestinale seront

différents. Lorsqu'on met des enzymes dans un aliment pour animal, on change les

substrats et donc l'équilibre de la flore (Yves Beckers and Piron 2009).

Une amélioration de la digestibilité est induite à l'ajout des enzymes dans

l'alimentation des volailles cependant peu d'étude ont ciblé l'inhibition des pathogènes

à l'aide des enzymes.

1.2.5.3. Les extraits de plantes

Depuis l'Antiquité, l'homme a utilisé les plantes pour leurs vertus bienfaisantes.

Aujourd'hui, leurs principes actifs sont à la base de nombreux médicaments. Parmi les

principales vertus des plantes, on peut citer la stimulation de la digestion, un effet anti-

inflammatoire, antalgique, antidiabétique, anti-cholestérol, tonique, antiparasitaire,

vermifuge, antiseptique : antibactérien, antifongique, antiviral (Guardia 2009).

Les principes actifs peuvent être regroupés en plusieurs 'familles' chimiques à savoir

les composés soufrés : thiosulfonates (allicine de l'ail), les aldéhydes (cinnamaldéhyde

24

de la cannelle, cuminaldéhyde du cumin), les phénols (thymol, menthol, carvacrol,

eugenol), les terpènes (pinène, cymène) et les tannins. Ces substances agissent en

bloquant la multiplication du microorganisme ou en détruisant sa paroi (Rhayour,

Bouchikhi et al. 2003).

Guardia et ses collaborateurs ont étudié l'effet d'une combinaison d'extraits végétaux

naturels (EXVa) à action anti microbienne, utilisée seule ou procédée d'une

combinaison (EXVb) à action anti-oxydante et antibactérienne, sur la performance de la

croissance des volailles. Cette étude a permis de déduire que l'utilisation seule

d'extraits de végétaux à action antimicrobienne n'a pas induit à une amélioration de la

croissance des volailles. Cependant, la combinaison (EXVb) ayant des propriétés anti­

oxydantes puis antibactérienne, permet d'améliorer les performances de croissance

(Guardia 2009).

L'ail représente l'une des meilleures plantes utilisé vue ses effets bénéfiques Dès que la

gousse est hachée, l'alliin est transformée par une enzyme en allicin qui est le principe

actif majeur. Celui-ci est relativement instable puisque la moitié de l'allicin est détruite

en 2 à 4 heures à température ambiante. On attribue à l'ail de nombreuses vertus

notamment des activités antibactériennes, anti-cholestérol, anti-tumoral, etc. L'huile

d'ail obtenue par distillation à la vapeur conserve la propriété anti-tumorale et anti­

oxydante mais perd une partie de l'activité antibactérienne et anti-thrombose

(Srivastava, Bordia et al. 1995).

La plupart des études ont montré que les extraits végétaux ont une plus grande activité

contre bactéries à Gram positif par rapport aux bactéries à Gram négatif (Shelef 1984;

Zaika 1988; Smith-Palmer, Stewart et al. 1998; Ceylan and Fung 2004).

Si aujourd'hui les différentes propriétés des phyto-molécules observables in vitro sont

reconnues (action antibactérienne, immuno-modulatrice, anti-oxydante) leur action in

vivo sur la croissance des animaux, notamment du poulet, montre des effets variables

(Ceylan and Fung 2004; Windisch, Schedle et al. 2008).

Aucune de ces molécules n'a encore démontré un potentiel réel pour substituer les

antibiotiques. Les enzymes, par exemple, n'ont montré qu'une action trop faible sur les

25

performances des animaux. Les huiles essentielles quant à elles, possèdent un pouvoir

antimicrobien tout en activant l'appétit et les sécrétions digestives. Néanmoins, leur

action antimicrobienne, comme leurs effets bénéfiques sur les performances

zootechniques, restent inférieurs comparés aux antibiotiques.

Une des plus récentes alternatives proposées est le recours au probiotiques qui sont des

microorganismes vivant qui, lorsqu'il est intégré en quantité suffisante, exerce un effet

positif sur la santé. Selon plusieurs chercheurs, les probiotiques sont bien placés pour

prendre la relève des additifs antibiotiques en raison de leurs aptitudes nutritionnelles et

antimicrobiennes fort intéressantes.

1.3. LES PROBIOTIQUES

1.3.1. Définition

Le terme "probiotique" est un mot relativement nouveau qui signifie "en faveur de la

vie". Le concept probiotique est né de la théorie de la longévité de Metchnikoff en

1907. Il fut le premier à proposer l'utilisation des Lactobacilles des yaourts pour la

restauration du microbiote dans le tractus gastro-intestinal. Les probiotiques ont

d'abord été développés dans les années 1960 pour les élevages d'animaux afin de

prévenir les infections et stimuler le gain de poids. La première définition officielle a

été proposée par Fuller en 1989 qui définit un probiotique comme étant « un

supplément alimentaire microbien vivant qui affecte positivement la santé de l'animal

en améliorant sa balance microbienne intestinale ». Cette définition a été révisée

plusieurs fois, notamment par la FAO (Food and Agriculture Organization of the

United Nations) et la WHO (World Health Organization). En 2001, leur nouvelle

définition s'énonce comme suit : « Les probiotiques sont des microorganismes vivants

qui lorsqu'ils sont administrés en quantité adéquate, produisent un effet bénéfique pour

la santé de l'hôte ».

26

1.3.2. Critères de sélection

Les micro-organismes doivent posséder diverses propriétés de survie pour répondre à la

définition des probiotiques (Gagnon 2007). Ils doivent présenter une activité positive et

persister durant leur passage dans le tractus digestif. Ces propriétés sont propres à

chaque souche et ne peuvent pas être extrapolables d'une souche à l'autre même au sein

d'une même espèce (Dunne, O'Mahony et al. 2001). Plusieurs critères majeurs de

sélection ont été établis par différents auteurs dans le but de sélectionner les souches

potentiellement probiotiques. Ces critères, résumés dans le tableau 1.3, sont réparties

en trois catégories à savoir les critères de sécurité, fonctionnels et technologiques.

Tableau 1.3 : Principaux critères de sélection des probiotiques. Adapté de (Klaenhammer and Kullen 1999; Saarela, Mogensen et al. 2000; Ouwehand, Salminen et al. 2002; Gueimonde and Salminen 2006).

Critères de sécurité

Critères fonctionnels

Critères technologiques

Identification taxonomique précise.

Souche caractérisée par des techniques phénotypiques et

génotypiques.

Historique de non pathogénicité et non-invasion de l'épithélium

intestinal.

Pas de transmission possible de gènes de résistance aux

antibiotiques.

Tolérance de l'acidité à la bile et aux enzymes digestives.

Adhésion aux cellules intestinales et persistance dans le tractus

intestinal.

Production de substances antimicrobiennes (bactériocines, acides

organiques, peroxyde d'hydrogène ou autres composés inhibiteurs)

et antagonisme envers les pathogènes.

Immunomodulation.

Aptitude à produire des effets bénéfiques sur la santé de l'hôte.

Stabilité au cours des procédés de fabrication et dans le produit fini.

Conservation des propriétés probiotiques après production.

Non modification des qualités organoleptiques du produit fini.

Parmi les critères reliés à la sécurité, l'identification taxonomique de la souche est une

étape importante dans l'établissement de nouvelles souches potentiellement

27

probiotiques. Chaque souche doit être identifiée par des techniques moléculaires fiables

et confrontée à une nomenclature actualisée (FAO/WHO 2002). Actuellement, le

séquençage de la région 16S est la méthode moléculaire de référence pour identifier

l'espèce d'une souche, mais cette méthode est longue et requiert une large collection de

souches de référence (FAO/WHO 2002). Le séquençage de l'ARN 16S est une

méthode très fiable couramment utilisée pour l'identification des souches probiotiques

Dans ce dernier cas, il est recommandé que la technique soit combinée avec des tests

biochimiques et phénotypiques pour s'assurer de la conformité de la souche. L'origine

de la souche est également une condition importante car l'interaction spécifique avec

l'hôte est maximisée lorsqu'elle provient du même habitat (Alvarez-Olmos and

Oberhelman2001).

Parmi l'ensemble des critères présentés au Tableau 1.3, l'aptitude à produire des effets

bénéfiques sur la santé demeure encore délicat à évaluer dû notamment au fait que les

modes d'action par lesquels les probiotiques exercent un rôle fonctionnel in vivo sont

méconnus (Klaenhammer and Kullen 1999). La compréhension des mécanismes

d'action représente un des défis scientifiques majeurs dans le domaine des probiotiques.

D'un point de vue technologique, les souches probiotiques doivent posséder plusieurs

critères telles que la facilité à être cultivée tout en conservant leurs propriétés

biologiques et leur stabilité au cours des procédés de production et d'entreposage

(Champagne, Gardner et al. 2005).

1.3.3. Les effets santé associés aux probiotiques

Plusieurs effets bénéfiques sur la santé ont été associés à la consommation des

probiotiques. La Figure 1.3 illustre la diversité des effets santé documentés et rapportés

dans la littérature.

28

Amélioration de la digestion du lactose (sécrétion de lactase)

Influence positive sur la flore intestinale Bonne croissance et le bien-être

Réduction des produits du catabolisme éliminés par le foie et le rein

Augmentation de la valeur nutritionnelle (bonne digestion et absorption des minéraux et vitamines

V

Prévention des infections intestinales (virus. Helicobacter pylori..) et urogénitales

Régulation de la motilité intestinale (constipation, syndrome

N d'irritation intestinale)

Prévention de : ostéoporose. cancer, hypertension et athérosclérose (réduction du j janx de cholestérol)

Modulation du système immunitaire Réduction de l'inflammation >pu des réactions allergiquesy

Figure 1.3 : Les principaux effets bénéfiques attribués aux probiotiques. Adapté de

Mercenier et al. (2003).

L'apport de probiotiques doit être régulier (Gagnon, Kheadr et al. 2004). Les

probiotiques sont souvent considérés comme des aliments fonctionnels ou des

compléments alimentaires, mais pas comme des médicaments (FAO/WHO 2002).

Malgré la diversité des allégations revendiquées, les mécanismes par lesquels les

probiotiques exercent leur effets bénéfiques sur l'hôte ne sont pas toujours connus.

1.3.4. Activité antimicrobienne des probiotiques

L'activité antimicrobienne des probiotiques est probablement l'activité la plus

documentée. Plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer ces activités. Ces

mécanismes sont résumés dans la figure 1.4.

29

Mécanisme 1 : Inhibition de l'adhésion du

pathogène

Exclusion stérique

^ Adhésion au mucus

Inhibition des enzymes cytoplasmiques

Mécanisme 2 : Inhibition de la croissance du

pathogène

Lyse cellulaire

/ Acides organiques Bactériocines

Compétition stérique <

Adhésion aux cellules épithéliales

Compétition nutritionnelle

Restriction Nutriments r

Interaction avec le système , immunitaire

Mécanisme 3 : Immunomodulation

Augmentation de la défense immune

Figure 1.4 : Mécanismes d'action proposés des microorganismes probiotiques dans le

traitement des infections entériques. Adapté de Kaur, Kuhad et al. (2009) et Calder and

Kew (2002).

Un des mécanismes qui suscite de plus en plus d'intérêt en recherche dans le domaine

de probiotiques est la production de substances inhibitrices telles que les acides

organiques et les bactériocines. Paradoxalement, très peu d'études ont montré, par des

tests in vitro ou in vivo, l'implication de ces substances inhibitrices dans l'activité des

probiotiques.

1.3.5. Les bactériocines

1.3.5.1. Définition

La première définition des bactériocines date de 1953 et faisait référence aux protéines

de type colicine produites par les bactéries à Gram négatif (Jacob, Lwoff et al. 1953).

La découverte de la première bactériocine remonte à 1925. Cette dernière, isolée

30

^Escherichia coli <P, possédait une activité bactéricide envers une autre souche

d'Escherichia coli V. Elle fut nommée colicine V (Gratia 1925). La découverte de

composés similaires chez les bactéries à Gram positif, (Tagg, Dajani et al. 1976) a

élargi le terme "bactériocines" à l'ensemble des peptides antimicrobiens produits par les

bactéries, qui sont des peptides antimicrobien de faible poids moléculaire. Elles ont une

activité inhibitrice dirigée contre les bactéries proches de la souche productrice. Leur

spectre d'action est généralement étroit. Les bactériocines représentent une arme

importante dans les phénomènes de compétitions bactériennes car elles aident la

bactérie productrice à se défendre contre les autres bactéries de son environnement. À

cette époque, les bactériocines étaient encore définies comme des substances ayant un

spectre d'action limité. En 1963, Hamon and Peron (1963) ont observé que certaines

bactériocines produites par les bactéries à Gram positif pouvaient avoir un spectre

d'activité étendu. Le terme plus général de bactériocine fut proposé en 1976 pour

englober toutes les substances de nature protéique synthétisées par les bactéries et qui

ont un pouvoir antibactérien dirigé contre des bactéries taxonomiquement proches du

microorganisme producteur (Tagg, Dajani et al. 1976). Aujourd'hui, il est généralement

accepté que la majorité de ces peptides sont cationiques, hydrophobes, qu'ils sont

sensibles aux proteases et qu'ils présentent une activité maximale à pH acide (Ennahar,

Deschamps et al. 2000). La famille de bactériocine inclut une diversité des protéines en

termes de taille, cibles microbiennes, modes d'action, et mécanismes d'immunité. La

nomenclature des bactériocines est relativement simple. De la même manière que la

terminaison "ase" est associée à la dénomination d'enzymes, le suffixe «ine» est utilisé

afin de dénoter une activité bactériocinogène (Kaiser and Montville 1993). Certaines

bactériocines tirent leur nom de la souche productrice, d'autres ont été nommées en

termes généraux, par exemple les "colicines" produites par les coliformes, ou les

"lactostrepcines" produites par les streptocoques lactiques (Kozak, Bardowski et al.

1978; Klaenhammer 1988; Ecker 1992). Les bactériocines ont en effet une activité

bactéricide ou bactériostatique qui affecte, dans la plupart des cas, des bactéries

taxonomiquement proches de l'organisme producteur. Ce sont des peptides ou des

protéines synthétisées par voie ribosomale. Les bactériocines sont séparées en deux

grandes familles, celles produites par les bactéries à Gram positif et celles produites par

les bactéries à Gram négatif.

31

La famille de bactériocine inclut une diversité des protéines en termes de taille, cibles

microbiennes, modes d'action, et mécanismes d'immunité. Il faut savoir qu'un type

bactérien ou même une bactérie, peut produire plus d'une bactériocine (Gagnon et al

2007).

1.3.5.2. Utilisation

Les microorganismes produisent un grand nombre de systèmes de défenses microbiens.

Ceux-ci incluent des sous produits métaboliques tels que les acides lactiques produits

par les lactobacilles, des agents lytiques tels que les lysozymes, de nombreux types de

protéines, des exotoxines et des bactériocines qui sont employées dans plusieurs

domaines en raison de leur grand potentiel dans l'amélioration de la santé de l'être

humain et des animaux ainsi que dans des éventuelles utilisations dans le secteur

agricole (David, Oliver et al. 2007). Leur utilisation dans le domaine alimentaire est

devenue très intéressante grâce à leur potentiel d'assurer une sécurité microbienne et

une bonne qualité du produit alimentaire sans modifier la qualité organoleptique du

produit. Il s'agit donc de très bons agents conservateurs (Cutter and Siragusa 1996).

D'autres études ont montré l'utilisation des bactériocines comme agent antimicrobien

dans l'emballage des produits carnés (Ming, McDonaldMcGinn et al. 1997) et les

produits marins. Tel que déjà mentionné, l'utilisation des bactériocines n'est pas

restreinte au domaine alimentaire, mais trouvent aussi des applications dans le domaine

médical et vétérinaire. Les bactériocines pourraient servir d'alternatives aux

antibiotiques pour le traitement des maladies infectieuses tant chez l'humain que chez

l'animal. Il faut cependant, bien signaler que peu d'études sont réalisées pour la

détermination des mécanismes d'action des bactériocines. Davies, Milne et al. (1999)

ont montré qu'une augmentation en teneur des lipides réduit l'activité biologique des

bactériocines dans la matrice alimentaire. Il faut également signaler que les

bactériocines sont des peptides amphiphiles capables de s'absorber aux macromolécules

de la matrice alimentaire, mais ces propriétés peuvent limiter leur utilisation comme

agents de conservation.

32

1.3.5.3. Les bactériocines actives contre les bactéries à Gram négatifs

Les bactéries à Gram négatif produisent un certain nombre de peptides avec une activité

antibiotique. Ces bactériocines sont principalement produites par les bactéries de

l'écosystème intestinal, représentées principalement par la famille des

Enterobacteriaceae. Elles sont réparties en deux grands groupes, les colicines et les

microcines.

Les colicines

Les colicines ont été largement étudiées et une trentaine de molécules différentes ont

été identifiées. Elles sont toutes produites par Escherichia coli (Braun, Killmann et al.

2002) et possèdent un spectre d'activité restreint aux souches phylogénétiquement

proches (Gillor, Nigro et al. 2005). Les colicines possèdent en général un poids

moléculaire élevé compris entre 25 et 80 kDa (Dirix, Monsieurs et al. 2004). Ce sont

des protéines qui ne subissent pas de modifications post-traductionnelles, sauf en ce qui

concerne la methionine N-terminale qui peut être enlevée (Smajs, Smarda et al. 2003).

Elles présentent une même organisation structurale basée sur trois domaines

fonctionnels. La partie N-terminale, appelée domaine T, riche en résidus glycine,

participe à la translocation de la colicine à travers la membrane externe en interagissant

avec un système de transport. La partie centrale, appelée domaine R, représente 50 %

de la colicine et intervient dans la reconnaissance spécifique de la colicine avec son

récepteur membranaire. Enfin, la partie C-terminale, appelée domaine C, est

responsable de l'activité bactéricide de la colicine et possède une séquence de liaison

avec la protéine d'immunité (Lazdunski, Bouveret et al. 2000; Cao and Klebba 2002;

Riley and Wertz 2002).

Braun, Patzer et al. (2002)et Lazzaroni, Dubuisson et al. (2002) ont proposé une

classification des colicines selon la voie de translocation dans la cellule cible qu'elles

utilisent. Effectivement, la structure de leur domaine T leur permet d'interagir avec les

systèmes périplasmiques Toi (colicines du groupe A) ou Ton (colicines du groupe B)

(Cao and Klebba 2002; Gillor, Kirkup et al. 2004). Le groupe A comprend notamment

33

les colicines A, El à E9, K, N et DF13 tandis que le groupe B regroupe les colicines B,

D, la, Ib, M, 5 et 10 (Tableau 1.4).

Tableau 1.4 : Classification des colicines et leurs cibles cellulaires (Lazdunski,

Bouveret et al. 2000)

Groupes Colicines Cibles cellulaires

Groupe A A

DF13

HI

E2, E7, E8 et E9

E3àE6

K

N

Membrane cytoplasmique

Acides nucléiques

Membrane cytoplasmique

Acides nucléiques

Acides nucléiques

Membrane cytoplasmique

Membrane cytoplasmique

Groupe B B

D

la et Ib

M

5 et 10

Membrane cytoplasmique

Acides nucléiques

Membrane cytoplasmique

Peptidoglycane

Membrane cytoplasmique

Les microcines

Asensio et al (1976) ont été les premiers à présenter les microcines (Mec) comme une

nouvelle famille de peptides à activité antibiotique produits par les bactéries à Gram

négatif. Ils définissent les microcines en tant que peptides antibiotiques de faible poids

moléculaire, produits par des bactéries non sporulantes isolées à partir du tractus

intestinal humain, sécrétés dans le milieu de culture et agissant sur des

microorganismes phylogénétiquement proches (Asensio, Perezdiaz et al. 1976). Bien

que les microcines se rapprochent des colicines par de nombreux points, elles forment

un groupe spécifique de peptides à activité antibiotique. Elles se distinguent des

colicines par plusieurs caractéristiques dont leur petite taille (< 10 kDa) et leur

sécrétion non létale pour les bactéries productrices (David, Oliver et al. 2007).

Contrairement aux colicines, les microcines ne sont pas produites uniquement par des

souches d'Escherichia coli. Une microcine a été découverte chez une souche de K.

pneumoniae (De Lorenzo 1984). Par ailleurs, elles possèdent des points communs avec

34

les bactériocines de petite taille des bactéries à Gram positif, tels que leur nature

hydrophobe et leur stabilité à la chaleur, à certaines proteases et aux pH extrêmes

(Pons, Lanneluc et al. 2002).

Jusqu'à aujourd'hui, dix microcines ont été identifiées (Tableau 1.5), parmi lesquelles

sept sont bien caractérisées (Mec B17, C7, E492, J25, H47, L et V) et trois (Mec D93,

M et N24) sont peu connues. Des différences au niveau de leur poids moléculaire et des

modifications post-traductionnelles permettent de répartir les microcines en deux

classes (Pons, Lanneluc et al. 2002).

Tableau 1.5 : Les dix microcines découvertes.

Microcines Références

Classe I

B17 (Patzer, Baquero et al. 2003) C7 (Garcia-Bustos, Pezzi et al. 1984) D93 (Martinez, Carter-Franklin et al. 2003) J25 (Salomon and Farias 1992) E492 (Delorenzo 1984) H47 (Lavina, Gaggero et al. 1990) L (Gaillard-Gendron, Vignon et al. 2000) M (Braun, Killmann et al. 2002; Patzer, Baquero et al. 2003) N24 (O'Brien and Gibson 1970) V (Gratia 1925; Yang and Leong 1982)

Classe II

La classe I regroupe les microcines B17, C7, D93 et J25. Elles ont un très faible poids

moléculaire, inférieur à 5 kDa, sont largement modifiées post-traductionnellement et

sont toutes sécrétées par Escherichia coli (Pons, Lanneluc et al. 2002). Les microcines

de classe II comprennent les microcines E492, H47, L, M, N24 et V et sont synthétisées

sous forme de précurseurs avec des peptides signal très homologues. Elles sont de plus

grande taille (7 à 10 kDa). Les microcines de classe II sont toutes hydrophobes et non

modifiées post-traductionnellement.

35

1.3.6. Les probiotiques en aviculture

En alimentation animale de nombreux genres bactériens et fongiques incluant

Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus, Streptococcus, Pediococcus, Enterococcus,

Propionibacterium, Saccharomyces, Aspergillus et Torulopsis sont utilisés, comme

probiotique (Tannock 1997). En général, les souches probiotiques sont sélectionnées

pour leurs effets bénéfiques sur la santé tout en assurant leur sécurité d'utilisation

(innocuité). L'utilisation commerciale de probiotiques en élevages industriels des

volailles est relativement nouvelle. Comme pour les autres animaux, l'utilisation des

probiotiques s'est développée à la suite des recherches effectuées sur le tractus gastro­

intestinal qui ont permis une meilleure compréhension du rôle de la microflore et de

son importance sur la santé et l'hygiène digestive des animaux (Gaggia, Mattarelli et

al.). Les différentes études réalisées sur des volailles ont montré que les probiotiques

exercent des activités antibactériennes contre diverses bactéries pathogènes notamment

celles responsables d'infection chez les poulets dont Salmonella sp (Van Immerseel,

Cauwerts et al. 2002; Higgins, Higgins et al. 2008), Campylobacter et Escherichia coli

(Zacconi, Scolari et al. 1999; Ragione, Narbad et al. 2004). L'administration de

Lactobacillus salivarius A23 à des poussins a permis d'augmenter le taux des

Lactobacilles dans le jabot dès le premier jour d'administration. Par contre, aucune

augmentation significative n'a été observée au niveau du caecum. Ceci signifie que ce

probiotique colonise préférentiellement le jabot (Zacconi, Scolari et al. 1999).

L'administration d'une préparation brut de microflore caecale a permis de protéger les

animaux contre des infections à Salmonella Typhimunium et à Salmonella Enteritidis

(Andreatti, da Silva et al. 2000; Higgins, Higgins et al. 2008). Enterococcus faecium

J96, une souche probiotique isolée de l'intestin d'une poule a permis de réduire le taux

de croissance de Salmonella Pullorum, Gallinarum, Typhimurim et Enteritidis in vitro.

L'administration orale de 109 UFC de cette souche à des poussins de 30 h d'âge leur a

permis de résister à une infection à Salmonella pullorum (Audisio, Oliver et al. 2000).

Dans le même ordre d'idée, l'administration simultanée de Salmonella Enteritidis et

Lactobacillus salivarius CTC2197 par voie orale à des poussins d'un jour a permis une

élimination complète des Salmonelles (Zacconi, Scolari et al. 1999).

36

L'utilisation d'un consortium de souches probiotiques contenant Lactobacillus

salivarius et Lactobacillus Blantarum inhibent in vitro Escherichia coli et Salmonella

Typhimurium a également été proposée par Murry and Hinton (2006). De la même

façon, une suspension fécale permet de protéger les poussins contre une colonisation

par Salmonella Typhimurium, Salmonella Agona, Salmonella Infatis, Salmonella

Enteritidis (De Oliveira, Berchieri et al. 2000). Willis and Reid (2008) ont montré que

la présence de Campylobacter jejuni à diminuer chez les volailles avec un régime

alimentaire supplémenté avec 108 UFC/g d'une combinaison de Lactobacillus

acidophilus, Lactobacillus casei, Bifidobacterium thermophilus, et Escherichia

faecium.

Globalement, les études rapportées dans la littérature suggère que l'utilisation d'un

mélange de plusieurs souches probiotiques appartenant à des genres bactériens

différents a permis d'obtenir des effets plus significatifs que ceux obtenus avec des

monosouches (Jung, Houde et al. 2008; Awad, Ghareeb et al. 2009; Revolledo, Ferreira

et al. 2009; Vandeplas, Dauphin et al. 2009). Ces études ont également montré qu'il

serait possible de favoriser la colonisation du tube digestif des poussins dès l'éclosion

par l'utilisation des probiotique et que cette colonisation est plus rapide et plus efficace

pour la protection des animaux qu'une colonisation naturelle. Chez les poussins,

l'infection par des bactéries pathogènes est beaucoup plus fréquente du fait que la flore

intestinale n'est pas complètement établie. De plus, les poussins étant séparés de leur

mère dès leur éclosion dans l'élevage, n'ont pas la possibilité d'acquérir la microflore

protectrice maternelle.

Cependant, il est à noter que l'utilisation de probiotiques chez la poule pondeuse

permet d'améliorer la qualité de l'œuf (épaisseur des coquilles) mais ne protège pas le

poussin contre l'infection après l'éclosion (Panda, Reddy et al. 2003). Ainsi, pour

obtenir l'effet protecteur escompté, les probiotiques doivent être administrés en continu

dès l'éclosion.

Certaines études ont allé chercher remède pour les antibiotiques dans les probiotiques

mais cependant le mode d'action de ces derniers reste encore mal connue. D'autre part

37

peu de recherches ont utilisés des souches Gram négatifs pour contrer les pathogènes

causant le plus de mortalité en élevage et de cas de toxi-infections alimentaires.

38

HYPOTHÈSE ET OBJECTIFS DU MÉMOIRE

Hypothèse

Les souches bactériennes productrice de substances inhibitrices telles que les

bactériocines et faisant partie du microbiote normal du tube digestif de la volaille

représentent des candidates à fort potentiel probiotique d'utilisation pour la prévention

des infections entériques majeurs en aviculture

Objectifs

L'objectif général de ce travail de maîtrise est d'identifier et caractériser des souches à

fort potentiel probiotique actives contre des pathogènes à Gram négatif tel que

Salmonella et Escherichia coli de la volaille. D vise également à caractériser sur les

plans physicochimiques et biologiques les substances antimicrobiennes responsables de

cette activité biologique.

39

CHAPITRE 2. CRIBLAGE ET CARACTERISATION DE L'ACTIVITÉ INHIBITRICE DE SOUCHES INTESTINALES VIS-

À-VIS DES PATHOGÈNES ENTÉRIQUES GRAM NÉGATIF

40

2.1. RÉSUMÉ

Cette étude vise à identifier, à partir de contenus intestinaux de volailles, de nouvelles

souches probiotiques productrices de bactériocines actives contre des pathogènes à

Gram négatif incluant Escherichia coli et Salmonella. Vingt quatre souches ont été

isolées du contenu digestif de volailles en santé et ont été soumises à une première

étape de criblage visant à identifier celles présentant une activité inhibitrice

significative contre Escherichia coli 0157 : H7, Salmonella enterica et Yersinia

enterocolitica. Sept souches à savoir : 11004, 11006, 11012, 11014, 11016, 11018 et

11026 ont été alors retenues à la suite de ce premier criblage. Dans un deuxième temps,

l'activité inhibitrice des surnageants des sept cultures des souches actives a été évaluée

après un traitement thermique de 100 °C durant 5 min, une filtration sur membrane de

0,22 u.m et une combinaison des deux traitements. Cette deuxième étape nous a permis

de retenir 3 souches qui semblent produire des substances inhibitrices thermostables

très apparentées à des bactériocines et ont conservé une activité inhibitrice significative

contre Escherichia coli 0157 : H7 et Salmonella enteritica.

41

2.2. INTRODUCTION

Les maladies entériques sont une préoccupation importante en aviculture en raison des

conséquences économiques et sanitaires qu'elles engendrent. Sur le plan économique

ces maladies sont responsables de pertes importantes associées à la faible productivité

du troupeau et au taux de mortalité élevé. Sur le plan sanitaire, les animaux malades

peuvent transmettre à l'humain des microorganismes pathogènes via la consommation

de denrées contaminées.

À l'échelle mondiale, l'industrie avicole et porcine sont les deux secteurs qui

enregistrent la plus forte croissance avec des taux annuels de 2,6% et 3,7% au cours des

dix dernières années (FAO 2007). Malheureusement, les denrées alimentaires

provenant de ces deux espèces sont également les denrées les plus incriminées dans la

transmission de bactéries potentiellement pathogènes pour l'homme (Van Immerseel,

Cauwerts et al. 2002). Dans le cas de la volaille les carcasses peuvent être contaminées

par plusieurs bactéries pathogènes durant le plumage, le refroidissement, 1'evisceration,

le lavage, etc. Une des stratégies utilisée pour limiter la propagation de ces pathogènes

bactériens par les denrées de volaille est la réduction de la charge bactérienne chez

l'animal vivant. Dans ce contexte, le recours aux antibiotiques demeure l'approche la

plus préconisée pour lutter contre plusieurs infections chez la volaille. Ainsi, l'utilisation

des antibiotiques en alimentation animale a permis d'améliorer les conditions sanitaires des

animaux et d'accroître la productivité des élevages en réduisant les coûts de production.

Cependant, l'utilisation abusive de ces antibiotiques qui possèdent beaucoup de

similitudes avec ceux utilisés en médecine humaine, a entraîné une augmentation

inquiétante du nombre de souches pathogènes multi-résistantes. Cette situation a conduit

l'Union européenne à décréter, en 2006, l'interdiction complète des antibiotiques à titre

de facteurs de croissance dans les aliments pour animaux. Comme alternative aux

antibiotiques, plusieurs additifs alimentaires ont été suggérés notamment les enzymes,

les huiles essentielles et les extraits de plantes.

Certes, ces molécules ont présenté certains effets bénéfiques pour la santé de volailles,

Cependant, aucune de ces molécules n'a encore démontré un potentiel réel pour

substituer les antibiotiques. Les enzymes, par exemple, n'ont montré qu'une action trop

42

faible sur les performances des animaux ce qui ne joue pas en leur faveur pour succéder

aux additifs antibiotiques. Les huiles essentielles quant à elles, possèdent un pouvoir

antimicrobien tout en activant l'appétit et les sécrétions digestives. Néanmoins, leur

action antimicrobienne, comme leur effet bénéfique sur les performances

zootechniques, restent inférieurs comparé aux antibiotiques.

Une des plus récentes alternatives proposées est le recours au probiotiques. Les

probiotiques sont des microorganismes vivants qui, lorsqu'ils sont intégrés en quantité

suffisante, exercent un effet positif sur la santé. Selon plusieurs chercheurs, les

probiotiques sont bien placés pour prendre la relève des antibiotiques en raison de leurs

aptitudes nutritionnelles et antimicrobiennes fort intéressantes.

Les mécanismes par lesquels les probiotiques inhibent les bactéries intestinales

pathogènes incluent la concurrence pour les sites de la colonisation, la compétition pour

les nutriments, la production des composés toxiques tels que les acides organiques et

les bactériocines, ou la stimulation du système immunitaire (Calder and Kew 2002;

Kaur, Kuhad et al. 2009). Ces mécanismes ne sont pas mutuellement exclusive et

l'inhibition peut comprendre une, plusieurs ou tous ces mécanismes (Gagnon, 2007).

Bien que la production de bactériocines soit un phénomène relativement bien étudié

aussi bien chez les Gram négatifs que positifs, l'implication de ces molécules bioactives

dans l'activité antibactérienne des probiotiques n'a jamais été mise en évidence

(Gagnon, 2007).

Dans le cadre de se travail, on postule que des souches à Gram négatif d'origine

intestinale productrices de bactériocines constitueraient des souches probiotiques très

prometteuse pour la prévention des infections entériques à Escherichia coli 0157 : H7

et Salmonella chez la volaille.

43

2.3. MATÉRIEL ET MÉTHODE

2.3.1. Souches bactériennes et conditions de culture

2.3.1.1. Souches productrices

Vingt-quatre souches isolées de contenus intestinaux de volailles et ayant démontré une

activité inhibitrice contre Escherichia coli K12 et Salmonella enteritidis ont été utilisées

lors de cette étude. Ces souches sont présentées dans le tableau 2.1.

La souche Escherichia coli LR05 qui est une souche sauvage productrice des MccL,

B17, D93 et J25 et résistante à la MccV (ou ColV) et à la colicine M (Sable, Duarte et

al. 2003) a été utilisée comme témoin positif.

2.3.1.2. Souches sensibles

Les 24 souches bactériennes ont était testées contre 5 souches pathogènes ainsi que

contre une souche non pathogène de référence appelée Escherichia coli MC4100. Cette

souche, qui est un dérivé d'Escherichia coli K12, est particulièrement intéressante car

elle est sensible à toutes les microcines connues sauf, la microcine D93. Les 5 souches

pathogènes testées proviennent de la collection de l'Université Laval et de l'Université

La Rochelle et sont énumérées dans le tableau 2.2.

2.3.1.3. Propagation des souches productrices et sensibles

Toutes les souches sont repiquées deux fois dans du milieu Brain Heart Infusion (BHI;

Difco, Sparks, MD) et incubées à 37°C. Avant leur utilisation, ces souches sont

conservées à -80°C dans une solution cryoprotectrice contenant du glycerol à 20%.

Pour les tests d'évaluation de l'activité inhibitrice, les souches ont été propagées dans

un milieu minimum M63 (Miller 1972). La composition de ce milieu de même que les

conditions de culture ont été optimisées pour la production de bactériocines. Ainsi, les

effets de l'agitation, de l'ajout ou non de la thiamine et du glucose de même que le

temps d'incubation sur la production de bactériocines ont été étudiés.

44

Tableau 2.1 : Souches à fort potentiel probiotiques

11001 Activité inhibitrice vis-à-vis d'E. coli K12 et 5. enteritidis 11004 Activité inhibitrice vis-à-vis d'E. coli K12 et 5. enteritidis 11006 Activité inhibitrice vis-à-vis d'E. coli K12 et 5. enteritidis

Activité inhibitrice vis-à-vis d'E. coli K12 et S. enteritidis 11007 11010 Activité inhibitrice vis-à-vis d'E. coli Kl2 et 5. enteritidis

Activité inhibitrice vis-à-vis d'E. coli Kl2 et 5. enteritidis (faible), V+ 11012 11013 Activité inhibitrice vis-à-vis d'E. coli Kl2 11014 Activité inhibitrice vis-à-vis d'E. coli K12 11015 Activité inhibitrice vis-à-vis d'E. coli Kl2 11016 Activité inhibitrice vis-à-vis d'E. coli K12 11018 Activité inhibitrice vis-à-vis d'E. coli K12 11019 Activité inhibitrice vis-à-vis d'E. coli Kl2 11022 Activité inhibitrice vis-à-vis d'E. coli K12 et S. enteritidis (faible),

V+,B17+,J25+

11023 Activité inhibitrice vis-à-vis d'E. coli K12 et 5. enteritidis 11024 Activité inhibitrice vis-à-vis d'E. coli Kl2 et 5. enteritidis 11025 Activité inhibitrice vis-à-vis d'E. coli Kl2 et 5. enteritidis 11026 Activité inhibitrice vis-à-vis d'E. coli K12 et 5. enteritidis 11038 Activité inhibitrice vis-à-vis d'E. coli Kl2 et S. enteritidis (faible), V 11039 Activité inhibitrice vis-à-vis d'E. coli Kl2 11040 Activité inhibitrice vis-à-vis d'E. coli Kl2 11058 Activité inhibitrice vis-à-vis d'E. coli Kl2 et S. enteritidis (faible), V+

11060 Activité inhibitrice vis-à-vis d'E. coli Kl2 11061 Activité inhibitrice vis-à-vis d'E. coli K12 11062 Activité inhibitrice vis-à-vis d'E. coli Kl2 J25+ : Possède le gène de structure de la MccJ25 B17+ : Possède le gène de structure de la MccB17 V+ : Possède le gène de structure de la MccV (ColV)

Tableau 2.2 : Souches sensibles

Souche Origine E. coli MC4100 La Rochelle France

E. coli 0157 : H7 ATCC 35150 E. coli 0157 : H7 Ottawa (Canada), isolé à partir d'un patient

S. enterica ssp enterica serotype seftenberg ATCC 8400 S. enterica ssp enterica serotype Montevideo ATCC 8387

Y. enterocolitica serotype 0:3 Kapperud (Norvège), isolé à partir d'un patient

45

2.3.2. Mise en évidence de l'activité inhibitrice

2.3.2.1. Test de diffusion sur gélose

Les cultures bactériennes sont centrifugées à 4°C pendant 10 min à une vitesse de

5000xg et les surnageants de culture obtenus sont utilisés directement ou après un

traitement thermique de 100°C pendant 5min, une filtration 0,22 im et une

combinaison des deux traitements avant de tester l'activité inhibitrice pour tester leur

activité inhibitrice en utilisant le test de diffusion sur gélose tel que décrit par Tagg,

Dajani et al. (1976). Les tests ont été réalisés dans du milieu M63 gélose préalablement

enrichi en hydrolysat de caséine (Fluka biochemika) et en MgS04 (Aldrich) (Portrait

1999). La souche E. coli LR05 a été utilisée comme témoin positif.

Traitement thermique + Filtration

Filtration Témoin -

Traitement thermique Sans traitement Témoin +

Figure 2.1 : Schéma illustrant le principe de test de diffusion sur

gélose

2.3.2.2. Test de microdilution

La croissance d'E. coli 0157 : H7 et de 5. enteritica a été évaluée en absence et en

présence des surnageants des souches intestinales en utilisant la méthode de dilution

critiques sur microplaque. La figure 2.2 illustre le principe de fonctionnement de ce

test. Ainsi que la disposition des échantillons analysés.

46

Chaque microplaque permet l'évaluation de l'activité inhibitrice contre une souche

sensible. Les puits de la ligne 1 correspondent au témoin négatif et sont remplis avec

175ul du milieu BHI. Les puits de la ligne 2 correspondent au témoin positif et sont

remplis avec 125uJ de milieu BHI et inoculé avec 50ul de la souche sensible. Dans les

autres puits de la microplaque, les surnageants des souches à tester sont ajoutés en

duplicata en présence de 50|ri de la même souche sensible. Les microplaques sont

ensuite incubées à la température optimale de la souche sensible utilisée. Des mesures

d'absorbance (DO) à 650nm sont effectuée à tous les 15min durant 24h afin de suivre la

croissance des souches sensibles.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

C

H

00OOOOOOOOOO 00OOOOOOOOOO ©©oooooooooo oeoo oooooooo ©©OOOOOOOOOO ©©oooooooooo ©©oooooooooo ©©oooooooooo

^s

Figure 2.2 : Suivie de la croissance microbienne sur microplaque.

47

2.4. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS

2.4.1. Criblage des souches

Optimisation du milieu et des conditions opératoires

Plusieurs paramètres opératoires ont été modifiés pour la mise en évidence de la

production de bactériocines à savoir l'agitation, l'ajout ou non de la thiamine et/ou du

glucose ainsi que le temps d'incubation. La figure 2.3 montre l'activité du surnageant

de la souche Escherichia coli LR05 contre la souche sensible Escherichia coli MC4100

à deux temps d'incubation différents pour la production 18h ou 8h à 37°C. Le tableau

2.3 présente l'activité du surnageant de la souche Escherichia coli LR05 cultivé dans le

milieu M63 enrichi en thiamine et/ou en glucose. Le milieu minimal M63 ne contient

pas de source de fer, car la production des bactériocines et reliée au système de capture

du fer. L'ajout de glucose et de thiamine permet cependant la production d'une

biomasse plus importante. L'agitation à 150 rpm montre que la production de substance

inhibitrice par les souches intestinales retenues nécessite une bonne aération. L'étude

de ces paramètres nous a permis de définir un milieu de culture modèle de même que

des conditions opératoires optimales pour l'évaluation de l'activité inhibitrice des

surnageant de culture des souches intestinales testées. Nos résultats ont montré que la

meilleure production de biomasse est obtenue dans un milieu minimal M63 enrichi en

glucose (concentration final de 4 g/L) et en thiamine (inoculum de 0,1 % d'une solution

à 0,1% en concentration) incubé sous agitation de 150 rpm durant 18 h à une

température de 37°C.

48

Figure 2.3 : Activité du surnageant de la souche E. coli LR05 contre la souche sensible E. coli MC4100. A : Croissance de 8h à 37°C. B : Croissance de 18h à 37°C.

Tableau 2.3 : Activité inhibitrice contre E. coli MC4100.du surnageant de culture de la souche E. coli LR05 cultivée à 37°C pendant 18h sous agitation dans le milieu M63. 1 : milieu M63 supplémenté de thiamine; 2 : milieu M63 supplémenté de glucose; 3 : milieu M63 supplémenté de glucose et de thiamine.

Ajout dans le milieu M63

f 1 : Thiamine (0,1%)

f 2 : Glucose (4g/l) f 3 : Thiamine + Glucose f Le tableau 2.4 présente les diamètres d'inhibition obtenus avec les surnageants des

différentes souches intestinales contre différents pathogènes à Gram négatif. Sept des

49

24 souches testées ont été retenues pour leur forte activité inhibitrice et ont été soumise

à un deuxième essai dans le but d'identifier celles sécrétant des substances inhibitrices

thermostables. Les surnageants de culture de ces sept souches ont subit trois traitement

différents soit un chauffage à 100°C pendant 5 minutes ou une filtration avec un filtre à

0,22 [im ou bien la combinaison des deux traitements avant de procéder à l'évaluation

de leur activité antimicrobienne contre trois souches indicatrices.

Les résultats de cette étude sont présentés dans le tableau 2.5. Cette deuxième étape de

criblage a permis de retenir trois souches parmi les sept testées à savoir 11004,11006 et

11026 puisqu'elles présentent une activité inhibitrice sur les souches sensibles même

suite aux traitements thermiques et de filtration. Des exemples d'activité inhibitrice

obtenue avec les trois souches retenues lors du test de diffusion sur gélose sont

présentés à la figure 2.4.

50

Tableau 2.4 : Évaluation de l'activité inhibitrice (diamètre d'inhibition) contre des pathogènes à gram négatif des surnageant de culture des 24 souches intestinales tel que déterminée par le test de diffusion sur gélose optimisé.

Souche

E. coli 0157 : H7 ACIA

Ottawa

E. coli 0157 : H7 ATCC

35150

S. seftenberg ATCC 8400

S.montevideo ATCC 8387

Y. enterocolitica

origine norvège

E. coli MC4100

11001 / / / / / / 11004 0,85 cm 0,90 cm 0,80 cm 0,90 cm 0,80 cm 1,25 cm 11006 1,20 cm 1,10cm 1,00 cm 1,20 cm 0,85 cm 1,60 cm 11007 / / / / / 1,00 cm 11010 / / / / 0,80 cm 1,25 cm 11012 0,95 cm 1,00 cm 0,90 0,90 cm / 1,20 cm 11013 / / / / / 1,00 cm 11014 1,00 cm 0,80 cm / / 1,00 cm 1,25 cm 11015 / / / / / / 11016 1,00 cm 1,00 cm 0,80 cm 0,75 cm 1,00 cm 1,30 cm 11018 0,90 cm 0,80 cm 0,80 cm 0,70 cm 1,00 cm 1,20 cm 11019 / / / / / / 11022 / / / / / / 11023 / / / / / / 11024 / / / 0,70 cm 0,75 cm 1,05 cm 11025 / / / / 0,80 cm 1,00 cm 11026 0,70 cm 1,05 cm 0,90 cm 1,05 cm 0,85 cm 1,40 cm 11038 / / / / 0,95 cm / 11039 / / / / 0,8 cm / 11040 / / / / 1,10cm 11058 / 0,85 cm 0,80 cm 1,00 cm 1,20 cm 11060 / / / / / 11061 / / / / / 11062 / 1,00 cm 0,90 cm 0,85 cm 1,25 cm

/ : Aucune zone.

51

Tableau 2.5 : Évaluation de l'activité inhibitrice des surnageants de culture des souches intestinales après un traitement thermique à 100°C pendant 5 min et/ou une filtration sur membrane 0,22 [xm.

E. coli ( ATCC3515I

D157: )

H7 5. enterica ATCC 8387 E. coli MC4100

Traitement ST TT F TF ST TT F TF ST TT F TF R+ 2 N N N 0,8 N N N 2 N N N R- SO SO SO SO SO SO SO SO SO SO SO SO 11004 0.8 N 0,9 N N N N N 1,3 0,7 N N 11006 0.7 N N N N N N N 1,5 1,2 1,1 1,2 11012 N N N N 0,7 N N N 1,2 0,7 0,7 0,7 11014 N N N N N N N N 1 0,8 N 0,8 11016 N N N N N N N N 1,2 0,9 0,8 0,8 11018 N N N N N N N N 1,2 N N N 11026 0,7 N N N N N N N 1,1 1.1 1,2 1,1

Les mesures sont en cm R+ : témoin positif (surnageant de la souche E. coli LR05) R- : témoin négatif (pas de substance inhibitrice) N : non significatif SO : aucune zone d'inhibition n'est visible ST : Sans traitement TT : Traitement thermique (5 min à 100°C) F : Filtration (0,22u.m) TF : Traitement thermique + filtration

52

Figure 2.4 : Test de diffusion sur gélose montrant l'activité inhibitrice des surnageant de culture des souches 11006 (A), 11004(B) et 11026(C) contre la souche sensible E. coli MC4100 suite aux différents traitements.

53

2.4.2. Test de microdilution

2.4.2.1. Activité inhibitrice contre E. coli MC4100

La figure 2.5 représente la courbe de croissance de E. coli MC4100 seule ou en

présence du surnagent de culture des souches 11004, 11006 et 11026. Le surnageant de

la souche E. coli LR05 qui produit les MccL, B17, D93 et J25 a été utilisé comme

contrôle positif. Les courbes de croissances obtenues montrent une inhibition de la

croissance d'E. coli MC4100 en présence des différents surnageant de culture pendant

les 14 premières heures d'incubation. Une croissance progressive a été ensuite

observée. Cette croissance peut être expliquée par deux phénomènes possibles soit

l'épuisement de la substance antimicrobienne produite en raison de la présence de

proteases dans le milieu soit par la nature de l'activité antimicrobienne exercée qui

serait plutôt de type bactériostatique.

De plus nous avons démontré que l'activité inhibitrice observée contre E. coli MC4100

est de type dose dépendante. Tel que présenté dans la figure 2.6, l'effet inhibiteur des

différents surnageants diminue lorsque les surnageants sont dilués au 1/2, 1/4, 1/8 et

1/16.

54

0,7

0,6

0,5

o in

Q

0,4

O 0,3

0,2

0,1

•E. coliMC4100

■Sgt E. coli LR05

■Sgt 11004

■Sgt 11006

■Sgt 11026

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Time (h)

Figure 2.5 : Courbes de croissance de E. coli MC4100 en absence et en présence des surnageants non dilués des différentes souches intestinales.

55

19 2 i

0,6

o.r.

0.4

0.3

DJ

0,1

u

E.coliMC4100

Set E. coli LR05

SgtllCKM

SgtllOOe

Sgtll026

9 14

Time (h)

IS 24

Figure 2.6 : Croissance d'Escherichia coli MC4100 en présence des surnageants de culture des souches intestinales diluées 1/2 (A), 1/4(B), 1/8(C) et 1/16(D).

56

2.4.2.2. Activité inhibitrice contre Escherichia coli 0157 :H7

Une expérience similaire à la précédente a été réalisée avec la souche pathogène

Escherichia coli 0157 :H7. La figure 2,7 illustre les courbes de croissance

d'Escherichia coli 0157 :H7 en présence et en absence des surnageants des souches

intestinales. Cette figure montre un effet inhibiteur qui est moins important que celui

observé contre la souche sensible Escherichia coli MC4100. Suite à la dilution des

surnageants, l'effet inhibiteur diminue rapidement et aucune inhibition n'a été observée

à partir de la dilution 1/4 (figure 2.8). La figure 2.8 montre aussi que parmi les quatre

souches testées, la souche 11026 est celle qui montre l'activité inhibitrice la plus

marquée. Cependant, la souche utilisée comme témoin positif E. coli LR05 reste la plus

efficace de toutes les souches testées.

57

0 2 4 6 810121416182022242628

Time (h)

■E.coli 0157 H7

■Sgt E. coli LR05

■Sgt 11004

■Sgt 1006

■Sgt 11026

Figure 2.7 : Croissance d'Escherichia coli 0157 :H7 en absence et en présence des surnageants de culture des différentes souches intestinales.

58

Q O

-Ecoli0157H7

- Sgt E. coli LROS

-Sgtll004

-Sgt 11006

-Sgt 11026

E.coli0157H7

Sgt E. coli LR05

Sgt 11004

Sgt 11006

Sgt 11026

Figure 2.8 : Croissance d'Escherichia coli 0157 :H7 en présences des surnageants des de culture des souches intestinales diluées 1/2 (A) et 1/4 (B).

59

2.4.2.3. Activité inhibitrice contre Salmonella enterica ssp enterica

serotype Montevideo

La figure 2.9 montre un effet inhibiteur des trois souches inhibitrices contre la

croissance de Salmonella enterica, suite à une expérience similaire aux deux autres.

Cependant cette figure montre un effet inhibiteur moins important que celui observé

contre la souche Escherichia coli MC4100 mais semblable à celui observé contre la

souche pathogène Escherichia coli 0157 : H7. De plus, suite à la dilution des

surnageants quatre fois l'effet inhibiteur diminue rapidement (figure 2.10) tout comme

observé pour la souche pathogène Escherichia coli 0157 : H7, avec la souche 11026

étant la plus active.

Nurmi et Rantale (1973), proposaient le concept d'exclusion compétitive en mettant en

évidence l'effet protecteur de la flore intestinale d'animaux adultes distribuée à des

poussins pour prévenir la colonisation par Salmonella Infantis. L'expérience consistait

à traiter des poussins juste après l'éclosion avec une flore caecale de poulet adultes

sains (Nurmi 1973). Ce concept a été repris plus tard par Zhang-Barber et al. (1998) qui

ont confirmé que l'administration à des poussins nouveau-nés de flores intestinales de

poulets adultes, en bonne santé, prélevées entre 37 et 80 jours d'âge permet de

développer une résistance aux infections intestinales. L'utilisation de flore caecale

normale peut ainsi réduire la colonisation caecale par les souches pathogènes,

cependant le mode d'action de cette flore reste encore mal étudié. Selon Nisbet (2002)

plusieurs modes d'actions sont à l'origine de l'activité des flores bactériennes mais les

mécanismes ne sont pas clairement identifiés. D faut noter que certains effets

inhibiteurs mis en évidence in vitro ne sont pas toujours reproductibles in vivo

(Patterson and Burkholder 2003).

60

1,2 1,2

1

0,8 o

/ " Salmonella

0,8 o / Salmonella

2 0,6 ci

0,4

0,2

/ — S g t E. coli LR05

Sgt 11004

2 0,6 ci

0,4

0,2

/ < * — S g t E. coli LR05

Sgt 11004

2 0,6 ci

0,4

0,2 J T Sgt 11006

— S g t 11026

2 0,6 ci

0,4

0,2 Jstr Sgt 11006

— S g t 11026 0

(

t ^ t ^ ^ m ^ ^ s i ^ 0

( ) 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Time (h)

Figure 2.9 : Croissance de la souche Salmonella enterica en absence et en présence des surnageants des souches bactériocinogènes.

61

-Salmonella

-SgtdeE. coliLROS

-Sgt 11004

-SgtllOOG

■Sgt 11026

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Time f h]

S ID d O

1.2

O.S

0,6

0.4

0,2

B

-Salmonella

-Sgt E. coliLROS

-Sgt 11004

-Sgt11006

-Sgt 11026

8 10 12 14 16 18 20 22

Time (h)

Figure 2.10: La croissance de Salmonella enterica en présence des surnageants de culture des souches intestinales diluées 1/2 (A) et 1/4 (B).

62

De manière générale, les études portant sur l'utilisation des probiotiques chez les

animaux d'élevage sont difficiles à évaluer car la plupart n'ont pas été statistiquement

analysées. De plus, les protocoles expérimentaux ne sont pas clairement définies, les

micro-organismes n'ont pas été identifiés et la viabilité des organismes n'a pas été

vérifiée (Stavric, 1992). Dans de nombreux cas, l'état de l'environnement et le stress

infligé aux volailles ne sont pas pris en considération dans la réponse vis-à-vis

l'admission de cette flore fécale.

L'utilisation des souches à Gram négatif dans l'alimentation des animaux a été

proposée pour la première fois suite à la constatation de la tolérance à l'acidité de

certaines souches d'E. coli (Bearson, Bearson et al. 1997; Ganzle, Hertel et al. 1999).

Depuis, plusieurs études ont utilisés des souches de E. coli productrices de colicin pour

réduire la charge digestive de E. coli pathogènes chez les animaux d'élevage (Tkalcic,

Zhao et al. 2003). Portrait et al. (1999) ont aussi montré l'effet inhibiteur de la

microcine J25 produite par certaines souches d'E. coli sur Salmonella enteritidis in

vitro. Toutefois, l'effet des bactériocines mis en évidence in vitro n'est pas facile ni à

mettre en évidence ni à reproduire in vivo.

Finalement, Schroeder et al. (2006) ont montré que la souche probiotique E. coli Nissle

1917 a été utilisée avec succès pour prévenir la diarrhée aiguë induite par des

pathogènes entérotoxinogènes chez les porcs (Schroeder, Duncker et al. 2006).

Les résultats obtenus dans le cadre de cette étude ont permis de sélectionner des

souches intestinales à Gram négatif productrices de substances inhibitrices apparentées

à des bactériocines. Trois de ces souches ont montré une activité inhibitrice marquée

contre des pathogènes de la volaille à savoir Salmonella (Enteritidis et Enterica) et E.

coli 0157 :H7. Ces souches présentent donc un potentiel certain d'utilisation comme

probiotique pour prévenir les infections entériques chez la volaille. Cependant et afin de

répondre aux exigences de la réglementation actuelle en termes de probiotiques

animaux, une identification poussée de ces souches de même que la démonstration de

leur innocuité demeurent nécessaire avant de permettre l'ajout de ces souches comme

supplément dans l'alimentation de la volaille. Ces deux aspects font l'objet du chapitre

3 de ce mémoire.

63

CHAPITRE 3. IDENTIFICATION ET CARACTERISATION DE SOUCHES À FORT POTENTIEL PROBIOTIQUE ISOLÉES DU

TUBE DIGESTIF DE VOLAILLES

64

3.1. RESUME

Trois souches bactériennes isolées du contenu intestinal de la volaille et baptisées

11004, 11006 et 11026 ont été identifiées et sélectionnées pour leur forte activité

inhibitrice vis-à-vis E. coli et Salmonella deux pathogènes entériques chez la volaille.

Une identification poussée utilisant des approches différentes mais complémentaires de

microscopie, biochimie et biologie moléculaire ont été utilisées pour l'identification

exacte de ces souches. Ainsi l'utilisation de la coloration Gram combinée à une

observation microscopique, une analyse du profil de fermentation des sucres par les

galeries API 20 E et une amplification de la région d'ARN16S ont permis d'identifier

les trois souches comme étant des Escherichia coli.

L'analyse du lipo-polysaccharides et des antigènes « O » ont permis de déterminer le

serotype de chacune des trois souches, Finalement et dans le but d'évaluer l'innocuité

des souches, la recherche de quatre gènes de virulence à savoir le gène codant pour

l'aérobactine (Aero), pour les facteurs cytotoxiques nécrosants (toxines CNF), pour les

adhésines fimbriaires ( P) et pour l'hémagglutinine sensible à la température (Tsh) a été

réalisée en utilisant la méthode d'amplification par PCR. Les résultats obtenus ont

montré que les trois souches possèdent les gènes de septicémie Aero et Tsh et la souche

11006 possède en plus le gène P.

65

3.2. INTRODUCTION

Les probiotiques sont des microorganismes vivants qui lorsqu'ils sont administrés en

quantité adéquate, produisent un effet bénéfique pour la santé de l'hôte (FAO/WHO.,

2001). Plusieurs effets bénéfiques sur la santé ont été associés à la consommation des

probiotiques tel que l'amélioration de la digestion, l'influence positive sur la flore

intestinale, la régulation de la motilité intestinale, la prévention de certaines maladies

(ostéoporose, cancer, hypertension...), la modulation de la réponse immunitaire et la

prévention des infections intestinales et urogénitales.

Plusieurs souches bactériennes à fort potentiel probiotiques ont été isolées et

caractérisées et sont aujourd'hui utilisées chez l'humain avec diverses allégations santé.

Cependant, l'utilisation des probiotiques chez les animaux est encore à un stage très

précoce. À titre d'exemple, l'emploi commercial de probiotiques en aviculture est

relativement nouveau. Des études récentes ont montré que l'incorporation de certaines

cultures probiotiques chez la volaille permet de renforcer l'écosystème microbien et

contribue à stimuler les mécanismes de défense immunitaire tout en protégeant les

poulets contre les conséquences de stress tels que la vaccination et les changements de

températures (Feuillet 2007; Awad, Ghareeb et al. 2009).

Selon la réglementation actuelle au Canada, l'utilisation des probiotiques en élevage

des animaux est régie par la loi T-3 159 sur les aliments pour bétail sous la rubrique

D cultures microbiennes vivantes et levures". Selon cette loi, une culture bactérienne

vivante ne peut ajoutée comme supplément à l'alimentation animale que si elle satisfait

à certaines exigences relatives à son innocuité et son efficacité. Entre autre, le

demandeur doit clairement identifier les espèces de bactéries utilisées et soumettre un

rapport d'analyse indiquant les méthodes de dénombrement et d'identification ainsi que

le profil biochimique de chacune des souches. Une description des méthodes de

confirmation utilisées doit aussi être soumise.

La grande majorité des souches actuellement approuvées et utilisées comme

probiotiques sont généralement des bactéries Gram positifs. Ces souches présentent peu

d'intérêt en aviculture puisque la majorité des souches pathogènes rencontrées chez la

volaille sont des bactéries à Gram négatif. La caractérisation et l'identification des

66

souches à fort potentiel probiotique actives contre les pathogènes à Gram négatif tels

que Salmonella et E. coli 0157 :H7 demeurent une réelle nécessité pour le secteur

avicole.

Dans le chapitre précédent et dans le but de sélectionner des souches à fort potentiel

d'utilisation comme probiotique chez le poulet, nous avons décrit les travaux relatifs à

l'identification de trois souches isolées de l'intestin de volailles en santé et qui étaient

capable d'inhiber certains pathogènes entériques de la volaille à savoir Salmonella et E.

coli. Bien que ces souches présentent déjà un certain potentiel, leur utilisation comme

probiotique en alimentation animale nécessite obligatoirement une identification

poussée et une caractérisation biochimique et moléculaire. De plus, leur innocuité doit

être démontrée sans aucun doute possible aussi bien pour les volailles que pour l'être

humain.

L'objectif général de ce chapitre est d'utiliser une approche polyphasique pour

l'identification et la caractérisation des trois isolats 11004,11006 et 11026 sélectionnées

pour leur activité inhibitrice. Il vise également à évaluer l'innocuité de ces isolats en

vue de leur utilisation comme supplément pour aliment de bétail.

67

3.3. MATERIEL ET METHODE

3.3.1. Souches bactériennes et conditions de culture

Les trois souches bactériennes 11004, 11006 et 11026 isolées du contenu intestinale de

volailles et ayant démontré une activité inhibitrice contre E. coli Kl2, S. enteritidis, S.

enteritica, E. coli 0157 : H7 et E. coli MC4100 ont été utilisées lors de cette étude.

La souche E. coli LR05 qui est une souche sauvage productrice des MccL, B17, D93 et

J25 et qui est résistante à la MccV (ou ColV) et à la colicine M (Sable, Duarte et al.

2003) a été utilisée comme témoin positif.

Toutes ces souches sont conservées à -80°C dans une solution cryo-protectrice

contenant du glycerol à 20%. Toutes les souches sont repiquées deux fois dans du

milieu BHI ; (Difco, Sparks, MD) et incubées à 37°C.

Dans un premier temps, des cultures fraîches des trois souches ont été soumises à une

observation microscopique ainsi à un test de coloration Gram. Dans un deuxième

temps, une analyse biochimique à l'aide des galeries API20E a été réalisée. Ces deux

premières étapes ont permis une identification partielle des souches.

3.3.2. Tests de sérotypage

Le sérotypage est une technique immunologique qui consiste en la mise en évidence

d'antigènes structuraux bactériens et donc de classer les souches en sérogroupes ou

sérovars. Ce test est basé la réaction spécifique entre un anticorps présent dans un

sérum test et un antigène porté par le microorganisme étudié. Cette réaction est

visualisée grâce à test d'agglutination qui est le résultat macroscopique de la réaction

antigène-anticorps. Lors de cette étude, plus de 85 antiserums ont été utilisés.

3.3.3. Méthodes moléculaires

Les méthodes moléculaires utilisées dans cette partie du projet avaient pour finalité

d'une part, d'identifier les souches isolées et d'autre part, d'évaluer leur innocuité. Cinq

68

gènes ont été alors ciblés, le gène codant pour l'ARN 16S et quatre gènes codant pour

des facteurs de virulence chez E. coli à savoir les gènes Aero, P, Tsh et CNF.

3.3.3.1. Amplification et séquençage de l'ARN 16S

Le gène ADNr 16S a été amplifié chez les trois souches en utilisant les amorces

spécifiques au domaine ADNr 16S à savoir SSU27F

S'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG'S et SSU1492R

5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT'3 (Lane, 1991). Le mélange réactionnel (25 [il)

était constituée de 19,25 ul d'eau «nuclease free water » (Invitrogen Life

Technologies, Carlsbed, CA, USA), 2,5 ul de 10X Taq buffer, 1 ui de dNTP (A, T, G et

C à 10 uM), (New England biolabs Ltd, ON, Canada) 1 [il d'une solution d'ADN cible

(25 ng/[il), 0,5 [il de chacun des deux amorces (10 uiM/uil) et 0,25 [il (1,25 U) de

l'enzyme Taq polymerase (New England Biolabs). L'amplification par PCR a été

réalisée dans un Tgradient (Montréal, Dorval, PQ, Canada) en utilisant 35 cycles

d'amplification. Chaque cycle comprend les étapes suivantes : une dénaturation de 30 s

à 94°C, une hybridation des amorces à 55°C durant 30 s, une elongation à 72°C pour

1,5 min et une extension de 5 min. Les différents produits d'amplification ont été

analysés par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,8% (Invitrogen) dans un tampon TAE

IX contenant 40mM de Tris-aceatate, lmM d'EDTA (Sambrook, Fritsch, & Maniatis

1989). La coloration a été réalisée à l'aide du bromide d'éthidium et une visualisation à

l'aide des UV (Gel Doc, BioRad, Mississauga, ON, Canada) a été effectuée.

Le séquençage de l'ARDr 16S a été réalisé au service de l'Université Laval (Life and

Health Sciences Pavillon, Québec, Québec, Canada) avec l'appareil ABI Prism 3100.

L'analyse des séquences d'ADN a été effectuée à l'aide du logiciel « Genetics

Computer Group Wisconsin Package software » (version 10.2) (Devereux, Haeberli,

and Smithies, 1984). Les séquences obtenues ont été comparées à celles de la base de

données utilisée pour la recherche de similitude (Pearson and Lipman, 1988) à l'aide du

service FASTA du centre national de biotechnologie information NCBI (National

Center of Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

69

3.3.3.2. Recherche et amplification des gènes de virulence

Quatre gènes de virulence connus chez E. coli ont été ciblés à savoir le gène Aero

codant pour l'aérobactine, un système de captation de fer codée par un opéron

plasmidique ou chromosomique (Mainil 2003), le gène CNF codant pour un facteur

cytotoxique nécrosants (Mainil 2003; Van Bost, Jacquemin et al. 2003), le gène P

codant pour une adhésine fimbriaire (Feria, Machado et al. 2001; Mainil 2003) et

finalement le gène Tsh codant pour une hémagglutinine thermosensible (Mainil and

Van Bost, 2004). L'amplification de ces gènes a été réalisée au laboratoire de référence

pour Escherichia coli de Faculté de médecine vétérinaire, Université de Montréal,

Saint-Hyacinthe, Qc.

70

3.4. RESULTATS ET DISCUSION

3.4.1. Analyse microscopique, coloration Gram et galerie API20

Suite à la réalisation des testes biochimique à l'aide du système d'identification API

20E, nos codes d'identification des trois souches sont :

- 11004:514 4552. - 11006:504 4572. - 11026:504 0552.

Les essais d'observation en microscopie, la coloration Gram de même que les résultats

des tests biochimiques obtenus avec les galeries API 20E indiquent sans aucun doute

possible que les souches 11004,11006 et 11026 appartiennent l'espèce Escherichia coli.

3.4.2. Tests de sérotypage

Selon la littérature, les sérogroupes d'E. coli les plus incriminés dans les cas de toxi-

infections alimentaires ou dans les maladies entériques qui causent des mortalités en

aviculture sont les serotypes Oi, O2, O35 et O78 représentant de 15 à 61 % des souches

isolées bien que d'autres soient aussi présents. Les autres serotypes représentés de

manière significative sont : 08 , O15, Oig, O35, Og8, O109, O115 et OHÔ (Stordeur and

Mainil, 2002)

71

Tableau 3.1 : Résultats du test de sérotypage des souches 11004,11006 et 11026

■ ■ J - -

Echantillons Sérotypie1

11004 018-023

11006 ONT

11026 Ol

ONT : non typé

'Liste des antiserums testés pour l'antigène O :

O,, 0 2 , 0 4 , 0 5 , 0 6 , Ov, Og, 0 9 , O,o, O n , 01 5 , 0, 6 , 0 1 7 , 0 1 8 , O20, 0 2 1 , 02 2 , 0 2 3 , 02 5 , 02 6 , 027, O34, O35, O36, O45, O49, O53, O54, O55, Oô0, 064, Oô9, O71, O73, O75, O76, Û78, 0 8 2 , 083, Os4, 086, 08 8 , O91, Oc2, 098, O100, Oioi, O]03, Oifj8, O109, Oui, O112, O113, O114, O115, On6, O117, On», O119» Oi2o, O121, Oi23, Oi25, Oi26, Oi28, O131, Oo2 , O137, 0|38 , O141, O143, O145, O146, O147, Oi48, O149, O153, O157, O159, Oi63, Ono, Oni, Oi72, O173.

Le tableau 3.1 nous permet de voir que la souche 11026 appartient à l'un des serotype le

plus incriminé dans les toxi-infections alimentaires ainsi que dans les maladies

entériques causant un taux élevé de mortalité en élevage de volailles. Dans le cas de la

souche 11004, une agglutination significative a été observée avec les antiserums à 018

et 023 ce qui classerait cette souche dans les serotypes les plus incriminés dans les

maladies entériques chez l'humain et les cas de mortalité dans l'élevage des volailles.

Enfin, la souche 11006 n'a agglutiné en présence d'aucuns des 85 antiserums utilisés.

3.4.3. Analyses moléculaires

La séquence de l'ARNr 16S (environ 1500 nucleotides) est spécifique de chaque

microorganisme et de son évolution depuis un ancêtre commun. De plus, le grand

nombre de séquences actuellement disponible (plus de 6000 séquences de procaryotes)

permet de dessiner un vaste arbre phylogénétique de microorganismes et d'y placer

chaque nouvelle séquence. À partir des alignements de séquences, il est possible

d'identifier les souches. Dans certains cas, des espèces sont si proches qu'elles ne

possèdent que très peu de différences dans la séquence 16S. Une région plus divergente

sera alors utilisée. Le pouvoir pathogène quand à lui est lié à la présence de gènes de

virulence qu'il faudra cibler.

72

Figure 3.1 : Analyse du produit d'amplification du gène d'ARN 16S par

d'électrophorèse sur gel d'agarose

La figure 3.1 nous présente le gel d'électrophorèse suite à l'amplification de la région

codant pour l'ADNr 16S chez les trois souches intestinales.

Le tableau 3.2 illustre les homologies des séquences obtenues avec celles des souches

déjà séquencées et disponibles dans GenBank. L'ADNr 16S de la souche 11004 montre

un grand degré de similitude (99%) avec des gènes d'E. coli S88 et E. coli 0127 : H6I

(GenBank Accession number CU928161.2 et FM180568.1). Une homologie de 99%

a également été observée entre la souche 11006 et d'E. coli SYW003 et BEBJ3

(GenBank Accession number EF620924.1 and EF560787.1). Finalement, le séquençage

de la région 16S de l'ADNr de la souche 11026 révèle une homologie de 99% avec la

souche E. coli IAI1, SE 11 et E. coli 0157.H7 EC4115 (GenBank Accession number

CU928160.2, AP009240.1 et CP001164.1). Ces résultats confirment que les trois

souches isolées lors de cette étude sont identifiées comme étant des souches d'E. coli

pathogènes.

73

Tableau 3.2 : Homologies de séquences entre les souches isolées et les souches de

références répertoriées dans GenBank.

Souche Description Homologie Score Numéro maximale maxima

1 d'accession

11004 Escherichia coli S88 99% chromosome, complete 2595 CU928161.2 genome Escherichia coli 0127 : H6 99% strain E2348/69 complete 2595 FM 180568.1 genome, Shigella dysenteriae FBD012 16S ribosomal RNA gene

99% 2595 EU009183.1

Shigella dysenteriae FBD011 16S ribosomal RNA gene

99% 2595 EU009182.1

Shigella boydii FBD006 16S ribosomal RNA gene

99% 2595 EU009177.1

11006 Escherichia coli SYW003 16S 99% 2601 EF620924.1 ribosomal RNA gene Escherichia coli BEBJ3 99% 2601 EF560787.1 16S ribosomal RNA Shigella sp. 4095 99% 2595 FJ405323.1 16S ribosomal RNA gene Escherichia coli SYW004 16S ribosomal RNA gene

99% 2595 EF620923.1

Escherichia coli BE23 16S ribosomal RNA gene

99% 2595 EF560779.1

110026 Escherichia coli IAI1 complete genome

99% 2597 CU928160.2

Escherichia coli SE11, complete genome

99% 2597 AP009240.1

Escherichia coli 0157 : H7 99% 2597 strain EC4115, complete CP001164.1 genome Escherichia coli 16S ribosomal RNA gene

99% 2597 EU722744.1

Escherichia coli SMS-3-5, complete genome

99% 2597 CP000970.1

74

L'espèce E. coli comprend de nombreuses souches pathogènes pour l'homme et les

animaux basés sur la possession de nombreux facteurs de pathogènicité. On distingue

alors les souches à tropisme intestinal (entérotoxinogènes, entéropathogènes,

entérohémorragiques, vérotoxinogènes et entéro-invasives) des souches à tropisme

extra-intestinal (uropathogènes et invasives). Si les propriétés et les facteurs spécifiques

de virulence des souches à tropisme intestinal sont relativement bien connus et

caractérisés, ceux des souches à tropisme extra-intestinal le sont beaucoup moins,

surtout chez les animaux (Mainil 2003).

Plusieurs articles de synthèse ont fait le point sur les connaissances actuelles en rapport

avec les facteurs de virulence et les propriétés spécifiques des souches invasives d'E.

coli. Chez les « Avian Pathogenic E. coli » (APEC), le pouvoir pathogène est liée à la

production d'aérobactine, la résistance au complément fimbriae P et/ou d'adhésines

(Mainil 2003; Mainil 2003; Mainil and Van Bost 2004). Plusieurs études ont également

montré que la plupart des souches APEC (73-98%) possède le système d'acquisition du

fer appelé aérobactine, alors que les souches non pathogènes le produisent moins

fréquemment (Stordeur and Mainil 2002). Comme le montre le tableau 3.3 les trois

souches analysées possèdent le gène codant pour l'aérobactine.

La toxine CNF a été découverte dans les années 80 provenant d'une souche d'E. coli

issue de nourrissons atteints de diarrhée. La toxine CNF induisait la formation de

cellules HeLa géantes multi-nuclées. Son rôle principal serait de permettre aux

bactéries de pouvoir se multiplier dans le sang ou les organes autres que l'intestin

(Stordeur and Mainil 2002). Les toxines CNF semblent agir en modifiant une petite

protéine G de 21kDa appelée Rho qui joue un rôle majeur dans la régulation du

cytosquelette des cellules eucaryotes et donc leur division et que cette altération

provoque une polymérisation des filaments d'actine du cytosquelette entraînant le

blocage de la motilité cellulaire et de la cytokinèse. De plus, il a été montré que ce

phénomène pourrait permettre l'entrée de bactéries normalement non invasives dans les

cellules épithéliales de l'hôte. Les résultats obtenus lors de notre étude ont montré que

les trois souches intestinales étudiées ne possèdent pas le gène CNF (Tableau 3.3) ce

qui est en parfaite concordance avec les travaux de Mainil (2003) et de Van Bost,

Jacquemin et al. (2003) qui ont montré que la majorité des souches d'E. coli provenant

75

de l'espèce aviaire aucune ou très peu de souches APEC sont positives pour les toxines

CNF.

Les adhésines fimbriaires de la famille P se définissent sur la base de leurs propriétés

d'agglutination des erythrocytes humains du groupe sanguin O. Des souches exprimant

des fimbriae P, ou en possédant les gènes, d'origine urinaire, systémique ou intestinale

ont aussi été isolées chez les volailles (Feria, Machado et al. 2001; Mainil 2003). La

présence du gène P chez la souche 11006 suggère un pouvoir septicémique très

important de cette souche puisque ces adhésines permettent à la bactérie de résister aux

mécanismes de défense de l'organisme et, ce faisant, de se multiplier sur place,

provoquant la formation de microcolonies.

D'autre part, il a été montré que le gène Tsh isolé d'une souche APEC de poulet est

associé préférentiellement à des souches pathogènes et ne se retrouve pas dans des

fèces d'animaux sains (Stordeur and Mainil 2002; Mainil and Van Bost 2004) ce qui

laisserai conclure que sa présence est un indicateur de pathologie. Tel qu'indiqué dans

le tableau 3.3 les trois souches d'E. coli isolées sont porteurs du gène Tsh ce qui

renforce l'hypothèse de ces trois souches soient potentiellement pathogènes.

Tableau 3.3 : Les gènes de septicémies détectées chez les trois souches.

Echantillons Gènes détectés dans

l'échantillon

11004 Aero, Tsh

11006 P, Aero, Tsh

11026 Aero, Tsh

En conclusion à ce dernier chapitre, il est clair que E. coli est une espèce bactérienne

qui est très présente parmi le microbiote colique normale de la volaille. Plusieurs

serotypes ont été déjà identifiés comme pathogène chez la volaille mais plusieurs autres

demeurent encore inconnues.

Lors de cette étude, la souche 11026 a été identifiée comme étant une E. coli 01 , ce qui

l'associe directement aux serotypes le plus incriminés dans les toxi-infections

76

alimentaire ainsi que dans les maladies entériques causant un taux élevé de mortalité en

aviculture. La présence des gènes codant pour l'aérobactine et l'hémagglutinine

confirme cette affirmation. En ce qui concerne la souche 11004 et bien que le serotype

exact n'a pas été déterminé en raison de l'agglutination des deux antiserums

différents 018 et 023, sont caractère pathogène a été confirmé par la présence des

gènes Aero et Tsh. Finalement pour la souche 11006 et bien qu'aucun serotype n'a été

obtenu (absence d'agglutination avec les 85 antiserums testés), la présence de trois des

quatre gènes de virulence suggère également un fort potentiel de pathogénicité chez

cette souche. Malgré l'activité inhibitrice intéressante observée, les trois souches

sélectionnées lors de cette étude ne peuvent être utilisées comme probiotiques en

alimentation animale.

77

CONCLUSION GENERALE

À l'échelle mondiale, les élevages de porcs et de volailles sont les sous-secteurs qui

enregistrent la plus forte croissance avec des taux annuels de 2,6% et 3,7% au cours des

dix dernières années (FAO, 2007). Plus de 40,4 % des cas de toxi-infections

alimentaires proviennent de la filière « Viandes et volailles », dont 19,2% représentés

par les volailles occupant ainsi la première place (CQIASA, 2008). Les pathogènes

alimentaires associés à la chaire de volailles sont surtout des souches à Gram négatif. À

l'heure actuelle, la prévention de ces maladies repose encore essentiellement sur

l'antibiothérapie. Cependant, les antibiotiques connaissent actuellement leurs limites

d'utilisation vue l'émergence de souches résistantes.

Dans le présent travail, vingt quatre isolats de contenus intestinaux de volailles ont été

criblées pour leur activité inhibitrice contre des souches pathogènes à Gram négatif en

vue de leur utilisation comme probiotique en aviculture.

Parmi les vingt quatre isolats étudiés, sept ont présenté une activité importante contre

Salmonella, Escherichia coli et Yersinia enterocolitica. L'analyse poussée des

surnageants de culture de ces souches a permis d'identifier trois (11004,11006 et 11026)

qui ont préservé leur activité inhibitrice à la suite d'un traitement thermique de 5

minutes à 100°C et d'une filtration sur une membrane de 0.22 [im. Le suivi de la

croissance des souches pathogènes entériques en présence des surnageants des trois

souches a révélé une forte activité inhibitrice pendant les 10 à 14 premières heures

d'incubation et une prolongation de la phase de latence. Une croissance progressive a

été ensuite observée. Cette croissance peut être expliquée par deux phénomènes

possibles soit l'épuisement de la substance antimicrobienne produite en raison de la

présence de proteases dans le milieu ou soit par la nature de l'activité antimicrobienne

exercée qui serait plutôt de type bactériostatique.

L'utilisation d'une approche multidisciplinaire combinant des méthodes biochimiques

et moléculaire a permis de conclure que nos trois souches sont des Escherichia coli.

78

Finalement, l'analyse de l'innocuité de ces souches a permis d'identifier la présence de

plusieurs gènes de pathogénicité indiquant le caractère pathogène de ces souches.

À la lumière de l'ensemble des résultats obtenus et en tenant compte de l'aspect

réglementaire, les souches intestinales ayant fait l'objet de cette étude ne peuvent pas

être utilisées comme probiotique en alimentation avicole.

Ce mémoire représentait une phase préliminaire d'un projet d'envergure et laisse

entrevoir une possibilité à l'avenir de trouver des souches présentant des

caractéristiques intéressantes et répondant aux normes de la réglementation.

79

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ANNEXES

Annex 1: Séquences des gènes d'ADNr 16S des différentes souches intestinales

11004 (1416 base)

ACACATGCAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAAT GTCTGGGAAACTGCCYGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAG ACCAAAGAGGGGGACCTTMGGGCCTCTTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGT AACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACG GTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCC GCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATACCT TTGCTCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGG GTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATC CCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCTGATACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCA GGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACT GACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATG TCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGT ACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT CGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACGGAAGTTTTCAGAGATGAGAATGTGCCTTC GGGAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCA ACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAA CTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATG GCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGA GTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTT CCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTANCCTT CGGGAGGGCGCTACCA

11006 (1419 base)

ACACATGCAGTCGAACGGTAACAGGAANCAGCTTGCTGTTTNGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAAT GTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAAYGTCGCAAG ACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGT AACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACG GTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCC GCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATACCT TTGCTCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGG GTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATC CCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCTGATACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCA GGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACT GACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATG TCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGT ACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT CGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACCTTGTAGAGATACGAGGGTGCCTTC GGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCA ACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAA

89

CTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATG GCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGA GTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTT CCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTT CGGGAGGGCGCTACCACTT

11026 (1411 base)

ACACATGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAA TGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAA GACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGG TAAAGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACAC GGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGC CGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATACC TTTGCTCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAG GGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAAT CCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCTGATACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCC AGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGAC TGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGAT GTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAG TACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAAT TCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTT CGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGC AACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAA ACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAAT GGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGG AGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGT TCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCANGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCT TCGGGAGGGCG