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NUMERATON, ISOLEMENT ET IDENTIFICATION

DES BACTERIES

Fromageries BEL Maroc, TangerFormation assurée parProf. A. TANTAOUI ELARAKISeptembre 2006

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Numération, isolement et identification des bactéries

Objectifs

Améliorer les aptitudes des participants en matière de:

o Numération des micro-organismeso Isolement des souches microbienneso Identification des bactéries d’intérêt Améliorer la qualité et la fiabilité des

analyses microbiologiques

3


ContenuGénéralités

1- Principes généraux de l'isolement, de la numération et de l'identification des bactéries

2- Cas particuliers de certains groupes bactériens

3- Autres aspects relatifs aux analyses bactériologiques

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Généralités- Culture microbienne

- Isolement des micro-organismes

- Numération des micro-organismes

- Identification des espèces

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Généralités

Culture microbienne

Définition: cultiver un micro-organisme, c’est le placer dans des conditions favorables à sa multiplication

Nécessite un milieu de culture approprié (eau, éléments nutritifs, pH, etc.)

Exige des conditions d’incubation favorables (température, durée, oxygénation, etc.)

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Généralités

Isolement des micro-organismes

Définition: obtention, à partir d’un mélange d’espèces microbiennes (dans un aliment par exemple), une espèce donnée en culture pure

Principes des techniques d’isolement: - Séparation physique des différentes espèces cultivées sur un milieu solide non sélectif

- Isolement de l’espèce ou du groupe recherché sur un milieu sélectif (où les espèces indésirables sont inhibées)

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Généralités

Numération des micro-organismes

Définition: détermination du nombre de représentants d’une espèce ou d’un groupe microbien dans 1g ou 1ml de produit

Principes des techniques de numération:- Culture sur milieu liquide en boîte de Petri de

dilutions appropriées de l’échantillon- Culture sur milieu liquide en tube (3 à 5

tubes par dilution) et estimation du nombre le plus probable grâce à la table de Mc Crady

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Généralités

Identification des espèces

Définition: déterminer l’espèce à laquelle appartient le micro-organisme étudié (l’identification peut s’arrêter au genre)

Nécessite, sur une culture pure, la détermination des caractéristiques:

- Morphologiques- Culturales- Biochimiques et physiologiques, - etc.

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1- Principes généraux … 1.1- Morphologie et structure

1.2- Choix des milieux 1.3- Choix des conditions d'incubation 1.4- Recherche de caractéristiques

biochimiques ou physiologiques supplémentaires

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1- Principes généraux

1.1- Morphologie et structure

1.1.1- Forme unitaire de la cellule1.1.2- Modes de groupement des

cellules1.1.3- Gram positivité et Gram

négativité1.1.4- Formation d’endospores 1.1.5- Récapitulation

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1- Principes généraux 1.1- Morphologie et structure

1.1.1- Forme unitaire de la cellule Très variée

Formes dominantes:

ronde (sphérique à ovoïde): coccus (cocci)

bâtonnet (allongée): bacille, bacillus ou bacterium

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1- Principes généraux 1.1- Morphologie et structure1.1.1- Forme unitaire de la cellule (suite)

ciliature polaire monotriche

ciliature péritriche

ciliature polaire multitriche

ciliature amphi-triche multitriche

Salmonella

Yersinia ruckeri Présence éventuelle de flagelles

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1.1.2- Modes de groupement des cellules Chez les cocci, groupements spécifiques:

- En chaînes: Streptococcus (et Lactococcus)

- En grappes de raisin: Staphylococcus

http://images.google.fr/imgres?imgurl=http://membres.lycos.fr/microzoo/streptocoques.jpg&imgrefurl=http://membres.lycos.fr/microzoo/maladies.html&h=274&w=345&sz=11&hl=fr&start=1&tbnid=cAxGE_8HkmJYeM:&tbnh=95&tbnw=120&prev=/images%3Fq%3DStreptocoques%26svnum%3D10%26hl%3Dfr%26lr%3D

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1- Principes généraux 1.1- Morphologie et structure1.1.2- Modes de groupement des cellules (suite)

Chez les bâtonnets, moins importants Exemples:- Streptobacilles: chaînes de bacilles- Gerbes: bacille de Koch

http://usinfo.state.gov/fr/img/assets/8136/bacille_de_koch.jpg

http://www.ruedesecoles.com/Dossiers/Images/dos06006i02.png

15

1- Principes généraux 1.1- Morphologie et structureRécapitulatif

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1.1.3- Gram positivité et Gram négativité

Bactéries généralement réparties en Gram positives et Gram négatives

- Technique de coloration- Résultats- Précautions- Explication: structure de la paroi

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1.1.3- Gram positivité et Gram négativité Technique de colorationPhase Gram positive Gram négative

1- Coloration primaire (Violet de

gentiane)

Réalisée Réalisée

2- Fixation (lugol: I2/KI)

Réalisée Non réalisée

3- Décoloration (alcool/acétone)

4- Coloration secondaire (Fuchsine)

Résultat final

Non réalisée

Réalisée

Violet

Réalisée

Réalisée

Rose

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1.1.3- Gram positivité et Gram négativité Résultats

Bâtonnets à Gram positif

Bâtonnets à Gram négatif & cocci à Gram positif

http://www.microbes-edu.org/professionnel/observations/obs13/J12/gram.jpg

19


1.1.3- Gram positivité et Gram négativité Précautions

Respecter les principaux paramètres suivants:

- Concentration des solutions

- Durée de contact

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1.1.3- Gram positivité et Gram négativité Explication: structure de la paroi

Gram positivité ou négativité selon structure de la paroi bactérienne

Bactéries à Gram négatif:- peptidoglycane: couche mince- « membrane externe »:complexes lipoprotéiqueset lipopolysaccharidiques

Bactéries à Gram positif:- peptidoglycane: couchetrès épaisse; seul constituant important

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1.1.4- Formation d’endospores

Endospore: micro-cellule résistante formée par certaines bactéries (surtout genres Bacillus et Clostridium)

Formée dans la cellule végétative, qu’elle quitte à maturité

Spore déformante ou non déformante Spore centrale, terminale ou

subterminale

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1- Principes généraux 1.1- Morphologie et structure1.1.4- Formation d’endospores (suite)

A: ovale, terminale;

B: rectangulaire, terminale;

C: rectangulaire, subterminale;

D: rectangulaire, centrale;

E: circulaire, terminale;

F: circulaire, centrale,

G: spore déformante, terminale

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Endospores bactériennes

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1.1.5- Récapitulation

Forme Bâtonnets Cocci

Gram Positif Négatif

Mobilité Immobile Mobile PéritricheMonotricheAmphitrichePolaire multitriche

Sporulation Non sporulée Sporulée DéformanteNon déformanteCentraleTerminaleSubterminale

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1.2- Choix des milieux de cultureGénéralités1.2.1- Milieu minimum1.2.2- Milieu empirique1.2.3- Milieu sélectif1.2.4- Milieu enrichi1.2.5- Milieu ordinaire1.2.6- Milieu synthétique1.2.7- Milieu semi-synthétique

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1- Principes généraux 1.2- Choix des milieux de culture

Généralités

milieu de culture: solution nutritive qui permet la culture des micro-organismes

doit contenir les composants nécessaires à la multiplication des micro-organismes: eau, éléments nutritifs (sources d’énergie, de

Carbone, d’Azote, minéraux et éventuellement facteurs de croissance)

pH ajusté au besoin

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1- Principes généraux 1.2- Choix des milieux de cultureGénéralités (suite)

Consistance des milieux:o Milieu liquide: « bouillon »o Milieu solide ou gélosé: « gélose »

(milieu liquide + Agar-agar: plus de 12g/l en général)

o Milieu semi-solide: « gélose molle » (7g/l d’Agar-agar au maximum) pour certains usages particuliers (mobilité, production de gaz)

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1.2.1- Milieu minimum

Contient les composants et éléments strictement nécessaires à la croissance bactérienne

Suffisant pour les micro-organismes n’ayant pas d’exigences particulières

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1- Principes généraux 1.2- Choix des milieux de culture1.2.1- Milieu minimum- Composition

- Source de C et d’énergie- Source de K et de P- Source d’Azote et de S- Source de Mg- Source de Ca- Source de Fe- Sources d’oligoéléments- Source d’eau- Un tampon pH

Glucose (généralement)K2HPO4

(NH4)2SO4

MgCl2CaCl2Citrate de FeSels de Cu, Zn, Co, Ni, B, etc.Eau distilléeKH2PO4 (par exemple)

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1.2.2- Milieu empirique

Milieu à base de produits naturels végétaux ou animaux

Composition exacte inconnue

Pas d’effet sélectif

Exemples: - Milieu Brain Heart (Cervelle Cœur)

- Milieu Viande Foie

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1.2.3- Milieu sélectif Permet seulement la culture de certains

micro-organismes Contient des éléments inhibiteurs pour

les espèces indésirables Pour la culture d’un type de micro- organisme à partir d’un prélèvement polymicrobien

Exemples d’élémentsInhibiteurs:

- NaCl à forte concentration- Thiosulfate de sodium- Cristal violet- Azide de sodium

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1.2.4- Milieu enrichi Contient, outre les composants de

base, des substances indispensables aux micro-organismes et que ceux-ci ne peuvent pas synthétiser

Utilisé pour micro-organismes exigeants

Exemple:Milieux au sang frais(sang riche en nutriments divers)

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1.2.5- Milieu ordinaire Permet la culture de micro-

organismes sans exigence particulière Composition simple Sans aucun effet de sélection

Exemples:- Bouillon ordinaire- Gélose ordinaire- PCA (Plate Count Agar)

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1.2.6- Milieu synthétique Composition chimique connue

exactement (quantitativement et qualitativement)

Couramment utilisés Utilisés pour la recherche d’une réaction ou d’un métabolisme précis

Exemple:Milieu au tryptophane pour recherche de tryptophanase(production d’indole)

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1.2.7- Milieu semi-synthétique

Composition connue de manière précise pour certains composants seulement (substances ayant un intérêt comme les facteurs de croissance)

Les autres composants sont présents de manière empirique

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1.3- Choix des conditions d’incubation

1.3.1- Température

1.3.2- Durée

1.3.3- Oxygénation

37

1- Principes généraux 1.3- Choix des conditions d’incubation

1.3.1- Température

Différents cas: Optimale pour les espèces cultivées Exigée par la nature du groupe

recherché (psychrotrophes du lait: 7°C selon définition de la F.I.L.)

Pour distinguer entre 2 ensembles d’un groupe microbien :fermentation du

lactose avec production de gaz - Coliformes totaux à 32°C en 48h - Coliformes fécaux à 44,5°C en 48h

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1.3.2- Durée Suffisante pour permettre:- Croissance des espèces voulues- Accomplissement des réactions

voulues Pas trop longue pour éviter:- Croissance d’espèces indésirables- Accomplissement de réactions non

souhaitées

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1.3.3- Oxygénation

Aérobies stricts: air libre (S/V élevé, agitation et aération, etc.)

Anaérobies stricts: gélose profonde, atmosphère dépourvue d’Oxygène

Microaérophiles: culture en double couche de gélose

Aéro-anaérobies facultatifs: variable selon les cas

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1.4- Car. bioch. ou physio. supplém.

1.4.1- Fermentation de sucres1.4.2- Production de gaz1.4.3- Activités enzymatiques

particulières1.4.3- Autres activités spécifiques

41

1- Principes généraux 1.4- Car. bioch. ou physio. supplém.

1.4.1- Fermentation de sucres

Principe:- Milieu de culture avec le sucre étudié

comme seule source de Carbone- pH légèrement alcalin au départ- Indicateur coloré de pH ajouté- Mise en évidence de l’acidification

(effet de la fermentation des sucres) par virage de l’indicateur coloré)

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1- Principes généraux 1.4- Car. bioch. ou physio. supplém.1.4.1- Fermentation de sucres

Exemples Milieu Sucre(s) Bactéries Indicateur

Kligler Glucose + Lactose

Entérobacteries Rouge de phénol

Chapman Mannitol Staphylocoques Rouge de phénol

Gélose désoxycho-late lactose

Hugh et Leifson

Lysine fer

Lactose

Variable

Glucose

Coliformes

Gram négatifs

Entérobactéries

Rouge neutre

Bleu de bromothymol

Pourpre de bromocrésol

Exemples de milieux avec des indicateurs colorés de pH pourla mise en évidence de la fermentation des sucres

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1- Principes généraux 1.4- Car. bioch. ou physio. supplém.1.4.1- Fermentation de sucresExemples (Cas du milieu de Kligler)

1- Pas de pousse ou, s’il y a pousse, le métabolisme des acides aminés a alcalinisé le milieu

2- Fermentation du lactose et du glucose

3- Fermentation des 2 sucres avec production de gaz

4- Fermentation du glucose seulement (1g/l), l’utilisation des acides aminés a alcalinisé la tranche

5- Production de H2S

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1.4.2- Production de gaz

Résulte de certains métabolismes Généralement H2, CO2, H2S, etc. Permet de séparer des ensembles

appartenant à un même groupe:- Coliformes fécaux et totaux (voir plus haut)

- Lactobacilles homo- (gaz -) et hétérofermentaires (gaz +)

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1- Principes généraux 1.4- Car. bioch. ou physio. supplém.1.4.2- Production de gazTechniques

Technique Type de milieu

Bouchon de paraffine Liquide ou semi-solide

Cloche de Durham Liquide

Dislocation de la gélose

Solide

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1- Principes généraux 1.4- Car. bioch. ou physio. supplém.1.4.2- Production de gazTechniques (suite)

Technique du bouchon de paraffine

- Milieu liquide ou semi-solide- Bouchon poussé vers le haut: production de gaz

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1- Principes généraux 1.4- Car. bioch. ou physio. supplém.1.4.2- Production de gazTechniques (suite)

Cloche de Durham

Gaz

Technique de la cloche de Durham

- Milieu liquide- Cloche poussée vers le haut et contenant des gaz (1/3 de son volume au moins): production degaz

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1- Principes généraux 1.4- Car. bioch. ou physio. supplém.1.4.2- Production de gaz- Techniques

Gélose disloquée

- Milieu solide- Dislocation de la gélose par formation de poches de gaz

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1.4.3- Activités enzym. particul.

- Catalase: Staphylococcus

- Coagulase: Staphylocoque pathogène- Nitrate réductase

- Tryptophanase: production d’indole à partir du tryptophane

H2O2 H2O + ½ O2Catalase

NO3- NO2

- + ½ O2Nitrate

réductase

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1.4.4- Autres activités spécifiques

Exemples o Production de H2S (anaérobies

sulfitoréducteurs, Enterobacteriaceae sur milieu de Kligler)

o Réduction du TTC: formation du tiphénylformazan, rouge et insoluble

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2- Cas particuliers … 2.1- Coliformes 2.2- Lactobacilles 2.3- Streptocoques du groupe D

2.4- Sulfitoréducteurs et butyriques

52

2- Cas particuliers …

2.1- Coliformes

2.1.1- Généralités sur les Coliformes

2.1.2- Numération sur gélose VRBL

2.1.3- Numération sur gélose au Tergitol 7 et TTC

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2- Cas particuliers …2.1- Coliformes

2.1.1- Généralités sur les Coliformes Bactéries en bâtonnets à Gram

négatif, non sporulées, aéro-anaérobies facultatives, fermentant le lactose avec production de gaz

Appartiennent à la famille des Enterobacteriaceae

Plus de 20 espèces, réparties en 5 genres: Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Hafnia, Citrobacter

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2- Cas particuliers …2.1- Coliformes2.1.1- Généralités sur les Coliformes (suite)

On distingue les Coliformes fécaux et les Coliformes totaux

- Coliformes fécaux: fermentent le lactose

avec production de gaz à 44,5 °C en 48h

- Coliformes totaux: (fécaux + non fécaux): fermentent le lactose avec production de gaz à 32 °C en 48h

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- Bons témoins de contamination fécale ou d’origine fécale

- Témoins de mauvaises pratiques d’hygiène - Sensibles à la chaleur (moyen de contrôle

de la pasteurisation)

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- Les coliformes sont peu exigeants du point de vue nutritif.

- Ils ont une vitesse de croissance très élevée: danger de prolifération abondante dans les aliments

Exemple: Escherichia coli se divise toutes les 20 min dans les conditions optimales de croissance:

en une heure, l’effectif de la population se multiplie par 8.

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Conséquences possibles:

- Altération de certains produits: cas du gonflement précoce de certains fromages (lait trop chargé en Coliformes, surtout en cas de mauvais développement des bactéries lactiques, à cause des antibiotiques par exemple)

- Possibilité de pathogenèse de certaines souches

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2.1.2- Numération sur VRBL

Objet Composition Rôle de chaque constituant Mode d’emploi Lecture Contrôle de qualité

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2- Cas particuliers …2.1- Coliformes2.1.2- Numération sur VRBL

Objet

Mise en évidence des bactéries Coliformes (dont Escherichia coli) dans l’eau, le lait et les produits laitiers, la viande et d’autres produits alimentaires

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Composition

Composants nutritifs

Peptone de viandeExtrait de levureLactose

7g/l 3g/l10g/l

Agents sélectifs

Mélange de sels biliairesCristal violetNaCl

1,5g/l0,002g/l

5g/l

Indicateur Rouge neutre 0,03g/l

Gélifiant Agar-agar 13g/l

pH 7,4 + 0,2

61


Rôle de chaque constituant Cristal violet et sels biliaires: inhibent

la flore secondaire à Gram positif NaCl: inhibe les germes sensibles au

sel La fermentation du lactose en acides

est révélée par:- Le virage au rouge de l’indicateur de

pH (rouge neutre)- La précipitation des sels biliaires

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Mode d’emploi

Inoculation selon la méthode de la boîte coulée

Incubation 24h + 2h; 30°C + 1°C

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LectureTypes de colonies Interprétation

Colonies rouges avec un halo de précipité rougeâtre (Ø 1-2 mm)

Enterobacteriaceae lactose positives (Coliformes, E. coli)

Colonies en « tête d’épingle » roses

Entérocoques, éventuellement Klebsiella

Colonies incolores Enterobacteriaceae lactose négatives

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Contrôle de qualité

Souche test Croissance Couleur

Salmonella typhimurium CIP 6062 (équivalent ATCC

14028)Bonne Beige

Escherichia coli ATCC 25922

Bonne Rouge

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Nulle -

65


2.1.3- Numération sur gélose au Tergitol + TTC

Objet Composition Préparation Rôle des constituants Mode d’emploi Lecture

66

2- Cas particuliers …2.1- Coliformes2.1.3- Numération sur gélose au Tergitol + TTC

Objet

Dénombrement des Coliformes, notamment dans l’eau par la méthode de filtration sur membrane

67


Composition


PeptoneExtrait de viande Extrait de levureLactose

10g/l 5g/l

6g/l20g/l

Agent sélectif Tergitol 0,01g/l

Indicateurs Bleu de bromothymolTTC

0,05g/l0,025g/l


pH 7,2 + 0,2

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Préparation Dans un litre d’eau distillée, ajouter

51,54g de milieu déshydraté Stériliser à l’autoclave Ajouter dans le milieu en surfusion (à

45°C): 50 ml d’une solution stérile de TTC à

0,05% 50 ml d’une solution de Tergitol 7 à

0,2%

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Rôle des constituants

- Le Tergitol 7 empêche l’envahissement par Proteus

CH3

H3C CH3

CH3

O=S-O-

ONa+

Tergitol 7 (Heptadecyl sulfate de Sodium)

- Excellent détergent- Excellentes propriétés mouillantes- Agent antimicrobien sélectif- pH (à 1% dans l’eau): 6

70

2- Cas particuliers …2.1- Coliformes2.1.3- Numération sur gélose au Tergitol + TTCRôle des constituants (suite)

Le TTC (C19H15ClN4) sert à montrer l’effet réducteur: sa réduction aboutit au Triphénylformazan, rouge et insoluble

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2- Cas particuliers …2.1- Coliformes2.1.3- Numération sur gélose au Tergitol + TTCRôle des constituants (suite)

La fermentation du lactose donne une

acidification qui se traduit par le virage au jaune du bleu de bromothymol

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Mode d’emploi Ensemencement par étalement d’un

petit volume d’échantillon, ou

En déposant une membrane Millipore après filtration d’un volume donné d’eau

Incubation 21h + 3h à 30°C + 2°C

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LectureTypes de colonies

Fermentation du lactose

Réduction du TTC

Interprétation

Jaunes+ - Escherichia coli,

Enterobacter

Rose rouge avec halo

jaune

+ + Autres Coliformes

Bleues ou vertes

- - Autres espèces

74


2.2- Lactobacilles

2.2.1- Généralités sur les Lactobacilles

2.2.2- Lactobacilles homofermentaires sur gélose Rogosa

2.2.3- Lactobacilles hétérofermentaires sur MRS liquide

75

2- Cas particuliers …2.2- Lactobacilles

2.2.1- Généralités sur les Lactobacilles

Bactéries en bâtonnet à Gram positif, non sporulées

Isolées des produits laitiers et d’autres produits (végétaux surtout)

Très exigeantes sur le plan nutritionnel (vitamines, peptides, acides aminés, etc.); ne poussent pas sur les milieux ordinaires

Acidophiles: pH optimum autour de 6; poussent encore bien à des pH inférieurs

76

2- Cas particuliers …2.2- Lactobacilles2.2.1- Généralités (suite)

N’utilisent pas l’O2; une atmosphère enrichie en CO2 (ou même anaérobiose) leur est favorable

Fermentent les sucres (dont lactose); acide lactique comme produit final principal:

• Lactobacilles homofermentaires: acide lactique = 90% des produits de fermentation

• Lactobacilles hétérofermentaires: acide lactique = 50% des produits (+ autres produits dont gaz)

77


2.2.2- Lactob. homoferm. sur gélose Rogosa

Objet Composition Préparation Rôle des constituants Utilisation Lecture Contrôle de qualité Précautions

78

2- Cas particuliers …2.2- Lactobacilles2.2.2- Lactobacilles homofermentaires sur gélose Rogosa

Objet

Milieu sélectif pour Lactobacilles seuls si pH ajusté autour de 5,4

Peut servir à la culture de toutes les

bactéries lactiques avec un pH autour de 6,2

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Composition


TryptoneExtrait de levureGlucoseDihydrogénophosphate de KCitrate d’ammoniumSulfate de MagnésiumSulfate de ManganèseSulfate ferreux

10g/l 5g/l

20g/l6g/l2g/l

0,575g/l0,12g/l

0,034g/l

Agents sélectifs

Acétate de sodiumAcide acétique glacialTween 80

25g/l1,32g/l

1g/l


pH 5,4 + 0,2

80


Préparation

- Peser les ingrédients (ou le milieu déshydraté du commerce: 82g pour un litre) sans l’acide acétique glacial

- Dissoudre dans un litre d’eau distillée et porter à l’ébullition jusqu’à dissolution complète

- Ajouter l’acide acétique glacial (1,32g) et mélanger soigneusement

- Chauffer 2 à 3 min à 90-100°C en agitant souvent- Répartir sans autoclaver

81


Rôle des constituants Composants nutritifs: satisfaction des

exigences nutritionnelles importantes Acétate de sodium à concentration élevée:

inhibe de nombreuses bactéries lactiques L’acide acétique renforce cet effet inhibiteur

(action antimicrobienne et pH) pH 5,4 très sélectif pour Lactobacilles (sans

acide acétique; pH 6,2, toutes bactéries lactiques poussent)

82

2- Cas particuliers …2.2- Lactobacilles2.2.2- Lactobacilles homofermentaires sur gélose RogosaRôle des constituants (suite)

Tween: inhibiteur

HO(CH2CH2O)w (OCH2CH2O)xOH

(OCH2CH2O)yOH

(OCH2CH2O)z O

O

C17H33

Tween 80 (Polysorbate 80): w+x+y+z = 20Émulsifiant et antimicrobien

O

83


Utilisation Pour Lactobacilles, recommandé:- Incubation 3j à 37°C ou 5j à 30°C- De préférence, atmosphère à 95%

d’H2 et 5% de CO2

- Sinon, recouvrir la gélose d’une 2ème couche

Avantages de l’incubation sous atmosphère contrôlée:

- Évite l’évaporation de l’eau- Fournit des conditions depotentiel Redox favorables - Le CO2 stimule la croissance

84

2- Cas particuliers …2.2- Lactobacilles2.2.2- Lactobacilles homofermentaires sur gélose RogosaUtilisation (suite)

Pour les bactéries lactiques thermophiles: incubation à 42°C; 48h

Pour les Leuconostoc: incubation à 25°C; 3j

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LecturepH

initialTypes de colonies Interprétation

5,4 + 0,2Petite (0,5-2,5 mm), blanc grisâtre, plate ou bombée, lisse ou rugueuse

Lactobacilles

6,2 + 0,2

Petite (0,5-2,5 mm), blanc grisâtre, plate ou bombée, lisse ou rugueuse

Diamètre O,5-1 mm« Slime » à 25°C

Toutes bactéries lactiques

Entérocoques et PédiocoquesLeuconostoc

86


Contrôle de qualité

Souche test Résultat

Lactobacillus acidophilus ATCC 19992

Croissance

Staphylococcus aureus ATTC 25923

Pas de croissance

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Précautions

Lactobacillus carnis ne pousse pas sur ce milieu

Avant de poursuivre l’identification, effectuer sur les souches isolées:

- la coloration de Gram- le test de la catalase

88


2.2.3- Lactob. hétérof. sur MRS liquide

Objet

Composition Rôle des constituants

Préparation, utilisation et lecture

89

2- Cas particuliers …2.2- Lactobacilles2.2.3- Lactobacilles hétérofermentaires sur MRS liquide

Objet Le milieu MRS est un milieu

d’isolement sélectif et enrichi pour Lactobacilles

Le MRS liquide permet de distinguer les Lactobacilles hétérofermentaires à l’aide de la cloche de Durham qui révèle la production de gaz

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Composition


Peptone trypsique de caséineMacération de viandeExtrait de levureGlucosePhosphate bipotassiqueSulfate de MagnésiumSulfate de ManganèseCitrate d’ammonium

15g/l 500ml/l

5g/l20g/l

2,4g/l0,2g/l

0,05g/l2g/l

Agents sélectifs

Acétate de sodiumTween 80

5g/l1g/l

pH 5,4 + 0,2

91


Rôle des constituants Composants nutritifs: satisfaction des

besoins nutritionnels importants Citrate d’ammonium: source de

citrate pour mise en évidence de la production de diacétyl

Acétate de sodium: inhibiteur pour de nombreuses bactéries, notamment les bactéries lactiques

Tween 80: inhibiteur d’autres espèces

92


Préparation, utilisation et lecture Milieu préparé et réparti en tubes,

avec cloches de Durham, et autoclavé Incubation à 30°C; 48h Si cloche remplie de gaz à raison du

1/3 de son volume au moins: Lactobacille hétérofermentaire

Autre technique de mise en évidence de la production de gaz: milieu MRS en gélose molle ou milieu semi-gélosé (7g d’agar -agar par litre) avec bouchon de paraffine

93

2- Cas particuliers …2- Cas particuliers …

2.3- Streptocoques du groupe D2.3- Streptocoques du groupe D

2.3.1- Généralités sur les 2.3.1- Généralités sur les Streptocoques du groupe DStreptocoques du groupe D

2.3.2- Culture sur milieu KF + TTC2.3.2- Culture sur milieu KF + TTC

2.3.3- Culture sur milieu BioKar 2.3.3- Culture sur milieu BioKar 016016

http://images.google.fr/imgres?imgurl=http://membres.lycos.fr/microzoo/streptocoques.jpg&imgrefurl=http://membres.lycos.fr/microzoo/maladies.html&h=274&w=345&sz=11&tbnid=cAxGE_8HkmJYeM:&tbnh=92&tbnw=116&hl=fr&start=1&prev=/images%3Fq%3Dstreptocoques%2B%26svnum%3D10%26hl%3Dfr%26lr%3D

94

2- Cas particuliers …2.3- Streptocoques du groupe D

2.3.1- Généralités sur les Strepto. gr. Do Bactéries en cocci à Gram positif o De 0,5 à 1 µm de diamètre o Groupement typique en chaînetteso Immobileso Dépourvues de spores o Rarement capsulées o A catalase variable o Aéro-anaérobies facultatives

95

2- Cas particuliers …2.3- Streptocoques du groupe D2.3.1- Généralités sur les Strepto. gr. D (suite)

o Métabolisme fermentatif o Produisent acide lactique et/ou acide

acétique, acide formique, éthanol et CO2, à partir des glucides

96


o Appartiennent à la famille des Streptococcaceae

o Les Streptocoques fécaux (Entérocoques) forment le groupe sérologique D de Lancefield, qui comprend 5 espèces

97


1er sous-groupe:Entérocoques Vrais

Enterococcus feacalis var. zymogenes var. liquefaciensE. faeciumE. durans

2ème sous-groupe

Enterococcus bovisE. equinus

98


o Plus résistants aux traitements thermiques que les Coliformes (ex: 63°C, 30 min)

o Cultivent bien en présence de 6,5% de NaCl, et 0,2% d’azide de sodium

99


o Bons indices de contamination fécale

o Présence sans Coliformes: contamination fécale ancienne ou produit ayant subi un chauffage

o Peuvent contribuer à l’altération des aliments

100


2.3.2- Culture sur milieu KF + TTC

Objet Composition Préparation Rôle des constituants Lecture

101

2- Cas particuliers …2.3- Streptocoques du groupe D2.3.2- Culture sur milieu KF + TTC

Objet Milieu Kenner Fecal au TTC pour

Streptocoques Milieu rendu sélectif pour les

Streptocoques fécaux (du groupe D) ou Entérocoques (+ Streptococcus avium du groupe Q)

Pour dénombrement classique ou après filtration (eaux)

102


Composition


PeptoneExtrait de levureLactoseMaltose Glycérophosphate de Na

10g/l 10g/l1g/l

20g/10g/l

Agents sélectifs

Azide de sodiumChlorure de sodium

0,4g/l5g/l

Indicateurs Pourpre de bromocrésolTTC

0,015g/l0,1g/l


pH 7,2 + 0,2

103


Préparation Peser 71,4g de milieu déshydraté (si

gélosé). Ajuster le pH Autoclaver 10 min à 115-121°C (ou

laisser bouillir 5 min si pouvoir sélectif total non requis)

Ajouter 10 ml d’une solution stérile de TTC à 1%

Répartir

104


Rôle des constituants L’azide de sodium et le sel (5%)

inhibent de nombreuses espèces, rendant le milieu sélectif pour les Streptocoques du groupe D

Le pourpre de bromocrésol montre (virage au jaune) l’acidification du milieu

Le TTC montre l’effet réducteur (triphénylformazan, précipité rouge)

105


Lecture Les colonies de Streptocoques fécaux

sont: rouge ou marron (réduction du TTC) avec un halo jaune (virage du

pourpre de bromocrésol suite à la fermentation des sucres et à la libération d’acides organiques)

106


2.3.3- Culture sur milieu BioKar 016

Objet Composition Préparation Rôle des constituants Lecture

107

2- Cas particuliers …2.3- Streptocoques du groupe D2.3.3- Culture sur milieu BioKar 016

Objet

Milieu sélectif pour l’isolement et le dénombrement des Streptocoques fécaux dans les produits alimentaires et pharmaceutiques

108


CompositionComposants

nutritifsTryptonePeptone pepsique de viande Extrait de levureCitrate de sodium

17g/l 3g/l5g/l1g/l

Agents sélectifs

Azide de sodiumChlorure de sodiumBile de boeuf

0,25g/l5g/l

10g/l

Indicateurs EsculineCitrate de fer ammoniacal

1g/l0,5g/l

Gélifiant Agar-agar 13,5g/l

pH (à 25°C) 7,1 + 0,2

109


Préparation

- Dissoudre 56,2g de milieu déshydraté dans 1l d’eau distillée

- Autoclaver 15 min à 120°C

- Après ensemencement, incuber 24 à 72h à 37°C

110


Rôle des constituants Agents sélectifs:

- Bile de bœuf (bactéries vivant dans l’intestin)

- Chlorure de sodium (5%)

- Azide de sodium

111

2- Cas particuliers …2.3- Streptocoques du groupe D2.3.3- Culture sur milieu BioKar 016Rôle des constituants (suite)

Indicateurs Esculine: décomposée par les Streptocoques en glucose et esculéine

Citrate de fer ammoniacal: fournit le révélateur: esculéine + Fe3+ précipité noir

112


Lecture

Colonies de Streptocoques fécaux: typiquement noires (hydrolyse de l’esculine et formation du complexe esculéine-fer noir)

Remarque: les autres Streptococcaceae et les Pseudomonaceae hydrolysent l’esculine, mais sont inhibées dans ce milieu

113


2.4- Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs et butyriques

2.4.1- Généralités

2.4.2- Principes généraux de la culture des anaérobies

2.4.3- Milieu VF au sulfite et à l’alun de fer

114

2- Cas particuliers …2.4- Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs et butyriques

2.4.1- Généralités Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs Bâtonnets à Gram positif Anaérobies stricts Sporulés (thermorésistants) Réduisent les sulfites (libération de H2S) Souvent gazogènes (H2, CO2 notamment)

Genre Clostridium

115

2- Cas particuliers …2.4- Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs et butyriques2.4.1- Généralités (suite)

Les butyriques: Espèces du genre Clostridium qui

conduisent une fermentation butyrique (acides, en particulier acide butyrique, gaz: CO2 et H2)

Espèces: C. sporogenes, C. butyricum, C. tyrobutyricuim

Responsables de gonflements tardifs dans les fromages

116


2.4.2- Principes généraux de la culture des anaérobies Milieu riche en matière organique,

surtout protéines (capacité d’équilibre Redox)

Régénération avant usage: ébullition pour chasser l’O2 dissous

Refroidissement rapide du milieu sans réintroduction d’O2 (sous courant d’eau froide; ne pas agiter)

117

2- Cas particuliers …2.4- Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs et butyriques2.4.2- Principes généraux de la culture des anaérobies (suite)

Après inoculation, éviter de réintroduire de l’O2 (dans les milieux gélosés en tube, mouvement de rotation de la main autour de l’épaule)

Incuber à l’abri de l’O2; exemples:- dans une jarre à anaérobies- sous un bouchon de paraffine- en gélose profonde

118


2.4.3- Milieu VF sulfitoréducteurs

Objet Composition Préparation Rôle des constituants Utilisation Lecture

119

2- Cas particuliers …2.4- Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs et butyriques2.4.3- Milieu VF sulfitoréducteurs

Objet Milieu pour isolement et numération

des anaérobies sulfitoréducteurs

Pour la recherche des anaérobies sporulés sulfitoréducteurs, nécessité de détruire les formes végétatives par un traitement thermique (ce choc thermique favorise, la germination des spores bactériennes survivantes)

120

2- Cas particuliers … 2.4- Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs et butyriques2.4.3- Milieu VF sulfitoréducteurs

Composition


Extrait de viande - foieGlucoseAmidon

30g/l2g/l2g/

Indicateurs Sulfite de sodiumCitrate de fer ammoniacal

0,5g/l0,5g/l


pH 7,6 + 0,2

121


Préparation Milieu de base:- Peser 46g de milieu déshydraté (sans

les indicateurs) - Dissoudre dans 1l d’eau distillée - Ajuster le pH- Répartir dans des tubes (20 ml) - Autoclaver: 20 min; 115°C

122

2- Cas particuliers …2.4- Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs et butyriques2.4.3- Milieu VF sulfitoréducteursPréparation (suite)

Les indicateurs- Préparer une solution de sulfite de

Sodium (A) et une solution de citrate de fer ammoniacal (B) à 5% chacune

- Stériliser les 2 solutions par filtration ou par ébullition (10 min)

- Ajouter dans chaque tube de milieu de base 0,5 ml de A et 4 gouttes de B (les 2 solutions doivent être fraîches)

123


Rôle des constituants Les extraits de viande et de foie,

riches en protéines, fixent l’O2 et le rendent indisponibles pour les bactéries

Le sulfite de Sodium est source de sulfite pour la mise en évidence de la réduction des sulfites en H2S

124

2- Cas particuliers …2.4- Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs et butyriques2.4.3- Milieu VF sulfitoréducteursRôle des constituants (suite)

Le citrate de fer ammoniacal apporte le fer pour révéler la présence de H2S par formation

d’un précipité noir de FeS

H2S + Fe2+ FeS + 2H+

Remarque: le Fer peut être remplacé par le Plomb (exemple: sous-acétate de plomb):

formation d’un précipité de PbS noir

125


Utilisation

• Chauffer l’échantillon (80°C; 5 à 10 min) pour tuer les formes végétatives et favoriser la germination des spores (choc thermique)

• Régénérer le milieu de base

• Ajouter les indicateurs

126

2- Cas particuliers …2.4- Anaérobies Sporulés Sulfitoréducteurs et butyriques2.4.3- Milieu VF sulfitoréducteursUtilisation (suite)

• Inoculer 1ml de l’échantillon ou d’une dilution de l’échantillon

• Homogénéiser sans introduire d’Oxygène

• Incuber en anaérobiose (37 ou 43°C; 24h)

127


Lecture

• Celles qui réduisent les sulfites ont des colonies noires (coloration nette ou diffuse)

Les bactéries anaérobies

strictes sporulées sulfitoréductrices

correspondent pratiquement

au genre Clostridium

• Les anaérobies poussent dans ce milieu qui est favorable aux bactéries anaérobies en général

numeraton, isolement et identification des … · 2 numération, isolement et identification des...

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