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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université d’Oran

Faculté des Sciences

Département de Biologie

Laboratoire de Microbiologie Appliquée

Mémoire de Magister Option : Microbiologie Appliquée

Présenté par Hamedi Amine Rizk

Thème

Etude du potentiel probiotique et technologique des

lactobacilles isolés du lait cru de chamelle

Soutenue devant les membres du jury suivant :

Président: Mr Boutiba Z. Professeur université d’Oran

Examinateur: Mr Henni D.E. Professeur université d’Oran

Examinateur: Mr Baba Hamed B. M C A université d’Oran

Examinateur: Mr Guessas B. M C A université d’Oran

Encadreur: Mr Kihal M. Professeur université d’Oran

2008-2009

Sommaire

Dédicaces

Remerciements

Liste des figures

Liste des tableaux

Liste des abréviations

Résumé 1

Summary 2

Résumé en Arabe 3

Revue bibliographique

1. Introduction 4

2. Ecosystème intestinal et probiotique 5

2.1. Généralités 5

2.2. Colonisation bactérienne de l’estomac et de l’intestin grêle 5

2.3. Fonction de la microflore intestinale 7

3. Les probiotique 8

3.1. Définition 8

4. Microorganismes probiotiques 9

4.1. Les bactéries lactiques 10

4.1.1. Les lactocoques 10

4.1.2. Les propionibactéries 11

4.1.3. Les bifidobactéries 12

5. Présentation du genre Lactobacillus 13

5.1. Lactobacillus johnsonii 14

6. Propriétés probiotiques et technologiques des lactobacilles 15

6.1. Propriétés technologiques des lactobacilles 15

6.1.1. Affinage des fromages 15

6.1.2. Fabrication du yaourt 15

6.1.2.1. Acidification 15

6.1.2.2. Arômatisation 16

6.1.2.3. Texture 16

6.1.3. Biopréservation des aliments 16

6.2. Métabolismes des lactobacilles 17

6.2.1. Métabolisme des sucres 17

6.2.2. Activité protéolytique 21

6.3. Propriétés probiotiques des lactobacilles 23

6.3.1. Diminution des diarrhées associées à l’antibiothérapie 23

6.3.2. Amélioration de la digestion du lactose 24

6.3.3. Inhibition des bactéries pathogènes 24

6.3.4. Effets sur l’immunité systémique et intestinale 25

6.3.5. Action sur le syndrome d’irritabilité intestinale chronique 26

6.3.6. Réduction des allergies alimentaires 26

6.3.7. Effet anticancérigène 27

6.3.8. Effet sur la maladie de Crohn 28

6.3.9. Effets sur les diarrhées à rota-virus et sur les diarrhées du voyageur 28

6.3.10. Réduction du cholestérol sérique 29

7. Critères de sélection des probiotiques 29

7.1. Critères de salubrité 29

7.2. Habilité à survivre dans les produits agroalimentaires et durant le stockage 29

7.3. Capacité à survivre au transite gastrique 30

7.4. Adhérence aux cellules épithéliales 31

Matériel et méthodes

1. Introduction 32

2. Isolement des lactobacilles 32

3. Provenance des souches bactériennes 33

4. Purification et ré-identification des espèces 33

4.1. Test de catalase 33

4.2. Test du type fermentaire 33

4.3. Test de croissance à différentes concentrations de NaCl 34

4.4. Test de croissance à différentes températures et de thermorésistance 34

4.5. Test de l’ADH 34

4.6. Test du profil fermentaire 34

5. Etude du potentiel probiotique 35

5.1. Résistance aux sucs gastriques 35

5.2. Résistance aux sels biliaires 35

5.3. Résistance aux enzymes pancréatiques 35

5.4. Pouvoir inhibiteur 36

6. Etude des propriétés technologiques 36

6.1. Etude de la cinétique d’acidité en milieu lait 36

6.2. Etude de la cinétique de croissance en milieu lait 37

6.3. Métabolisme du citrate 37

6.4. Production d’acétoïne 38

6.5. Etude des interactions entre les souches lactiques et les bactéries du yaourt 38

6.6. Evaluation de l’activité protéolytique 38

7. Conservation de souches 39

7.1. Conservation à court terme 39

7.2. Conservation à long terme 39

Résultats et discussions 40

Discussion générale 56

Conclusion et perspectives 60

Références bibliographique 62

Index de milieux de cultures 76

Dédicace

Je dédie le présent travail à mon défunt père puisse-t-il reposer en paix

et avoir la toute miséricorde de Dieu tout-puissant. ainsi qu’a ma très

chère mère pour son dévouement, sa gentillesse, son courage et son

soutient durant tant d’années. Que Dieu la garde pour nous.

a mon frère et mes sœurs : Med Zakaria, hinda et asma qui ont su m’orientés

et me guider dans ma vie, ainsi qu’à leurs conjoints, ouarda, mecheri et

Nabil. A mes adorables neveux et nièces : Rayane, Safouane, Ghizelène,

Mehdi, Mansour, Mokhtar et au petit dernier Merouan

A mes amis : Anas, Mourad, Hamid Nabil, Zaki, Djelloule, Mounir, Hicham,

Abdelwahabe, Sofian, Ali, Mohamed, Nacer, Mahi, Brahim, Mohamed, Kacem,

Nadir, Tarik, Souma et touts ceux que je n’ais pas citer mais que je garde

dans ma mémoire et mon cœur.

a l’ensemble du personnel des laboratoires de recherches de l’université

d’es-Sénia

a tous mes enseignants pour qui j’ai un respect tout particulier : Pr Kihal,

Pr Henni, Pr Boutiba, Dr Guessas, Dr Haddadji, Dr Saidi, Dr Senhadji et Dr

Sahraoui.

Remerciements

De par le nom de Dieu, tout-miséricordieux, tout-compatissant. Puisse-t-il bénir

notre seigneur Muhammad, clef et sceau de la prophétie.

Je remercie notre Dieu miséricorde de m’avoir amené à réaliser ce modeste

travail. Qui a été réalisé au niveau du Laboratoire de Microbiologie Appliquée

de la faculté des Sciences de L'université d'Oran sous la direction du Professeur

Kihal .M, auquel je lui exprime toute ma gratitude pour son aide précieuse et

pour sa patience tout au long de la période de mon travail au sein de son

laboratoire.

Je remercie vivement le professeur Boutiba Z. pour avoir bien voulus présider le

jury de soutenance.

Mes vifs et sincères remerciements vont au Pr Henni D.E. au Pr Baba Hamed B. et

au Dr Guessas B. pour avoir acceptés d’examiner mon modeste travail.

Enfin, je remercie tout ceux qui mon soutenus durant ces longues années.

Liste des figures

Figure 1: Composition de la microflore intestinale chez l’humain 6

Figure 2: Lactococcus lactis subsp lactis au microscope électronique 11

Figure 3: Observation au microscope électronique de du genre Propionibacterium 12

Figure 4: Observation au microscope électronique du genre Bifidobacterium sp 12

Figure 5: Observation au microscope électronique du genre Lactobacillus 14

Figure 6: Voie de la glycolyse relative à l’utilisation du glucose chez les bactéries lactiques 17

Figure 7: Représentation des différents systèmes de transport chez les lactobacilles 18

Figure 8: Voie des pentoses phosphates 19

Figures 9: Voie du tagatose (à gauche) et voie de Leloir (à droite) 20

Figure 10: Système de protéolyse des lactobacilles 22

Figure 11: Procédure d'isolement en profondeur 32

Figure 12: Instruments pour la mesure de l’acidité dornic titrable 36

Figure 13: Aspects des colonies en boites 41

Figure 14: Aspect des souches issues des cultures pures en milieu liquide 41

Figure 15: Résultats du test de l’ADH sur milieu M16 BCP 42

Figure 16: Observation microscopique de la souche A4 au grossissement G x 100 43

Figure 17 Résultats du profil fermentaire de la souche A4 43

Figure 18: Histogramme de comparaison entre les souches testées au niveau de leur résistance aux

traitements 46

Figure19: Mise en évidence de l'inhibition de Salmonella sp par les bactéries lactiques de la collection

47

Figure 20: Mise en évidence de l'inhibition d'Escherichia coli par les bactéries lactiques de la collection

47

Figure 21: Mise en évidence de l'inhibition de Vibrio cholerae par les bactéries lactiques de la collection

48

Figure 22: Mise en évidence de l'inhibition de Staphylococcus aureus par les bactéries lactiques de la

collection 48

Figure 23: Mise en évidence de l'inhibition de Pseudomonas sp imip R par les bactéries lactiques de la

collection 49

Figure 24: Histogramme de comparaison entre le pouvoir inhibiteur des différentes souches 49

Figure 25: Courbe de cinétique de croissance et d’acidité en milieu lait écrémé avec de l’extrait de levure

50

Figure 26: Courbe de cinétique de croissance et d’acidité en milieu lait écrémé sans extrait de levure

51

Figure 27: Aspect des colonies sur milieu citrate de Simmons 52

Figure 28: Formation d’annaux rouges due à la production d’acétoïne 53

Figure 29: Interactions entre les souches lactiques et les bactéries du yaourt 53

Figure30: Activité protéolytique des souches lactique 54

Figure 31: Histogramme de comparaison entre les diamètres des halos de protéolyse 55

Liste des tableaux

Tableau 1: Lactobacilles utilisés dans les cultures probiotiques 9

Tableau 2: Principales espèces et sous espèces de lactobacilles utilisées en industrie laitière 14

Tableau 3: Différents systèmes de transport des sucres chez certains lactobacilles 20

Tableau 4: Principales souches utilisées durant nos travaux 40

Tableau 5: Différents test d’identification et leurs résultats respectifs 42

Tableau 6: Résultats du profil fermentaire avec les différents sucres 43

Tableau 7: Les concentrations microbiennes auxquelles correspondes les DO utilisées dans les

tests probiotiques 44

Tableau 8: résume les résultats du dit test concernant la résistance ou non des souches aux

différents traitements. Les concentrations sont obtenues après dénombrement sur milieu solide 45

Tableau 9: Valeurs des cinétiques de croissance et d’acidité en milieu lait écrémé avec de

l’extrait de levures 50

Tableau 10: Valeurs des cinétiques de croissance et d’acidité en milieu lait écrémé avec de

l’extrait de levures 51

Tableau 11: Diamètres en centimètres des halos de protéolyse des espèces respective 55

Liste des abréviations

ADH : Arginine déshydrogénase

ATP : Adénosine Tri Phosphate

ATPase : Enzyme qui dégrade l’ATP

B : Bifidobacterium

BCP : Pourpre de bromocrésol

biovar : biovariant

°C : Degrés Celsius

°D : Degrés Dornic

DO : Densité Optique

H : Helicobacter

h : heurs

IFN : Interferon

Ig : Immunoglobuline

IL : Interleukine

Lb : Lactobacillus

Lc : Lactococcus

LDL : Low Density Lipids

min : minutes

NK : Natural Killers

P : Pediococcus

pH : Potentiel hydroélectrique

sp : espèce indéterminée

Str : Streptococcus

subsp : sub specie (sous espèce)

TFG : Transforming factors of growth

Th : Tumor human

TLR : Toll-Like Receptors

TNF : Tumor Necrosis Factors

trs : tours

UpH : Unité de pH

Vmax : Vitesse maximale

1

Résumé

L'évolution d'une fermentation lactique spontanée à une fermentation dirigée est réalisée grâce à

des levains lactiques sélectionnés, qui donnent des produits laitiers diverses possédants des

caractères organoleptiques variés. L'intégration de nouvelles souches lactiques provenant de

différents écosystèmes est actuellement utilisée pour augmenter la durée de bio-préservation des

aliments. En plus ; l'activité de certaines souches lactiques à caractère probiotique est exploitée

pour produire des aliments fonctionnels à caractères préventifs et thérapeutiques. Dans ce travail

nous avons axé notre recherche sur le potentiel probiotique et technologique de quelques espèces

du genre Lactobacillus, isolées du lait cru de chamelle du sud-ouest Algérien. Les techniques

microbiologiques et biotechnologiques ont été utilisées pour accomplir ce travail. Les résultats

obtenus pour l'aptitude de la souche A4 de Lb. johnsonii à résister aux stresses acide, basique et

enzymatique qui nous montrent clairement que cette espèce est probiotique en comparaison avec

les souches les plus étudiées qui sont Lb. casei (5) et Lb. rhamnosus (6). L'aptitude de cette

souche A4 (Lb. johnsonii) à inhiber les bactéries pathogènes est confirmée par les résultats

d'interactions entre les souches lactiques et les souches pathogènes (Staphylococcus aureus,

Escherichia coli, Pseudomonas sp. imip R, Vibrio cholerae et Salmonella sp). La souche A4 a

coagulé le lait en 14h. Cette souche de Lb. johnsonii a montré une stimulation de Streptococcus

thermophilus ce qui indique la possibilité de son intégration comme agent probiotique dans de

nouveaux dérivés laitier d’intérêt nutritionnel. Donc le lait de chamelle peut être considéré

comme un écosystème permettant le développement d’une microflore lactique à caractère

probiotique.

Mots clés: Lait de chamelle, lactobacilles, propriétés probiotique et technologiques, bio-

préservation des aliments.

2

Summary

The evolution from a spontaneous fermentation to a directed fermentation is realized with selected

lactic acid bacteria which give many dairy products with different sensitive characters. The

integration of new lactic acid bacteria‘s strains isolated from diverse ecosystems is now used to

increase the bio-preservation of dairy products. Moreover, probiotic activity of lactic acid bacteria

is exploiting in the fact to produce functional foods. The aim of this study is the research of the

possible probiotic potential and the technological characteristics of some Lactobacillus species

isolated from Algerian’s raw camel’s milk. Microbiological and biochemical techniques are used

to do this work. Results shown that Lactobacillus johnsonii (A4) can resist to acidic, basic and

enzymatic stresses in comparison with Lactobacillus casei (5) and Lactobacillus rhamnosus (6).

So we can say that this strain is a probiotic. The inhibition activity of the strains A4 against

pathogens (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas sp. imip R, Vibrio cholerae

and Salmonella sp) is clearly obtained by testing these strains with the direct method. Milks

coagulation by Lb. johnsonii is done after 14h of incubation. The strain also showed stimulation of

Streptococcus thermophilus so that indicate the possibility to use it as probiotic agent in new

fermented products. Finely, raw camel’s milk can be defined as an ecosystem that promotes the

development of a microflora with probiotic characters.

Key words: Camels milk, Lactobacillus, probiotic and technologic proprieties, bio-preservation.

3

الملخص التطور في الصناعة التخميرية الغير متوجهة إلى الصناعة المتوجهة يتحصل عليها بواسطة بكتيرات الحليب

إضافة الى دالك هناك أصناف جديدة من بكتيرات الحليب الناجمة من . التي تعطي خواص منتقاة مخبريا

يتركز هذا .. أوساط مختلفة تستعمل الغراض وقائية كما تستغل لإلطالة من مدة صالحية المواد الغذائية

كذالك الكشف على , للقاعدية و لالنزيمات الهضمية, البحث في الكشف على الخاصيات المقاومة للحموضة

لقد تم استعمال لحاجة هذا البحث . الخصائص التكنولوجية لبكتيرات اللبن المعزولة من حليب الناقة الجزائرية

.Lbالنتائج المتحصل عليها تتمثل في مقاومة جيدة للساللة . التقنيات المكروبيولوجية و البيوكميائية

johnsonii (A4) مقارنتا مع السالالت , األساسية و لالنزيمات الهضمية, للحموضةLb. casei (5) et

Lb. rhamnosus (6) .كذالك مه واحيت تثبيط البكتيريا المسببت في التسمماة الغذائيت :Staphylococcus

aureus, Escherichia coli, Pseudomonas sp. imip R, Vibrio cholerae et Salmonella

spلقذ خمرث الساللت . تحصلىا على وتائج جذ مشجعت(A4) و قذ , ساعت14 الحليب المىزوع مه الزبذة في

مما يمكىىا القىل أوىا مه إمكاوىا Streptococcus thermophilusأظهرة أيضا تعايشا ايجابيا مع البكتيريا

.الخالصت هي أن حليب الىاقت غىي بالبكتيريا المفيذة لإلوسان. استعمالها في مىاد غذائيت جذيذة

الخاصيات التكنولوجية و المفيدة , Lactobacillusمه الصىف بكتيريت الحليب ,حليب الىاقت: كلماث المفتاح

.حماية طبيعية للمواد الغذائية, لإلنسان

Etude du potentiel probiotique et technologique des lactobacilles isolés du lait cru de chamelle


4

1. Introduction:

Les populations mondiales ont connues au cours de deux derniers siècles des évolutions sans

précédent de leur mode de vie en général et de leur alimentation en particulier. Dans ce paysage et

suite à des conséquences négatives de ces évolutions sur la santé avec l’apparition des maladies

dites de civilisation. En effet, l’alimentation est susceptible de moduler diverses fonctions de

l’organisme, et peut aussi contribuer à diminuer le risque de certaines pathologies. Ces dernières

années plusieurs études ont été entreprises afin d’évaluer l’impact sur la santé de certaines

composantes de l’alimentation à caractère non nutritionnel tels que les micronutriments, les

prébiotiques et les probiotiques (Belgnaoui, 2006). Les probiotiques ont fait l’objet de nombreuses

études et leur bienfaits reconnus par tous. Le pionnier fut Metchnikoff qui a fondé sa théorie

concernant les probiotiques sur la longévité des paysans bulgares qui été due à leur consommation

quotidienne de lait fermenté. La fermentation des denrées alimentaires est l’une des plus

anciennes méthodes pour leur conservation (Vasiljevic et Shah, 2008). Durant les récentes années,

le monde a connu une marginalisation dans la vente de produits contenants des probiotiques, et

d’énormes études ont été entreprises pour obtenir une preuve scientifique sur l’effet bénéfique de

ces organismes vivants (Alander et al., 1997). La sélection des probiotiques se base non seulement

sur leurs effets bénéfique sur la santé de l’hôte ou dans le traitement des infections liées au

système gastro-intestinale (Corcoran et al., 2003), mais aussi sur leur capacité à adhérer à la

muqueuse intestinale (Ehrmann et al., 2001 et Ouwehand et al., 2000) ainsi que pour leur autre

capacité à survivre aux stresses du transite digestif (Elahi et al., 2008) et donc résister aux sucs

gastriques et aux sels biliaires, pour certains auteurs, ils doivent aussi résister aux enzymes

pancréatiques (Ruiz-Moyano et al., 2008). Les probiotiques renferment plusieurs genres de

bactéries et de levures (Shah, 2007), dont la plus grande partie est représentée par les lactobacilles

(Frece et al., 2004). L’habitat d’origine des espèces de Lactobacillus ainsi que leur effet inhibiteur

envers les souches entéropathogènes ont un grand impacte dans leur valorisation au rang de

probiotiques (Annuk et al., 2002). Le présent travail se focalisera sur les propriétés

technologiques, antimicrobiennes et probiotiques des souches de lactobacilles isolées à partir du

lait cru de chamelle (Camelus dromedarius).



5

2. Ecosystème intestinal et probiotique:

2.1. Généralités:

De la naissance à leur mort, les animaux ainsi que l’homme vivent en équilibre avec une flore

microbienne extrêmement dense et variée qu’ils abritent, pour l’essentiel, dans la cavité de leur

tube digestif. La flore microbienne est estimée numériquement 10 fois supérieure au nombre de

cellules de l’organisme (Belgnaoui, 2006). Les rôles que jouent les probiotiques dans

l’écosystème intestinal en tant qu’agents thérapeutiques ou préventifs de plusieurs désordres liés

au système gastro-intestinal reçoivent une attention très particulière. L’écosystème intestinal est

très complexe, il renferme plus de 500 espèces différentes de microorganismes répartis selon

l’anatomie comme suit : 0-104

ufc/ml dans l’estomac, ce nombre réduit est dû principalement à

l’acidité. Il existe une variabilité quantitative et qualitative dans la flore du duodénum, de l’iléon

et du colon allant de 0-105

ufc à 10

8 ufc et 10

10-10

12 ufc respectivement. Cette abondance est

certainement due au pH neutre et à la disponibilité en nutriments (Jonkers et stockbrügger, 2007).

Le développement d’une flore intestinale stable aide l’humain à résister contre les infections du

tractus gastro-intestinal. Ce phénomène a été décrit par de nombreux auteurs qui lui on attribués le

nom d’antagonisme bactérien, interférence bactérienne, effet barrière, colonisation résistante et

exclusion compétitive. La meilleure preuve de l’effet protecteur de la flore intestinale tient dans

une étude faite sur des animaux n’ayant aucun microorganisme intestinal été plus vulnérables

envers les infections que ce contenant une flore gastrique stable (Fuller, 1989).

2.2. Colonisation bactérienne de l’estomac et de l’intestin grêle:

Le développement d’une flore microbienne dans le tractus intestinal humain dépend de l’inoculum

original à la naissance, de l’environnement vital et de l’allaitement. La colonisation du tractus

digestif de l’enfant débute à la naissance, puis continu lors des périodes d’allaitement et de

sevrage, ceci en résulte une communauté microbienne relativement stable. Une flore intestinale

mature confère une barrière physique et immunitaire entre l’hôte et son l’environnement. Cette

fonction maintient un intestin sain et protège l’hôte par une microécologie (Salminen et al., 2006).

Quelques heures seulement avant un repas, l’estomac d’un humain sain ne contient qu’une infime

concentration microbienne, ce sont généralement des lactobacilles ou des germes acido-tolérants

ou acidophiles. La partie supérieure de l’intestin grêle contient des lactobacilles et des

streptocoques en concentrations relativement plus élevées que celle de l’estomac. Dans les

circonstances normales la digestion humaine qui s’effectue au niveau de l’intestin grêle dure entre



6

2h à 4h environ, c’est cet afflux rapide de nutriments qui aide à la colonisation permanente du

tractus digestif (Macfarlane et Dillon, 2006).

Figure 1 : Composition de la microflore intestinale chez l’humain (Gagnon, 2007)

Différents facteurs endogènes associés à l’hôte, aux bactéries et à l’environnement contribuent à

maintenir la composition et le bon fonctionnement de la microflore, contrôlant ainsi l’homéostasie

intestinale. La physiologie du système digestif de l’hôte, ainsi que les nutriments endogènes et

l’habitat colique interviennent donc dans la régulation et la stabilité de la microflore. Parmi ces

facteurs endogènes, on retrouve le pH ou le potentiel d’oxydoréduction, les interactions

microbiennes, la muqueuse épithéliale intestinale, le péristaltisme, les sécrétions acides et

biliopancréatiques, et la production de mucus (Holzapfel et al., 1998). Les facteurs exogènes tels

que la composition du régime alimentaire et des circonstances environnementales (contamination

par des pathogènes, antibiothérapie, chimiothérapie, climat, stress, hygiène…) peuvent également

modifier le fonctionnement et la composition de la microflore (Mitsuaka, 1989 et Belgnaoui

2006).



7

2.3. Fonction de la microflore intestinale:

Le développement d’un microbiote intestinal dans le tractus gastro-intestinal de l’humain dépend

de l’inoculum original à la naissance, de l’environnement de vie et des pratiques d’alimentation

(Salminen et al., 2006). La colonisation microbienne de l’enfant commence à la naissance et

continue durant l’allaitement et la période de sevrage, ce qui en résulte une communauté

microbienne stable chez l’adulte (Guarner et Malagelada, 2003). La relative stabilité de

l’écosystème intestinal suggère la présence de mécanismes de régulation et de défense propres à

l’hôte ou à la microflore résidente. Ainsi, il apparaît la notion de synergie, de symbiose et de

commensalisme entre l’hôte et sa microflore (Belgnaoui, 2006). Les populations microbiennes

peuvent affecter les fonctions digestives et la physiologie de l’épithélium intestinal par leur

activité métabolique (Roberfroid et al., 1995). En effet, les bactéries intestinales participent à la

décomposition de substances non digérées, en particulier les glucides alimentaires (fibres,

amidons résistants, sucres non absorbés) et de substances endogènes tel que le mucus (Gibson et

Roberfroid, 1995). Une autre fonction importante exercée par la flore intestinale est la maturation

et la stimulation du système immunitaire de l’hôte. Le système immunitaire local associé à la

muqueuse digestive ainsi que le système immunitaire général sont fortement stimulés ou parfois

inhibés, par certaines bactéries de la flore du tube digestif. Plusieurs études ont montré que la flore

intestinale stimule l’activité phagocytaire (Nicaise et al., 1993), la sécrétion des cytokines par les

macrophages (Nicaise et al., 1999), les lymphocytes intra épithéliaux (Bandeira et al., 1990), ou

encore le nombre de plaques de Peyer (Ducluzeau et Raibaud, 1979). Les bactéries de la flore

intestinale modulent donc l’activité du système immunitaire de façon à établir la tolérance de

l’hôte à leur égard et éviter une réponse contraire à leur implantation. Cette interaction entre le

système immunitaire muqueux et la microflore intestinale maintient cette muqueuse dans un état «

d’inflammation physiologique » contrôlée (Berg et Savage, 1975 ; Shroff et al., 1995). D’ailleurs,

à l’état basal, le microenvironnement intestinal est caractérisé par la présence de cytokines à

fonction immunosuppressive telles que l’IL-10 et le TGF-β produites par les cellules Th3 (Strober,

1998) les cellules épithéliales, mésenchymateuses et dendritiques (Fagarasan et Honjo, 2003 et De

Jong et al., 2002). L’intestin manifeste naturellement une réponse immunitaire T régulatrice

traduisant une prédisposition à l’induction de la tolérance locale vis-à-vis d’antigènes de

l’environnement, particulièrement ceux d’origine bactérienne (Powrie et al., 1994). La

reconnaissance de la microflore endogène par le système immunitaire de l’hôte se traduit en effet

par la production d’anticorps locaux et systémiques (Apperloo-Renkema et al., 1993). En

atteignant la lumière intestinale, les Ig A de la lamina propria exercent une action protectrice



8

contre les antigènes microbiens (Matsunaga et Rahman, 1998) par régulation de l’adhésion et la

croissance bactérienne (Brandtzaeg et al., 1989). Différents facteurs endogènes associés à l’hôte,

aux bactéries et à l’environnement contribuent à maintenir la composition et le bon

fonctionnement de la microflore, contrôlant ainsi l’homéostasie intestinale. La physiologie du

système digestif de l’hôte, ainsi que les nutriments endogènes et l’habitat colique interviennent

donc dans la régulation et la stabilité de la microflore. Parmi ces facteurs endogènes, on retrouve

le pH ou le potentiel d’oxydoréduction, les interactions microbiennes, la muqueuse épithéliale

intestinale, le péristaltisme, les sécrétions acides et biliopancréatiques, et la production de mucus

(Holzapfel et al., 1998). Les facteurs exogènes telle que la composition du régime alimentaire et

des circonstances environnementales (contamination par des pathogènes, antibiothérapie,

chimiothérapie, climat, stress, hygiène…) peuvent également modifier le fonctionnement et la

composition de la microflore (Mitsuaka, 1989).

3. Les probiotiques:

3.1. Définition:

Durant plusieurs années, le terme « probiotique » a été utilisé dans différentes applications. Il a été

tout d’abord utilisé pour définir des substances produites par des protozoaires pour en stimuler un

autre (Lilly et Stillwell, 1965) plus tard il a été utilisé pour décrire des suppléments alimentaires

destinés à l’alimentation animale ayant des effets bénéfiques sur l’animal hôte en affectant sa flore

intestinale (Parker, 1974). Récemment, il a été défini comme suit « organismes ou substances qui

contribue à l’établissement d’un équilibre dans la microflore intestinal ». Cette définition est

insuffisante car imprécise, cela inclurait les antibiotiques. Le plus judicieux serait de le définir

comme « supplément alimentaire contenant des microorganismes vivants qui affecte

bénéfiquement l’animal hôte en régulant l’équilibre de la flore intestinale » (Fuller, 1989). La

FAO (Food and Agriculture Organization) et l’OMS (Organisation mondiale de la santé ; WHO)

ont établi récemment des lignes directrices pour l’utilisation du terme « probiotiques » dans les

aliments et formulent la définition suivante : «micro-organismes vivants qui lorsqu’ils sont

administrés en quantités adéquates, exercent une action bénéfique sur la santé de l’hôte qui les

ingère» (FAO/OMS, 2002). La notion de probiotiques a été développée principalement grâce aux

travaux de Metchnikoff ayant suggéré que l’ingestion de bactéries lactiques vivantes accroît la

longévité en réduisant dans le tube digestif la population de bactéries putréfiantes ou produisant

des toxines (Metchnikoff, 1907).



9

4. Microorganismes probiotiques:

La consommation de probiotiques dans des aliments comme le yaourt date depuis plusieurs

années, ce n’est que dans les années 1900 que les scientifiques ont commencé à s’intéressés sur

les raisons de l’effet bénéfique qu’offrent ces complément alimentaires. Plusieurs genres

bactériens et de levures sont utilisés autant que probiotiques, notamment les genres de

Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Bifidobacterium, Enterococcus et Saccharomyces. Les

bactéries probiotiques ayant des propriétés désirables et les plus documentées sont : Lactobacillus

johnsonii La1, Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC 53103), Lactobacillus casei Shirota,

Lactobacillus acidophilus NCFG 1478, Lactobacillus reuteri et Bifidobacterium animalis Bb12

(Shah, 2007).

Tableau 1 : Lactobacilles utilisés dans les cultures probiotiques (Shah, 2007)

Espèces Souches

L. acidophilus

Lb. acidophilus

Lb. johnsonii

Lb. acidophilus

Lb. acidophilus

Lb. bulgaricus

Lb. lactis

Lb. casei Immunitans

Lb. plantarum

Lb. rhamnosus

Lb. rhamnosus

Lb. reuteri

Lb. rhamnosus

Lb. plantarum

Lb. reuteri

Lb. casei

Lb. paracasei

Lb. fermentum

Lb. Helveticus

LA-1/LA-5 (Chr. Hansen)

NCFM (Rhodia)

La1 (Nestlé)

DDS-1 (Nebraska Cultures)

SBT-2062 (Snow Brand Milk Products)

Lb12

L1A (Essum AB)

(Danone)

299v, Lp01

GG (Valio)

LB21 (Essum AB)

SD2112/MM2 (Biogaia)

271 (Probi AB)

(Probi AB)

SD2112 (aussi connu sous MM2)

Shirota (Yakult)

CRL 431 (Chr. Hansen)

RC-14 (Urex biotech)

B02



10

4.1. Les bactéries lactiques:

Les bactéries lactiques forment un groupe hétérogène d’organismes Gram positifs, non sporulants

et qui fermentent les sucres pour produire de l’acide lactique. Leur habilité à réduire le pH par la

production d’acide issue de leur métabolisme fermentatif conduit au développement de propriétés

organoleptiques très recherchées, à la prévention de la croissance de microorganismes pathogènes

et à l’élaboration d’un produit final sain (Durlu-Ozkaya et al., 2001). Leur utilisation est apparue,

depuis des millénaires, dans la fabrication des aliments comme les fromages, les charcuteries, les

boissons fermentées, le pain au levain, les sauces, les saumures, les légumes fermentés, les

ensilages etc. Elles permettent, de part leur métabolisme, d'augmenter la durée de conservation

d'origine des denrées et leur confèrent une saveur et une texture différente (Badis et al., 2006). Les

bactéries lactiques sont considérées comme des microorganismes non pathogènes. Cela dit, ce

groupe peut jouer le rôle de pathogène opportuniste chez des patients immunodépressifs, des

patients longuement hospitalisés ou des patients ayant subis des interventions chirurgicales (Svec

et al., 2007). Mais dans une autre étude, Adams a conclu que la consommation de bactéries

lactique ne représenté aucun risque pour la santé humaine (Jonkers et Stockbrügger, 2007).

Depuis longtemps les bactéries lactiques sont devenues les principaux candidats probiotiques et

bénéficient d’un statut GRAS (Generally Regarded As Safe) (Belgnaoui, 2006).

4.1.1. Les lactocoques:

Le genre Lactococcus correspond au groupe des streptocoques lactiques de Sherman (1937) dont

la principale espèce est Lactococcus lactis (Lc. lactis sp). Par définition, le genre Lactoccoccus est

formé de bactéries à Gram positif dont les cellules, en forme de coques, sont associées par paires

ou en chaînettes de longueur variable. Elles sont dépourvues de catalase et ne sont pas capables

d’utiliser l’oxygène mais se multiplient en sa présence (anaérobies aérotolérantes). Parmi, les Lc.

lactis sp, deux sous espèces et un biovariant prédominent en fermentation laitière: Lc. lactis subsp.

lactis (Lc. lactis), Lc. lactis subsp. cremoris (Lc. cremoris) et Lc. lactis subsp. lactis biovar.

diacetylactis (Lc. diacetylactis). Le groupe des levains mésophiles, auquel les lactocoques

appartiennent, est le premier à avoir fait l’objet de sélection et de production pour l’industrie

laitière. Les souches sont sélectionnées pour leur aptitude à acidifier le lait, à travers leur

métabolisme homofermentaire, et former des arômes. Leur température optimale de croissance

s’étend de 25 à 35°C, respectivement pour les souches de Lc. cremoris et Lc. lactis. Les

lactocoques sont capables de croître à 10°C mais pas à une température supérieure à 40°C.

(Grattepanche, 2005). Etant non considérés comme des habitants naturels de la flore intestinale



11

chez l’humain, seulement quelques études ont été entreprises sur les propriétés probiotiques du

genre Lactococcus. Mais dans ce contraste, d’autres recherches ont démontré qu’il était possible

aux lactocoques d’être présents dans le tractus gastro-intestinal humain. Depuis, le genre

Lactococcus est largement utilisé dans les cultures starter des industries agroalimentaires, ceci

fondé sur les propriétés probiotiques de ce genre et que ça pourrait mener à l’élaboration de

nouveaux produits probiotiques (Kimoto et al., 1999).

Figure 2 : Lactococcus lactis subsp lactis au microscope électronique. Une barre représente 1µm (Kimoto et al.,

1999).

4.1.2. Les propionibactéries:

Les propionibactéries lactiques regroupent les espèces suivantes : Propionibacterium

freudenreichii, P. jensenii, P. acidopropionici et P. thoenii ont montrés un effet probiotique

comme la production d’acide propionique, de bactériocines, de vitamine B12, la synthèse de β-

galactosidase, la stimulation de la croissance des bifidobactéries réduction de la production

d’enzymes intestinales impliquées dans la production de substances cancérigènes, et des effets

favorables dans le métabolisme des lipides et dans la réponse immunitaire (Perez-Chaia et al.,

1995). Seulement quelques souches de propionibactéries lactiques ont été sélectionnées pour leur

propriété d’adhésion aux cellules intestinales (Huang et Adams, 2003)



12

.

Figure 3 : Observation au microscope électronique du genre Propionibacterium. Une barre représente 2µm (Huang et

Adams, 2003)

4.1.3. Les bifidobactéries:

Les bifidobactéries sont des bâtonnets aux formes variées dont la plus caractéristique est une

forme en Y. Les bifidobactéries sont non sporulées, à Gram-positif, hétérofermentaires,

anaérobies strictes. Leurs conditions optimales de croissance se situent à des températures entre

37°C et 41°C et à des pH compris entre 6,5 et 7,0. Les bifidobactéries sont hétérofermentaires et

dégradent les hexoses en produisant de l’acide lactique et acétique dans un ratio molaire de 2:3

(Scardovi, 1986). Une approche multiphasique est souvent utilisée pour identifier des

bifidobactéries. Cette approche comprend la présence d’une activité fructose-6-phosphoketolase

(F6PPK), une enzyme clé du genre Bifidobacterium (Ventura et al., 2004b et Gagnon, 2007). Les

bifidobactéries, ayant des effets probiotiques et utilisées commercialement, sont moins

nombreuses que les lactobacilles. La souche la plus étudiée est Bifidobacterium lactis Bb12

(Prioult, 2003). Le genre Bifidobacterium est le genre majeur du tractus intestinal humain et il

représente 25% des microorganismes cultivables de ce même tractus (Sghir et al., 1998).



13

Figure 4 : Observation au microscope électronique du genre Bifidobacterium sp. Une barre représente 2µm (Gagnon,

2007)

5. Présentation du genre Lactobacillus:

Le genre Lactobacillus représnte le plus large groupe des bactéries lactiques, il contient le plus

grand nombre d’éspeces qui peuvent êtres isolées de differents biotopes (humains, animaux,

plantes…etc) (Stilles et Holzapfel, 1997). Le genre Lactobacillus contient un assemblage divers

de 140 espèces avec des aspects variés allant du bacille long et fin au coccobacille en passant par

la forme bâtonnet court ou légèrement flexueux. Ils sont Gram positif, non sporulés, fréquemment

associés en chaînettes et habituellement immobiles. Les lactobacilles se montrent généralement

plus résistants au stress acide que les lactocoques (Siegumfeldt et al., 2000 et Singh et al., 2009).

Cette différence pourrait s’expliquer par un pH optimal plus faible pour l’enzyme chargée de

réguler le pH intracellulaire (translocation de protons par une ATPase) chez les lactobacilles. Le

métabolisme des sucres chez Lactobacillus est hétéro- ou homofermentaire. Certaines souches

sont thermophiles, d’autres mésophiles(Nannen et al., 1991). Les espèces homofermentaires

strictes fermentent les hexoses en acide lactique en utilisant la voie EMP (Embden-Meyerhoff

Parnas), ils ne fermentent ni les pentoses ni le gluconate, ils appartiennent aux espèces Lb

delbruekii subsp bulgaricus, Lb. delbruekii subsp. lactis et Lb. helveticus et on les trouve

généralement dans les cultures starters. Ils sont thermophiles (45°C) et thermorésistants (Law et

Haandrikman, 1997). L’autre groupe renferme l’espèce de Lb. acidophilus et Lb. casei, qui ne

sont pas connues pour être utilisées comme cultures starters mais qui sont très bien connues pour

les bienfaits qu’elles procurent autant que microorganismes probiotiques ainsi que pour leurs

utilisations dans l’affinage des fromages. Hétérofermentaires facultatives, ces lactobacilles

fermentent les hexoses en acide lactique ou en acide lactique, acétique, formique et éthanol quand



14

la quantité de glucose est limitée. Les pentoses sont fermentés en acide lactique et acétique via la

voie des pentoses phosphate (Carr et al., 2002). Les lactobacilles hétérofermentaires strictes

fermentent les hexoses ainsi que les pentoses en utilisant la voie des pentoses phosphate, ces

espèces peuvent causer des arômes indésirables et des formations de gaz durant l’affinage des

fromages, ils produisent des protéinases, des endopeptidases, des aminopeptidases, des

dipeptidases, des tripeptidases et des PSP (Proline-Spécifiques peptidases). L’espèces spécifique à

ce groupe est Lb kefir (Hassan et Frank, 2001).

Figure 5 : Observation au microscope électronique du genre Lactobacillus. Une barre représente 2µm (Gagnon,

2007)

Tableau 2 : Principales espèces et sous espèces de lactobacilles utilisées en industrie laitière. Lb. : Lactobacillus.

(Kandler et al., 1986)

Espèces Fermentation du

lactose

Croissance

A 15°C A 45°C

Lb. helveticus Homofermentaire - + Thermophile

Lb. delbruekii subsp. bulgaricus - +

Lb. delbruekii subsp. lactis - +

Lb. acidophilus - +

Lb. casei + - Mésophile

Lb. plantarum + -

Lb. kefiri Hétérofermentaire + -

Lb. brevis + -

Lb. fermentum - + Thermophile



15

5.1. Lactobacillus johnsonii (Fujisawa et al., 1992; Klein et al., 1998):

Lactobacillus johnsonii est une espèce d’origine humaine et son genome est le deusième à être

complètement séquencé, c’est une espèce microaérophile et homofermentaire stricte (Pridmore et

al., 2004). Cette epsèce est auxotrophe pour les acides aminés, les purines et pour plusieurs

cofacteurs, ce qui éxplique sa présence dans la partie supérieure du tractus gastro-intestinal où les

acides aminés et les peptides sont en quantités suffisantes pour sa croissance (Ventura et al.,

2004a). Lb. johnsonii est bien connue pour son activité probiotique, son genome possède des

gènes codants pour l’homéostasie du tractus gastro-intestina, pour les factreurs d’élongation et

pour la synthèse protéines qui contrent le choc thermique, ainsi que des gènes qui leur permettent

de s’adhérer à la muqueuse intestinale ou au cellules épitheliales et ceux qui codent probablement

pour des facteurs contribuants aux interaction avecl’ hote et des effets probiotiques (Granato et al.,

2004; Bergonzelli et al., 2006 et Claesson et al., 2007).

6. Potentiel probiotique et technologique des lactobacilles:

6.1. Propriétés technologiques des lactobacilles:

Les lactobacilles sont utilisés dans plusieurs domaines dont la manufacture des produits laitiers

comme cultures starters, ils participent aussi dans la fabrication du pain, les ensilages, et sont aussi

proposés comme biopréservant naturels dans les produits non fermentés (De Angellis et Gobetti,

2004). Leur métabolisme fermentaire leur permet, une fois, dans une produit donné d’abaisser le

pH de celui-ci. Par cette chute du pH l’aliment ce voie protégé du fait de l’inhibition des bactéries

putréfiantes, en plus de ça, les lactobacilles augmentent la valeur nutritive de l’aliment auquel

elles sont ajoutées ; ceci est du encor une fois à la production d’acide lactique qui par diminution

du pH provoque la libération des acides aminés essentiels et de vitamines (Slover et Danziger et

Danziger, 2008).

6.1.1. Affinage des fromages

L’affinage est étroitement relié à la production de protéases et d’autres enzymes. Ces enzymes

doivent êtres produits en quantité suffisante afin de libérer les différentes textures et le maximum

d’arômes attribués aux différents types de fromages. L’activité des peptidases est plus importante

que celle des protéinases (Visser et al., 1983). Par exemple, les peptidases des lactobacilles

utilisés en culture starter, hydrolysent les peptides (incluant ceux liés à l’arôme) en contribution



16

avec d’autres enzymes microbiennes, produisent un environnement idéal au développement d’un

arôme typique du cheddar (Trepanier et al., 1991 et Hassan et Frank, 2001).

6.1.2. Fabrication du yaourt

6.1.2.1. Acidification

Le yaourt est fabriqué grâce à l’association de Streptococcus thermophilus et de Lactobacillus

bulgaricus. Ces organismes croissent en symbiose qui en résulte une rapide acidification. La

présence de lactobacilles stimule la croissance de S. thermophilus en libérant des acides aminés et

des peptides de la caséine (Rajagopal et Sadine, 1990). En retour les streptocoques stimulent la

croissance des lactobacilles en absorbant l’oxygène, en abaissant le pH et en produisant de l’acide

formique et du pyruvate (Radke-Mitchell et Sandine, 1984). Certains yaourts contiennent en plus

de ces deux microorganismes, d’autres bactéries qui peuvent intervenir soit pour l’arômatisation,

soit pour la texture (points discutés ultérieurement), soit autant que compléments afin de rendre

l’aliment fonctionnel ces bactéries probiotiques interviennent dans l’établissement d’un équilibre

de la flore intestinale du consommateur, en peut en citer : Lb. acidophilus, Lb. casei, Lb.

rhamnosus et Lb. johnsonii. L’incorporation de bactéries probiotiques se fait dans différents

produits agroalimentaires, mais l’industrie laitière reste la plus utilisée autant que véhicule pour

l’administration de probiotiques, et le yaourt représente l’élément far de ce groupe (Lourens-

Hatting et Viljeon 2001; Tamime et al., 2005 et Damini et al., 2007)

6.1.2.2. Arômatisation

L’arôme idéal d’un yaourt est un mélange équilibré de l’acidité et de l’acétaldéhyde. Ce processus

est réalisé lors de la sélection des souches, de l’équilibre entre les bacilles et les cocci et lors du

contrôle de la fermentation. La source principale de l’acétaldéhyde provient de la conversion de la

théorine en acétaldéhyde, cette réaction est catalysée par la théroine aldolase de Lb. delbruekii

subsp bulgaricus (Hickey et al., 1983). Certains lactobacilles comme Lb. acidophilus, produisent

de l’alcool déshydrogénase, cette dernière convertie l’acétaldéhyde en éthanol (Marshall et Cole,

1983).



17

6.1.2.3. Texture

Le yaourt a une texture qui est déterminée par le traitement thermique sur la matrice du lait de

base et par les cultures starter (Sodini et al., 2004 et Damini et al., 2007). La texture d’un yaourt

est la résultante d’une interaction complexe entre les protéines du lait, sont acidité et entre les

polysaccharides exocellulaires produites par les cultures starter (Hassan et al., 1995). Les

propriétés les plus recherchées sont la finesse, la douceur et la viscosité. Les cultures starter

peuvent influencer chacune de ces propriétés par la production d’exopolysaccharides, ces

dernières sont produites soit sous forme de fibres soit sous, forme de capsules (Ariga et al., 1992).

6.1.3. Biopréservation des aliments

De par leur métabolisme, les lactobacilles agissent comme éléments protecteurs de la qualité

hygiénique et sanitaire de l’aliment qu’ils colonisent et ainsi augmenter la durée de vie de celui-ci.

Cette protection s’effectue soit grâce à la production d’acides organiques qui en réduisant le pH

du milieu inhibent la plupart des bactéries pathogène dont la majorité est neutrophile, soit par

compétition pour les nutriments ou soit grâce à la production de substances dites bactériocines

(Mami, 2007).

6.2. Métabolismes des lactobacilles:

6.2.1. Métabolisme des sucres

Comme il est mentionné plus haut, les lactobacilles utilisent généralement pour le métabolisme

des sucres soit la voie d’Embden-Meyerhof Parnas (EMP) soit la voie des pentoses-phosphate. La

première, et peut-être la plus importante étape consiste dans le transport des carbohydrates jusqu’à

la membrane cytoplasmique et leur accumulation ultérieur au niveau du cytoplasme. Cela dit, la

plupart des cultures starter ne possèdent pas de système phosphotransférase (PTS) pour le

métabolisme du lactose, et son contraints d’utiliser un système lactose perméase/β-galactosidase

(lac-Prem/β-gal) pour le métabolisme de ce sucre (Hutkins, 2001).



18

Figure 6 : Voie de la glycolyse relative à l’utilisation du glucose chez les bactéries lactiques (voie d’Embden-

Meyerhof Parnas). (Grattepanche, 2005)

Certaines espèces de Lactobacillus, comme Lb. casei, possèdent les deux systèmes (PTS et lac-

Perm/β-gal. Le tableau résume les différents systèmes de transport quelques espèces de

lactobacilles (Grossiord et al., 1998).



19

Figure 7 : Représentation des différents systèmes de transport chez les lactobacilles (Grattepanche, 2005)

Il est important de souligner que les espèces qui utilisent le système lac-Prem/β-gal ne laissent pas

le galactose à l’état libre, elles le fermentent réduisant ainsi la production d’arômes indésirables.

Pour certains lactobacilles qui transportent le lactose via le système PTS, le galactose-6-phosphate

(G-6-P) résultant de l’hydrolyse du lactose-phosphate par la phospho-β-galactosidase, est

directement utilisé par la voie du tagatose (Hutkins, 2001). Quand le galactose s’accumule dans le

cytoplasme par la galactose perméase, il est enfin incorporé dans la voie de Leloir, qui

phosphoryle le galactose, celui-ci est ensuite converti de galactose-1-P en galactose-6-P et rentre

directement dans la glycolyse (de Vos, 1996 et Hutkins, 2001).



20

Figure 8 : Voie des pentoses phosphates (Hutkins, 2001)



21

Figures 9 : Voie du tagatose (à gauche) et voie de Leloir (à droite) (Hutkins, 2001)

Tableau 3 : Différents systèmes de transport des sucres chez certains lactobacilles (Hutkins, 2001)

Souches Système de transport du lactose Voie d’utilisation du galactose

Lb. delbruekii subsp

bulgaricus

lactose-perméase Leloir

Lb. helveticus lactose-perméase Leloir

Lb. casei PTS, lactose-perméase Leloir, tagatose



22

6.2.2. Activité protéolytique

Les lactobacilles sont auxotrophes à plusieurs acides aminés et doivent obtenir les acides aminés

nécessaires du milieu où ils croissent. La quantité d’acides aminés et de peptides de petit poids

moléculaire présents dans le lait ne suffisent pas à une grande densité microbienne, et pour contrer

cela, les espèces du genre Lactobacillus ont besoin d’un système de protéolyse pour tirer le

maximum d’acides aminés de la caséine (Pritchard et Coolbear, 1993 ; Chen et J. Steele, 2004). A

l’inverse des lactocoques, le système de protéolyse des lactobacilles est très peut étudier.

Toutefois, les voies métaboliques empruntées par ces deux genres bactériens semblent

relativement proches (Pritchard et Coolbear, 1993). La protéolyse est cependant plus prononcée

pour les lactobacilles (Marilley et Casey, 2004). L’intérêt porté à l’étude de l’activité

protéolytique des lactobacilles s’est développé rapidement, ceci est dû à la découverte de plusieurs

espèces de ce genre considérées comme des cultures non-starter dans différents fromages à pâte

dure (Fira et al., 2001). L’activité protéolytique peut se résumer en trois points essentiels. Le

premier consiste en l’hydrolyse de la caséine en une large collection de peptides. Dans la seconde

étape, les peptides sont transportés dans la cellule par l’un des plus importants systèmes de

transport. Une fois à l’intérieur, les peptides sont ensuite hydrolysés par un large groupe de

peptidases en acides aminés libres qui seront soit métabolisés en protéines, soit assimilé (Hutkins,

2001).



23

-

Figure 10 : Système de protéolyse des lactobacilles (Grattepanche, 2005)



24

6.3. Propriétés probiotiques des lactobacilles:

Les lactobacilles d’importants colonisateurs de la flore digestive de l’homme et des animaux. Les

preuves qui ont impliquées ce genre bactérien dans de nombreux rôles bénéfiques ne manquent

pas, ont peut en citer la stimulation immune, l’exclusion des pathogènes entériques et la

production de peptides et d’enzymes actives, et diverses opportunités furent entreprises afin

d’incorporer les espèces de ce genre bactérien dans les aliments fonctionnels (Klaenhammer,

1995). L’habitat originel des espèces du genre Lactobacillus a un grand impacte sur leur sélection

au tant que bactéries probiotiques (Kandler et Weiss, 1986). Les lactobacilles présentent des effets

inhibiteurs envers les entéropathogènes (Drago et al., 1997), celles en particulier qui sont utilisées

comme probiotiques, possèdent un grand pouvoir antagoniste envers les Gram-positifs

(Lactobacillus sp, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus ; Ten Brink et al., 1994 ;

Staphylococcus sp., Mami et al., 2008), les Gram-négatifs (Escherichia coli, Suskovic et al.,

1997) et sur les champignons (Candida sp et Fusarium sp Suskovic et al., 1997 et Lavermiococca

et al., 2003). L’activité antimicrobienne est due à la production de plusieurs métabolites on peut

en citer : les acides organiques et leurs dérivés (L’acide phenyllactique et l’acide 4-hydroxy-

phenyllactique, Lavermiococca et al., 2000), le dioxyde de carbone, l’éthanol, le diacétyle, la

reuterine (De Vuyst et Vandamme, 1994) et la reutericycline (Messens et De Vuyst, 2002).

L’inhibition peut aussi se faire grâce aux bactériocines qui sont des protéines excrétées par les

bactéries et qui sont fréquemment mais pas toujours reliées à la souche productrice (Chumchalovà

et al., 2004). Entre autre plusieurs études suggèrent que l’adhésion des lactobacilles à la muqueuse

intestinale prévient l’attachement des pathogènes et stimule leur élimination du tractus intestinal

en cas d’infection (Fernandez et al., 2002).

6.3.1. Diminution des diarrhées associées à l’antibiothérapie

Les diarrhées associées à l’antibiothérapie ou DAA ont une grande importance épidémiologique,

et affectent une large portion des populations du monde. Les DAA sont un effet secondaire de la

consommation à court ou à long terme d’antibiotiques. Dans les cas récents, l’influence négative

de l’antibiothérapie sur la microflore intestinale est acceptée comme le principal mécanisme

(Cremonini et al., 2002).Plusieurs études se concentrent sur les effets que pourraient avoir les

probiotiques sur les DAA. Les résultats apportés par certains scientifiques ont clairement prouvé

des diminutions dans les incidences des DAA par quelques espèces de Lactobacillus (Jonkers et

Stockbrügger, 2007). Les probiotiques peuvent prévenir et restaurer les déséquilibres dus à



25

l’antibiothérapie, et leur utilisation au tant qu’agent traitant contre les DAA présente un très grand

intérêt. Plusieurs souches probiotiques ont été utilisées dans cette voie, comme par exemple :

Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus GG, les résultats ont montrés une diminution

de l’incidence des diarrhées de 0-10% (Koning et al., 2008).

6.3.2. Amélioration de la digestion du lactose

Plusieurs personnes soufrent d’une intolérance au lactose due à un déficit congénital en enzyme β-

galactosidase résultant à une incompétence à digérer le lactose. Cela dit ces mêmes personnes

peuvent assimiler le lactose présent dans le yaourt mieux que celui contenu dans le lait (Fuller,

1989). Cette assimilation peut s’expliquer par l’hydrolyse du lactose par les lactobacilles

probiotiques durant leur métabolisme fermentaire (Salminen et al., 2003). L’action bénéfique

résulte de la présence de β-galactosidase dans les cellules bactériennes (Gilliland, 2001). On peut

en déduire donc que cet effet est plus métabolique que dû à l’action d’une biomasse vivante, mais

les propriétés spécifiques des probiotiques peuvent influencer cette action : certains probiotiques

utilisent rapidement le lactose, d’autres ont une forte activité lactasique (Salminen et al., 2003).

Quand les bactéries probiotiques sont assimilées au niveau de l’intestin, elles interagissent avec la

bile qui augmente la perméabilité membranaire de ces mêmes bactéries, et de ce fait permettre au

substrat d’être hydrolysé (Gilliland, 2001). Ces propriétés attestent aussi sur l’aptitude des

probiotiques à réduire les symptômes d’une intolérance au lactose (Marteau et al., 2001 et

Salminen et al., 2003).

6.3.3. Inhibition des bactéries pathogènes

La plupart des bactéries entériques infectent l’hôte dans différentes conditions atmosphériques du

tractus gastro-intestinal, causant ainsi des diarrhées et d’autres symptômes. Salmonella sp et

Clostridium difficile causent des inflammations du colon et de l’iléum Shigella sp quand à elle

préfère la muqueuse colique (Dupont, 2005). Certains lactobacilles inhibent dans différents essais

la croissance de Listeria monocytogenes (Wilson et al., 2004). Une des plus importante propriété

des lactobacilles probiotiques est leur pouvoir de réduire et de prévenir les infections du tractus

gastro-intestinal (Hutt et al., 2006). L’habilité des espèces du genre Lactobacillus à inhiber

plusieurs variétés de bactéries Gram positives ou Gram négatives est mieux connue. Cette

inhibition est due soit à la production d’acides organiques, de peroxyde d’hydrogène ou de

bactériocines (Fernández et al., 2003). Ces bactériocines sont des substances ayants au moins une

partie protéique, sécrétées par les lactobacilles ou par d’autres bactéries phylogénitiquement



26

proches (Klaenhammer, 1988). Jusqu’à maintenant, quatre classes de bactériocines ont été

identifiées : les lantibiotiques (classe I), les non lantibiotiques (classe II), les peptides à haut poids

moléculaire (classe III) et les complexes glyco-lipoprotéines (classe IV) (Klaenhammer, 1993 ;

Hernandez et al., 2005 et Mami, 2007). Mais d’autres études ont confirmées que l’adhésion de ces

mêmes bactéries à la muqueuse intestinale empêcherait l’attachement de bactéries pathogènes par

compétition sur le substrat (Fernandez et al., 2002 et Valenzuela et al., 2008). Récemment, des

espèces du genre Lactobacillus ont données des résultats intéressants concernant l’inhibition de

l’attachement d’Helicobacter pylori sur les cellules gastriques. Une administration de lactobacilles

peut prévenir ou traiter complètement une infection à H. pylori (Sheu et al., 2002). En plus de

l’inhibition envers les bactéries entéropathogènes citées, certains Lactobacillus exercent un grand

pouvoir inhibiteur envers des staphylocoques à coagulase négative et Staphylococcus aureus, mais

aussi sur d’autres pathogènes comme Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis et

Escherichia coli (Pham et al., 2009). Les lactobacilles probiotiques ont aussi montés des résultats

concluants dans la prévention et l’éradication de vaginoses. Dans une étude de Kohler et Reid en

2005, a démontré qu’une culture mixte de Candida albicans avec Lb. rhamnosus conduit à

l’expression du gène de stress et diminue l’expression du gène de filamentation du champignon,

des facteurs très importants dans la virulence de la candidose (Reid et al., 2005).

6.3.4. Effets sur l’immunité systémique et intestinale

Les systèmes immunitaires spécifiques et non spécifiques n’ont pas atteint leur maturité au

moment de la naissance. La colonisation du tube digestif par la flore intestinale est un stimulus

essentiel impliqué dans la maturation des réponses immunitaires. Toutefois, l’impact spécifique de

chaque espèce est encore mal connu. Les probiotiques ont rapidement été identifiés comme

potentiellement actif sur ces paramètres. Plusieurs travaux montrent l’impact du probiotique

Lactobacillus rhamnosus GG sur la réponse post-vaccinale d’Ig A sécrétoires (Rochat, 2004). Les

parois des espèces de Lactobacillus probiotiques stimulent les monocytes macrophages via le

TLR-2. Il existe en effet une augmentation de la réponse des macrophages en présence d’acides

lipoteichoïques, composant des membranes de bactéries Gram (+). Les cellules mononuclées

périphériques humaines, stimulées par Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei,

Lactobacillus acidophilus, ou Lactobacillus helveticus sécrètent de l’IL1β, du TNFα et de l’IFNγ

(Heyman et Heuvelin, 2006). Les propriétés immunologiques des probiotiques ont été largement

étudiées, certains Lactobacillus tels que Lb. casei, Lb. rhamnosus et Lb. plantarum augmentent

considérablement l’immunité systémique de la muqueuse (Perdigon et al., 2001). Ces mêmes



27

souches, par leur adhérence à la muqueuse intestinale stimulent les cellules phagocytaires plus

efficacement que d’autres bactéries. Dans une étude, il est démontré que l’administration de

lactobacilles agissait sur la sécrétion de TNFα, d’IFNγ et d’IL-12, ainsi que sur la régulation des

cytokines (IL-4 et IL-10). Certaines espèces encore induisent l’immunité sécrétoire sélective,

d’autres aussi augmentent la réponse inflammatoire intestinale (Maldonado Galdeano et Perdigon,

2004). Une bactériothérapie orale à base de probiotiques réduirait significativement les

symptômes d’une inflammation allergique par réduction des marqueurs d’inflammation locale et

systémique en cas de dermatites atopiques (Viljanen et al., 2005). Récemment, une étude de

Kalliomäki et al, à déterminé l’effet de l’administration du probiotique Lactobacillus rhamnosus

GG à des mères avec des antécédents de dermatites atopiques, en pré et post-accouchement a

montrée des résultats probants contre le développement de cette maladie (Roessler et al., 2007).

6.3.5. Action sur le syndrome d’irritabilité intestinale chronique

Le syndrome d’inflammation intestinale chronique résulte d’un disfonctionnement dans le tractus

gastro-intestinal, qui se manifeste par des douleurs abdominales, des ballonnements, des diarrhées

ou des constipations. La consommation de lactobacilles probiotiques peut changer la composition

et l’activité métabolique de la flore intestinale par la production d’acides gras à chaines courtes et

de gaz. Plus encore, ils affectent la mobilité intestinale et exercent un effet anti-inflammatoire

réduisant par cet effet les symptômes de ce syndrome (Jonkers et Stockbrügger, 2007). Des études

menées à l’aide de Lactobacillus plantarum en addition avec Lb. rhamnosus GG et Lb. reuteri à

montrer des résultats prometteurs concernant les symptômes de cette irritabilité (Kajander et al.,

2007). Les derniers mécanisme connus à cet effet sont l’induction de contractions propulsives,

l’accélération du transit, ou la modification de l’absorption de fluide et de sodium dans le colon

(Kim et al., 2005).

6.3.6. Réduction des allergies alimentaires

L’administration de probiotiques modifie fortement l’environnement intestinal, que ce soit sur la

flore endogène ou sur la sécrétion de cytokines (Paganelli et al., 2002). Le mécanisme possible

par lequel les probiotiques diminuent la réponse inflammatoire lors d’une allergie induit leur effet

sur les défenses non-immunologiques et immunologiques du tractus digestif ce qui modifie la

dégradation des allergènes alimentaires (Kirjavainen et al., 1999). L’effet stimulant des bactéries

probiotiques sur les macrophages, les cellules dentiriques, les éosinophiles, les neutrophiles les

cellules NK et M et l’activation des récepteurs Toll-like induit une production d’acide nitrique et

une résistance aux inflammations de la muqueuse, promouvoit la maturation des IgA plasmatiques



28

et facilite l’induction de la tolérance orale aux antigènes alimentaires. L’association de Lb.

bulgaricus et de Lb. acidophilus réduirait la fréquence des allergies alimentaires (Paganelli et al.,

2002).Les bactéries probiotiques sont importantes dans la réduction de l’inflammation associée

aux réactions d’hypersensitivités chez les sujets atteints d’allergies alimentaires (Isolauri et al.,

2000). Aussi, certains lactobacilles probiotiques peuvent augmenter l’effet barrière de la flore

endogène et diminuer l’inflammation intestinale et de ce fait apporter des outils aidant le

traitement des allergies alimentaires (Kalliomaki et Isolauri, 2004). D’autres probiotiques plus

spécifiques soulagent certains symptômes d’allergies alimentaires comme ceux associés aux

protéines du lait, probablement en dégradant ces dernières en petits peptides et en acides aminés

(Parvez et al., 2006). Il est clairement démontré que Lb. gasseri a un effet stimulant sur les IL-12

produites par les splenocytes ainsi qu’un effet régulateur des IgE par établissement d’un équilibre

entre les Th1 et Th2, ce qui pourrait être un index important dans l’évaluation du pouvoir

antiallergique des lactobacilles probiotiques (Sashihara et al., 2007).

6.3.7. Effet anticancérigène

L’activité anticancérigène ou antimutagène est attribuée à plusieurs souches utilisées en industrie

laitière. Ceci représente un autre effet bénéfique en ce qui concerne les lactobacilles probiotiques.

Plusieurs études sur des sujets humains ont démontrés des effets non négligeables de lactobacilles

sur le contrôle du cancer du colon (Gilliland, 2001). Lb. acidophilus, Lb. casei Shirota et Lb.

rhamnosus GG ont montrés dans différentes études des aptitudes à réduire l’activité enzymatique

de la flore intestinale (Gill et Rowland, 2002). Ce phénomène peut l’activité enzymatique

cancérigène et avoir un effet bienfaisant sur le colon, la vessie et le tractus urinaire, ces effets sont

soit :

La modification de la microécologie intestinale.

Le changement de l’activité métabolique intestinale (diminution de la conversion de

métabolites percancérigènes ou cancérigènes).

La normalisation de la perméabilité (prévention ou diminution de l’absorption de toxines).

L’augmentation de l’immunité intestinale (augmentation de la résistance vis-à-vis des

produits chimiques, des inflammations et d’autres facteurs).

La fortification de l’effet barrière intestinal.

La supplémentassions en acide butyrique et folique (Salminen et al., 2003).

Plusieurs travaux ont mis en évidence une association inverse entre la consommation de produits

laitiers fermentés, en particulier yaourt et risque de tumeurs colorectales, cancers ou adénomes.



29

Cependant, d’autres effets que ceux propres des probiotiques peuvent expliquer ces associations.

En outre, l’apport en calcium a été associé à une diminution de risque de tumeurs colorectales.

Cependant, certaines études ont mis en évidence une association inverse spécifique entre risque de

tumeur et consommation de yaourt. Dans une étude témoin en France, les consommateurs

réguliers de yaourt avaient un risque divisé par deux de gros adénome, considéré comme à haut

risque de transformation maligne (Boutron-Ruault, 2007).

6.3.8. Effet sur la maladie de Crohn

La maladie de Crohn est une maladie intestinale chronique caractérisée par des périodes

d’activation et d’inactivation indéterminées. Les causes les plus probantes de cette maladie sont

dues à des bactéries infectantes de la lamina-propria, une baisse de la tolérance orale et à une

faiblesse de la fonction barrière de la muqueuse (Jonkers et Stockbrügger, 2007). Des études

cloniques préliminaires on prouvé que l’administration de probiotiques réduirait les effets de cette

maladie (Salminen et al., 2003).Une étude portant, sur l’administration de Lb. rhamnosus GG à

des sujets présentant une maladie de Crohn et traité a montré une augmentation des cellules

sécrétant des IgA dirigées contre des antigènes alimentaires (β-lactoglobuline et caséine)

suggérant un effet protecteur (Malin et al., 1996). Egalement, la culture organotypique de biopsies

coliques de malades a montré une diminution de la sécrétion de TNFα en présence de Lb. casei ou

de Lb. bulgaricus, suggérant également un effet protecteur (Prantera et al., 2002 et Heyman et

Heuvelin, 2006).

6.3.9. Effets sur les diarrhées à rota-virus et sur les diarrhées du voyageur

Les virus sont responsables d’un haut pourcentage de diarrhées chez les individus quelque soit le

groupe d’âge (DuPont, 2005). Parmi les entéropathogènes viraux, les norovirus, rota-virus et

astrovirus sont les trois causes les plus communes d’infections entériques virales dans les pays

développés (Gagnon, 2007). L’hypothèse que la diminution de la sévérité des diarrhées à rota-

virus étaient liées à une diminution de l’entrée des rota-virus dans l’intestin est due aux

modifications de la glycosylation de surface des cellules intestinales. Effectivement, lorsque des

cellules HT-29 MTX sont traitées par des probiotiques, leur niveau d’infection par rota-virus est

diminué de plus de 80% (Trugnan, 2003). La plupart des études concernant l’utilisation de Lb.

rhamnosus GG dans la prévention de diarrhées à rota-virus ont vues des diminutions de la durée

des diarrhées de 1 à 2 jours avec une augmentation des IgA et une diminution de l’entré de rota-

virus (Jonkers et Stockbrügger, 2007). La diarrhée du voyageur est la forme de diarrhées la plus

commune aux touristes américains et européens qui voyagent dans certains pays d’Afrique et



30

d’Asie. Les recherches menées en vue de soulager ces sujets de cette maladie sont revenues très

prometteuses, car ces mêmes personnes ont révélé être soulagées après une consommation de Lb.

rhamnosus en combination avec Lb. acidophilus (Salminen et al., 2003).

6.3.10. Réduction du cholestérol sérique

La concentration du cholestérol sérique est le facteur majeur dans les maladies cardiaques, et

l’augmentation de sa concentration surtout en ce qui concerne le LDL-cholestérol est étroitement

liée à l’augmentation du risque de cette maladie (Liong et Shah, 2006). Une alimentation à base de

lait fermenté supplée de probiotiques administrée à des personnes souffrant

d’hypercholestérolémie a eue pour résultante la diminution de la concentration de 3g à 1,5g. Lb.

acidophilus est connue pour son utilisation du cholestérol durant sa croissance rendant ce dernier

inabsorbable par la matrice sanguine (Shah, 2007). Ces mêmes résultats sont observés pour Lb.

johnsonii (Gilliland, 2001).

7. Critères de sélection des probiotiques:

Pour qu’un lactobacille (ou tout autre microorganisme) puisse être considéré comme probiotique,

et afin qu’il puisse intervenir dans le bon fonctionnement du tractus digestif de l’hôte, il faut qu’il

atteigne la muqueuse intestinale à l’état vif (Holzapfel, 2001). Dés l’administration, le

microorganisme doit franchir des barrières et des entraves constitutives du mécanisme de

digestion ou de défense de l’hôte. Plusieurs critères de sélections sont requis pour

l’authentification d’un probiotique, ces critères englobent : l’origine humaine et la non-

pathogenèse ainsi que les aspects technologiques et fonctionnels (Saarela et al., 2000 et Annuk et

al., 2002). Les points critiques de sélection d’un microorganisme probiotiques se résument donc

comme suit :

7.1. Critère de salubrité

Les espèces du genre Lactobacillus appartiennent au groupe de microorganismes reconnus pour

être sains (generally regarded as safe ou GRAS) de part leur origine mais aussi par leur

application dans des produits agroalimentaires (Tuohy et al., 2006 et Vesterlund et al., 2007).Ils

procurent plusieurs bienfaits à l’organisme de l’hôte qui les hébergent et sont généralement

considérés comme des bactéries non-pathogènes ou seulement comme pathogènes opportunistes

surtout dans leur aptitude à provoquer des caries dentaires (Slover et Danziger et Danziger 2008).

Seulement quelques cas ont été répertoriés concernant la pathogénèse des lactobacilles (Cannon et



31

al., 2005). Les cas cités par la littérature mettent en évidence quelques cas d’endocardites ou

d’infections (Bernardeau et al., 2008).

7.2. Habilité à survivre dans les produits agroalimentaires et durant le stockage

Du point de vue technologique, les souches probiotiques doivent posséder plusieurs qualités telles

que la facilité à être cultivée à de hautes densités cellulaires tout en conservant leurs propriétés

biologiques et leur stabilité au cours des procédés de production et d’entreposage (Champagne et

al., 2005). À ce titre, de nouvelles technologies permettant de produire des souches probiotiques à

haute viabilité et fonctionnalité sont actuellement disponibles (Lacroix et Yildirim, 2007 ;

Gagnon, 2007). Les souches probiotiques de Lactobacillus sont véhiculées via des produits

alimentaires, le plus commun étant le yaourt (Tamime et al., 2005). Plusieurs problèmes se posent

dans ces cas, incluent l’oxygène, les degrés d’acidité, la présence d’autres microorganisme et la

température (Temmerman, 2003 et Damin et al., 2007). Les concentration élevées d’oxygène

dissout dans le process de fabrication des yaourts est un agent limitant dans la viabilité des

lactobacilles probiotiques qui sont connus pour être des microaérophiles, ceci dit, l’utilisation de

Streptococcus thermophilus dans ce même produit élimine une bonne partie de cet oxygène et

ainsi protège ces bactéries (Lourens-Hattingh et Viljoen 2001).Entre autre, l’utilisation de l’acide

ascorbique comme adjuvant aide aussi dans la préservation des espèces de Lactobacillus en

réduisant le potentiel redox (Shah et al., 1995 et Talwalkar et al., 2004).

7.3. Capacité à survivre au transite gastrique

Pour gagner l’intestin, un microorganisme probiotique doit impérativement franchir l’estomac qui

constitue une imposante barrière (Morelli, 2007). Après le stresse acide de l’estomac, les

microorganismes probiotiques sont mélangés dans de la bile et dans le jus pancréatique qui

contiennent des sels biliaires et des enzymes pancréatiques affectant sévèrement la viabilité de ces

bactéries (Shima et al., 2009). Plusieurs études ont démontrées le pouvoir de certaines souches de

Lactobacillus à résister au stresses du transite digestif, ce pouvoir est dû certainement à leur

origine humaine mais aussi grâce à la protection qu’offrent les aliments dans lesquels ils sont

adjuvés (Ross et al., 2005).



32

7.4. Adhérence aux cellules intestinales

L’adhésion des microorganismes probiotiques à la muqueuse intestinale est l’un des caractères le

plus important pour que ces derniers puissent accomplir leurs bienfaits (Ouwehand et al., 1999).

Des études pionnières de Reid et al en 1985 et 1987, ont démontrés expérimentalement que des

espèces de lactobacilles d’origine humaine ont la propriété d’adhérer à l’épithélium intestinal

(Servin et Coconnier, 2003). Cette propriété est la résultante d’une interaction entre des protéines

de surfaces présentes chez les lactobacilles (Lectin-like proteins) et les cellules épithéliales de la

muqueuse intestinale (Saito, 2004).



32

1. Introduction:

L’utilisation du lait de chamelle au niveau des régions arides remonte depuis des lustres. Ces

propriétés bienfaisantes ne sont guère contestées et font l’objet de plusieurs recherches tant qu’au

niveau biochimique qu’au niveau microbiologique (Benkerroum et al., 2004). Notre travail

consiste en l’évaluation des potentiels probiotiques et technologique des lactobacilles du lait de

chamelle nous avons sélectionné quelques espèces du genre Lactobacillus isolées de ce même lait.

Les démarches expérimentales sont réalisées au niveau du Laboratoire de Microbiologie

Appliquée, du Département de Biologie, Faculté des Sciences, Université d’Oran.

2. Isolement des lactobacilles:

Après enrichissement en incubant le lait cru de chamelle à 37°C pendant 24h, des suspensions de

dilution décimales et centièmes ont été préparées pour atteindre 10-9

UFC/ml. Trois dilutions

seront utilisées : 10-6

, 10-7

et 10-9

. L’ensemencement se fait en profondeur et nécessite un milieu

MRS (De Man et al., 1960) à pH 5,4 (Badis et al., 2006). On utilise trois séries de boites pour

chaque dilution. La méthode consiste à verser un volume de 1ml de la dilution dans chaque boite,

à couler le milieu en surfusion et à homogénéiser en effectuant des 8. Après solidification des

milieux, les boites de Petri sont incubées à 30°C pendant 24h à 48h (Carr et al., 2002). En ce qui

concerne les souches Lb4 et Lb10, leur isolement est réalisé en utilisant un MRS modifié (sans

KH2PO4) se qui nous permet d'obtenir des forme de bacilles sans passé par les étapes de

purification contrairement aux autres souches.

Figure 11: Procédure d'isolement en profondeur



33

3. Provenance des souches bactériennes:

Les bactéries pathogènes (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25921,

Pseudomonas sp imip R, Vibrio cholerae et Salmonella sp) proviennent de la collection du

laboratoire de microbiologie du centre hospitalier universitaire d’Oran. Les souches de

Lactobacillus delbruekii subsp. bulgaricus et Streptococcus thermophilus sont isolées d’un yaourt

produit localement.

4. Purification et ré-identification des espèces:

Parmi les souches choisies nous avons sélectionnés la souche A4 (Lb. johnsonii) pour poursuivre

les différents tests. Le choix de cette espèce est fondé sur son potentiel autan que probiotique mais

aussi sur sa performance inhibitrice. Nous l’avons tout de même comparé avec les autres souches

de la collection sur le plan inhibiteur et pour le potentiel probiotique mais aussi avec les souches

isolées du yaourt pour les propriétés technologiques.

Pour la purification des espèces bactériennes nous avons fait des successions d’ensemencements

du MRS liquide au MRS solide le pH des deux milieux étant de 5,4± 0,2 il nous permet d’obtenir

des cultures pures de lactobacilles vu que les espèces de ce genre sont connues pour leur caractère

acidophile (Carr et al., 2002).

4.1. Test de catalase:

Les espèces du genre Lactobacillus sont déficientes en catalase, cela dit, le système NAD va

capter les hydrogènes du H2O2 jouant ainsi le rôle d'une pseudo-catalase et permettant aux espèces

de ce genre de réduire les effets de ce métabolite. Ce test nous permet par le dépôt d’une goutte de

peroxyde d’hydrogène sur une colonie de confirmer la production de cette enzyme par une

réaction d’effervescence (Larpent et Larpent, 1990).

4.2. Test du type fermentaire:

En utilisant un milieu MRS glucosé dans des tubes contenants des cloches de Durham on peut

distinguer les espèces homofermentaires des hétérofermentaires. Cette différence s’explique par la

façon dont chaque souche métabolise le glucose, soit en suivant la voie EMP soit d’autres voies

(les détails sont illustrés dans la partie bibliographique) (Carr et al., 2002).



34

4.3. Test de croissance à différentes concentrations de NaCl:

On utilise pour ce test des milieux MRS à 4% et 8% de NaCl dans lesquels on ensemence la

souche bactérienne. Il nous permet de déterminer la résistance de la dite souche au stresse halin

(Larpent et al., 1990 et Samelis et al., 1994).

4.4. Test de croissance à différentes température et de thermorésistance:

Ces tests nous permettent d’évaluer l’aptitude d’une espèce bactérienne à croitre dans une large

gamme de températures. En ensemence de la suspension bactérienne dans un milieu MRS et on

incube les tubes à 15°C, 30°C et à 45°C. La lecture des résultats ce fait après 18h pour les deux

derniers et pendant une semaine pour le test de 15°C. Pour la thermorésistance, on fait chauffer la

suspension bactérienne pendant 10 min à 63,5°C puis en incube à 30°C (Bottazzi, 1988 ; De

Roissart et Luquet, 1994).

4.5. Test de l’ADH:

Le test consiste en un ensemencement de la souche sur un milieu M16 BCP solide à pH 7. Les

réactions observées sont un virement de couleur du milieu vers la couleur jaune après 18h qui

s’explique par l’acidification de ce dernier, puis après 48h d’incubation, le milieu réalcalinisé par

l’hydrolyse de l’arginine retrouvera sa couleur originelle si l’espèce possède l’enzyme sinon il

restera jaune dans le cas contraire (Thomas, 1973).

4.6. Test du profil fermentaire:

C’est pour ainsi dire le test confirmatif de l’espèce mais aussi le test clé. Il consiste en une

centrifugation de la culture jeune à 5000 trs/min pendant 5 min, on récupère le culot auquel on fait

un lavage au tampon phosphate pour éliminé les résidus de milieu et pour équilibrer le pH à 7,

s’en suit une deuxième centrifugation à 3000 trs/min pendant 3 min. Le culot final est inondé par

2 ml de MRS BCP sans sucre et à pH 7. Le mélange enfin est distribué sur une série de tubes

contenants du MRS BCP plus un sucre donné à raison de 1% (Klein et al., 1998 et Stiles et

Holzapfel, 1997).



35

5. Etude du potentiel probiotique:

Des 11 souches de Lactobacillus nous avons choisis 4 : 5, 6, A3 et A4 (respectivement : Lb. casei,

Lb. rhamnosus, Lb. pontis et Lb. johnsonii) pour lesquels on a fait subir des traitements qui

résument à peut prés le cours que peut suivre un microorganisme probiotique durant son passage

dans le tractus digestif

5.1. Résistance aux sucs gastriques:

Pour le traitement aux sucs gastriques dont la composition est indiquée dans l’annexe, nous avons

suivi le protocole établi par les auteurs tout en détaillant les paramètres du temps et de la

concentration microbienne. Aux densités de 0,4 ; 0,5 ; 0,6 ; 0,7 et 0,8 nous avons inoculés après

centrifugation à 7000 tours/min pendant 1 minute 500µl de sucs gastriques de synthèse à pH 2

pendant des durées de 30 min, 1h00, 1h30 et 2h00 (Fernandez et al., 2002 et Kim et al., 2006).

5.2. Résistance aux sels biliaires:

Suite au précédent traitement, les souches sont ensuite centrifugées à la même vitesse et pendant

1min. Le culot est tout de suite inondé avec 500µl de MRS additionné à 5% de sels biliaires et à

pH 8,5 pour créer le maximum de stresse aux cellules microbiennes et de ce fait obtenir un résultat

qui pourrait justifier l’administration de ces souches comme probiotiques pour l’homme. Les

durées de traitement sont toujours respectées (Shima et al., 2009).

5.3. Résistance aux enzymes pancréatiques:

On récolte le culot après centrifugation à 7000 trs/min lequel est lavé au tampon phosphate puis

recentrifugé cette fois à 5000 trs/min pendant 1min. Le culot final est inoculé de 500µl de MRS à

0,1% de trypsine et d’α-chymotrypsine à pH 7 (Kim et al., 2006 et Ruiz-Moyano et al., 2008).

Les temps d’incubation sont respectés pour chaque traitement et la température est maintenue à

37°C. Après le dernier traitement, la souche est centrifugée à 7000 trs/min pendant 1 min, lavée au

tampon phosphate puis centrifugée à 5000 trs/min pendant 1 min. Le culot final est additionné à

500 µl d’eau physiologique et on effectue des dilutions de l’ordre de 1/100 jusqu’à la dilution 10-8

que l’on ensemence en profondeur dans un milieu MRS à pH 7 et qu’on incube à 37°C.



36

5.4. Pouvoir inhibiteur:

Nous avons confronté les 11 souches de bactéries lactiques de la collection avec Staphylococcus

aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25921, Pseudomonas sp imip R, Vibrio cholerae et

Salmonella sp. Le principe de cette méthode consiste en une confrontation directe entre les

souches lactiques ensemencées sur milieu MRS tamponné versus chaque souche pathogène

ensemencée sur milieu MH semi-solide en double couche. Par diffusion de la substance inhibitrice

on obtient une zone claire d’inhibition que l’on mesure pour évaluer le potentiel inhibiteur de la

souche. L’utilisation du MRS tamponné est facultative mais permet de restreindre le champ sur la

nature de la substance inhibitrice (Fleming et al., 1975 et Allende et al., 2007).

6. Etude des propriétés technologiques :

6.1. Etude de la cinétique d’acidité en milieu lait :

Nous avons utilisés pour l’étude de la cinétique de croissance deux laits écrémés, l’un sans extrait

de levure et le deuxième qui en contient. La mesure de cette activité est effectuée en pH mètrie et

en degrés Dornic. La méthode consiste à ensemencer 100 µl de la souche dans 10 ml de lait

écrémé, on effectue des lectures toutes les 2h. Pour la mesure en °D, il suffit de disperser 5 gouttes

de phénolphtaléine dans le mélange et de titrer du NaOH 1/9 à l’aide d’une burette sachant que 1

°D=VNaOH × 10 (Bourgeois et al, 1996 et Mami, 2007).

Figure 12: Instruments pour la mesure de l’acidité dornic titrable (Mami, 2007).



37

La vitesse maximale d'acidification est exprimée en unités de pH par min se calcule en divisant la

valeur du pH à laquelle correspond la fin de la phase exponentielle de croissance par le temps de

cette même valeur

Vmax= UpH/temps. (De Souza Oliveira et al., 2009)

6.2. Etude de la cinétique de croissance en milieu lait:

Nous avons respecté la même comparaison concernant les milieux lait pour l’étude de la cinétique

de croissance ainsi que la même méthodologie d’ensemencement, la seul différence est que toutes

les 2h on effectue des dilutions de l’ordre de 10-7

, 10-8

et 10-9

que l’on ensemence en profondeur

sur milieu MRS. On ensemence deux boites par dilution pour être conforme à la méthode de

dénombrement en milieu solide (Kihal et al., 1996).

La détermination du taux de croissance qui représente le nombre de cellules divisées par heur se

fait comme suit:

µ=n/t=log Nt – logN0/0.301 t

n= log Nt – logN0/0.301

µ= log Nt – logN0/0.301 t (Mami, 2007)

Tandis que pour le temps de génération ou le temps que met une cellule à ce diviser ce calcule

comme suit:

G= 1/µ

6.3. Métabolisme du citrate:

On ensemence les souches sur milieu citrate de Simmons puis on incube à 30°C pendant 24h, la

réaction positive se manifeste par une coloration bleue des colonies Cit+ sinon elles restent

blanchâtres en cas ou l’espèce ne métabolisme pas le citrate (Cit-). La coloration des colonies est

due réaction entre les ions et le bleu de bromothymol (Kempler et Mc Kay, 1980).



38

6.4. Production d’acétoïne:

La production d’acétoïne est testée sur milieu Clark et Lubs. En effectuant sur celui-ci, après 24h

d’incubation la réaction de Voges-Proskaeur (VP). Dans un tube à essai, 5ml de cette culture sont

transvasés, 0,5 ml de réactif α- naphtol à 6% dans l’alcool absolu (VP1) et 0,5 ml d’une solution

de soude (NaOH) à 16% dans l’eau distillée (VP2). On agite soigneusement les tubes et on laisse

5 à 10 min à température ambiante. Le test positif se traduit par l’apparition d’un anneau rose à la

surface du milieu, après 10 min (Fil, 1996). A titre de comparaison nous avons suivit deux

méthodes, l'une consistant en un ensemencement de 1 ml de la culture jeune dans le milieu Clark

et Lubs puis dépôts directs des réactifs VP1 et VP2. L'autre consiste en la démarche citée ci-

dessus.

6.5. Etude des interactions entre les souches lactiques et les bactéries du yaourt:

L’aptitude d’une souche probiotique à coexister avec les bactéries du yaourt ou à inhiber sa

croissance constitue des facteurs importants en ce qui concerne l’utilisation de cette dernière

comme adjuvant dans ce genre de produits. Nous avons confronté certaines souches lactiques de

la collection (Lb. casei, Lb. rhamnosus, Lb. pontis et Lb. johnsonii) avec Streptococcus

thermophilus et Lb. delbruekii subsp. bulgaricus en utilisant toujours la méthode directe, mis à

part deux modifications, l’une concernant l’utilisation d’un MRS non tamponné à pH 6,8 pour

l’ensemencement des souches lactiques et l’autre concernant la double couche de MRS molle au

lieu du MH 1/2 (Mami et al., 2008).

6.6. Evaluation de l’activité protéolytique:

Nous avons utilisé pour ce test des milieux PCA à différentes concentrations de lait écrémé (1%,

2% et 3%). La méthode consiste à ensemencer les souches lactiques sur les milieux par la

technique des multipoints et à incuber le tout à 30°C pendant 24h. Le résultat attendu est un halo

de protéolyse au tour de la colonie bactérienne dont on mesure le diamètre pour évaluer l’intensité

de cette action (Moulay et al., 2006).



39

7. Conservation des souches:

7.1. Conservation à court terme:

La conservation à court terme des isolats purifiés, est réalisée par ensemencement sur gélose

inclinée. Après incubation à 28C° pendant 18 heures on verse une quantité de glycérol sur la

crème bactérienne pour ralentir d'une part leur métabolisme en association avec la température et

comme moyen de protection contre les changements de températures, les tubes sont placés à

(+4°C), où ils peuvent être conservés pour plusieurs semaines. On l'utilise généralement pour

prévenir d'éventuelles contaminations des cultures, ou dans le cas de pertes des souches (Kihal et

al., 1996).

7.2. Conservation à longs terme:

Pour une conservation à long terme, les cultures pures sont centrifugées à 5000 trs/min pendant 5

min, elles sont lavées au tampon phosphate puis recentrifugées à 3000 trs/min pendant 3 min. Les

culots sont maintenus en suspension dans un milieu contenant 10% de lait écrémé (enrichie par

0,05% d’extrait de levure) et 30% de glycérol déposées à une température de (–20°C). Au fur et à

mesure des besoins, les cultures sont décongelées rapidement et repiquées dans du lait deux fois

avant l’utilisation (Samelis et al, 1994). Cette méthode nous permet d'avoir une collection de

souches que l'on peut utilisée à volonté suivant la nécessité de l'étude.

Résultats et discussion



40

1. Souches bactériennes:

Nous avons choisi ces espèces du fait de leur hétérogénéité mais aussi du fait de leur capacité à

inhiber un large spectre de bactéries indésirables. Leur identification est effectuée grâce aux

méthodes classiques établies par les différents auteurs. Ces méthodes nous permettent d'avoir un

avant gout sur l'authentification des souches en vue d'établir des identifications moléculaires.

Nous nous sommes cela dit focaliser sur la souche A4 pour les tests probiotiques et

technologiques. L'intérêt porté à cette souche est basé sur les données bibliographiques qui la

placent au rang de microorganisme bénéfique pour l'humain.

Tableau 4 : Principales souches utilisées durant nos travaux : Les rouges représentent les souches utilisées pour les

tests probiotiques et les bleues celles utilisées pour l’étude des interactions

Souche Genre et espèce Provenance et origine

3 Lb. pontis Lait de chamelle

5 Lb. casei Lait de chamelle

6 Lb. rhamnosus Lait de chamelle

8 Lb. johnsonii Lait de chamelle

A1 Lb. johnsonii Lait de chamelle


A3 Lb. pontis Lait de chamelle


68 Lb. rhamnosus Lait de chèvre

Lb4 Lb. sp Lait de chamelle

Lb10 Lb. sp Lait de chamelle

St1 Streptococcus thermophilus Yaourt Danone

Ldb1 Lb. delbruekii subsp bulgaricus Yaourt Danone

Staph Staphylococcus aureus CHUO ATCC 25923

E coli Escherichia coli CHUO ATCC 25921

Ps imip R Pseudomonas sp imip R CHUO Patient

V cholerae Vibrio cholerae CHUO Patient

Salm Salmonella sp CHUO Patient



41

2. Aspects des souches lactiques dans les différents milieux:

Figure 13° : Aspects des colonies en profondeur (à gauche) et en surface (à droite)

Lorsqu'elles sont isolées les espèces de lactobacilles apparaissent généralement sous forme de

colonies lenticulaires brunâtres facilement repérables. En surface par contre, elles apparaissent

sous forme de colonies blanchâtres à bords arrondis et nets, elles dégagent aussi une odeur très

particulière, semblable à celle des laits fermentés due à la production d'acide lactique.

Figure 14° : Aspect des souches issues des cultures pures en milieu liquide

Pour s'assurer de la pureté d'une souche de lactobacille il faut que le milieu soit dense en dessous

et clair au dessus. La différence entre les espèces reste l'aspect du trouble, il peut être soit

brumeux soit cotonneux. C'est très facilement détectable en remuant le tube légèrement en

formant de petits cercles.

Témoin -



42

3. Ré identification des espèces lactiques:

Tableau 5 : Différents test d’identification et leurs résultats respectifs.

ADH 4%

NaCl

8%

NaCl

Type fermentaire 15°C 30°C 45°C TR

A4 - + + Homofermentaire + + + +

Figure 15 : Résultats du test de l’ADH sur milieu M16 BCP

5 3

6 8

A3

A2 A1

A4 68

Lb4 Lb10

Halo

d’acidification du

milieu M16 BCP



43

Figure 16: Observation microscopique de la souche A4 au microscope optique (une barre représente 10 µm)

Tableau 6 : Résultats du profil fermentaire avec les différents sucres

Man

nose

Sac

char

ose

Lév

ulo

se

Sucr

ose

Rham

nose

Gal

acto

se

Xylo

se

Esc

uli

ne

Sorb

itole

Ara

bin

ose

Mal

tose

Fru

ctose

Lac

tose

Glu

cose

Raf

finose

A4 + + + + - + - - + + + + + -

Figure 17 : Résultats du profil fermentaire de la souche A4

Les tests de ré-identification effectués sur la souche A4 nous permettent de confirmer qu'elle

appartient à l'espèce de Lactobacillus johnsonii avec un pourcentage de fiabilité de 90% par

rapport aux références (Klein et al., 1998; Carr et al., 2002).

Mann Sacc Lév Sucr Rham Gal Xyl Esc Sor Ara Malt Fru Lac Gluc Raff

10 µm



44

4. Evaluation du potentiel probiotique:

4.1. Résistance aux stresses acide, basique et aux enzymes pancréatiques

Tableau 7 : Les concentrations microbiennes auxquelles correspondes les DO utilisées dans les tests probiotiques

DO Concentration ufc/ml Log ufc/ml

0,4 8,7 × 108 8,93

0,5 1,7 × 109 9,23

0,6 2,1 × 109 9,32

0,7 2,9 × 109 9,46

0,8 3,4 × 109 9,53



45

Tableau 8 : résume les résultats du dit test concernant la résistance ou non des souches aux différents traitements. Les

concentrations sont obtenues après dénombrement sur milieu solide.

30 min 1h00 1h30 2h00

ufc/ml Log ufc/ml Log ufc/ml log ufc/ml log

5 0,4 1,02 × 108 8 9,4 × 10

7 7,97 8,7 × 10

7 7,93 7,4 × 10

7 7,86

0,5 1,5 × 108 8,1 1,4 × 10

8 8,14 1,3 × 108 8,11 1,2 × 10

8 8,07

0,6 1,9 × 108 8,27 1,8 × 10

8 8,25 1,7 × 108 8,23 1,5 × 10

8 8,17

0,7 2,6 × 108 8,41 2,4 × 10

8 8,38 2,2 × 108 8,34 2,1 × 10

8 8,32

0,8 3,1 × 108 8,5 3,0 × 10

8 8,47 2,6 × 108 8,41 2,5 × 10

8 8,39

6 0,4 1,1 × 108 8,0 1,0 × 10

8 8 9,0 × 107 7,95 7,6 × 10

7 7,88

0,5 1,5 × 108 8,1 1,4 × 10

8 8,14 1,3 × 108 8,11 1,2 × 10

8 8,07

0,6 2,0 × 108 8,3 1,9 × 10

8 8,27 1,8 × 108 8,25 1,6 × 10

8 8,2

0,7 2,7 × 108 8,43 2,5 × 10

8 8,39 2,4 × 108 8,38 2,3 × 10

8 8,36

0,8 3,1 × 108 8,5 3,0 × 10

8 8,47 2,9 × 108 8,46 2,8 × 10

8 8,44

A3 0,4 0 0 0 0 0 0 0 0

0,5 0 0 0 0 0 0 0 0

0,6 0 0 0 0 0 0 0 0

0,7 0 0 0 0 0 0 0 0

0,8 0 0 0 0 0 0 0 0

A4 0,4 9,4 × 107 7,98 8,3 × 10

7 7,91 7,1 × 107 7,85 6,1 × 10

7 7,78

0,5 1,4 × 108 8,14 1,3 × 10

8 8,11 1,1 × 108 8,04 1,0× 10

8 8

0,6 1,9 × 108 8,27 1,8 × 10

8 8,25 1,7× 108 8,23 1,6 × 10

8 8,2

0,7 2,6 × 108 8,41 2,5 × 10

8 8,39 2,3 × 108 8,36 2,2 × 10

8 8,34

0,8 3,0 × 108 8,47 2,9 × 10

8 8,46 2,8 × 108 8,44 2,7 × 10

8 8,43



46

Figure 18 : Histogramme de comparaison entre les souches testées au niveau de leur résistance aux traitements

Les souches 5 et 6 utilisées dans notre cas comme éléments comparatif de résistance aux

différents traitements ont parfaitement répondues aux attentes, la souche A3 quand à elle n'est pas

répertoriées comme probiotique ce qui explique le fait qu'elle n'a résistée aux traitements. Vu que

les concentrations microbiennes de la souche A4 se situent légèrement au dessous de celles des

souches 5 et 6 nous pouvons la classée au rang de microorganisme probiotique. L'histogramme

montre les concentrations microbiennes représentées en log ufc/ml des souches testées en fonction

des densités de chaque souche et du temps.

Log ufc/ml



47

Résultats du test du pouvoir inhibiteur :

Figure19: Mise en évidence de l'inhibition de Salmonella sp par les bactéries lactiques de la collection

Figure 20: Mise en évidence de l'inhibition d' Escherichia coli par les bactéries lactiques de la collection

A2 A1

A4 68

Lb4 Lb10

5 3

6 8

A3

5 3

6 8

A3

A2 A1

A4 68

Lb4 Lb10

Halo d’inhibition



48

Figure 21: Mise en évidence de l'inhibition de Vibrio cholerae par les bactéries lactiques de la collection

Figure 22: Mise en évidence de l'inhibition de Staphylococcus aureus par les bactéries lactiques de la collection

A2 A1

A4 68

Lb4 Lb10

5 3

6 8

A3

A2 A1

A4 68

Lb4 Lb10

5 3

6 8

A3



49

Figure 23: Mise en évidence de l'inhibition de Pseudomonas sp imip R par les bactéries lactiques de la collection

Figure 24 : Histogramme de comparaison entre le pouvoir inhibiteur des différentes souches

0,95

1,2

0,7

1,2

0,95

1,35

1,15

1,5 1,5

0,95

1,2

1,54 1,55

1,1 1,1

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

Staphylococcus aureus

Escherichia coli Pseudomonas sp imip R

Vibrio cholerae Salmonella sp

3

5

6

8

A1

A2

A3

A4

68

Lb4

Lb10

5 3

6 8

A3

6 5 3

8 A1 A2

A3 A4 68



50

En comparaison avec les autres souches, la souche A4 montre un grand pouvoir inhibiteur envers

les souches pathogène de la collection. Contrairement à certaine souches qui sont plus actives sur

les Gram positifs, la souche A4 possède un pouvoir inhibiteur à spectre large et il est d'autant plus

grand sur Pseudomonas. sp. imipenème R. Ce qui peut expliquer les résultats émis par les auteurs

concernant l'inhibition d'Helicobacter pylori. L'histogramme montre la différence entre les

diamètres des zones d'inhibition exprimés en cm des différentes souches.

5. Evaluation des propriétés technologiques :

5.1. Cinétique de croissance en milieu lait :

Tableau 9 : Valeurs des cinétiques de croissance et d’acidité en milieu lait écrémé avec de l’extrait de levures

0h 2h 4h 6h 8h 10h 12h 14h 16h 18h 20h 24h 48h

log ufc/ml 8,99 9,29 9,43 9,54 9,71 9,84 10,69 10,68 10,68 10,66 9,84 9,79 9,73

pH 6,53 6,44 6,38 6,26 5,86 5,71 5,61 5,12 4,99 4,80 4,63 4,35 4,17

°D 28 30 38 40 47 60 66 70 83 85 89 105 125

Figure 25 : Courbe de cinétique de croissance (à gauche), valeurs de l'acidité en pH (à droite) et les valeurs de

l'acidité en °D (au centre)

8

8,5

9

9,5

10

10,5

11

0h 4h 8h 12h 16h 20h 48h

3

4

5

6

7

8

0h 4h 8h 12h 16h 20h 48h

0

20

40

60

80

100

120

140

0h 4h 8h 12h 16h 20h 48h

Temps

log ufc/ml

Temps

°D pH

Temps



51

Les graphiques montrent l'évolution de la croissance et de l'acidité en fonction du temps, on

remarque nettement les trois phases de croissance bactérienne et on peut expliquer l'absence de la

phase de latence par le fait que la souche étudié a une origine laitière donc elle n'a pas besoin de

s'acclimater au milieu utilisé pour l'étude.

Vmax= 4.17

2880 Vmax=1.44 10

-3 upH/min

µ=0.63

G=1h58min

Tableau 10 : Valeurs des cinétiques de croissance et d’acidité en milieu lait écrémé avec de l’extrait de levures

0h 2h 4h 6h 8h 10h 12h 14h 16h 18h 20h 24h 48h

log ufc/ml 8,99 9,14 9,25 9,32 9,36 9,43 9,55 9,70 9,73 9,85 9,87 10,68 10,67

pH 6,60 6,54 6,46 6,35 6,23 6,02 5,95 5,59 5,54 5,25 5,12 5,05 4,67

°D 20 24 28 30 34 37 41 48 51 57 60 65 70

Figure 26 : Courbe de cinétiques de croissance (à gauche), d’acidité en pH (à droite) et d’acidité en °D (au centre)

8,5

9

9,5

10

10,5

11

0h 4h 8h 12h 16h 20h 48h

4

4,5

5

5,5

6

6,5

7

0h 4h 8h 12h 16h 20h 48h

0

20

40

60

80

0h 4h 8h 12h 16h 20h 48h

Temps Temps Temps

°D pH log ufc/ml



52

Contrairement au milieu lait enrichi en extrait de levure, la croissance de la souche dans du lait

écrémé sans extrait de levure semble plus lente du fait qu'elle n'atteint la phase exponentielle

qu'après 20h d'incubation, on remarque aussi que l'activité acidifiante dépend aussi de ce facteur.

Du fait qu'elle n'atteint le pH coagulant (pH 5 ou 60 °D) qu'après 20h d'incubation.

Vmax= 4.67

2880 Vmax= 1.63 10

-3 upH/min

µ=0.12

G=8h33min

5.2. Métabolisme du citrate :

Figure 27 : Aspect des colonies sur milieu citrate de Simmons

Après 18h à 24h d'incubation on ne remarque aucune coloration des colonies de bactéries

lactiques, le fait qu'elles soient de couleur blanchâtre explique que ces espèces ne métabolisent pas

le citrate.

6 5

A4 A3

Colonie Cit-



53

5.3. Production d’acétoïne :

Figure 28 : Formation d’annaux rouges due à la production d’acétoïne

Les deux résultats montrés ci-dessus révèlent la production d'acétoïne par la souche A4 et que les

résultats son comparables que ce soit par ensemencement de la culture jeune dans le milieu Clark

et Lubs puis dépôts directs des réactifs VP1 et VP2, ou par ensemencement de la culture jeune

dans ce même milieux et dépôts des réactifs après 18h d'incubation.

5.4. Interactions avec les bactéries du yaourt :

Figure 29 : Interactions entre les souches lactiques avec Str. thermophilus (à gauche) et avec Lb. delbruekii subsp

bulgaricus

On remarque d'après les résultats des interactions entre les souches lactiques et les bactéries du

yaourt une inhibition de Lb. delbruekii subsp. bulgaricus très prononcées concernant la souche A4

par rapport aux autres souches. Cela dit, St. thermophilus ne subie pas cette effet on remarque

même une synergie entre cette espèce et les autres souches.

6 5

A4 A3

Réaction

positive de

production

d’acétoïne



54

5.5. Activité protéolytique :

Figure30 : Activité protéolytique des souches lactique sur milieu PCA 1% (à gauche), PCA 2% (au centre) et PCA

3% (à droite)

Tableau 11 : Diamètres en centimètres des halos de protéolyse des espèces respectives

PCA 1% PCA 2% PCA 3%

5 1,6 2 2,5

6 1,5 1,8 2,3

A3 1,9 2,2 3,1

A4 1,8 2,1 2,9

6 5

A4 A3

Halo de protéolyse



55

Figure 31 : Histogramme de comparaison entre les diamètres des halos de protéolyse

L'activité protéolytique d'après les résultats se montre proportionnelle à la concentration du milieu

PCA en lait écrémé. Ce qui tombe sous le sens que plus il y'a de caséine plus les halos de

protéolyses sont prononcés. Concernant maintenant la comparaison de cette activité entre les

souches lactiques, la souche A4 montre une activité protéolytique plus grande par rapport aux

souches 5 et 6, et légèrement inferieure à celle de la souche A3. L'histogramme montre la

comparaison entre les diamètres des halos de protéolyse en cm en fonction des concentrations des

milieux PCA en lait écrémé.

1,5

1,8

2,3

1,9

2,2

3,1

1,8

2,1

2,9

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

PCA 1% PCA 2% PCA 3%

5

6

A3

A4

cm

Discussion générale



56

Les espèces de bactéries lactiques détectées dépendent essentiellement de la nature du lait cru et

des conditions d’analyse (Guessas, 2007). Le lait de chamelle (Camelus dromedarius) est depuis

longtemps considéré comme un aliment thérapeutique par les habitants des régions arides. Il est

très bien protégé contre différents contaminants microbiens par des systèmes inhibiteurs naturels,

incluant le système LPS (lactoperoxydase/ thiocyanate/ peroxyde d’hydrogène), les lactoferrines,

les lysozymes, les immunoglobulines et les acides gras libres (Benkerroum et al., 2004). Le lait de

chamelle contient aussi une microflore variée qui constitue une deuxième ligne de défense par la

production d’acide lactique, de peroxyde d’hydrogène et de bactériocines (Konuspayeva et al.,

2003). Le lait de chamelle est abondamment colonisé par plusieurs espèces de lactobacilles,

Khedid et al en 2009 ont concluent après analyse de la flore du lait de chamelle des régions arides

du Maroc que le plus grand nombre d'espèces présentent dans les laits analysés appartenaient au

genre Lactobacillus. En comparaison par exemple au lait de chèvre ou au lait de vache qui sont

dominés par les lactocoques si ce n'est par les deux genres (Badis et al., 2004 et Badis et al.,

2006). Dans ce travail nous avons axé notre recherche sur le potentiel probiotique et

technologique de quelques espèces du genre Lactobacillus, plus particulièrement sur l’espèce la

plus dominante est Lactobacillus johnsonii isolées du lait cru de chamelle du sud-ouest Algérien.

Les tests de ré-identification de la souche A4 nous ont permis de confirmer que cette souche

appartient à l'espèce de Lactobacillus johnsonii, même si l'on à déjà identifier cette espèce

auparavant, il subsiste un doute concernant la stabilité de l'espèce surtout après une longue période

de conservation au froid (Damin et al., 2007). Aussi les variations de températures influent d'une

manière importante sur la stabilité de l'espèce, du fait que des altérations sur le génome bactérien

peuvent intervenir (Kurtmann et al., 2009). Concernant les résultats des tests, on remarque que la

souche A4 fait partie du groupe des thermobacteria vue qu'elle résiste à 63,5°C et qu'elle pousse à

une température de 45°C (Klein et al., 1998). Aussi elle est ADH- et homofermentative (Mami,

2007), mais aussi qu'elle tolère de fortes concentrations de NaCl (Carr et al., 2002) ce qui peut

placer cette souche au rang de microorganisme facilement inductible en industrie laitière vu que la

plupart de ces paramètres sont des facteurs limitants dans le cas de plusieurs lactobacilles (De

Angelis et Gobbetti, 2004).

Les résultats obtenus pour l'aptitude de la souche de Lb. johnsonii à résister aux stresses acide,

basique et enzymatique nous montrent clairement que cette espèce peut être considérée comme

microorganisme probiotique en comparaison avec les souches les plus étudiées dans ce domaine

qui sont Lb. casei (5) et Lb. rhamnosus (6) (Perea Velez et al., 2006). La concentration en fin des



57

traitements de la souche A4 égalent 8 log ufc/ml, sachant que d'après Salminen et al., 2006, la

concentration d'administration d'un microorganisme probiotique doit être de 107 ou 10

8 et que

d'après la définition de l'OMS un probiotique doit être administré à une concentration bien définie

pour qu'il puisse accomplir ces effets bénéfiques pour son hôte. Nous avons tout de même pris en

considération la souche Lb. pontis (A3) pour qu'elle serve comme témoin négatif, les résultats

attendus concordent parfaitement avec ceux obtenus par nos soins concernant la sensibilité de

cette souche vis-à-vis des différents traitements (Fernandez et al., 2002). En général, un

microorganisme probiotique n'est jamais administré sous forme de crème bactérienne, il est soit

adjuvé dans des produits agroalimentaires (Jus, yaourt… etc.) (Fuller, 1989 et Champagne et

Gardner, 2008) ou sous forme de capsules contenants ces microorganismes lyophilisés (Corcoran

et al., 2003). Ces méthodes permettent même si l'espèce considérée comme probiotique résiste à

l'environnement gastro-intestinal d'augmenter leurs chances d'arriver en quantité suffisante au

niveau de l'intestin (Pan et al., 2009).

L'aptitude de cette souche (Lb. johnsonii) à inhiber un large groupe de bactéries pathogènes est

confirmée par les résultats d'interactions entre les souches lactiques et les souches pathogènes

utilisées dans cette étude et qui sont Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas sp.

imip R, Vibrio cholerae et Salmonella sp. Le fait que ce test soit réalisé sur un milieu tamponné

nous oriente dans la direction de production de substances inhibitrice outre que l'acide lactique

(Benhammouche, 2005 et Guessas, 2007). Le choix des espèces pathogènes est basé sur leurs cites

d'infections, on retrouve généralement Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae et Salmonella sp

dans les cas d'intoxications ou de toxi-infections alimentaires, tandis que Escherichia coli et

Pseudomonas sp. imip R sont connues comme des germes uro-pathogènes. Dans leurs études

Annuk et al en 2002 et Fernandez et al en 2002, ils démontrent clairement que plusieurs espèces

de lactobacilles sont largement efficaces concernant l'inhibition de ces germes, et même contre des

germes sporulants (Mami, 2007) et d'autres plus ciblés comme Helicobacter pylori (Sheu et al.,

2002) et Listeria monocytogenes (Benhammouche, 2005 et Falgas et Makris, 2009).

On remarque concernant la production d'acide en milieu lait est plus importante quand le lait

écrémé est enrichi en extrait de levure. La souche A4 a atteint la valeur de coagulation en 14h

d'incubation contrairement au milieu lait écrémé sans extrait de levure où le pH coagulant n'est

atteint qu'après 20h d'incubation. Si on prend en compte les valeurs de pH égale à 5.12 et de 70 °D

par exemple, on remarque que ces données sont atteintes après 14h d'incubation pour le milieu lait

écrémé avec de l'extrait de levure, tandis que pour le deuxième milieu, elles ne sont atteintes



58

qu'après 20h et 48h d'incubation. Aussi on remarque que les valeurs du pH s'abaissent de façon

très rapide en ce qui consiste le milieu lait enrichit en extrait de levure par rapport à l'autre lait

écrémé, les Vmax comme on peut le remarquer sont de 1.44 10-3

upH/min pour 1.63 10-3

upH/min

respectivement (De Souza Oliveira et al., 2009). Si on compare ces résultats avec ceux de Moulay

et al en 2006 on trouve que la souche de Lb. johnsonii est plus acidifiante par rapport à Lc. lactis

subsp. lactis, vu que la Vmax de cette souche est de 4.75 10-2

upH/h tandis que celle de la souche

A4 est de 8.67 10-2

upH/h. Hekmat et al en 2009, ont pratiquement obtenu les mêmes résultats

lorsqu’ils ont mesuré l’acidification du lait par les souches de Lb. reuteri et Lb. rhamnosus.

Pour la cinétique de croissance en milieu lait on note comme pour la cinétique d'acidité une nette

différence entre les paramètres du milieu lait écrémé avec de l'extrait de levure et ceux du lait

écrémé sans extrait de levure. Cette différence ce situe au niveau de la vitesse de croissance de la

souche qui est de 0.63 pour le premier milieu et de 0.12 pour le second. C'est pour cela que l'on

note les trois phases de croissance de la souche pour le premier milieu au bout de 48h

d'incubation, mais pour le lait écrémé sans extrait de levure, c'est au bout de 48h d'incubation que

l'on note la phase stationnaire de croissance. Comparativement à Lb. plantarum (Mami, 2007) et à

Lc. lactis subsp lactis (Moulay et al., 2006) la souche de Lb. johnsonii à une croissance

relativement lente, cela dit elle est plus prononcé si on la compare à la croissance de Lb.

rhamnosus (Guessas, 2007).

Dans leur étude, De Souza Oliveira et al ont noté pratiquement les mêmes différences de l'activité

acidifiante et de l'aptitude de croitre normalement pour des microorganismes probiotiques dans

des laits écrémés sans source exogène d'acides aminés d'autres facteurs en comparant

l'acidification de laits écrémés simples avec celle de laits écrémés avec apport de substance

prébiotique.

La production de substances aromatiques par la souche A4 est notée en se basant sur la production

d'acétoïne (Benhammouche, 2005). Le métabolisme du citrate conduisant à la production du

diacétyle (Kihal et al., 1996 et Grattepanche, 2005) est malheureusement absente chez cette

souche.

Mais cette déficience est compensée par l'activité protéolytique de l'espèce de Lb. johnsonii. On

note des halos de protéolyse très prononcé par rapport à ceux des espèces de lactocoques étudié

par Moulay et al en 2006. Cette activité est la résultante de la déficience de cette espèce et comme

c'est le cas pour la majorité des lactobacilles en facteurs de croissance. C'est en hydrolysant les



59

protéines du lait que les différentes espèces de lactobacilles puisent le principale des peptides et

acides aminés nécessaires à leur croissance. La protéolyse est notamment très recherchée chez les

espèces de lactobacilles surtout dans l’industrie fromagère où ils sont utilisés (Irlinger et Mounier,

2009).

L'effet inhibiteur de la souche A4 envers Lb delbruekii subsp bulgaricus confirme le fait que les

substances inhibitrices produites par les espèces de lactobacilles se concentrent sur les espèces

phylogénitiquement proches de la souche productrice (Grattepanche, 2005). Dans une étude

partiellement similaire on remarque qu'il existe un antagonisme entre certaines souches de

lactobacilles (Mami, 2007).

En fin, on remarque que vis-à-vis de Streptococcus thermophilus la souche A4 stimule la

croissance de cette espèce sans doute en lui apportant les acides aminés et vitamines nécessaires à

sa croissance. C'est pour cela que l'on n'a noté aucune zone d'inhibition dans le test de

confrontation des souches lactiques avec l'espèce de St thermophilus.

Conclusion et perspectives



60

Les lactobacilles nous montrent à chaque étude effectuée des particularités très surprenantes les

unes que les autres. Ces bactéries d'origine laitière semblent compenser leur déficience en facteurs

de croissance par d'autres aptitudes qui servent au mieux leurs utilisateurs. Leur diversité et leur

hétérogénéité font que ce sont des microorganismes de la vie de touts les jours. Du fait qu'elles

participent dans de nombreuses réactions qui sont indispensables tant pour l'alimentation que pour

la santé humaine.

La tendance que prend les habitants du monde et surtout ceux des pays occidentaux sur les

aliments et les produits bio a fait naitre un grand intérêt concernant la santé humaine, depuis déjà

quelques années la priorité est donnée à la prévention plus qu'à la médication.

En plus de ces valeurs nutritives et thérapeutiques, le lait de chamelle comme nous l'avons fait

remarqué possède une flore riche, diversifiée et bienfaisante pour l'humain. Nous ferons remarqué

aussi que les habitants des régions arides et dont la nourriture est à base de lait de chamelle ont

une excellente forme physique et ne se plaignent que de quelques maladies seulement.

D'après les résultats que l'on a obtenus, on peut conclure sur le fait que l'espèce de Lactobacillus

johnsonii isolée du lait frais de chamelle peut être considérée comme microorganisme probiotique.

Du fait de sa résistance vis-à-vis des traitements de pH et enzymatiques. Cette souche à

parfaitement répondue aux attentes la concernant surtout sur le point de stabilité et même de

conservation des caractères surtout après plusieurs mois de conservation au froid. Il nous reste

maintenant à savoir sur quels points bénéfiques pour l'hôte va se concentré la souche étudié pour

cela nous projetons d'abord de confirmer l'aptitude de cette espèce à se fixer au niveau des cellules

épithéliales intestinales. Car nous rappelons que pour être actif, un microorganisme probiotique

doit avoir la particularité de s'adhérer au niveau de ces cellules. Puis l'étude se focalisera en

grande partie sur les effets bénéfiques de cette souche, que ce soit au niveau métabolique ou

thérapeutique.



61

Les propriétés technologiques de cette souche sont aussi très intéressantes. Durant les tests de ré-

identification elle montre des résistances vis-à-vis de grandes températures mais aussi à de hautes

concentrations de NaCl, qui sont des paramètres très recherchés en industrie alimentaire surtout

laitière mais aussi celle des saumures et autres produits requérant de fortes températures lors de la

fabrication ou de fortes concentrations salines lors de l'affinage ou du stockage. Les cinétiques de

croissance et d'acidité nous ont aussi permis d'avoir des précisions concernant la vitesse de

croissance mais aussi sur l'aptitude acidifiante de cette souche qui sont très recherchés en

fermentation industriel. L'inhibition de Lactobacillus delbruekii subsp bulgaricus joue un grand

rôle dans la texture d'un yaourt par exemple, le fait d'avoir de souches protéolytiques donnerai un

produit très dur et difficilement appréciable. Surtout que l'on à clairement noté la grande activité

protéolytique de la souche étudiée.

Enfin, nous espérons vivement approfondir les données de cette souche qui reste quand même très

peut étudiée, surtout au niveau de la stabilité des caractères mais aussi sur l'aptitude de cette

souche à produire en continu des métabolites industriels ou thérapeutiques.

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Index des milieux de cultures

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Milieu MRS (de Man Rogosa et Sharpe, 1960): Pour l’isolement des bactéries

lactiques

Extrait de levure 5g

Extrait de viande 10g

Peptone 10g

Acétate de sodium 5g

Citrate de sodium 2g

Glucose 20g

KH2PO4 2g

MgSO4 0,25g

MnSO4 0,05g

Agar 15g

Eau distillée q.s.p 1000ml

pH=6,8

Autoclavage : 120°C pendant 20 minutes

77

Milieu MRS BCP: Pour le test des sucres



Peptone 10g

Acétate de sodium 5g

Citrate de sodium 2g

Glucose 20g

KH2PO4 2g

MgSO4 0.25g

MnSO4 0.05g

Bromocrésol pourpre 0,025mg


pH=7


Bouillon nutritif: Pour les cultures jeunes des bactéries pathogènes



Peptone 5g

Chlorure de sodium 5g

Eau distillé q.s.p 1000ml

pH=7.4


78

Lait écrémé

Lait écrémé 100g

Extrait de levure 0.5g


pH=7

Autoclavage : 110 °C pendant 10 mn.

Eau physiologique: Pour les dilutions

Chlorure de sodium 8,5g

Peptone 0,5g


pH=7


Milieu Muller Hinton (Muller et Hinton, 1941): Pour les tests des interactions

Infusion de viande de bœuf 300ml

Peptone de caséine 17,5g

Amidon de mais 1,5g

Agar 17g

pH=7.4


79

Milieu M16 BCP (Thomas et al., 1973): Pour le test de l’ADH

Extrait de levure 2,5g


Lactose 2g

Biopolytone 5g

Peptone papaînique de soja 5g

Acide ascorbique 0,5g

Acétate de sodium 1,8g

L-Arginine 4g

Pourpre de bromocrésol 0,05g

Agar 10g

Eau distillée qsp 1000ml

pH 6,5,

Autoclavage 120°C pendant 20 min

Tampon phosphate

KH2PO4 13,697g

Na2HPO4 17,814g

Eau distillé q.s.p 1000ml


80

Sucs gastriques de synthèse (Fernandez et al., 2002)

Glucose 3,5g

NaCl 2,05g

KH2PO4 0,6g

CaCl2 0,11g

KCl 0,37g

Pepsine 13,3g


pH 2

Bain marie 100°C pendant 10 min

Sels biliaires (Fernandez et al., 2002)

MRS 1000ml

Sels biliaires 50g

pH 8,5


Enzymes pancréatiques

MRS 1000ml

Trypsine 100mg

α-chymotrypsine 100mg

pH 7


81

Citrate de Simmons

Citrate de Na 1g

Bleu de bromothymol 0,8g

NaCl 5g

Sulfate de Mg 0,2g

K2HPO4 1g

Dihydrogénophosphate d’ammonium 1g

Agar 15g


pH 7


Clark et Lubs

Peptone 5g

Glucose 5g

KH2PO4 5g


pH 7


PCA au lait écrémé

Peptone 5g

Extrait de levure 2,5g

Glucose 1g


pH 7


etude du potentiel probiotique et technologique des ...nabil. a mes adorables neveux et nièces :...

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