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ARTICLETECHNIQUES DE L’INGÉNIEURL’expertise technique et scientifique de référenceTechniques

de l'Ingénieur

p2645Spectrométrie de masse - Principe et appareillage

Date de publication : 12/09/2014 Par :

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Guy BOUCHOUX Professeur à l’université Paris XI (Orsay), École Polytechnique, DCMR, Palaiseau

Michel SABLIER Chargé de recherches au CNRS, École Polytechnique, DCMR, Palaiseau

Guy BOUCHOUX Professeur à l’université Paris XI (Orsay), École Polytechnique, DCMR, Palaiseau

Michel SABLIER Chargé de recherches au CNRS, École Polytechnique, DCMR, Palaiseau

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p3327 Analyse des lipides - Constituants mineurs, qualitéet authenticité

10/12/2015

Véronique OLLIVIER Ingénieure de laboratoire, responsable de la section d'analyse des corps gras végétaux, Servicecommun des laboratoires auprès de la DGCCRF et de la DGDDI, Laboratoire de Marseille, France

Denis OLLIVIER Directeur de laboratoire, responsable d'Unité, Service commun des laboratoires auprès de laDGCCRF et de la DGDDI, Laboratoire de Marseille, France

Jacques ARTAUD Professeur émérite, Aix-Marseille Université. LISA, EA4672, Équipe METICA, Marseille, France

Analyse des macromolécules biologiques

Techniques d'analyse Mesures - Analyses

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Analyse des lipides

Constituants mineurs,

Co

qualité et authenticité

par Véronique OLLIVIERIngénieure de laboratoire, responsable de la section d’analyse des corps gras végétauxService commun des laboratoires auprès de la DGCCRF et de la DGDDI, Laboratoire deMarseille, France

Denis OLLIVIERDirecteur de laboratoire, responsable d’UnitéService commun des laboratoires auprès de la DGCCRF et de la DGDDI, Laboratoire deMarseille, France

et Jacques ARTAUDProfesseur émériteAix-Marseille Université. LISA, EA4672, Équipe METICA, Marseille, France

es lipides, utilisés comme corps gras alimentaires ou industriels, sontconstitués d’un ensemble hétérogène de familles chimiques comportant

des triglycérides (triacylglycérols), des diglycérides, des monoglycérides,des phospholipides, des acides gras libres, des stérols, des esters de stérols,des alcools, des pigments (caroténoïdes, chlorophylles), des tocophérols, deshydrocarbures...

Les lipides biologiques comportent des triglycérides, des acides gras et desphospholipides mais aussi des lipides complexes tels que les phosphoglycé-rides, les sphingolipides, les glycolipides et les polycétides.

Les corps gras sont appelés « Huile » lorsqu’ils sont liquides à la températureambiante et « Graisse », suivie de l’indication animale ou végétale selonl’origine de l’extraction si elle solide (concrète) à la température de 15 °C(cf. réglementation en vigueur). Cet état physique différent provient de leurcomposition en acides gras. Les huiles sont plus riches en acides grasinsaturés que les graisses.

Les lipides sont une famille de composés essentiels à la vie au même titreque les glucides et les protides. Ils ont un rôle essentiel comme :

– constituants de la membrane cellulaire ;

1. Détermination des constituants mineurs ....................................... P 3 327 - 2

2. Paramètres de qualité .......................................................................... — 9

3. Contaminants ......................................................................................... — 10

4. Recherche de l’authenticité ............................................................... — 12

5. Différents référentiels de normes .................................................... — 15

6. Conclusion............................................................................................... — 16

7. Glossaire et sigles ................................................................................. — 16

Pour en savoir plus ........................................................................................ Doc. P 3 327

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– éléments nutritionnels ;– réserve d’énergie ;– isolant thermique...



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ANALYSE DES LIPIDES _______________________________________________________________________________________________________________

1 g de corps gras fournit 9 kcal ou 37,6 kJ.Les termes de corps gras ou de matières grasses sont plutôt réservés aux

triglycérides et désignent les huiles et graisses présentes dans les produitsalimentaires.

En fait, les corps gras sont un mélange complexe de lipides qui se classenten deux grands domaines :

– les composés saponifiables (90 à 98 %) réagissant avec un réactif alcalin(NaOH, KOH...) ;

– les composés insaponifiables (2 à 10 %) ne réagissant pas avec un réactifalcalin.

Cet article concerne principalement les composés insaponifiables. Il traite dufractionnement de l’insaponifiable et de l’analyse des différentes familles decomposés qui le constitue : stérols, alcools triterpéniques, hydrocarbures,tocophérols, cires, pigments et vitamines. Il aborde la détermination desparamètres de qualité ainsi que les contaminants. Il décrit les méthodes derecherche de l’authenticité.

La fraction saponifiable fait l’objet de l’article précédent [P 3 325]. Comme il

est d’usage dans la profession, les pourcentages indiqués sont, sauf précisioncontraire, massiques.

Un glossaire et un tableau de sigles sont donnés en fin d’article.

1. Déterminationdes constituants mineurs

1.1 Fractionnement de l’insaponifiable

Le corps gras est saponifié par de l’hydroxyde de potassiuméthanolique à ébullition. Après avoir rajouté de l’eau au contenuréactionnel, l’insaponifiable est extrait par de l’éther diéthylique oude l’hexane. Le solvant est évaporé, le résidu est pesé aprèsséchage.

L’existence de deux normes indiquant deux solvants d’extrac-tion différents est due à des conditions climatiques ou réglemen-taires qui ne permettent pas l’utilisation d’éther diéthylique :

– NF EN ISO 3596 (Corps gras d’origine animale et végétale –Détermination de la teneur en matières insaponifiables. Méthodepar extraction à l’oxyde diéthylique) ;

– NF EN ISO 18609 (Corps gras d’origine animale et végétale –Détermination de la teneur en matières insaponifiables – Méthodepar extraction à l’hexane).

Les deux méthodes ne sont pas applicables aux cires et, de

d’éthyle. La détermination de la teneur en insaponifiable est unélément de caractérisation d’un corps gras.

L’insaponifiable est fractionné par chromatographie planaire(CP) sur gel de silice. De nombreux systèmes de solvants peuventêtre utilisés : chloroforme-oxyde diéthylique 8-2 v/v, hexane-oxydediéthylique 7-3 v/v, hexane-acétate d’éthyle 8-2 v/v. Le fractionne-ment s’effectue généralement en fonction de la polarité décrois-sante des familles de composés.

L’échantillon est déposé sous forme d’une bande sur la largeurde la plaque (figure 1). Après développement, révélation et identi-fication des bandes, la silice correspondant aux familles decomposés à analyser est grattée puis extraite à l’aide de divers sol-vants (chloroforme, éther diéthylique, dichlorométhane). L’extraitest filtré, séché puis concentré par évaporation.

Le fractionnement peut aussi être réalisé par chromatographieliquide sur colonne de silice (à pression atmosphérique (CPL) ou àhaute pression (CLHP)) ou d’alumine (NF EN ISO 12228-1, cf. § 1.2).Une méthode par CLHP, automatisable, sur colonne de silice, per-met de fractionner l’insaponifiable à l’aide d’un mélange éluanthexane-isopropanol 99-1 v/v et d’une détection réfractométrique.Les composés élués sont récupérés à l’aide d’un collecteur defractions.

La fraction insaponifiable représente en général 2 à 10 %des corps gras. Elle est constituée d’un ensemble de famillesde composés chimiques (hydrocarbures, tocophérols, toco-triénols, phytostéroïdes, composés phénoliques, pigments...)comportant chacune un nombre plus ou moins important deconstituants. L’analyse des composants de chaque famillenécessite généralement un fractionnement préalable del’insaponifiable.

À titre d’exemple, les hydrocarbures (apolaire) ont un rapportfrontal Rf de 0,97 tandis que les stérols (polaire) ont un Rf de 0,25. Larévélation est effectuée par pulvérisation de dichloro-2,7-difluores-céine ou de rhodamine B qui ne réagissent pas avec les composés envue de leur analyse ultérieure.

Un exemple d’application est donné pour la séparation des stérolsdans la norme NF T60-254 (§ 1.2).

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façon plus générale, aux corps gras à teneurs élevées en matièresinsaponifiables. La méthode d’extraction à l’hexane donne desrésultats systématiquement plus faibles que la méthode à l’oxyde

La figure 2 montre un chromatogramme d’insaponifiable qui pré-sente l’avantage par rapport au fractionnement par CP de séparer les∆5 des ∆7-stérols.



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_______________________________________________________________________________________________________________ ANALYSE DES LIPIDES

1.2 Fraction stérolique

Les stérols constituent le dernier maillon de la filière triterpéni-que dont l’origine est le squalène. La composition stérolique est undes critères de caractérisation des corps gras. Les graisses anima-les contiennent le cholestérol comme stérol ultra-majoritaire(98 %) tandis que la fraction stérolique issue des lipides végétauxse compose de plusieurs ∆5-stérols parmi lesquels le β-sitostérolest généralement prépondérant. Ces ∆5-stérols sont généralementaccompagnés de ∆7-stérols. Toutefois, certaines familles botani-ques sont très riches en ∆7-stérols avec l’α-spinastérol comme sté-rol majoritaire (huile d’argan) (figure 3).

Les stérols sont des alcools triterpéniques tétracycliques(fonction hydroxyle sur le carbone 3) représentant 30 à 60 % del’insaponifiable.

Les stérols peuvent être analysés d’un point de vue qualitatif selonla norme NF T60-232 (Corps gras d’origine animale et végétale –Détermination de la composition de la fraction stérolique – Méthodepar chromatographie en phase gazeuse).

La teneur en stérols totaux peut être déterminée en chromato-graphie phase gazeuse CPG avec précision par la méthoded’étalonnage interne suivant les normes :

– NF T60-254 (Corps gras d’origine animale et végétale – Déter-mination de la composition de la fraction stérolique – Méthode parchromatographie en phase gazeuse avec isolement des stérolstotaux par HPLC) ;

– NF EN ISO 12228-1 (Corps gras d’origine animale et végétale –Détermination de la teneur en stérols individuels et totaux –Méthodes par chromatographie en phase gazeuse – Partie1) ;

– NF EN ISO 12228-2 (Huile d’olive et huile de grignons d’olive –Détermination de la composition et de la teneur en stérols et endialcools triterpéniques par chromatographie en phase gazeuse) ;

– NF T 60-249 [Corps gras d’origine animale et végétale –

Figure 1 – Fractionnement de l’insaponifiable par chromatographie planaire

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1 : front de solvant

2 : hydrocarbures

3 : tocophérols

4 : alcools triterpéniques

9 : ligne de dépôt

8 : dialcools triterpéniques5 : alcools aliphatiques

6 : méthyl-stérols

7 : stérols

Hydrocarbures Alcools

Temps

Stérols

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Dosage des faibles teneurs en cholestérol (étalon : solution debétulinol ou α-cholestanol introduite avant l’étape desaponification)].

Figure 2 – Fractionnement par chromatographie liquidesur une colonne de silice d’un insaponifiable d’huile de tournesol



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La teneur en stérols peut être aussi déterminée par méthodeenzymatique : oxydation enzymatique des stérols à l’aide d’unecholestérol oxydage, puis d’une catalase, formant un formal-déhyde. Le formaldéhyde réagit avec le pentane-2,4-dione pourformer de la luditine dosée par spectrométrie à 405 nm selon lanorme NF EN ISO 11702 (Corps gras d’origine animale et végétale.Détermination enzymatique de la teneur en stérols totaux).

Les stérols doivent être transformés en dérivés suffisammentvolatils pour être analysés par chromatographie en phase gazeuse.Les dérivés silylés et acétylés sont les plus couramment utilisés :

– triméthylsilyléther (TMS) obtenus à l’aide de réactifs silylantsanhydres ;

• mélange pyridine-hexaméthylsilasane-triméthylchlorosilane(2-1,8-1,2 v/v/v),

• bisilyltrifluoroacétamide-triméthylchlorosilane (90-10 v/v) ;

– acétates obtenus par microacétylation par le mélange pyri-dine-anhydride acétique (50-50 v/v).

Les colonnes capillaires de CPG ont des longueurs de 20 à 60 m.Les phases stationnaires sont soit des méthylpolysiloxanes (OV 1,SE 30 ou équivalent), soit des méthylphénylpolysiloxanes (SE 52,SE 54 ou équivalent). Les épaisseurs de film varient de 0,1 à0,3 µm. L’injecteur est de type injecteur diviseur (split). Ledétecteur est à ionisation de flamme.

Les différents stérols sont identifiés par le temps de rétentionrelatif exprimé par rapport au β-sitostérol, composé généralement

1.3 Alcools triterpéniquesLes alcools triterpéniques, les méthylstérols et les stérols se

séparent par chromatographie couche mince CCM lors du fraction-nement de l’insaponifiable (Rf des alcools triterpéniques, desméthylstérols légèrement supérieur à celui des stérols). Aprèsgrattage de la bande, extraction des constituants, ceux-ci sont déri-vés en triméthylsilyléthers, ou acétates, puis analysés en CPG dansles conditions voisines de celles de l’analyse des stérols.

Les dialcools triterpéniques (érythrodiol et uvaol) plus polairesque les stérols se séparent sur couche mince de silice (figure 1).Leur analyse présente un grand intérêt dans la caractérisation decertaines huiles alimentaires ou la recherche d’adultération oufalsification (grignons d’olive, pépins de raisin). Les analyses peu-vent être réalisées suivant la norme NF EN ISO 12228-2 (§ 1.2) ou lanorme du Conseil olécide international COI/T.20/Doc. n˚ 30 (Déter-mination de la composition et de la teneur des stérols et dialcoolstriterpéniques par chromatographie gazeuse sur colonne capillaire).

1.4 Hydrocarbures

Figure 3 – Formules des principaux

3

3 7

5

R

Campestérol

Cholestérol

Brassicastérol

Stigmastérol

24-Méthylène cholestérol

β-SitostérolHOO

HO

Formule

Formule

∆5-Avénatérol

∆7-stérol∆5-stérol

∆7-Stigmasténollll

∆7-Avénastérol

α-Spinastérol

Groupement R

R

Groupement R

a b

� �55 -- eett 77--ssttéérroollss

Les figures 4a et b, donnent les compositions stéroliques d’unehuile d’olive caractérisée par sa richesse en ∆5-stérols et d’une huiled’argan constituée principalement de ∆7-stérols.

Copyright © – Techniques de l’Ingénieur – Tous droits réservésP 3 327 – 4

majeur dans les huiles et graisses végétales, les graisses animalescontenant essentiellement du cholestérol. La composition stéroli-que des principales huiles végétales est donnée dans le tableau 1.

Les hydrocarbures sont obtenus après saponification et fraction-nement sur couche mince (figure 1) ou colonne de silice. Les hydro-



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Tableau 1 – Composition en stérols (en % sauf précision contraire) des principales huiles végétales

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Amande [4] < 0,05 < 0,05 2 à 4 1 à 2 80 10 à 12 1 à 2 1 à 2 266

Argan [5] < 0,4 3,2 à 5,7 34,0 à 44,0 44 à 49 4,0 à 7,0

Arachide [4] 0 à 3,8 0 à 0,2 12,0 à 19,8 18,2 à 20,0 55,0 à 70,0 0 à 1,0 0 à 0,3 0 à 0,3 100

Colza [3] 0,3 11,3 35,3 0,3 47,1 5,3 0,4 0 400 à 500

Colza [2] < 4 17 à 13 28 à 40 < 1 45 à 61 1 à 3 1 à 3 1 à 3 540 à 880

Colza [4] < 1,3 5,0 à 13,0 24,7 à 38,6 0,2 à 1,0 45,1 à 57,9 2,5 à 6,6 < 1,3 < 0,8 450 à 1 130

Noisette [3] < 1 < 0,5 4,5 à 7 0,5 à 1,5 82 à 88 2,5 à 4,5 1,0 à 2,5 0,5 à 6,0 80 à 190

Noisette [2] < 1 < 0,5 4 à 7 < 2 82 à 88 2 à 5 1 à 3 1 à 6 120 à 400

Lin [4] 1 à 2 0 à 1 28 à 29 9 à 10 44 à 53 10 à 13 1 à 4 < 1 200 à 410

Olive [4] < campé (app.) > 100

Palme [4] 2,6 à 6,7 – 18,7 à 27,5 8,5 à 13,9 50,2 à 62,1 0 à 2,8 0,2 à 2,4 0 à 5,1 27 à 80

Palmiste [4] 0,6 à 3,7 0 à 0,8 8,4 à 12,7 12,0 à 16,6 62,6 à 73,1 1,4 à 9,0 0 à 2,1 0 à 1,4 70 à 140

Pépin de raisin [4] < 0,5 < 0,2 7,5 à 14,0 7,5 à 12,0 64,0 à 70,0 1,0 à 3,5 0,5 à 3,5 0,5 à 1,5 200 à 700

Pépin de raisin [2] < 0,5 11,0 à 15,0 8,0 à 12,0 66,0 à 73,0 2,0 à 4,0 < 3,0 1,0 à 3,0 259 à 418 > 2,0

Pépin de raisin [3] < 0,3 0 10,7 à 14,6 7,7 à 10,5 < 0,2 65,8 à 73,2 1,7 à 4,1 0,6 à 2,4 1,2 à 2,8 280 à 410 3 à 4

Soja [3] 0 à 1,0 0 19,3 à 23,4 16,9 à 19,3 0 à 0,5 46,8 à 56,4 1,5 à 2,5 250 à 410

Soja [4] 0,2 à 1,4 < 0,3 15,8 à 24,2 14,9 à 19,1 47,0 à 60,0 1,5 à 3,7 1,4 à 5,2 1,0 à 4,6 180 à 450

Tournesol [4] < 0,7 < 0,2 6,5 à 13,0 6,0 à 13,0

0,5 à 1,1 [3] 50 à 70 0 à 6,9 6,5 à 24,0 3,0 à 7,5 240 à 500

Tournesol oléique [4] < 0,5 < 0,3 5,0 à 13,0 4,5 à 13,0 Présence 42,0 à 70,0 1,5 à 6,9 6,5 à 24,0 0 à 9,0 170 à 520

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app : apparent

carbures saturés apolaires se séparent des hydrocarburespolyinsaturés légèrement polaires comme le squalène. Les hydro-carbures sont analysés par CPG sur colonne capillaire apolaire.Quelques corps gras peuvent présenter des teneurs en hydrocarbu-res importantes : squalène dans certaines huiles de poisson(figure 5) (squalidés), karitène dans le karité. La fraction d’hydrocar-bures des huiles d’olive est constituée d’environ 90 % de squalène(5 à 9 g/kg). Les n-alcanes majoritaires ont un nombre d’atomes decarbone impairs et une condensation en carbone qui varie de 25 à31 [1]. La quantification s’effectue par étalonnage interne.

1.5 Tocophérols – Tocotriénols

prénique à 16 atomes de carbones saturés (tocophérols) outri-insaturés (tocotriénols).

Les tocophérols (vitamine E) sont des composés possédant à lafois une activité vitaminique et une activité antioxydante. Alorsque l’activité vitaminique décroît de l’α-tocophérol au δ-tocophérol,l’activité antioxydante croît de l’α-tocophérol au δ-tocophérol.

Les tocophérols peuvent être obtenus après fractionnement del’insaponifiable, mais, du fait de leur oxydabilité, il est nécessairede les protéger : saponification à froid, ou à chaud, mais de courtedurée et en présence de pyrogallol.

Le fractionnement peut être effectué par chromatographie pla-naire CP sur silice (figure 1). Après grattage de la bandecorrespondante, extraction des composés puis transformation entriméthylsilyléthers.


Les tocophérols (α, β, γ, δ) (figure 6) et les tocotriénols (α, β, γ, δ)(figure 7) sont des 8-méthylchromane-6-ol substitués par un ouplusieurs groupement méthyle et par une chaîne de type polyiso-

L’analyse est effectuée en chromatographie phase gazeuse CPGdans les mêmes conditions que celle utilisée pour l’analyse desstérols (§ 1.2).



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teneurs en tocophérols et tocotriénols par chromatographie enphase liquide à haute performance).

Le corps gras est mis en solution dans le n-heptane. Deux typesde colonnes chromatographiques sont utilisables :

– une colonne de silice (L = 250 mm, Φ = 4,6 mm, granulométrie≈ 5 µm) ;

– une colonne de silice greffée par des groupements diols(L = 250 mm, Φ = 4,6 mm, granulométrie ≈ 5 µm).

Diverses phases mobiles ont été expérimentées. Par exemple :

– le mélange tétrahydrofurane/n-heptane (3,85/96,15 v/v) pour lacolonne de silice greffée diols ou de silice ;

– le mélange isopropanol/n-heptane (0,5/99,5 v/v) pour lacolonne de silice.

La détection s’effectue par fluorescence (excitation : 290 nm ;

Figure 4 – Analyses par CPG des fractions stéroliques d’huiles d’olive et d’argan

2 8a

6a

67 9

10 13

144a4

12a

1

2

4

8

10

1112 13

145

6 7 93

Temps

Temps

Inte

nsi

té

Inte

nsi

té

a fraction stérolique d'une huile d'olive

b fraction stérolique d'une huile d'argan

Colonne RTX-1, L : 60m, φint. : 0,25mm, epfilm : 0,1µm,1 : cholestérol, 2 : cholestanol (étalon interne), 3 : brassicastérol, 3a : 24-méthyIène cholestérol, 4 : campestérol, 4a : campestanoI 5 : stigmastérol, 6 : ∆7-campestérol, 6a : stigma-8,22-diène-3-ol, 7 : ∆5,23-stigmastadiénol, 8 : β-sitostérol, 8a : spinastérol, 9 : sitostanol, 10 : ∆5-avenastérol, 11 : ∆5,24-stigmastadiénol, 12 : ∆7-stigmasténol, 12a : schotténol, 13 : ∆7-avenastérol, 14 : érythrodiol

Figure 5 – Formule du squalène (C30H50)

Le chromatogramme de la figure 8 montre la fraction tocophéro-lique d’une huile de palme. Cette huile présente une composition entocotriénols caractéristique.


Cependant la méthode la plus utilisée est la méthode par lachromatographie liquide CLHP selon la norme NF EN ISO 9936(Corps gras d’origine animale et végétale – Détermination des

émission : 330 nm) pour une meilleure sensibilité. Si l’on nedispose pas d’un fluorimètre, la détection en UV à 292 nm estpossible.



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3




Les tocophérols, comme les autres constituants de l’insaponi-fiable, présentent un profil caractéristique pour chaque corps gras.

1.6 CiresLes cires présentes dans les corps gras d’origines végétale et

animale sont généralement des esters d’acides gras et de mono ou

Figure 6 – Formules des tocophérols

Figure 7 – Formules des tocotriénols

Figure 8 – Analyse des tocophérols et tocotriénols d’une huile de palme par CPL sur colonne de silice

R1

HO

OR2

R3

R3CH3 CH3 CH3CH3 CH3

CH3CH3

CH3

H

H

H

�-tocophérol

�-tocophérol

�-tocophérol

�-tocophérol H

R2R1

R1HO

OR2

R3

R3CH3 CH3 CH3CH3 CH3

CH3CH3

CH3

H

H

H

�-tocophérol

�-tocophérol

�-tocophérol

�-tocophérol H

R2R1

Inte

nsi

té (

ua)

4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

300 000

250 000

200 000

150 000

100 000

50 000

0

Temps (min)

1 : α-tocophérol, 2 : α-tocotriénol, 3 : β-tocophérol, 4 : γ-tocophérol, 5 : γ-tocotriénol, 6 : δ-tocophéroI, 7 : δ-tocotriénol

76

5

4

2

1

3

Cette méthode peut aussi être utilisée pour doser l’acétated’ -tocophérol et les esters de tocophérols et tocotriénolsrajoutés dans les produits formulés. Il convient de procéder,avant l’analyse chromatographique, à une saponification àfroid. Il est recommandé d’effectuer en même temps l’analysed’échantillons contenant des quantités d’esters connues.

Dans certains corps gras (palme-maïs), les tocophérols sont

�


dialcools gras à condensation en carbone élevée. Certains corpsgras peuvent contenir des quantités non négligeables de ciresconsidérées toutefois comme des constituants mineurs.

associés aux tocotriénols, que l’on analyse conjointement,que ce soit en CPG ou en CLHP.



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Les cires peuvent se trouver naturellement à l’état (cire d’abeille,cires végétales) ou comme constituants mineurs de certains corpsgras (tournesol, huile de grignon d’olive...). L’analyse peut être réa-lisée selon deux approches :

– la cristallisation ;– le fractionnement chromatographique.

La teneur en cires peut être évaluée par un test (Cold Test ) quirenseigne sur la teneur présumée en cires par la mesure du tempsde l’apparition d’un trouble (cristallisation) à une température don-née au cours du refroidissement de l’échantillon. Pour les faiblesteneurs, la détection visuelle peut être remplacée par la mesure dela diffusion d’une lumière laser [2].

L’isolement des cires est obtenu par chromatographie liquide(CPL ou CCM).

Leur dosage dans les corps gras d’origine végétale est réalisépar CPG selon la norme XP ISO/TS 23647 (Corps gras d’originevégétale – Détermination de la teneur en cires par chromato-graphie en phase gazeuse). Les cires sont séparées par chromato-graphie sur colonne en utilisant un garnissage mixte constitué desilice et de silice imprégnée de nitrate d’argent (AgNO3). La déter-mination de la teneur en cires est effectuée par chromatographieen phase gazeuse sur colonne capillaire apolaire en utilisant unétalon interne adapté.

Pour les huiles d’olive, le dosage des cires peut être réalisé parCPG selon la méthode de l’annexe IV du règlement CEE n˚ 2568/91ou suivant la norme NF EN ISO 12873 (Huile d’olive et huile de gri-gnons d’olive – Détermination de la teneur en cires par chroma-tographie en phase gazeuse sur colonne capillaire). L’huile,additionnée d’un étalon interne (arachidate laurique) est fraction-née par chromatographie sur colonne de gel de silice hydratée(2 %). La fraction éluée par un mélange hexane-éther diéthylique

(99/1 v/v) est récupérée et analysée par chromatographie en phasegazeuse sur colonne capillaire apolaire (figure 9).

La détermination de la composition en alcools gras des ciresnécessite la saponification de la matière grasse. L’insaponifiableest extrait par de l’éther diéthylique. La fraction alcools aliphati-ques est séparée des autres constituants de l’insaponifiable parchromatographie sur plaque de gel de silice basique (figure 1). Lesalcools, récupérés du gel de silice, sont transformés en triméthyl-silyl éthers et analysés par chromatographie en phase gazeuse surcolonne capillaire apolaire selon l’annexe XIX du règlement CEEn˚ 2568/91 ou suivant la norme NF EN ISO 12871 (Huile d’olive ethuile de grignons d’olive – Détermination de la teneur en alcoolsaliphatiques par chromatographie en phase gazeuse sur colonnecapillaire).

1.7 PigmentsLes pigments naturels des corps gras sont essentiellement des

caroténoïdes et des chlorophylles et leurs dérivés.

Les caroténoïdes totaux sont dosés par spectroscopie visible(446 nm) en prenant du β-carotène comme référence. Uneméthode normalisée existe pour l’huile de palme, selon la normeNF EN ISO 17932 (Huile de palme – Détermination de la détériora-tion de l’indice de blanchiment (DOBI) et de la teneur en carotè-nes). La composition et le dosage des caroténoïdes sontdéterminés à partir de la fraction insaponifiable, obtenue dans desconditions douces, par CLHP sur une colonne C18 et détectionUV/visible ou barrette de diodes. Un dosage des caroténoïdestotaux est possible à l’aide de la norme NF EN 12823-2 (Produitsalimentaires – Dosage de la vitamine A par chromatographieliquide haute performance – Partie 2 : dosage du béta-carotène).

A

1

4

2

3

5

6

B C

2

10

20

30Inte

nsi

té (

ua)

40

50

60

70

4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Temps (min)

26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46

Colonne RTX-5, L : 15 m, φint. : 0,25 mm, epfilm : 0,25 µm.A : alkyls esters, B : cires, C : esters de stérols. 1 : squalène, 2 : arachidate laurique (étalon interne), 3 : cires C40, 4 : cires C42, 5 : cires C44, 6 : cires C46


Figure 9 – Analyse par CPG des cires d’une huile d’olive



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Les chlorophylles sont analysées par CLHP sur colonne de siliceavec éluant hexane-isopropanol (98,5-1,5 v/v). Le dosage des pro-duits de dégradation des chlorophylles : phéophytine a et a’ et lapyrophéophytine s’effectue selon la norme NF EN ISO 29841(Corps gras d’origine végétale – Détermination des produits dedécomposition des chlorophylles a et a′ (phéophytine a et a′ etpyrophéophytine)). Les pigments sont séparés des triglycéridessur une microcolonne de gel de silice puis analysés par chromato-graphie en phase liquide sur colonne RP18 (éluanteau-méthanol-acétone, 6/1/3 v/v/v) et détectés à 410 nm. La normeprécise que pour de faibles teneurs, la détection par fluorescence(excitation à 430 nm et émission à 670 nm) peut-être utilisée.

1.8 VitaminesLa détermination de la teneur en vitamine A s’effectue par CLHP

de la même manière que pour le carotène. Une méthode estdécrite dans la norme NF EN 12823-1 (Produits alimentaires –Détermination de la teneur en vitamine A par chromatographieliquide haute performance – Partie 1 : dosage du tout-E-rétinol etdu 13-Z-rétinol).

Pour les vitamines D, après saponification à froid et extractionde la fraction insaponifiable, le dosage est réalisé par double chro-matographie liquide : une première chromatographie sur unecolonne de silice permet la récupération de la fraction contenantles vitamines. Une deuxième chromatographie de cette fractionsur une colonne octadécyl en assure la quantification en CLHP parétalonnage externe. Cette méthode est décrite dans la normeNF EN 12821 (Produits alimentaires – Dosage de la vitamine D parchromatographie liquide haute performance – Dosage du cholécal-ciférol (D 3) ou de l’ergocalciférol).

2. Paramètres de qualité

Les lipides sont des composés altérables en raison de la pré-sence de chaînes grasses insaturées et de certains composésmineurs peu stables. La présence, au contact des huiles et desgraisses, d’oxygène, de lumière, d’eau, de matières organiques ensuspension (huiles vierges), de traces métalliques, d’enzymes, estun facteur de dégradation.

La mesure des paramètres de qualité s’effectue par différentesméthodes : volumétriques, spectroscopiques, chromatographiqueset électrochimiques.

2.1 Acides gras libres

L’hydrolyse des corps gras, qu’elle soit d’origine chimique (pré-sence d’eau) ou enzymatique par les enzymes lipolytiques (palme,karité, olive), entraîne la formation d’acides gras libres.

L’acidité et l’indice d’acide rendent compte de l’hydrolyse descorps gras. Cette caractéristique est utile pour apprécier la qualitédes corps gras, suivre l’efficacité du raffinage et donner des infor-mations sur des produits issus de la lipochimie.

La norme NF EN ISO 660 décrit deux méthodes :

– titrimétrique, soit à froid en milieu éthanol-oxyde diéthylique50/50 v/v, soit à chaud (éthanol) en utilisant dans les deux cas unesolution d’hydroxyde de potassium 0,1 M (éthanolique pour laméthode à froid, aqueuse pour la méthode à chaud) ;

– potentiométrique par détermination du point d’équivalenceaprès mise en solution du corps gras dans de l’éthanol chaud.Cette méthode est à privilégier dans le cas de corps gras trèscolorés.

2.2 Indice de peroxyde

L’Indice de peroxyde IP représente l’état d’oxydation d’un corpsgras au moment du dosage. L’indice de peroxyde ne peut enaucun cas rendre compte du passé oxydatif d’une matière grasse.L’oxydation des chaînes grasses insaturées forme des peroxydesou hydroperoxydes. Ces composés sont labiles et se décomposenten composés plus stables : aldéhydes, cétones, acides.

Aussi, de ce fait, l’indice de peroxyde évolue au cours du tempsen passant par un maximum avant de décroître de telle sortequ’un faible indice de peroxyde n’est plus à ce stade un critère fia-ble de la mesure de l’oxydation. Il est alors nécessaire de détermi-ner l’indice d’anisidine (§ 2.3) et (ou) de réaliser une analyseorganoleptique.

L’indice de peroxyde peut être déterminé selon trois méthodes :

– titrimétriques selon l’annexe III du règlement CEE n˚ 2568/91applicable aux huiles d’olive dont le champ d’application estétendu aux huiles et matières grasses. Cette méthode met enœuvre du chloroforme comme solvant dont l’utilisation tend à dis-paraître des laboratoires ; toutefois, l’utilisation de cette méthodeest la plus précise pour des IP faibles. Le domaine d’applications’étend jusqu’à 90 méq d’O2/kg de matières grasses ;

– titrimétrique selon la norme NF EN ISO 3960 (Corps gras d’ori-gines animale et végétale – Détermination de l’indice de peroxyde– Détermination avec point d’arrêt iodométrique). Cette méthodediffère de la méthode titrimétrique précédente par l’utilisationd’isooctane comme solvant au lieu du chloroforme. Elle s’appliqueaussi aux margarines et aux pâtes à tartiner ayant une teneur eneau variable. Elle ne convient pas pour les matières grasses pré-sentes dans le lait et ne s’applique pas aux lécithines. Le domained’application s’étend jusqu’à 30 méq d’O2/kg de matières grasses ;

– potentiométrique selon la norme NF EN ISO 27107 (Corps grasd’origines animale et végétale – Détermination de l’indice deperoxyde – Détermination avec point d’arrêt potentiométrique).Cette méthode permet une automatisation des dosages avec unpoint d’arrêt du titrage déterminé selon une méthode électrochimi-que. Son domaine d’application est le même que la précédenteméthode titrimétrique.

L’acidité A selon la norme NF EN ISO 660 (Corps grasd’origine animale et végétale – Détermination de l’indiced’acide et de l’acidité) est le pourcentage d’acides gras libresexprimé conventionnellement en acide laurique pour le coprahet le palmiste, en acide palmitique pour le palme et en acideoléique pour les autres corps gras.

L’acidité peut aussi s’exprimer sous la forme d’indice d’acidequi est le nombre de milligrammes de potasse nécessaire pour

L’indice de peroxyde IP est le nombre de microgrammesd’oxygène actif contenus dans un gramme de corps gras etsusceptibles d’oxyder l’iodure de potassium.

Il peut être exprimé de différentes façons : microgrammespar gramme, mole par kilogramme ou plus souvent milli-équivalent d’oxygène actif par kilogramme de matière grasse.La relation entre les diverses expressions est :


neutraliser 1 g de corps gras.

Le rapport entre l’acidité exprimée en acide oléique etl’indice d’acide est très voisin de 2. I I IP ( g/g) 16 P (mol/kg) P meq d’O /kg2µ = = 8



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2.3 Indice d’anisidineL’indice d’anisidine IA permet la quantification des composés

aldéhydiques, souvent caractéristiques d’une flaveur de rance(cf. [P 3 325], § 3.4). C’est un indice sans dimension.

La connaissance des indices de peroxyde IP et d’anisidinepermet de déterminer la valeur TOTOX (TOTal OXydation Value ) :

Le paramètre TOTOX est empirique. Il présente l’avantage dedonner une représentation de l’état d’oxydation de la matièregrasse et de sa potentialité à évoluer vers de nouveaux produitsd’oxydation. Les huiles de qualité ont en général une valeurTOTOX inférieure à 10.

2.4 Absorptions spécifiquesdans l’ultraviolet

L’analyse spectrométrique dans l’ultraviolet fournit des indica-tions sur la qualité d’une matière grasse, sur son état deconservation et sur les modifications dues aux processus technolo-giques du raffinage. Les traitements thermiques et de décolorationentraînent d’une part l’élimination de composés mineurs et d’autrepart une conjugaison des doubles liaisons des acides gras polyin-saturés avec formation de diènes et de triènes conjugués.

Les diènes conjugués absorbent à 232 nm, alors que les triènesconjugués et certains produits secondaires d’oxydation (cétones,α-dicétones) absorbent au voisinage de 268 nm. Les coefficientsd’extinction spécifiques permettent aussi d’évaluer le niveaud’oxydation des corps gras. La norme NF EN ISO 3656 (Corps grasd’origines animale et végétale – Détermination de l’absorbancedans l’ultraviolet, exprimé sous la forme d’extinction spécifique enlumière ultraviolette), mesure l’absorbance d’une solution dematière grasse dans l’isooctane ou le cyclohexane. Les résultatssont exprimés en extinction spécifique à des longueurs d’ondedéterminées (232 nm et 268 nm ou 270 nm suivant le solvantutilisé, respectivement isooctane et cyclohexane).

2.5 Composés polaires

Lorsque l’on chauffe des corps gras à des températures élevées(friture), les phénomènes d’oxydation et de dégradation des corpsgras sont accélérés. Cette oxydation importante peut être appré-ciée par :

– l’accroissement de l’acidité libre ;– l’accroissement de la viscosité ;– l’accroissement de l’indice de réfraction ;– la quantité de composés polaires issus de la dégradation. Ces

composés polaires sont un ensemble de substances polairesprésentes dans les corps gras non chauffés (monoglycérides,diglycérides, acides gras libres) ainsi que les produits polairesissus générés par le chauffage comme lors de la friture d’unaliment.

La détermination de la teneur en composés polaires selon lanorme NF EN ISO 8420 (Corps gras d’origines animale et végétale

d’éluant, est élué par un mélange éther de pétrole (40 à60 °C)-éther diéthylique (87/13 v/v) au travers d’une colonne desilice hydratée à 5 %. Les composés plus polaires que les triglycé-rides sont adsorbés sur la silice. L’éluant est évaporé, puis pesé. Lateneur en composés polaires est représentée par la différenceentre la quantité éluée et la quantité introduite. Il existe un arrêté(arrêté du 1er octobre 1986 relatif à la méthode officielle de dosagedes composés polaires dans les graisses et les huiles comestibles)qui décrit la norme analytique à appliquer.

2.6 Polymères de triglycérides

La méthode de dosage des composés polaires ne renseigne passur la nature des produits de dégradation d’une huile ayant servi àla friture (huiles naturellement riches en acides gras libres ou englycérides partiels) et est relativement longue à réaliser.

Aussi, une méthode alternative est disponible selon la normeNF EN ISO 16931 (Corps gras d’origines animale et végétale – Déter-mination de la teneur en triacylglycérols polymérisés par chromato-graphie liquide d’exclusion à haute performance) qui permet dedoser les polymères de triglycérides en quelques minutes par chro-matographie liquide d’exclusion. Les grosses molécules, non rete-nues par les pores, migrent plus rapidement que les petites. L’éluantutilisé est du tétrahydrofurane et la colonne de 300 mm est remplied’un gel de type styrène-divinylbenzène avec des pores de 10 nm(100 Å). La détection est effectuée par réfractométrie.

Cette méthode permet de séparer les triacylglycérols poly ou oli-gomériques, les triacylglycérols dimériques, les triacylglycérols,les diacylglycérols, les monoacylglycérols et les acides gras. Lesgraisses et les huiles ne doivent pas présenter des teneurs encomposés polaires et en polyméres de triglycérides supérieurs res-pectivement à 25 et 14 % (décret n˚ 2008 – 184). Les graisses et leshuiles ne satisfaisant pas aux dispositions du décret sontconsidérées comme impropres à la consommation humaine.

2.7 Mesure de la résistance à l’oxydation

Si l’on sait bien déterminer l’oxydation d’un corps gras, à unmoment donné, il est beaucoup plus difficile d’évaluer sa résis-tance à l’oxydation. Celle-ci peut être estimée par des tests d’oxy-dation accélérés.

Le test de Swift modifié consiste à faire barboter un courantd’air dans le corps gras chauffé à analyser. Cet air vient ensuitebarboter dans une solution contenant un indicateur coloré (rougede crésol). Les composés d’oxydation volatils entraînés modifientle pH de la solution colorée qui passe du violet au pourpre, puis aujaune, ce qui correspond à un indice de peroxyde d’environ20 meq d’O2/kg. Le résultat est exprimé par le temps (heures) mispar la solution pour changer de couleur.

Cette analyse peut être automatisée à l’aide d’un appareil Ranci-mat selon la norme NF ISO 6886 [Corps gras d’origines animale etvégétale – Détermination de la stabilité à l’oxydation (essai d’oxy-dation accélérée)]. Le principe consiste à faire un barbotage par del’air purifié dans un corps gras à une température spécifiée (géné-ralement 100 °C). Les composés volatils (acides carboxyliquescourts) entraînés par le courant gazeux sont piégés dans unesolution aqueuse dans laquelle est immergée une celluleconductimétrique. Elle mesure la fin de la période d’induction parune variation brutale de la conductivité de la solution.

3. Contaminants

Le coefficient Kλλλλ d’extinction spécifique à la longueurd’onde λ est l’absorbance d’une solution à 1 % (poids/volume)pour un trajet optique de 1 cm.

TOTOX P A= +2I I


– Détermination de la teneur en composés polaires) est uneméthode simple à réaliser ne nécessitant pas un appareillagesophistiqué : l’échantillon, après mise en solution dans le solvant

De nombreux composés organiques ou minéraux sontsusceptibles de contaminer les corps gras.



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3




Les performances sans cesse améliorées des méthodes analyti-ques permettent de reculer les seuils de détection et de quantifica-tion des contaminants.

3.1 Hydrocarbures halogénésLes hydrocarbures halogénés à bas point d’ébullition sont des

composés toxiques omniprésents. La norme NF EN ISO 16035(Corps gras d’origines animale et végétale – Dosage deshydrocarbures halogénés à bas point d’ébullition dans les huilescomestibles), spécifie leur dosage. Il est réalisé selon la techniquede l’espace de tête dynamique couplée à la chromatographie enphase gazeuse avec détecteur à capture d’électron. La méthodes’applique à tous les corps gras et huiles comestibles pour ledosage de ces composés dont la teneur est comprise entre 0,01 et0,2 mg/kg.

3.2 Composés organiques volatilsLa détection et l’identification de produits chimiques industriels

volatils (hydrocarbures saturés halogénés, hydrocarbures nonsaturés halogénés, esters, aldéhydes, alcools, amines, cétones,éthers, composés cycliques et aromatiques, composés azotés,acrylates...) dans les huiles comestibles brutes ou raffinéespeuvent être réalisée selon la norme NF EN ISO 15303 (Corps grasd’origines animale et végétale – Détection et identification d’uncontaminant organique volatil par CPG/SM). La méthode a été tes-tée pour des concentrations comprises entre 1 et 10 mg/kg.

La teneur en hexane résiduel fait l’objet de deux normes selon lateneur résiduelle :

– NF EN ISO 9832 (Corps gras d’origines animale et végétale –Dosage de l’hexane technique résiduel) ;

– NF T60 257 (Corps gras d’origines animale et végétale –Dosage de faibles quantités d’hexane technique résiduel).

3.3 Hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP)

La norme NF EN ISO 15753 (Corps gras d’origines animale etvégétale – Détermination des hydrocarbures aromatiques polycy-cliques), décrit une méthode générale et une méthode spécifiquepour l’huile de coprah et les huiles végétales avec les acides gras àchaîne courte, pour la détermination de 15 hydrocarbures aromati-ques polycycliques. Ces méthodes ne sont pas quantitatives pourles HAP volatils (naphtalène, acénaphtène, fluorène). L’huile depalme et l’huile de grignons d’olive ne peuvent pas être analyséespar cette méthode. La limite de quantification est de 0,2 µg/kg pourla majorité des composés analysés, à l’exception du fluoranthèneet du benzo[g,h,i]pérylène dont la limite de quantification est de0,3 µg/kg et de l’indéno[1,2,3-c,d]pyrène dont la limite de quantifi-cation est de 1 µg/kg. L’amendement à la norme précédente :NF EN ISO 15743/A1 (Corps gras d’origines animale et végétale –Détermination des hydrocarbures aromatiques polycycliques.Amendement 1 – exclusion de l’huile de grignons d’olive dudomaine d’application) indique que cette méthode n’est pas appli-cable à l’huile de grignons d’olive car les données de fidélité sontmédiocres.

La norme NF EN ISO 22959 (Corps gras d’origines animale etvégétale – Détermination de la teneur en hydrocarbures aromati-ques polycycliques par chromatographie de complexedonneur-accepteur et CLHP avec détection par fluorescence),s’applique à la détermination des corps gras comestibles. Elle aété validée pour l’huile de coco, l’huile d’olive, l’huile de tournesol

Détermination du benzo[a]pyrène – Méthode par chromatographeliquide à haute performance à polarité de phase inversée), spécifiela détermination du benzo[a]pyrène dans les corps gras bruts ouraffinés dans la gamme 0,1 à 50 µg/kg.

3.4 Pesticides et polychlorobiphényles

Le dosage des pesticides et des polychlorobiphényles est décritdans la norme NF EN 1528 qui comprend quatre parties :

– NF EN 1528-1 (Aliments gras – Dosage des pesticides et despolychlorobiphényles (PCB) – Partie 1 : généralités) ;

– NF EN 1528-2 (Aliments gras – Dosage des pesticides et despolychlorobiphényles (PCB) – Partie 2 : extraction de la matièregrasse, des pesticides et des PCB et détermination de la teneur enmatière grasse) ;

– NF EN 1528-3 (Aliments gras – Dosage des pesticides et despolychlorobiphényles (PCB) – Partie 3 : méthode de purification) ;

– NF EN 1528-4 (Aliments gras – Dosage des pesticides et despolychlorobiphényles (PCB) – Partie 4 : détermination, essais deconfirmation, divers).

La première partie traite du domaine d’application de la normeet de considérations générales sur les réactifs et l’appareillageutilisables pour chacune des méthodes analytiques sélectionnées.La deuxième partie précise les méthodes d’extraction de la matièregrasse contenant des pesticides et des PCB des différents groupesde denrées alimentaires. La troisième partie détaille les différentesméthodes de purification des matières grasses, des huiles ou de lamatière grasse extraite. La quatrième partie détaille quelquestechniques pour le dosage de résidus de pesticides et PCB dans lesaliments gras.

3.5 Métaux

La norme NF EN ISO 12193 (Corps gras d’origines animale etvégétale – Détermination de la teneur en plomb par spectrométried’absorption atomique avec four en graphite), spécifie uneméthode de détermination des traces de plomb (> 0,001 mg/kg)dans tous les types de corps gras bruts ou raffinés. Le mesuragede la teneur en plomb est réalisé à la longueur d’onde de283,3 nm.

Les traces de cuivre, de fer et de nickel sont déterminées dansles corps gras selon la norme NF EN ISO 8294 (Corps grasd’origines animale et végétale – Détermination de la teneur en cui-vre, fer et nickel par spectrométrie d’absorption atomique avecfour en graphite). Les longueurs d’onde de mesure sont : Cu(324,7 nm), Fe (302,1 nm) et Ni (232,0 nm). Les limites de reproduc-tibilité sont : < 0,2 mg/kg pour le Cu et < 0,1 mg/kg pour Fe et Ni.

Les traces de cadmium sont déterminées selon la normeNF EN ISO 15774 (Corps gras d’origines animale et végétale –Détermination de la teneur en cadmium par spectrométried’absorption atomique avec four en graphite). L’échantillon estpyrolysé puis atomisé dans un four graphique. Le dosage du cad-mium est réalisé par détermination de l’absorbance à une lon-gueur d’onde de 228,8 nm et l’utilisation d’une courbed’étalonnage. Un sel de palladium est ajouté à l’échantillon pouréviter les pertes de cadmium lors du traitement par pyrolyse.

Des éléments traces peuvent être déterminés selon la normeXP ISO/TS 21033 [Corps gras d’origines animale et végétale –Détermination des éléments traces par spectrométrie d’émissionatomique à plasma induit par haute fréquence (ICP-OES)]. Cetteméthode convient seulement lorsque les éléments sont présentssous forme solubilisée. Selon le solvant de dilution, la plupart des


et l’huile de soja. Elle peut être appliquée à d’autres huiles aprèsdétermination des paramètres appropriés. La normeNF EN ISO 15302 (Corps gras d’origines animale et végétale –

huiles brutes, dégommées, raffinées, décolorées, désodorisées ethydrogénées peuvent être analysées ainsi que presque tous lestypes de lécithines et de phospholipides (cf. [P 3 325], § 4.3.1).



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4. Recherchede l’authenticité

La grande différence de prix entre les huiles et notamment entreles huiles vierges et les huiles raffinées peut entraîner des tenta-tions d’adultérations et de falsification consistant à introduire toutou partie d’une huile de moindre coût dans une huile d’un prixsupérieur. On peut constater (en 2015) au niveau du commerce dedétail des prix qui sont :

– pour des huiles de types arachide, maïs, tournesol de 1,05 à2,5 € ;

– pour des huiles de moindre coût comme le colza ou le soja, de0,76 à 1,22 € ;

– pour des huiles vierges de 2,5 à plus de 30 €.

Le prix de revient à la production d’une huile d’olive vierge fran-çaise était pour la campagne 2014/2015 de 8 à 15 €/L. Il n’est doncpas possible de trouver des huiles françaises au niveau ducommerce de détail à des prix inférieurs à 15 €/L.

Du fait de ces différences de prix, la recherche d’adultération sefait le plus souvent dans le sens de la détection d’huiles de bascoût dans une huile de coût supérieur ou d’une huile raffinée dansune huile vierge.

Le décret n˚ 2008-184 de 2008 définit notamment les différentesdénominations d’huiles ou de graisses qui peuvent êtrecommercialisées. Ce décret ne définit plus les étapes du raffinageet renvoi à d’autres textes pour les taux limites résiduaires dessubstances qui peuvent être employées aux cours du raffinage. Deplus, il n’existe pas dans ces textes réglementaires de caractéristi-ques concernant la composition des huiles. Il faut donc s’en référeraux données de la littérature [2] [3], des normes commerciales [4][5], de la réglementation ou des banques de données [6] [7] pourjuger de problèmes de compositions. Au niveau international, leCodex Alimentarius [4] révise régulièrement des normes commer-ciales qui contiennent les critères physico-chimiques et lescompositions des lipides faisant l’objet de transactions internatio-nales. Seule, l’huile d’olive est soumise à un règlement européenn˚ 2568/91 (créé en 1991) définissant ses caractéristiques tant phy-sico-chimiques qu’organoleptiques ainsi que les méthodes decontrôles afférentes à ce produit. Ce règlement a été modifié unetrentaine de fois depuis sa date d’application, montrant que l’évo-lution des techniques analytiques et les résultats des recherchesconcernant la mise en évidence des adultérations peuvent être prisen compte rapidement par le législateur.

L’évolution des techniques d’analyses chromatographiques,spectrales et de traitement des données a rendu caduque la déter-mination des indices traditionnels trop peu informatifs par rapportà la sophistication des pratiques frauduleuses.

4.1 Exploitation de la compositionen acides gras

La détermination de la composition en acides gras est un outilrelativement simple pour contrôler la pureté d’un corps gras. Il suf-fit dans un premier temps de comparer les valeurs obtenues soit àcelles de la littérature [2] [3] [4] [5] [8], soit aux valeurs obtenues àpartir d’échantillons d’origine garantie.

Certains acides gras peuvent être considérés comme desmarqueurs.

L’analyse des acides gras permet aussi par exemple de détecterdes ajouts d’huile linoléique (18:2ω6 > 50 % des acides gras) oud’huile linolénique (18:3ω3 > 7 % des acides gras) à des teneurs del’ordre de 10 à 20 % dans des huiles oléiques comme l’huiled’olive. L’huile d’olive possède la particularité d’être très riche enacide gras mono insaturé : l’acide oléique (18:1ω9) à une teneursupérieure à 55 % avec trois autres acides gras principaux, l’acidepalmitique (16:0), l’acide linoléique (18:2ω6), et l’acide stéarique(18:0). Toutefois, sa composition est très variable en fonction deson origine [6].

L’apparition sur le marché de tournesol oléique (composition enacides gras semblable à l’huile d’olive) rend cette analyse seulebeaucoup moins efficace, ce qui ne permet plus de caractériserl’adultération d’une huile d’olive par une huile de tournesol oléi-que. L’analyse des acides gras s’est améliorée avec l’utilisation decolonnes capillaires performantes et de phases stationnaires plusspécifiques, permettant de séparer des isomères ou des composésqui n’étaient pas pris en considération, et qui peuvent servir de cri-tères discriminants pour mettre en évidence des adultérations.

La prise en compte de ces différents isomères est essentiellepour différencier des huiles d’olive issues de différentesvariétés [6] et les huiles de diverses natures botaniques, àcondition de posséder des banques de données fournies.

La quantification des mélanges s’effectue simplement par lamoyenne arithmétique des acides gras mis en œuvre.

Cependant, selon la nature des corps gras et la proportion d’hui-les de substitution, la composition en acides gras peut être insuffi-sante pour caractériser un mélange.

4.2 Exploitation de la compositionet de la teneur en stérols

L’analyse des stérols permet de détecter facilement des huilesde colza ou tournesol « classique » à des teneurs inférieures à 2 %dans une huile d’olive. La présence dans une huile d’olive de tauximportants de brassicastérol (caractéristique des crucifères) et decampestérol permet de mettre en évidence la présence d’huile decolza alors que des taux importants de ∆7-stigmasténol et de∆7-avénastérol permettent de mettre en évidence la présenced’huile de tournesol. L’huile de tournesol oléique peut ainsi êtredétectée. Par contre, de nouveaux traitements de déstérolisationpeuvent être appliqués aux huiles et, dans ce cas, les pour-centages de stérols d’une huile de tournesol oléique déstéroliséesont compris dans les domaines de variations des huiles d’olive.

Le cholestérol en quantité notable est caractéristique de lacomposition stérolique des graisses animales. Toutefois, certaineshuiles végétales peuvent présenter des teneurs en cholestérol nonnégligeables (palme, huile de pépins de tomate, huiles d’algues...).

Pour quantifier les mélanges à l’aide des stérols, il est néces-

Ainsi, la présence d’acide linolénique (18 :3ω3) dans une huiled’arachide ou de tournesol, à une teneur supérieure à 0,4 %, laissesupposer une adultération par du colza ou du soja.

Pour la nomenclature des acides gras, se reporteren [P 3 325], § 4.1.1.

Par exemple, la séparation des isomères d’acides gras en 16:1permet en routine de différencier l’acide palmitoléique (16:1ω9) del’acide hypogéique (16:1ω7) et pour les 18:1 de séparer l’acide oléi-que (18:1ω9) de l’acide z-vaccénique (18:1ω7).

La figure 10 montre le chromatogramme des stérols d’une huile decarthame adultérée par de l’huile de colza en raison de la présence debrassicastérol.


saire de connaître la teneur moyenne en stérols totaux des corpsgras utilisés afin de tenir compte des différences de teneurs res-pectives en stérols totaux.

De même, une teneur en acide myristique (14 :0) supérieure à0,5 % dans une huile d’olive laisse supposer une adultération par unehuile de palme.



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4.3 Exploitation de la compositionen triglycérides

Les progrès de la CLHP ont permis de réaliser des tables decompositions triglycéridiques. Un composé tel que la trilinoléinepeut être utilisé pour caractériser la présence d’huile de tournesolou de pépins de raisins dans des huiles qui présentent habituelle-ment une faible teneur en trilinoléine comme l’arachide ou l’olive.

La connaissance parfaite de l’huile d’olive à travers le monde apermis aux experts de modéliser la construction des triglycérides àpartir de la connaissance de sa composition en acides gras. Aprèsanalyse des triglycérides, et par comparaison au profil théorique, ilest possible de se prononcer sur une substitution partielle del’huile. Ce calcul s’exprime par le ∆ ECN42 qui mesure l’écart entrele modèle théorique et expérimental du profil de certains triglycéri-des, et est particulièrement sensible à la présence d’huile de grai-nes. Cette mesure tolère un écart ∆ ECN42 traduisant notammentla prise en compte de la variabilité géographique de lacomposition des huiles, puisque comme les acides gras, les trigly-cérides sont spécifiques d’une variété d’olive ou d’un terroir.

Cette différence permet d’abaisser le seuil de détection à moinsde 2 % pour la recherche d’huiles de tournesol oléique dans deshuiles d’olive et la méthode globale élargie aux ECN 44 et àECN 46 permet d’élargir la recherche aux huiles de noisette etd’amande [9].

L’utilisation du propionitrile comme solvant d’élution pour laCLHP offrant une résolution accrue (cf. [P 3 325], § 4.2.3) entre tri-glycérides permet de mieux mettre en évidence des adultérationsd’huile de sésame par des huiles de soja, de mieux caractériser leshuiles de pépins de raisins, d’arachide, de beurre de cacao et debeurre de karité...

La composition triglycéridique par CPG est aujourd’hui la seuleméthode normalisée permettant de mettre en évidence la présencede matières grasses étrangères dans le beurre de cacao (étude durapport C54/C50) (cf. [P 3 325], § 4.2.2).

Enfin, l’utilisation conjointe des informations fournies par lescompositions en acides gras et en triglycérides et par le traitementdes données (chimiométrie) constitue un excellent moyen d’appré-cier la pureté d’une huile, voire de son origine [6] [7] [10] [11]. Celanécessite la création de banques de données importantes [6] [7].

4.4 Mise en évidence d’huile raffinée dans une huile vierge

La détermination du coefficient d’extinction spécifique définit auparagraphe 2.4 est utilisé pour caractériser la qualité d’une huileainsi que les traitements technologiques qu’elle a pu subir. Eneffet, le traitement thermique et le passage sur terre activéeréalisés au cours des étapes de raffinage entraînent :

– l’élimination de composants mineurs ;– la formation d’acides gras E (trans) ;– la conjugaison des doubles liaisons des acides gras, avec for-

mation de diènes et de triènes conjugués qui absorbent entre 225et 280 nm.

Le dosage des acides gras trans, par chromatographie en phasegazeuse, peut être utilisé pour mettre en évidence des ajouts d’hui-les raffinées dans des huiles vierges (cf. [P 3 325], § 4.1.3).

Pour certaines huiles vierges comme l’onagre, la bourrache, letournesol... l’utilisation directe du spectre d’absorption ne suffitpas et il faut utiliser la dérivée seconde de ce spectre, comme l’ontmontré Ollé et Furon [12], afin de vérifier qu’il n’y ait pas d’autrescomposés détectés.

Ces critères analytiques ne sont pas suffisants pour éviter toutesles fraudes. Il a existé sur le marché des huiles d’olive raffinées,absolument incolores, dont les coefficients d’extinction spécifiquesUV, K270 et K232, permettaient de classer ces échantillons commehuiles d’olive vierges [13]. De plus, ces huiles ne contenaient pasd’acides gras trans en quantité notable. Il était alors possibled’ajouter jusqu’à 40 % de ces huiles traitées dans une huile d’olivevierge tout en restant, pour le K270 , au-dessous des valeurs régle-mentaires.

C’est pourquoi le dosage des stigmastadiènes a été intégré dansla panoplie analytique du règlement de 1991 concernant l’huiled’olive. Ces composés sont issus de la déshydratation du β-sitosté-

Figure 10 – Chromatogramme des stérols d’une huile de carthame adultérée

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Colonne RTX-65 TG, L : 30 m, φint. : 0,25 mm, epfilm : 0,1 µm,1 : cholestérol, 2 : cholestanol (étalon interne), 3 : brassicastérol, 3a : 24-méthyIène cholestérol, 4 : campestérol, 5 : stigmastérol, 6 : ∆7-campestérol, 7 : ∆5,23-stigmastadiénol, 8 : β-sitostérol, 9 : sitostanol, 10 : ∆5-avenastérol, 11 : ∆5,24-stigmastadiénol, 12 : ∆7-stigmasténol, 13 : ∆7-avenastérol

ECN pour Equivalent Carbon Number, cf. [P 3 325], § 4.2.1.

Le chromatogramme de la figure 11 montre l’analyse des triglycéri-


rol (stérol prépondérant de l’huile d’olive) lors d’opérations de raf-finage et particulièrement lors de la désodorisation et du passagesur terre activée. Cette déshydratation affecte aussi les autres

des par CPG d’un mélange d’huile de noix de coco adultérée par del’huile de palme détectée par la présence notamment de triglycéridesen C50 et C52.



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stérols : le campestérol donnant du campesta-3,5-diène, le stig-mastérol donnant du stigmastatriène. Cette analyse fait l’objet dedeux normes et d’une annexe du règlement CE :

– la norme NF EN ISO 15788-1 (Corps gras d’origines animale etvégétale – Dosage des stigmastadiènes dans les huiles végétales –Partie 1 : méthode par chromatographie en phase gazeuse surcolonne capillaire (méthode de référence)) ;

– la norme NF EN ISO 15788-2 (Corps gras d’origines animale etvégétale – Dosage des stigmastadiènes dans les huiles végétales –Partie 2 : méthode par chromatographie liquide haute performance(CLHP)) ;

– l’annexe XVII du règlement CE 2568/91.

Elle permet l’extraction et la concentration de ces composés à deslimites de détection telles que le seuil réglementaire de 0,05 mg/kgest fixé pour les huiles d’olive vierges. Pour les autres huiles vier-ges, quels que soient leurs traitements avant extraction de l’huile(pâte grillée de noix, d’amandes ou de noisettes), les teneurs enstigmastadiènes sont inférieures à ce seuil. La méthode par CLHPest une méthode de criblage ou screening qui atteint difficilement lasensibilité de la méthode par CPG.

4.5 Tocophérols, dialcools triterpéniques

Comme pour les stérols, les tocophérols peuvent être caractéris-tiques d’une huile et donc être utilisés comme marqueurs en seréférant aux données de la littérature [2] [3] [4]. Ainsi, le δ-tocophé-rol est caractéristique des huiles de soja. Il est en revanche absentdes huiles d’olive.

La présence de tocotriénol dans une huile d’olive par exempleindique l’addition d’huile de palme.

Les diols triterpéniques, érythrodiol et uvaol, sont caractéristi-

4.6 Cas de l’huile d’olive

L’huile d’olive [14] est uniquement obtenue à partir du fruit del’olivier (Olea europaea L.). La réglementation n˚ 1308/2013 prévoitles dénominations et définitions suivantes. L’huile d’olive viergeest obtenue directement des olives, uniquement par des procédésmécaniques, éventuellement physiques et notamment thermiques,à condition qu’ils n’altèrent pas l’huile. L’huile d’olive vierge nedoit subir de traitements autre que le lavage, la décantation, lacentrifugation et la filtration. Dans les huiles d’olive vierges, ondistingue trois catégories : l’huile d’olive vierge extra, l’huiled’olive vierge et l’huile d’olive vierge lampante. L’huile d’olivevierge lampante est impropre à la consommation en l’état. Elle estraffinée puis mélangée à de l’huile d’olive vierge pour donner del’huile d’olive qui devient alors consommable. L’huile de grignonsest obtenue par extraction avec des solvants ou des traitementsphysiques, à partir du tourteau restant lorsque l’huile d’olivevierge est extraite. Les méthodes d’analyses sont essentielles pourdistinguer ces différentes catégories d’huiles.

L’analyste va construire un arbre décisionnel pour choisir les cri-tères de qualité et de pureté en s’appuyant sur la réglementationen vigueur (figure 12).

– La qualité de l’huile d’olive vierge se détermine par l’acidité,l’indice de peroxyde, l’analyse spectrophotométrique, la teneur enesters éthyliques et l’examen organoleptique.

– La pureté de l’huile est déterminée par l’analyse des acidesgras, des stérols, des triglycérides par CLHP afin de rechercher laprésence éventuelle d’huiles étrangères. Ensuite, l’addition d’huiled’olive raffinée ou de grignons d’olive est recherchée par la déter-mination de la teneur en cires, de la teneur en stigmasta-3,5-diène,en érythrodiol et uvaol. Enfin, l’analyste va s’assurer de l’absencede résidus de solvants chlorés par un CPG équipé d’un détecteur àcapture d’électrons (§ 3.1).

Les grignons d’olive contenant de l’huile résiduelle peuvent fairel’objet d’une extraction par solvants. L’action du solvant a pour

Figure 11 – Analyse des triglycérides par CPG d’une huile de noix de coco adultérée par de l’huile de palme

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Colonne RTX-65 TG, L : 30 m, φint. : 0,25 mm, epfilm : 0,1 µm,1 : C30, 2 : C32, 3 : C34, 4 : C36, 5 : C38, 6 : C40, 7 : C42, 8 : C44, 9 : C46, 10 : C48, 11 : C50, 12 : C52, 13 : C54, 14 : POP, 15 : PLP, 16a : POS, 16 : POO, 17 : PLO, 18 : PLL, 19a : SOS, 19 : OOO, 20 : LOO


ques des huiles de pépins de raisins et de grignons d’olive. Cescomposés permettent de mettre en évidence ces deux huiles dansdes huiles d’autres natures.

effet la solubilisation et l’extraction en plus grande quantité de cer-tains composés [cires, alcools gras et di alcools triterpéniques(uvaol, erythrodiol)] de la peau de la drupe. La détection de ces



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composés à des teneurs anormalement élevées est la signature dela présence d’une huile de grignon d’olive.

La désodorisation des huiles vierges de qualité médiocre oulampantes par chauffage sous courant d’azote a pour effet d’éli-miner certains composés aromatiques générateurs de défauts.Au cours du processus de surmaturation des fruits, le méthanolou l’éthanol issus de la fermentation des fruits se combinent auxacides gras libres pour former des éthyl ou méthyl estersdétectables même après désodorisation. La présence de cescomposés dans une huile d’olive vierge extra, au-delà d’un cer-

La codification stricte de l’analyse organoleptique des huilesd’olive est une caractéristique de cette réglementation par rapportà celles des autres produits alimentaires. Cette analyse permet dejuger à la fois de l’état des olives avant trituration (olives gelées,olives chômées par dégradation anaérobie, olives moisies) et duvieillissement de l’huile (huile oxydée à caractère rance, huile àdéfaut de lies par fermentation des dépôts). Cette analyse organo-leptique réunit au moins 8 dégustateurs rigoureusement entraînéssur les 5 défauts majoritaires définis par l’annexe XII du réglementn˚ 2568/91 ainsi que sur l’évaluation de fruité, d’amer et depiquant.

Mais si l’huile d’olive est un produit parfaitement protégé, iln’est pas toujours nécessaire de réaliser des analyses aussi exper-tes afin de déterminer l’adultération d’un corps gras.

5. Différents référentielsde normes

Les référentiels analytiques utilisés par les laboratoires sont desources différentes selon leurs missions et permettent d’harmo-niser les pratiques. Les laboratoires de contrôle doivent préféren-tiellement utiliser, quand ils existent, des référentiels officielsd’application obligatoire : méthodes nationales fixées par arrêtés,voire européennes fixées par un règlement. Ces méthodes officiel-les peuvent également faire référence à des méthodes normalisées(on parle d’actes délégués) qui, en dehors de ces cas précis (1 %des cas), restent d’application volontaire. Étant élaborées de façonconsensuelle, elles participent au langage commun avec l’objectifd’organiser un haut niveau de qualité. Elles sont descriptives (nor-mes commerciales par filières, par exemple Codex alimentarius dela FAO, norme commerciale du Conseil oléicole international (COI)pour les huiles d’olive, norme marocaine concernant des huilesd’argan...), industrielles, méthodologiques et organisationnelles...Les normes sont regroupées par centres d’intérêt ougéographiques :

– les normes de l’American Oil Chemists’ Society (AOCS) ;

– les normes de l’Organisation internationale de standardisation(ISO) ;

– les normes de l’International Union of Pure and AppliedChemistry (IUCPA).

Ces normes sont souvent reprises en méthodes officielles ourecommandations par diverses normes commerciales internatio-nales de la filière des corps gras.

L’Association française de normalisation (AFNOR) est l’anima-teur central de la normalisation en France. Elle est organisée endivers secteurs (comités stratégiques, commissions de normalisa-tion constituées d’experts) et coordonne l’activité de normalisationnotamment avec les bureaux de normalisation sectoriels. L’AFNORest acteur de la normalisation européenne et internationale, elleest membre du Comité européen de normalisation (CEN) et del’ISO.

Les normes CEN (codifiées EN) remplacent obligatoirement lesnormes nationales de même objet (normes NF pour la France, DINpour l’Allemagne etc....), entraînant parfois des changements decodification. De fait, l’adoption d’une norme européenne (EN) (àl’exclusion des normes techniques type TS et TR de reprise facul-tative), équivalente à une norme nationale, supprime automatique-ment cette norme de la collection nationale et porte unecodification NF EN...

Figure 12 – Arbre décisionnel pour caractériser l’huile d’olive

Critères de puretéCritères de qualité

StigmastadiènesAcidité

Acides gras transIndice de peroxyde

Composition enacides gras

Extinction spécifiqueen UV

Analyse organoleptique

Alkyl esters

Éthyl esters

2-glycéryl monopalmitate

Solvants chlorés

Cires pour recherchede lampante

Composition en stérolsen teneurs

% en érythrodiol+ uvaol

Cires et si nécessairealcools aliphatiques

∆ ECN42


tain seuil, (cf. réglement n˚ 2568/91) indique que l’huile a subi unprocessus de désodorisation ou une adjonction d’huile d’olivevierge désodorisée.

Les normes ISO peuvent quant à elles être reprises dans les col-lections françaises de façon facultative et deviennent dans ce casdes normes codifiées NF EN ISO.



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6. Conclusion

Dans un certain nombre de cas, les paramètres physiques,physico-chimiques et les compositions en composés majeurs deslipides (acides gras, triglycérides, phospholipides) sont insuffisantspour caractériser et identifier les matières grasses. L’analyse descomposés mineurs (stérols, alcools triterpéniques, tocophérols,hydrocarbures...) constituants principalement l’insaponifiable,apporte des inform

analyse des lipides · 2020. 1. 30. · analyse des lipides _____ 1 g de corps gras fournit 9 kcal...

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