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Contrôle de la transcription de l’opéron lac

Les gènes de l’opéron lac sont contrôlés par une REGULATION NEGATIVE

Ils sont transcrits sauf s’ils sont sous la coupe d’une protéine régulatrice

Contrôle exercé par le répresseur

Quel est la nature du produit codé par le gène I ?Expérience PAJAMO (Pardee AB et al. (1959) J. Mol. Biol. 1, 173)

Conjugaison Hfr I+Z+ x F- I-Z-

On ne s’intéresse qu’aux cellules receveuses;les cellules donneuses sont tuées.

Démonstration de l’existence du répresseur lac : Expérience de conjugaison

*

Rôle du composant qui répond à l'inducteur (la protéine répresseur codée par lacI)dans le contrôle de la transcription des gènes structuraux lacZYA en réponse à l'environnement

Les gènes structuraux sont transcrits en un seul ARNm à partir d'un promoteur situé juste en amont de lacZ. L'état du répresseur détermine si ce promoteur sera initié ou non.

1- absence d'inducteur : pas de transcription, liaison à l'opérateur de la protéine répresseur (dans sa forme active).

2- addition d’un inducteur : transformation du répresseur en une forme inactive qui quitte l'opérateur. transcription débute alors au niveau du promoteur et se poursuit le long des gènes jusqu'à un terminateur situéquelque part au-delà de lacA.

Fonctionnement de l’opéron lac d’E. coli en l’absence de lactose

La protéine répresseur se fixe à l’opérateur et empêche la transcription.L’ARN polymérase peut se fixer au promoteur quand le répresseur est présent sur l’opérateur mais il ne peut y avoir initiation de la transcription.

*

Fonctionnement de l’opéron lac d’E. coli en présence de lactose

*

répresseur lac

Comment fonctionne le répresseur ?

le répresseur est contrôlé par une petite molécule inductrice

La synthèse d’enzymes en réponse à l’apparition d’un produit spécifique est appelée induction.

répresseur lac

Répresseur lac (suite)Le répresseur lac :

- un tétramère de sous-unités identiques de 360 résidus disposées selon 3 axes de symétrie d’ordre 2, mutuellement complémentaires(chaque sous-unité lie une molécule d’IPTG avec une constante de dissociation K = 10-6M)

1- en l’absence d’inducteur, liaison non spécifique du répresseur sous forme tétramérique à l’ADN double brin (K = 10-4M)

2- en présence d’inducteur, liaison spécifique du répresseur opérateur lac (affinité supérieure K = 10-13M).

Deux domaines fonctionnels pour chaque sous-unité :- un domaine N-terminal de 58 résidus : liaison à l’ADN (mais pas à l’IPTG)- le restant : liaison à l’IPTG.

Le répresseur lac trouve l’opérateur en se liant de façon non spécifique à l’ADN et en diffusant sur sa longueur selon une recherche à une dimension.

Le répresseur se fixe à un ADN double-brin contenant la séquence de l'opérateur lac de type sauvage. Le répresseur ne se fixe pas à un ADN de mutant Oc. L'addition d’IPTG in vitro libère le répresseur de l'ADN opérateur.

*

répresseur lac

Fixation à l’opérateurPièce maîtresse

Fixation de l’inducteurcœur

OligomérisationDomaine C-terminal

Structure de la sous-unité du répresseur lac.Il existe plusieurs domaines indépendants

dans la molécule.

* (Lewis et al. (1996) Science 271, 1247)

répresseur lac

IMPLICATIONS STRUCTURALES de l’INDUCTIONChangement de la structure du noyau par l’inducteur : les pièces maîtresses d’un répresseur ne sont plus dans une orientation qui permet la fixation à l’ADN.

En bleu : domaine de fixation à l’ADNEn rouge : hélices α impliquées dans la tétramérisationEn vert : sites de fixation de l’inducteurEn jaune: petites hélices de liaison

Structure d’un dimère du répresseur lac*

Annexe 13

Model of lac repressor tetramer (4 polypeptides) protein.

Effet de l’IPTG sur la structure du répresseur lacLa structure du répresseur lac sur lequel est fixé l’inducteur IPTG est présentée en orange; superposée à cette structure est présentée, en violet, la structure du répresseur lac associé à l’ADN.La fixation de l’IPTG induit un changement de la structure du répresseur ce qui altère les contacts établis avec l’ADN.

Modèle de liaison d’un répresseur tétramérique à deux opérateurs

Lorsqu’un répresseur tétramérique se fixe à 2 opérateurs,la séquence d’ADN entre eux est contrainte en une boucle étroite.

La structure en bleue au centre de la boucle d’ADN est la protéinerégulatrice CAP, qui se fixe dans la même région.

Boucle de l’ADN (fragment de 93pb) forméelorsque le répresseur lac est fixé en O1 & O3.

Séquence de l’opérateur

- l’opérateur lac occupe ~ 35 bp

- il est situé en aval du promoteur et couvre celui-ci

- il présente 2 séquences symétriques (séq. palidromique imparfaite)

- ~22 bp sont protégées des nucléases lors d’une expérienced’empreinte

- l’affinité du répresseur pour l’opérateur est 4x106 plus forte quepour une séquence d’ADN quelconque

Opérateur lac

opérateur

*

Interactions entre l’opérateur et le répresseuropérateur

La séquence des bases de l’opérateur lac

*

opérateur

L’opérateur possède une caractéristique commune à de nombreux sites de reconnaissance : il est palindromique.Il est formé de 2 séquences répétées inversées; chaque répétition peut être considérée comme un demi sitepour l’opérateur.

Séquence de l’opérateur lac : centré autour d’un GC en +11

résumé

Footprints of RNA polymerase and lac repressoron lac control-region DNA.

résumé

Séquence nucléotidique de la région promoteur lac-opérateur lac d’E. coli, depuisla région C-terminale de lacI (à gauche) à la région N-terminale de lacZ.Les séquences palindromiques de l’opérateur et le site de liaison de CAP sont surlignéesou soulignées (d’après Dickson RC et al., Science 1975 187, 32)

Le répresseur et l’ARN polymérase se fixent sur des sites qui se chevauchent au niveau du point de départ de l’opéron lac.

*

opérateur

L’opéron lac comprend 3 sites de fixation pour le répresseur lac.

O2

O1

O3

: the original operator

: 410 bp downstream in lacZ

: 83 bp upstream in lacI*

L’opéron lac est également soumis à une régulation positive

Un autre mécanisme régulateur appelé répression catabolique est mis en œuvre.

Répression catabolique : mis en évidence

Phénomène de diauxie

Le colibacille (E. coli) utilise le glucose du milieu comme source d’énergie.Si on remplace le glucose par du lactose, la croissance cesse.La croissance reprend rapidement lorsque les cellules ont produit les enzymes nécessaires à la conversion du lactose en glucose.

Quand deux sources de carbone particulière sont présentes ensembles dans le milieu de culture, la courbe de croissance est biphasique : phénomène de diauxie.

*

Répression catabolique

Cinétique de synthèse de l’ARNm de l’opéron lac suite à l’induction par l’IPTGpuis après addition de glucose.

Glucose : métabolite de choix d’E. coli

*

Comment s’exerce l’effet du glucose ?

L’effet répressif du glucose est médié par l’AMPc et une protéine appelée activateur des gènes cataboliques (CAP ou CRP)

Mécanisme de transport des sucres chez E. coli

La plupart des sucres sont transportés chez E. coli par le système PTS : phosphotransférase dépendante du PEP

Les sucres transportés sont phosphorylés lors de leur acheminement dans la cellule.Ainsi le glucose entre dans la cellule sous la forme de glucose-6-phosphate.

Le groupement phosphate est transféré au PEP par l’intermédiaire d’une série de protéines.

P roducti on d’ AMP c

Glucose

Glucose-6-phosphate

Entrée du glucose dans la cellule bactérienne

EN PRESENCE DE GLUCOSE

ACTIVATION de GENES

*

Répression catabolique

CRP ( cy cl ic AMP [ cAMP ] re cep tor p rote i n) , également appelée C AP ( ca tab ol ite a ctiva tor p rote in)

L’AMPc s’accumule quand le glucose est absent.

Quand le glucose est présent

- l’adénylate cyclase est inhibée

- AMPc phosphodiestérase est activée.

ATP

AMPc

AMP

Adénylcyclase

AMPc phosphodiestérase

-

glucose

+

glucose

*

La répression catabolique : plus généralement

représente un système de coordination générale de régulationsystème qui marque sa préférence pour l’utilisation du glucose en inhibant l’expression des opérons

qui codent les enzymes des voies métaboliques alternativesdéclenchée dans la cellule par la réduction de la concentration de l’AMP cyclique (AMPc)

N

NN

N

NH2

O

OHO

O

PO

O-

Structure de l’AMP cyclique (AMPc)

Répression catabolique

Le glucose entraîne une répression des catabolites en diminuant la concentration de l’AMPc.

Concentration réduiteen AMPc

glucose

AMPc

CAP active CAP inactive

transcription Pas de transcription

Répression catabolique

Sucre(s) dans le milieu de culture

Quantité relative de β-galactosidase

Glucose 1

Glucose + lactose 50

Lactose 2500

induction répression

*

Les niveaux de contrôle de l’expression de l’opéron lac

3 Scénarios :1- Pas de lactose présent

• L’opéron est “éteint”, pas d’ARNm synthétisé

2- Lactose présent; glucose présent également• La présence du lactose inactive le répresseur

il y a Transcription• Parce que le Glucose est présent cAMP est faibleCRP ne peut aider la transcription

3- Lactose présent; pas de glucose• la présence de lactose inactive le répresseur

il y a Transcription• Il n’y a pas de Glucose [cAMP] est élevée cAMP

se fixe à la CRP (activation) CRP se fixe & ‘aide’ la transcription

• Niveau élevé de transcription

CAP est un régulateur positif et l’AMPc la molécule inductrice

Le produit du gène I (répresseur lac) est un régulateur négatif;le lactose ou l’IPTG la molécule inductrice.

*

CRP

CAP : CAP : cece qu’ilqu’il fautfaut retenirretenir

1- active la transcription de plus de 100 promoteurs (facteur de transcription global).

2- protéine d’environ 45 kDa qui se fixe à l’ADN sous la forme d’un dimère (2 sous-unités identiques.

3- le 1er des activateurs transcriptionnels a avoir été isolé (1970) et le 1er pour lequel la structure 3D a été déterminée.

4- en présence d’AMPc, forme un complexe (CRP-AMPc) qui se fixe à une séquencecible de 22pb, située près ou au sein du promoteur qu’il contrôle

5- active la transcription du fait de contacts protéine-protéine avec l’ARNpolymérase

*

La protéine CRP : organisation structurale

*

CRP

Structure du complexe AMPc-CAP avec un ADN duplex comprenant un motif palindromique de 30pb.

CRP

Séquence consensus pour la fixation de la protéine CAP

AANTGTGANNTNNNTCANATTNNTTNACACTNNANNNAGTNTAANN

Pentamère hautement conservé Pentamère moins conservé

La séquence reconnue par CAP contient le pentamère TGTGA qui est bien conservé et (parfois) une inversion de cette séquence (TCANA).

CRP

La protéine CAP crée un coude de plus de 90° dans l’ADN autour du centre de symétrie.

Cooperative binding of Lac Repressor results in the formation of a DNA Loop

Lac Repressor = tetramer

*

O1 O2

CRP Site de fixation de l’AMPc-CAP

-70 -60 -505’ATGTGAGTTAGCTCACACATT3’TACACTCAATCGAGTGTGTAA

A TT A

Mutations rendant le promoteurindifférent à CAP

Axe de symétrie

Nucléotides aux contacts de l’AMPc-CAP

Promoteur

*

CRP

Démonstration expérimentale du rôle joué par la protéine CAP dans l’expression de la β-galactosidase

A mutant CRP protein with 10 lower affinityfor cAMP: if cAMP-CRP complex important foractivation then mutant should have reducedproduction of β-galactosidase

CRP

CAP

-41

-61

-92

+1

AraC

Sites de liaison de CAP

- en des positions différentes par rapport au point de départ de la transcription- le pentamère TGTGA orienté dans un sens ou dans l’autre

1- site de liaison de CAP : à l’intérieur du promoteur cas du locus gal2- site de liaison de CAP : adjacent au promoteurcas de l’opéron lac3- site de liaison de CAP : en amont du promoteurcas de l’opéron ara

CRP

Il existe 3 classes de promoteurs dépendant de CAP :

ClasseClasse I I –

- promoteurs qui requièrent uniquement CAP pour qu’il y ait activation

- promoteurs avec un seul de liaison pour CAP, localisé en amont du promoteur

Le site pour CAP peut être à des positions différentes mais toujours sur la même face de l’ADN

EXEMPLE : opéron lac

-61

lac AR1

CAP réalisedes contacts avec le α-CTDde l’ARN pol.

CRP

ClasseClasse IIII-

Promoteurs requièrent uniquement CAP pour qu’il y ait activation

Promoteurs présentent un seul site pour la protéine CAP qui recouvre le promoteur remplaçant la boîte –35

EXEMPLE : gal P1

-41.5

CRP

ClasseClasse IIIIII- promoteurs requièrent 2 exemplaires (ou plus) de la protéine CAP

Exemples: araBAD & malK.

Positions et séquences des 3 opérateurs

Effets de mutations sur chacun des 3 opérateurs

*

Le Le rép resse urrép resse ur laclac i nh ibeinh ibe la tra ns crip ti on e n f orma nt la tra ns crip ti on e n f orma nt uneune b oucl e b oucl e da nsda ns l ’ ADNl ’ ADN

DifférentsDifférents modèlesmodèles

1- région promotrice de l’opéron lac2- transcription3- répression : modèle 1 : fixation du répresseur en O1 & O3,

promoteur libre, site CAP toujours occupéARN pol. pas fixée au promoteur

4- répression : modèle 2 : fixation du répresseur lac en O1 & O2,site CAP toujours occupé,ARN pol fixée au promoteur mais pas de synthèse d’ARN car blocage de l’ARN pol. par le répresseur

*

Pour résumer

- en l’absence de lactose, une protéine tétramérique, possédant deux sites de fixation à l’ADN se fixe, en premier lieu, sur le principal opérateur O1 puis soit sur O2 soit sur O3.Deux des quatre sous-unités du répresseur reconnaissent O1; les deux restantes reconnaissant soit O2 soit O3.

- en général le répresseur se fixe en O1 & O3 provoquant la formation d’une structure en boucle de l’ADN entreles deux sites ce qui empêche l’ARN polymérase de se fixer au promoteur et donc d’initier la transcription.

- en fait la transcription n’est pas complètement bloquée : une faible transcription a lieu même en la présencedu répresseur fixé en ses opérateurs.

- en présence de lactose, la lactose perméase permet, dans un premier temps, l’entrée d’une petite quantité delactose, lequel est transformé en allolactose (un isomère structural du lactose) par la β-galactosidase.

- l’allolactose se fixe alors en des sites de la protéine répresseur provoquant un changement de conformation de celle-ci ce qui la rend incapable de se fixer aux séquences opérateur.

- ainsi, avec l’opérateur « libéré » du répresseur, l’ARN polymérase peut se fixer à la région promotrice et initierla transcription.

*

1

2

Cooperative binding of cAMP-CAP and RNAP on the lacpromoter

cAMP-CAP contacts the α-subunits of RNAP and enhances the binding of RNAP to the promoter.

Motif « Helix-Turn-Helix «These structures show three sequence-specific DNA-binding proteins that interact with DNA through a helix-turn-helix motif (highlighted in yellow). In each case, the helix-turn-helix units within a protein dimer are approximately 34 Å apart, corresponding to one full turn of DNA.

Un exemple d’utilisation en génie génétique de l’opéron lacPhénomène d’α-complémentation

α-complémentation

Utilisation de souches bactériennes mutantes dans le gène lac Z :synthétisent une β-galactosidase incomplète (dépourvue d'une séquence appelée peptide α) et

inactive.

La séquence codant le peptide α peut être apportée en trans par un plasmide ;

seul, le peptide α n'a aucune activité enzymatique, mais associé avec la protéine codée par lac Z' il restaure l'activité β-galactosidase de la protéine mutante.

site actifα-peptide

lacZ

Protéine tétramériqueACTIVE

site actifα-peptide

lacZ’lacZ (∆M15)délétion de 90pb

α-complémentation α-peptideProtéine dimériqueINACTIVE

Protéine ACTIVE

*

Genomic LacZ (∆15 mutant)

β-galactosidase

X-Galwhite

Genomic LacZ (∆15 mutant)

β-galactosidaseX-Galwhite

Plasmid encoded LacZ’

α

X-gal product

Suivi de la réaction catalysée par la β-galactosidase

Le galactoside substrat X-Gal forme, suite à son hydrolyse, un produit coloré.

pBluescript : vecteurs de clonage permettant de distinguer les bactéries véhiculant un vecteur recombinant de celles qui véhiculent un vecteur non recombinant. Caractéristique majeure : le segment du gène lac Z codant pour le peptide α est placé à cheval sur les sites de clonage.

2 situations :1- lorsque l'ADN est inséré à ce niveau, il interrompt le peptide α et les colonies bactériennes

apparaissent blanches sur les boîtes de Pétri. 2- par contre, si aucun ADN n'est inséré, l'α complémentation peut avoir lieu et les bactéries

apparaissent bleues.

+/- insert