l'expression d'un gène (classe ii) en une protéine...
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Séminaire Résidentiel InterdisplinaireSéminaire Résidentiel InterdisplinaireFaculté Faculté des Sciencesdes Sciences
1919--21 21 janvier janvier 20092009Duinse PoldersDuinse Polders BlankenbergeBlankenberge
L'expression L'expression d'un d'un gène gène ((classe classe II) en II) en une une protéine fonctionnelle protéine fonctionnelle : : une activité une activité
complexe dont complexe dont le le résultat est difficilement résultat est difficilement prévisible prévisible ??
T. T. ArnouldArnould
Plan de Plan de l’exposé l’exposé •• Partie Partie I : I : l’expression l’expression de de gènesgènes
* Les * Les acteurs acteurs et et mécanismes mécanismes de base :de base :–– ADNADN–– Transcription : les Transcription : les facteurs facteurs de transcription et les de transcription et les activateursactivateurs–– TraductionTraduction
•• Partie Partie II : la II : la régulation régulation de de l’expression l’expression de de gènes est gènes est le le résultat résultat de de nombreuses nombreuses influences influences opposées opposées -- activation activation ou répressionou répression
* * Nécessité Nécessité de de l’intégration l’intégration desdes signauxsignaux……–– Régulation transcriptionnelle Régulation transcriptionnelle ::
•• Interactions au Interactions au niveau du promoteur niveau du promoteur et et combinatoire combinatoire desdes facteurs facteurs de transcription de transcription activateurs activateurs et et cofacteurs cofacteurs (ADN)(ADN)
•• Régulation épigénétique Régulation épigénétique (ADN et (ADN et chromatinechromatine))–– Régulation postRégulation post--transcriptionnelle transcriptionnelle ((ARNmARNm))–– Régulation Régulation de la de la traduction traduction ((ProtéinesProtéines))–– Régulation postRégulation post--traductionnelle traductionnelle ((ProtéinesProtéines))
Le Le dogme dogme central…central…
ADN
Les protéines fonctionnelles qui assurent la chimie Les protéines fonctionnelles qui assurent la chimie cellulaire…destination finale du voyagecellulaire…destination finale du voyage
Les protéines :- représentent plus de 50 % de la masse sèche des cellules
- interviennent dans toutes lesfonctions cellulaires
Grande variété et diversification énorme des structures-fonctions
Structure : une classe de protéines (fibreuses) peut comporter des molécules très différentes (kératines, fibrine caillot sanguin, collagène, fibroïne de la soie, …)Fonction : les enzymes = catalyseurs (protéines globulaires)
Les Les acides aminés acides aminés : : briques briques de construction des de construction des protéinesprotéines
PolymPolymèère re linlinééaire composaire composéé dd’’acidesacidesaminaminéés (20 diffs (20 difféérents) rents) polympolyméérisriséés dans un ordre bien s dans un ordre bien ddééfini (= sfini (= sééquence)quence)
La chaLa chaîîne latne latéérale (R) :rale (R) : ddéétermine termine les propriles propriééttéés sps spéécifiques de cifiques de chaque acide aminchaque acide aminéé
La liaison La liaison peptidiquepeptidique
Structure - FonctionAugmentation de la température, ∆pH, changements [sels],…
Qu’estQu’est--ce qu’un gène ce qu’un gène ??•• Les Les gènes codent gènes codent pour des pour des protéinesprotéines…pas …pas toujours toujours !!!!!!•• 1 à 2 % de 1 à 2 % de l’ADN l’ADN -- chez chez l’homme l’homme ::
–– 3,6 103,6 1099 paires paires de basesde bases–– ± 25000 ± 25000 gènes mais gènes mais ± 10± 1066 de de protéinesprotéines…(4 …(4 mécanismes mécanismes : EA, PA, : EA, PA,
MPT et “mRNA editing”)MPT et “mRNA editing”)•• Domestiques Domestiques : tout le temps : tout le temps dans toutes dans toutes les cellulesles cellules•• Spécifiques Spécifiques : tout le temps : tout le temps dans certaines dans certaines cellulescellules•• Régulés Régulés : à : à certains certains moments moments dans certaines dans certaines cellulescellules
•• La Transcription La Transcription du gènedu gène……en un en un transcrit transcrit ((ARNmARNm) stable ) stable
Rôle dRôle du promoteur u promoteur central/proximal d’un central/proximal d’un gène gène : : recruter l’ARN pol recruter l’ARN pol par par l’intermédiaire l’intermédiaire de de facteurs facteurs de transcription…de transcription…
Complexe d’initiation eucaryoteComplexe d’initiation eucaryote
Promoteur central
Promoteur : courte séquence d’ADN non transcrite par l’ARN Pol mais qui s’y lie…(fort ou faible)
+ 1
La transcription de La transcription de l’ADN l’ADN en copies en copies d’ARNm d’ARNm ::ARN ARN polymérase polymérase IIII
Elongation et Terminaison
± 50 à 200 nucléotides/sSchéma d’une bulle de transcriptionSchéma d’une bulle de transcription
Les facteurs de transcription
• Les facteurs généraux de transcription : nécessaires àl’initiation de la synthèse de l’ARN au niveau des gènes de classe II. Ils forment avec l’ARN pol II un complexe au niveau du site d’initiation de la transcription et déterminent ainsi le site de démarrage de la transcription
• Les facteurs de transcription spécifiques : possèdent un rôle régulateur et participent à l’induction ou à la répression. Ils sont synthétisés ou activés d’une manière spécifique dans les cellules en réponse à des signaux. Les séquences qu’ils reconnaissent sont appelées les éléments de réponse.
Les Les promoteurs eucaryotes promoteurs eucaryotes : complexes, : complexes, spécifiques spécifiques et et capables capables d’d’être être liliéés s par des par des facteurs facteurs de transcription de transcription spspéécifiques/activateurs cifiques/activateurs ((± 1000) qui qui lient lient des des ssééquences quences particuliparticulièères res en en amontamont. . Ils contrôlent Ils contrôlent le le niveau dniveau d’’expression expression dd’’un un ggèènene…à…à la la demandedemande……en en fonction fonction des conditionsdes conditions……
Modifications Modifications postpost--transcriptionelles transcriptionelles de de l’ARNml’ARNm
Addition d’un GTP méthylé à A ou G
Protège de la dégradation : stabilité de l’ARNm
Initiation de la traduction
La La TraductionTraduction……en en une protéine conforméeune protéine conformée… …
Le code génétique est à tripletsIl faut 3 nucléotides pour spécifier un acide aminé donné
Ce qui offre 43 = 64 possibilités.
Brin transcrit/modèleADN
Le cadre de lectureA AUU GCC GUG C.. et non ..AAU UGC CGU GC..
Ile - Ala - Val Asn - Cys - Arg
Les Les ribosomes ribosomes
•• Complexes Complexes d’ARN d’ARN ribosomiques ribosomiques ((ARNr ARNr : : principales unités principales unités catalytiquescatalytiques) et de ) et de protéines ribosomiques protéines ribosomiques ((rrôle ôle structural)structural)–– ribozymeribozyme
•• Sites :Sites :–– E (exit)E (exit)–– P (P (peptidylpeptidyl))–– A (A (aminoacylaminoacyl))
Structure atomique : 0,24 nm
La série de codons alignés sur l’ARNm est « interprétée » par une série de molécules d’ARN de transfert (ARNt). Les différents ARNt fixent chacun un acide aminé pour l’acheminer vers les ribosomes. Cette réaction est catalysée par différentes aminoacyl-ARNt synthétases qui sont des enzymes d’activation. Chaque ARNt traduit un certain codon de l’ARNm en l’acide aminé correspondant.
La traduction
ARNt
Initiation de la Initiation de la traduction traduction des des transcrits transcrits en en protéinesprotéines… … ((Holick Holick et al., Nature et al., Nature Molecular Biol RevMolecular Biol Rev, 2005), 2005)
* Poly A : 20-200 A(stabilité - traduction)
Les acides aminés sont ajoutés un à un selon un cycle de trois phases :- reconnaissance du codon par l’ARNt correspondant (2 GTP)- formation de la liaison peptidique- translocation : le ribosome passe au codon suivant, l’ARNt portant la protéine en croissance passe du site A au site P et l’ARNt vide passe au site E avant de quitter le ribosome (1 GTP).
L’élongation de la traduction
Quand le ribosome arrive au codon stop (UAG, UAA ou UGA pour lesquels il n’existe pas d’ARNt), un facteur de terminaison se lie, ajoute une molécule de H2O au dernier acide aminé pour hydrolyser la liaison protéine-ARNt et la protéine est libérée.L’ARNm et les deux sous-unités du ribosome se dissocient ensuite.
La terminaison de la traduction
Transcription et traduction : résumé
•• Partie Partie II :II :
•• Quelques exemples Quelques exemples de de régulations dont régulations dont la la combinatoire est complexe combinatoire est complexe et rend et rend difficile difficile le le pronostic du résultat pronostic du résultat de de l’expression l’expression d’un d’un gène gène donnédonné……
•• Les Les nombreux niveaux soumis nombreux niveaux soumis à de à de très très nombreuses régulations donnent parfois nombreuses régulations donnent parfois desdessurprises surprises sur sur le le résultat attendurésultat attendu……
Intégration : des voies de signalisation cellulaires conduisent àactiver les facteurs de transcription
Série d’événements séquentiels….…la bonne protéine……à la bonne place……au bon moment……en bonne quantité…
N
N
N
N
L929 L929 (mtDNAd)
Parmi Parmi les les mécanismes d’activation mécanismes d’activation des des facteurs facteurs de transcription : le de transcription : le clivage protéolytique clivage protéolytique contrcontrôlôléé ou partiel ou partiel ((CholestCholestéérolrol--SREBPsSREBPs))
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Bengoechea-Alonso and Ericsson, 2007
La phosphorylation d’un facteur de transcription : l’origine de La phosphorylation d’un facteur de transcription : l’origine de son activation ou de son inactivation (changement de son activation ou de son inactivation (changement de localisation, répulsion avec l’ADN,…)localisation, répulsion avec l’ADN,…)
Modifications Modifications postpost--traductionnelles traductionnelles d’un d’un facteur facteur de de transcription : p53 transcription : p53 (Olsson, et al., 2007, Cell Death and Differentiation)(Olsson, et al., 2007, Cell Death and Differentiation)
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Domain-structure of human p53. The p53 protein consists of six major domains: TAD1 and 2; amino-acid residues 1ﾐ43 and 44ﾐ60; the PRD, residues 40ﾐ92; the DBD, residues 100ﾐ300, the 4D, residues 307ﾐ355, and the CTD, residues 356ﾐ393). NLS, nuclear localization signal; NES, nuclear export signal. Post-translational modifications are depicted in the individual domains of p53: P (phosphorylation), Ac (acetylation), Ub (ubiquitination), M (methylation), and SU (sumoylation)
L’activité transactivatrice (et autre) est fonction de l’intégration de ces signaux…une combinatoire difficile à prédire…
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Expression de gènes
L’activité L’activité des des facteurs facteurs de transcription de transcription contrcontrôlôléée e en en amont amont par les par les voies voies de de signalisationsignalisation……
•• Affinités Affinités de liaison de liaison différentesdifférentes•• Compétitions Compétitions (sites (sites reconnus reconnus par 2 par 2 ou plusieurs ou plusieurs
facteurs facteurs de transcription)de transcription)•• Coopération Coopération (SREBP + Sp1 : (SREBP + Sp1 : renforcementrenforcement))•• Antagonisme Antagonisme : YY: YY--1, 1, effet répresseureffet répresseur
–– Saturation Saturation biphasique biphasique des sites…(1 site + et 1 site des sites…(1 site + et 1 site --pour un pour un mmême facteur ême facteur de transcription)de transcription)
Un Un promoteur promoteur : : contient contient de de nombreux nombreux sites de liaisons sites de liaisons pour de multiples pour de multiples facteurs facteurs de transcriptionde transcription
LDLrTATAYY1YY1Sp1SREBPYY1Sp1YY1YY1
-122 -118 -100 -75 -65 -49 -26 -23
+ +-++
- - - -
CCAT/ACAT
Les facteurs de transcription activLes facteurs de transcription activéés (monoms (monoméériques riques ou ou homohomo--/h/hééttééroro--multimmultiméériques riques recrutent des recrutent des cofacteurs (cocofacteurs (co--activateurs ou coactivateurs ou co--rréépresseurspresseurs……))
Une difficulté Une difficulté de de prédiction prédiction : : l’interférence l’interférence des des voies voies de de signalisation conduisant signalisation conduisant à des à des signaux signaux contradictoirescontradictoires……
Regulation par “squelching”Regulation par “squelching”
Domaines de transactivation d’un FT est en interaction avec des co-activateurs/co-répresseurs (faible abondance).
Plusieurs domaines de transactivation de différents FT compètent pour ces molécules…
“Squelching” : modification de la transcription d’un gène donné suite à la séquestration de molécules en quantités limitantes (co-activateurs/co-répresseurs) par d’autres FT activés au niveau d’autres promoteurs…
Cahill et al., Febs Letters, 1994
Les cofacteurs (co-activateurs ou co-répresseurs) directs ou indirects possèdent souvent, respectivement, une activité Histone Acetyl-Transferase (HAT) ou Histone Deacetylase (HDAC)
LL’’accessibilitaccessibilitéé des des acteurs acteurs àà ll’’ADN ADN : : mméécanismes canismes éépigpigéénnéétiquestiques
Variations héritables dans l’expression génique après division cellulaire (mitose/méiose) qui ne sont pas provoquées par des changements dans la séquence de l’ADN…
MMéécanismes canismes ::
MMééthylation thylation de de ll’’ADNADN et et modifications modifications postpost--traductionnelles traductionnelles des des histoneshistones……
Impact :Impact : remodeler remodeler la la chromatine chromatine en en domaines domaines euchromatineeuchromatine, , ou ou hhééttéérochromatine rochromatine constitutive constitutive ou ou facultativefacultative……
Localisation Localisation des modifications des modifications épigénétiques sur épigénétiques sur les les queues des queues des histones histones : un code : un code difficiledifficile……une mune même ême modification modification peut avoir peut avoir des des effets opposeffets opposéés selon s selon ll’’histone touchhistone touchééee……
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Euchromatine Euchromatine versusversus HétérochromatineHétérochromatine……qu’estqu’est--ce ce qui qui change ?change ?
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Enzymes de modifications : une balance subtile entre des activités opposées…
Impact global et simplifié des régulations Impact global et simplifié des régulations épigénétiques épigénétiques sur sur la transcription : acétylation et la transcription : acétylation et méthylation méthylation (ADN/Histones)(ADN/Histones)
A = H4 AcétylationM = H3 K9 MéthylationM= DNA Méthylation
Chromatine non condensée "beads on a string" + PRC : condensation et aggrégation en « clumps »
Modifications de la Modifications de la chromatine chromatine : un : un mécanisme mécanisme à la à la base de la base de la différenciation cellulairedifférenciation cellulaire
Modifications Modifications épigénétiques dans épigénétiques dans les cancers…les cancers…
Régulation post-transcriptionnelle de l’expression par des miRNA (microRNA)
* ARN double-brin de ~22 bp généré à partir d’un transcript endogène de 60-80 nt (pre-miRNA) avec une structure hairpin.
=> La voie des miRNA est un mécanisme utilisépar la cellule pour réguler l’expression génique au niveau post-transcriptionnel.
Chez l’homme : ± 1000
Base de données miRNA:http://microrna.sanger.ac.uk/
PRIX NOBEL Médecine/Physiologie 2006 : Caractérisation de
l’effet RNAi chez Caenorhabditis elegans
Fire A., Mello C. (1998) Nature 391 p 806
La phosphorylation du facteur eIF2La phosphorylation du facteur eIF2α α bloque la traduction bloque la traduction ((HolickHolick, Nature , Nature Molecular Biol RevMolecular Biol Rev, 2005), 2005)
+ Aconitase
Les modifications postLes modifications post--traductionnelles changent l’abondance, l’état traductionnelles changent l’abondance, l’état fonctionnel, la localisation d’une protéine…et la nature de ses fonctionnel, la localisation d’une protéine…et la nature de ses partenairespartenaires(Mann (Mann and and Jensen, Nature Jensen, Nature Biotech Biotech 2003)2003)
Protéines
PhosphorylationpTyr
pSer,pThrRéversible,
Activation/InactivationModulation interactions
Signalisation
GlycosylationN-linkedO-linked
Protéines sécrétées/intraInteractions cellules-cellules
Signalisation O-GlcNAcRégulation activité enzymes
AcétylationHistones,…
Modulation interactions Protéines-DNA
Stabilité des protéines
UbiquitinationLys
Signal de dégradation protéasomeStabilité protéique
AcylationFarnesylationMyristoylationPalmitoylation
Localisation cellulaireMédiateur interactions protéiques
Signalisation
Hydroxylation ProlineStabilité
Interactions protéines
MéthylationDNA/Histones
Régulation expression de gènes
SulfatationTyr
Modulation interactions protéinesRécepteur-ligand
Formation ponts disulfures-S-S-
Intra-IntermoléculairesStabilité protéique
NitrosylationTyr
Module les interactions, la localisation et la stabilité…
L’abondance d’une protéine L’abondance d’une protéine : un : un équilibre entre équilibre entre synthèse synthèse et et dégradationdégradation…(“turn over” et “steady state”)…(“turn over” et “steady state”)
Core 20S : 28 sous unités α7,β7, β7, α7chymotrypsin-like, trypsin-like, and peptidylglutamyl peptide hydrolysing (PGPH)
Conclusions…Conclusions…•• I. I. Malgré Malgré la la complexitécomplexité……chaque chaque cellule de cellule de notre notre
corps corps exprime exprime des des dizainesdizaines, des , des centainescentaines, , voir voir des des milliers milliers de de gènes gènes à à chaque chaque instant…et instant…et cece, , en en nombreuses nombreuses copies de copies de protéines protéines fonctionnellesfonctionnelles
•• II. Pour les techniques II. Pour les techniques d’étude d’étude et les et les pronostics pronostics : attention à : attention à utiliser une méthode utiliser une méthode qui qui rende rende le le mieux compte mieux compte de la de la protéine fonctionnelle protéine fonctionnelle et et attention aux attention aux prédictions prédictions non non validées sur validées sur base base de de résultats obtenus résultats obtenus pour des pour des événements très événements très précocesprécoces…(activation d’un …(activation d’un facteur facteur de de transcription, transcription, abondance abondance relative d’un relative d’un transcrittranscrit,…).,…).
Pour Pour une une vision vision dynamique dynamique de de certains certains mécanismes mécanismes et et processus mentionnésprocessus mentionnés……
•• http://www.youtube.com/watch?v=41_Ne5http://www.youtube.com/watch?v=41_Ne5mS2ls&feature=relatedmS2ls&feature=related
•• Merci de Merci de votre votre attention…attention…