roxan, une nouvelle protéine cellulaire interagissant avec la protéine non-structurale nsp3 du...

RoXaN, une nouvelle protéine cellulaire interagissant avec la protéine

non-structurale NSP3 du Rotavirus

Pierre Lindenbaum

9 Juin 2000

Directeur de thèse: Dr. Didier PONCET. INRA/VIM/Laboratoire de Biologie Moléculaire des Rotavirus 78352 Jouy-en-Josas CEDEX

IntroductionRotavirus

L'initiation de la traduction

RésultatsRoXaN

Reconstitution

Analyse de la séquence de RoXaN

Interaction avec NSP3

Interaction avec eIF4G/NSP3

Interaction avec d'autres protéines

Discussion

Perspectives

Propriétés des TPR

Fonction de RoXaN

Obtention d'un sérum dirigé contre RoXaN

Double-Hybride

Impact du Rotavirus dans le monde

40% des enfants diarrhéïques de moinsde 5 ans.

300 000 000 $ en frais d'hospitalisation aux U.S.A.

Impact agronomique

1 000 000 décès/an

Principale cause des gastro-entheritesd'origine virale touchant les jeunesmammifères.

1

234

5

6

9

10

11

78

VP4

VP7

VP2

VP6

CORE

Protéine

VP1

VP2VP3

VP4

NSP1

VP6

NSP3NSP2VP7

NSP4

NSP5, NSP6

Segmentd'ARNdb

Structure du Rotavirus

c

ccc

c

c

c

c

c

Noyau

VP1VP2VP3VP4VP6

NSP1VP7

NSP2

NSP3

NSP4

NSP5

c

c

VIROPLASME

Traduction desprotéines Virales.

Réplication.

c

RETICULUM

Le cycle du Rotavirus

Comparaison des ARNm viraux / cellulaires

AUGUGACC 3'Coiffe ORF

ARNm virauxNSP3

AAAAAAAAAA 3'Coiffe ORF

ARNm cellulairesPABP

La protéine Non-Structurale NSP3

Liaison à l'ARN Liaison à l'eIF4G

Région "coiled-coil"



RésultatsRoXaN

Reconstitution





Discussion

Perspectives


Fonction de RoXaN


Double-Hybride

Rappels sur le Double Hybride

Milieu Leu-Trp-His-

Milieu Leu-Trp-His-

• Les Protéines X et Y interagissent:

• Les Protéines X et Yn'interagissent pas:

Liaisonà l'ADN

GAL4

X

GAL4Domaine activateurY

UAS HIS

Levure Leu- Trp- His-

APPÂT

PROIE

Double Hybride et transactivation

Liaisonà l'ADN

GAL4

X

UAS HIS



RésultatsRoXaN

Reconstitution





Discussion

Perspectives


Fonction de RoXaN


Double-Hybride

P|

P|

eIF4G

4EPABP

AAAAAAAAAAA

4A

40 SeIF3

m7G

AUG

MnKI

Erk1, Erk2, p38AAU

MAPK + FRAP/mTOR

4E

4E-BP4E-BP

eIF4GI est le support de l'initiation de la traduction

NSP3 interagit avec eIF4G

GAL4Domaine activateur

eIF4GI

m88-

NS

P3

Liaisonà l'ADNGAL4

Déplacement de la PABP par NSP3

4G

4A 4E

Cellules infectéesNSP3 déplace la PABP de EIF4G et permet la

traduction des ARN m viraux

5'Cap

NSP3AUGUGACC 3'

ARN viral

4G

4A 4ECellules non infectées

Traduction des ARNm polyadénylés.

5'Cap

PABPARN cellulaire

eIF4F

AAAAAAAAAAAA 3'

PABP

NSP3



RésultatsRoXaN

Reconstitution





Discussion

Perspectives


Fonction de RoXaN


Double-Hybride

Découverte de RoXaN-1


eIF4GI

m88-

NS

P3

Liaisonà l'ADNGAL4


RoX

aN-I



RésultatsRoXaN

Reconstitution





Discussion

Perspectives


Fonction de RoXaN


Double-Hybride

Northern Blot de RoXaN-1

6kb28S

18S

Northern Blot RoXaN-1 sur ARNm

de cellules MA104

Reconstitution de l'ADNc de RoXaN

RoXaN1 1274 pb

RoXaN2 2370 pb

RoXaN 5742pb

KIAA1031

Chromosome 22 (AL035659)

ESTAI28132

AI927120 (Humaine)



RésultatsRoXaN

Reconstitution





Discussion

Perspectives


Fonction de RoXaN


Double-Hybride

RoXaN

5742pb

977 Acides Aminés (110 kd)

Palindrome 20 bases

LDALD359

LDALD336

"coiled-coil"900-977

TPR82-115

Doigt de Zinc886-915Région

Hydrophobe271-325

RoXaN est ubiquitaire dans les tissus.

RT-PCR Elisa réalisée sur différents tissus en utilisant KIAA1031comme amorce (projet HUGE) unité: fg d'ADN/ng d'ARN poly(A).



RésultatsRoXaN

Reconstitution





Discussion

Perspectives


Fonction de RoXaN


Double-Hybride

Recherche d'un sérum dirigé contre RoXaN

Expression de RoXaN-1 par le système Bac-to-Bac

Expression de RoXaN-1 par le système pET

Expression de RoXaN-1 par le système GEX

Immunisation par un peptide

Immunisation par RoXaN-1 purifiée



RésultatsRoXaN

Reconstitution





Discussion

Perspectives


Fonction de RoXaN


Double-Hybride

NSP

3-H

isT

ag

NSP

3-90

11N

His

Tag

PAB

P H

isT

ag

- + - + - +plasmide seul: traduction in vitroRoXaN1 traduite in vitro + - + - + -

RoX

aN1

trad

uite

in v

itro

Protéine fixée aux billes

RoXaN1

69Kd -

46Kd -

30Kd -

RoXaN interagit avec NSP3 in vitro

NSP3HisHisHisHis

RoXaN S35

NSP3

50 kD(Chaines lourdes

des Ig)

25kD(chaines légères

des Ig)

Western Blot anti-NSP3 monoclonal

Transfection FLAG-RoXaN1

Infection:rotavirusImmuno

Précipitation Anti-FLAG Anti-NSP1

Lysat de cellules

infectées

Lysat de cellules

non- infectées

Western Blot anti-NSP3

FLAG

RoXaN-1

NSP3

NSP3 co-immunoprécipite avec RoXaN-1 in vivo

50 kD

25kD

Western Blot anti-FLAG(RoXaN1)

Infection: Rotavirus


Immunoprécipitation

RoXaN1

RoXaN1Stu

Lysattrans-fecté

RoXaN1

-FLAGinfecté

Lysat

infecté

RoXaN1Stu

NSP3NSP1NSP3 NSP3 NSP3 NSP1

FLAG

RoXaN-1

NSP3

NSP3 co-immunoprécipite avec RoXaN-1 in vivo

EcoRI|

PvuII|

CloneIt: Obtention de deletions en phase

Ro

XaN

1Coiled coils

(156-241)

Interaction avec RoXaN1

en double-hybride

NSP3A3154

A2881

1784

A3294

163

A9005

4 150

A9011N

4 204

206

A9011C

A9012N

4 240

A9020

163 293

A9012C241

NSP3

Domaine de Liaison à

l'ARN(4-149)

Domaine de Liaison à eIF4GI/II206-313)

Interactionavec

RoXaN1in vitro

n.d.

n.d.

n.d.

n.d.

n.d.

n.d.

n.d.

RoXaN1 en GAD (proie)

RoXaN1 en

pGBT9 (appât)

Met88

88n.d.

n.d.

n.d.

n.d.

n.d.

(1) interagit aussi avec GAD-RoXaN2

(1)

Délimitation de lazone d'interactionNSP3-RoXaN (1/2)

Délimitation de la zone d'interactionNSP3-RoXaN (2/2)

TPR NSP3

977|

1|

Interaction avec NSP3en double-hybrideRoXaN

m88.NSP3 clonée en

pGBT9 (Appât)

NSP3 clonée en GAD

(Proie)

n.d.

n.d.

n.d.

n.d.

n.d.

n.d.

n.d.

n.d.

n.d.

RoXaN2 763 | n.d.

30|

135| RoXaN1 StuI

163|

343|RoXaN1 Eco109

82|

398|

149|

135|

pGBT9 RoXaN1 SacIIStuI

pGBT9 RoXaN1 SacIIStuI Sma

103070/103071174|

144| 103060/103063

265|

144| 174

|103060/103071

244|103080/103061

341|

341|

-35|

246|

341|

-10|

135|

342|

103060/103061

144|

-10|

RoXaN1ATG|

UTR



RésultatsRoXaN

Reconstitution





Discussion

Perspectives


Fonction de RoXaN


Double-Hybride

pGBT9 / pYX212 / pGAD424

pGBT9-NSP3 / pYX212 / pGAD424-NSP3

pGBT9-EIF4G/ pYX-NSP3 / pGAD424-RoXaN1

pGBT9-EIF4G/ pYX-NSP3 / pGAD424

pGBT9-EIF4G / pYX212 / pGAD424-RoXaN1

pGBT9-EIF4G Eco/ pYX -NSP3/ pGAD424- RoXaN1

Contrôle (-)

Contrôle (+)

Domaine activateur

RoX

aN1

EIF4G37-176

UAS HIS

m88-

NS

P3

Le système triple-hybride.

Liaison

RoXaN appartient au complexe eIF4G/NSP3

dans le systéme triple hybride

EIF4G


Infection Rotavirus

Immunoprécipitation

Lysatde

cellulesinfectées

Lysatde

cellulesnon

infectéesFLAG FLAG FLAG NSP3

NSP3, eIF4G et RoXaN1 co-immunoprécipitent in vivo

Western Blot anti-EIF4GI

EIF4G

NSP3

RoXaN1FLAG

EIF4G

NSP3

RoXaN1FLAG



RésultatsRoXaN

Reconstitution





Discussion

Perspectives


Fonction de RoXaN


Double-Hybride

Crible de RoXaN en double-hybride

RoX

aN1

Liaisonà l'ADNGAL4


p170/

eIF3

TPR

de

RoX

aN

Liaisonà l'ADNGAL4

1

2

3

4

5

6

7

8

Appât:pGBT9 Proie:GAD424

1 m88NSP3 RoXaN12 pGBT9 GAD4243 TPR GAD-4244 TPR NSP25 TPR p1706 p170 GAD-4247 p170 NSP28 p170 RoXaN1

le TPR de RoXaN-1 interagit avecla sous/unité p170 de eIF3



RésultatsRoXaN

Reconstitution





Discussion

Perspectives


Fonction de RoXaN


Double-Hybride

Les motifs TPR (Tetratricopeptide)

Organismes

Fonctions diverses

CompartimentsBactéries, champignons, plantes, animaux

Cytosol, noyau, mitochondries, peroxysomes…

Nombre de motifs variables34 acides aminés

Co-chaperons, APC, repression de la transcriptiontransport peroxisomal, mitochondrial…SGT/Protéine NS1 du parvovirus

PP5FKBP52

CDC23

Les 3 motifs TPR de la PP5



RésultatsRoXaN

Reconstitution





Discussion

Perspectives


Fonction de RoXaN


Double-Hybride

Un homologue de RoXaN chez la drosophile

Score = 62.8 bits (150), Expect = 9e-10 Identities = 43/146 (29%), Positives = 69/146 (46%), Gaps = 20/146 (13%)

Query: 793 NKILDMQQTYDMWLKKHNPGKPGEGTPISSREGEKQIQMPTDYADIMMGYHCWLCGKNSN 852 +K D+ + KH PG G+G+ S +G++ T C C Sbjct: 243 HKTNDLLAAMKLTAGKHQPGS-GDGS--GSDQGDQAAPSTT----------CSYCTITFQ 289

Query: 853 SKKQWQQHIQSEKHKEKVFTSDSDASGWAFRFP-----MGEFRLCDRLQKGKACPDGDKC 907 ++ + +QH Q+E H +KV SD + W +R P + + LC+ + C G +CSbjct: 290 TRNELRQHCQTEAH-QKVIMSD-EGRDWKWRPPPRGYTLDTYSLCETFSEAHICHYGAQC 347

Query: 908 RCAHGQEELNEWLDRREVLKQKLAKA 933 AHGQ+ELNEW +R E + ++ KASbjct: 348 VEAHGQDELNEWKERFEYRRMRMQKA 373

RoXaN/CG9425

Un homologue de RoXaN dans le chromosome 16

humain

Query: 69 QVYLRALVRNLFNEGNDVYREHDWNNSISQYTEALNIADYAKSXXXXXXXXXXXXXYINR 128 + +L LV+NLF EGND++RE D+ ++ QY E LN+ADYA S ++N+Sbjct: 29 EAFLLKLVQNLFAEGNDLFREKDYKQALVQYMEGLNVADYAASDQVALPRELLCKLHVNK 88

Query: 129 IACYSNMGFHDKVLEDCNIVLSLNASNCKALYRKSKALSDLGRYKKAYDAVAKCSLAVPQ 188 ACY MG ++K LED L L++ + +AL+RK++AL++LGR+K+AY+ ++CSLA+PSbjct: 89 AACYFTMGLYEKALEDSEKALGLDSESIRALFRKARALNELGRHKEAYECSSRCSLALPH 148

Query: 189 DEHVIKLTQELAQKLGFKIRKAYVRAEALNH----------------------SVEDIEP 226 DE V +L QELAQKLG ++RKAY R + L S++DIESbjct: 149 DESVTQLGQELAQKLGLRVRKAYKRPQELETFSLLSNGTAAGVADQGTSNGLGSIDDIET 208

Query: 227 DL-LTPRQEAVPVVSLPA-PSFSH--EVGSELASVPVMPLTSILP--------------- 267 D + PR + S P P F H ++ + L S +P T LSbjct: 209 DCYVDPRGSPALLPSTPTMPLFPHVLDLLAPLDSSRTLPSTDSLDDFSDGDVFGPELDTL 268

Query: 268 -----------------------LQVEESALPSAVLANGGKMPFTMP------EAFLDDG 298 + V P GG +P + P +DSbjct: 269 LDSLSLVQGGLSGSGVPSELPQLIPVFPGGTPLLPPVVGGSIPVSSPLPPASFGLVMDPS 328

Query: 299 DMVLGDELD---------DLLDSAP--ETNETVMPS-ALVRGPLQ--------------- 331 + LD D LD P ET + S RG LSbjct: 329 KKLAASVLDALDPPGPTLDPLDLLPYSETRLDALDSFGSTRGSLDKPDSFMEETNSQDHR 388

Query: 332 --------TASVSPSMPFSASLLGTLPIGARYAPPPSFSEFYPPL---------TSSLED 374 S P MP +A L+ P+ A + + YP LESbjct: 389 PPSGAQKPAPSPEPCMPNTALLIKN-PLAATHEFKQACQLCYPKTGPRAGDYTYREGLEH 447

Query: 375 FCSS---LNSFSMSESK---------------------RDVAAEEECRYSGHCTFAYCQE 410 C L SE + +D+ +++C+Y +CTFAY QESbjct: 448 KCKRDILLGRLRSSEDQTWKRIRPRPTKTSFVGSYYLCKDMINKQDCKYGDNCTFAYHQE 507

Query: 411 EIDVWTLERKGAFSREAFF---GGNGKINLTVFKLLQEHLGEFIFLCEKCFDHKPRMISK 467 EIDVWT ERKG +R+ F GG + +LT+ KLL+EH G F FLCE CFD KPR+ISKSbjct: 508 EIDVWTEERKGTLNRDLLFDPLGGVKRGSLTIAKLLKEHQGIFTFLCEICFDSKPRIISK 567

Query: 468 RNKDNSTACSHPVTKHEFEDNKCLVHILRETTVKYSKIRSFHGQCQLDLCRHEVRYGCLR 527 KD+ + CS+ KH F +NKCLVHI+R T++KYSKIR F Q D+CRHEVRYGCLRSbjct: 568 GTKDSPSVCSNLAAKHSFYNNKCLVHIVRSTSLKYSKIRQFQEHFQFDVCRHEVRYGCLR 627

Query: 552 DMEQFYELWLKSQKNEKSEDIASQSNKENGKQIHMPTDYAEVTVDFHCWMCGKNCNSEKQ 611 DM+Q Y++WLK K + S++E KQI MPTDYA++ + +HCW+CGKN NS+KQSbjct: 797 DMQQTYDMWLKKHNPGKPGEGTPISSREGEKQIQMPTDYADIMMGYHCWLCGKNSNSKKQ 856

Query: 612 WQGHISSEKHKEKVFHTEDDQYCWQHRFPTGYFSICD 648 WQ HI SEKHKEKVF ++ D W RFP G F +CDSbjct: 857 WQQHIQSEKHKEKVFTSDSDASGWAFRFPMGEFRLCD 893

RoXaN / AF161540

eIF4G

4EPABP

AAAAAAAAAAA

4A

40 SeIF3

m7G

AUG

AAU

Rôle de l'eIF3

4G

4E5'Cap

PABP

AAAAAAAAAAAA 3'

4G

4E

4G

4E5'Cap

PABPAUG

PABP

AAAAAAAAAAAA 3'

En présence de poly(A) et de coiffe, la PABP et eIF4G stimulent l'initiation de la traduction. La PABP liant le complexe d'initiation en plusieurs endroits.

En absence de poly(A), la PABP peut transactiver la traduction coiffe dépendante en interagissant peut-être avec des facteurs de stimulation non identifiés à ce jour.

Facteur destimulationRoXaN ?

En absence de coiffe mais en présence de poly(A) eIF4G est capable de lier à la PABP.

AUG

AUG



Le Modèle d'Otero & Sachs (1999)



RésultatsRoXaN

Reconstitution





Discussion

Perspectives


Fonction de RoXaN


Double-Hybride

Perspectives

Purification de RoXaN

Rôle de RoXaN


Animaux "Knock-out"

Effets sur la traduction in vitro

Double hybride reverse

Homologues de RoXaN / NSP3

LUCUTR UTR

Remerciements

Didier Poncet, Maria Gajardo, Nathalie Castagne, Patrice Vende, Annie Charpilienne, Jean Cohen.

et beaucoup d'autres…

roxan, une nouvelle protéine cellulaire interagissant avec la protéine non-structurale nsp3 du...

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