khadidja sidelarbi implication du chaperome de la protéine

THÈSE

Pour l'obtention du grade deDOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE POITIERS

UFR des sciences fondamentales et appliquéesLaboratoire Signalisation et transports ioniques membranaires - STIM (Poitiers)

(Diplôme National - Arrêté du 25 mai 2016)

École doctorale : Biologie-santé - Bio-santé (Limoges)Secteur de recherche : Biomolécules, pharmacologie, thérapeutique

Présentée par :Khadidja Sidelarbi

Implication du chaperome de la protéine F508del-CFTR dansson transport intracellulaire et/ou sa dégradation : rôle des

lectines EDEMs et la mannosidase du RE

Directeur(s) de Thèse :Frédéric Becq, Caroline Norez

Soutenue le 24 novembre 2017 devant le jury

Jury :

Président Thierry Bergès Professeur, Université de Poitiers

Rapporteur Valérie Chappe Professeur associé, Université de Dalhousie, Halifax, Canada

Rapporteur Thomas Falguières Chargé de recherche INSERM, Saint-Antoine, Paris

Membre Frédéric Becq Professeur, STIM, Université de Poitiers

Membre Caroline Norez Maître de conférences, STIM, Université de Poitiers

Membre Christelle Coraux Chargé de recherche INSERM, Université de Reims

Pour citer cette thèse :Khadidja Sidelarbi. Implication du chaperome de la protéine F508del-CFTR dans son transport intracellulaire et/ousa dégradation : rôle des lectines EDEMs et la mannosidase du RE [En ligne]. Thèse Biomolécules, pharmacologie,thérapeutique. Poitiers : Université de Poitiers, 2017. Disponible sur Internet <http://theses.univ-poitiers.fr>

THESE

Pour l’obtention du Grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE POITIERS

(Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées) (Diplôme National - Arrêté du 25 mai 2016)

Ecole Doctorale : Biosanté

Secteur de Recherche : Biomolécules, pharmacologie, thérapeutique

Présentée par :

Khadidja SIDELARBI

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Implication du chaperome de la protéine F508del-CFTR dans son transport

intracellulaire et/ou sa dégradation : rôle des lectines EDEMs et de la mannosidase du RE

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Directeur de Thèse : Pr. Frédéric BECQ et Dr. Caroline NOREZ

************************

Soutenue le 24 novembre 2017 devant la Commission d’Examen

************************

JURY

Valérie Chappe Professeur associé, Université de Dalhousie, Halifax Rapporteur Thomas Falguières Chargé de recherche INSERM, Saint-Antoine, Paris Rapporteur Christelle Coraux Chargé de recherche INSERM, Université de Reims Examinateur Thierry Berges Professeur des Universités, Université de Poitiers Examinateur Caroline Norez Maître de Conférences, Université de Poitiers Examinateur Frédéric Becq Professeur des Universités, Université de Poitiers Examinateur

Sommaire

1

Sommaire Sommaire .................................................................................................................................. 1

Abréviations .............................................................................................................................. 4

Liste des Figures ....................................................................................................................... 6

Liste des tableaux ..................................................................................................................... 9

Introduction ............................................................................................................................ 10

I. Le contrôle qualité des glycoprotéines ........................................................................ 10

A. La voie ERAF ................................................................................................................. 11

1) Les modifications co- et post-traductionnelles .......................................................... 13

2) Les interactions avec les protéines chaperonnes ........................................................ 18

B. La voie ERAD ................................................................................................................ 33

1) ERMnI et son rôle dans ERAD .................................................................................. 40

2) EDEMs et leurs rôles dans ERAD ............................................................................. 43

3) Régulation des régulateurs d’ERAD « ERAD tuning » ............................................. 45

4) Réponse à l’accumulation des protéines mal repliées UPR ....................................... 47

II. Exemple du contrôle qualité : la protéine CFTR vs F508del-CFTR ........................ 49

A. Du gène à la protéine CFTR ........................................................................................... 49

1) Le gène CFTR ............................................................................................................ 49

2) Structure de la protéine CFTR ................................................................................... 50

3) Les fonctions de la protéine CFTR ............................................................................ 52

4) Les mutations du CFTR ............................................................................................. 53

B. Biosynthèse et repliement : F508del-CFTR vs WT-CFTR ............................................ 55

C. Le contrôle qualité de CFTR dans le RE et sa dégradation par ERAD .......................... 58

1) Les principales chaperonnes et lectines ..................................................................... 58

2) Motif de rétention dans le RE : AFT (Arginine-Framed Tripeptides) ....................... 61

3) Code de sortie du RE : le code diacide ...................................................................... 62

D. F508del-CFTR et la réponse UPR .................................................................................. 62

Sommaire

2

III. Le système de contrôle qualité du RE comme cible thérapeutique .......................... 64

Contexte, problématiques et objectifs .................................................................................. 70

Matériels et méthodes ............................................................................................................ 74

I. Matériel cellulaire ......................................................................................................... 74

Fiche technique N°1 : ............................................................................................................ 74

Lignées cellulaires, culture et entretien ............................................................................ 74


Congélation et décongélation des lignées cellulaires ....................................................... 76


Isolement des cellules épithéliales bronchiques des patients CF ..................................... 77

II. Techniques de biologie moléculaire et de biochimie .................................................. 79

Fiche technique N°4 ............................................................................................................... 79

Mesure de l’activité du protéasome ................................................................................. 79


Transfection de siRNA (small interfering RNA) ............................................................. 80


Western blot ..................................................................................................................... 82


Biotinylation de surface ................................................................................................... 87


Immunomarquage indirect ............................................................................................... 89


In situ Proximity Ligation Assay (Duolink) ..................................................................... 91

III. Techniques de physiologie cellulaire ........................................................................... 93

Fiche technique N°10 : .......................................................................................................... 93

Efflux d’iodure ................................................................................................................. 93


Etude des variations du potentiel membranaire avec la sonde oxonol ............................. 95


Chambre de Ussing .......................................................................................................... 97

Sommaire

3

Résultats ................................................................................................................................ 101

I. Les protéines EDEMs comme cibles thérapeutiques dans la mucoviscidose ........ 101

A. Contexte ........................................................................................................................ 101

B. Résultats ........................................................................................................................ 101

1) Article ....................................................................................................................... 101

2) Résultats complémentaires ....................................................................................... 133

II. Implication de l’α1,2-mannosidase du RE dans la rétention de F508del-CFTR .. 143

A. Contexte ........................................................................................................................ 143

B. Résultats ........................................................................................................................ 144

1) Effet des inhibiteurs des mannosidases sur la fonction de F508del-CFTR ............. 144

2) Effet du siRNA d’ERManI sur F508del-CFTR ....................................................... 144

3) Comprendre l’effet correcteur sur F508del-CFTR de l’extinction d’ERManI ........ 148

Discussion, conclusion et perspectives ................................................................................ 155

A. Synthèse d’une nouvelle famille d’iminosucres : dérivés multivalents du

Deoxymannojirimycin ......................................................................................................... 155

B. La famille des protéines EDEMs : de nouvelles cibles thérapeutique pour la

mucoviscidose ...................................................................................................................... 157

C. Etude du trivalent-DMJ comme correcteur de F508del-CFTR .................................... 159

D. A la recherche d’une autre cible thérapeutique pour la mucoviscidose : α1,2-mannosidase

I du RE ................................................................................................................................. 166

Références bibliographiques ............................................................................................... 171

Annexes ................................................................................................................................. 204

Article scientifique ............................................................................................................... 204

Abréviations

4

Abréviations °C: degré celsius 4PBA: sodium-4-phénylbutyrate

A: alanine AAA+: ATPases associated with diverse cellular activities AAT: α1-antitrypsin

ABC: ATP binding cassette Aha1: Activator of Hsp90 ATPase 1 ADP: adénosine diphosphate AFT: Arginine-Framed Tripeptides AMC: 7-mino-4-methylcoumarin AMPc: adénosine monophosphate cyclique ARN: acide ribonucléide Asn: asparagine ATF6: activating transcription factor-6 ATP: adenosine triphosphate

BAG-1/2: BCL2 associated athanogene 1/2 BCA: bicinchoninique acide BHK: baby hamster kidney BiP: binding immunoglobulin protein BSA: bovine serum albumin

Ca2+: ion calcium CF: cystic fibrosis CFBE: CF branchial epithelial CFTR: CF transmembrane conductance regulator CFTRinh: CFTR inhibiteur CHIP: C-terminus of Hsp70 interacting protein CHO: chinese hamster ovary CHOP: CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein Cl-: ion chlorure COPI/II: coat proteins I/II CRD: carbohydrate recognition domain Cu2+: ions cuivriques CypB: cyclophilines B Cys: cystéine

D: aspartate ddp: différence de potentiel del: deletion DMJ: 1-déoxymannojirimycine DNAJB12: DnaJ Hsp40 family member B12 DNJ: deoxynojirimycine DMSO: diméthylsulfoxide

ECL: enhanced chemiluminescence ECLs: extra cellular loops EGF: epidermal growth factor EDEM: ER degradation-enhancing 1,2-manosidase-like protein eIF2α: Eukaryotic Initiation Factor 2α ER: endoplasmic reticulum ERAD: ER associated degradation ERAF: ER associated folding ERdj: ER-localized DnaJ proteins ERES: ER-exit sites ERGIC: ER-Golgi intermediate compartment ERmanI: ER α1,2-mannosidase I ERQC: ER quality control

F: phenylalanine FKBP: FK506-binding proteins Fluo: florescent Fsk: forskoline

GH47: glycoside hydrolase family 47 Glc: glucose GlcNAc: N-Acetylglucosamine Gp78: Glycoprotein 78 Grp: glucose regulated protein Gst: génistéine GTP: guanosine triphosphate

Hdj: human DnaJ HEK293: human embryonic kidney 293

hERG: human ether-a-go-go-related gene

Herp: ER stress-inducible protein Hop: Hsp-organising protein

Abréviations

5

HRD1: HMG-CoA reductase degradation protein 1

HRP: horseradish peroxidase Hsc: heat shock cognate Hsp: heat shock protein HspBP1: Hsp binding protein 1 Htm1: homologous to mannosidase I

I-: ion iodure ICLs: intracellular loops IRE1: inositol requiring 1 Isc: short circuit current IgG: Immunoglobulin G

K+: ion potassium KCl: chlorure de potassium

kDa: kilo Dalton KO: knockout LAMP: lysosomal-associated membranes proteins LC3: microtubules-associated protein-light chain 3

Man: mannose Mns1: α1,2-mannosidase chez la levure Mg: magnésium MSD: membrane-spanning domain

N: asparagine Na+: ion sodium NBD: nucleotide-binding domain NEF: nucleotide exchange factors NHK: null hong kong

OS-9: osteosarcoma amplified 9 OST: oligosaccharyl transférase

PAGE: polyacrylamide gel electrophoresis PAF: paraformaldéhyde PBS: phosphate buffer saline PDI: protein disulfide isomerase PERK: protein kinase RNA-like ER kinase PPIase: peptidyl-prolylisomérases

PKA: protein kinase A PKC: protein kinase C PLA: proximity ligation assay

QCV: quality control vesicles

RD: regulatory domain RE: réticulum endoplasmique RISC: RNA induced silencing complex RMA1: RING-finger protein with membrane anchor-1 RNF5: RING finger protein

SBD: substrate binding domain SDS: sodium dodecyl sulfate SEL1L: suppressor/enhancer of Lin-12-like SERCA: sarco/ER Ca2+-ATPase siRNA: small interfering RNA SPP: signal peptide peptidase SRP: signal recognition particule

SVF: sérum de veau fœtal

T1/2: demi-vie TBS: tris buffer saline TG-SDS: tris-glycin-SDS TMD: transmembrane domain Trx: thiorédoxine

UGGT: UDP-Glucose:glycoprotein glycosyltransferase UPR: unfolded protein response

VIP36: vesicular integral membrane protein of 36 kDa VIPL: VIP36-Like

wt: wild type (sauvage)

XBP-1: x-box binding protein 1 XTP3-B: XTP3-transactivated gene B

protein

Ydj1: yeast dnaJ

Liste des figures

6

Liste des Figures Figure 1 : Reconnaissance du peptide signal par la SRP. ........................................................ 12

Figure 2 : Structure du motif oligosaccharidique N-glycan. .................................................... 13

Figure 3 : Glycosylation d’une protéine naissante. .................................................................. 14

Figure 4 : Formation des liaisons disulfure par les protéines PDI. .......................................... 16

Figure 5 : Réaction d’isomérisation peptidyl-prolyl cis-trans catalysée par des PPIases. ....... 17

Figure 6 : Interaction des glycoprotéines avec la chaperonne calnexine. ................................ 19

Figure 7 : Le Cycle de la calnexine/calréticuline. .................................................................... 20

Figure 8 : Influence des co-chaperonnes du complexe Hsp70 sur le devenir des protéines. ... 24

Figure 9 : Modes de transport des protéines hors du réticulum endoplasmique. ..................... 28

Figure 10 : Transport des glycoprotéines dans la voie sécrétoire (Yamamoto, 2014). ............ 30

Figure 11 : Représentation schématique de la maturation des oligosaccharides N-liés. .......... 31

Figure 12 : Etapes de la dégradation ERAD des glycoprotéines. ............................................ 35

Figure 13 : Structure du motif oligosaccharide N-glycan Glc3Man9GlcNAc2. ........................ 37

Figure 14 : Les trois principales ligases identifiées chez les mammifères. .............................. 38

Figure 15 : Représentation schématique des membres de la famille GH47. ............................ 40

Figure 16 : Modèle de compartimentation du RE dans les cellules de mammifères. .............. 42

Figure 17 : Le processus ERAD tuning. .................................................................................. 46

Figure 18 : Représentation des trois voies de l’UPR. .............................................................. 48

Figure 19 : Du gène à la protéine CFTR. ................................................................................. 50

Figure 20 : Représentation schématique de la structure de CFTR. .......................................... 51

Figure 21 : Régulation des canaux ioniques par la protéine CFTR. ........................................ 52

Figure 22 : Classification des mutations du CFTR et leurs conséquences sur la protéine CFTR.

.......................................................................................................................................... 54

Figure 23 : Localisation de la protéine WT- et F508del-CFTR. .............................................. 55

Figure 24 : Biosynthèse de WT- et F508del-CFTR et assemblage des domaines. .................. 56

Figure 25 : Rôle de Hsp70/90 et leur partenaires dans le contrôle de qualité de CFTR. ......... 59

Figure 26 : Adaptation de la capacité des voies ERAF et ERAD pour corriger les défauts

impliqués dans les pathologies conformationnelles. ........................................................ 65

Figure 27 : Représentation schématique des principales étapes de la biosynthèse de F508del-

CFTR et les sites d’action du Miglustat et des inhibiteurs de pompes Serca................... 71

Figure 28 : Objectifs de notre travail. ...................................................................................... 72

Liste des figures

7

Figure 29 : Principe de la transfection de siRNA. .................................................................... 80

Figure 30 : Principe de la technique du western blot. .............................................................. 82

Figure 31 : Assemblage du sandwich de western blot. ............................................................ 85

Figure 32 : Principe de la biotinylation de surface. .................................................................. 87

Figure 33 : Principe d’immunomarquage indirect. .................................................................. 89

Figure 34 : Principe de la technique de Duolink. ..................................................................... 91

Figure 35 : Exemple de représentation graphique des résultats d’efflux d’iodures. ................ 94

Figure 36 : Structure de la sonde oxonol [DiSBAC2(3)]. ........................................................ 95

Figure 37 : Exemple de représentation graphique de la fluorescence de la sonde oxonol. ...... 96

Figure 38 : Principe de la technique de chambre de Ussing. ................................................... 97

Figure 39 : Chambre de Ussing. ............................................................................................... 99

Figure 40 : Implication de RMA1/RNF5 et CHIP dans la dégradation de F508del-CFTR. .. 133

Figure 41 :Effet du trivalent-DMJ sur l’interaction de F508del-CFTR avec RNF5/RMA1 ou

CHIP. .............................................................................................................................. 134

Figure 42 : Effet du trivalent-DMJ sur l’activité du protéasome 20S intracellulaire. ............ 135

Figure 43 : Effet du trivalent-DMJ sur l’activité du protéasome 20S purifié. ....................... 137

Figure 44 : Effet du DMJ et ses dérivés multivalent sur l’activité du protéasome 20S purifié.

........................................................................................................................................ 138

Figure 45 : Effet de la tunicamycine sur l’expression protéique de BiP/GRP78 et eif2α. ..... 140

Figure 46 : Effet du trivalent-DMJ sur l’expression de la protéine BiP/GRP78 et eIF2α. .... 141

Figure 47 : Efficacité du potentiateur VX-770 sur F508del-CFTR corrigé par le trivalent-DMJ.

........................................................................................................................................ 142

Figure 48 : Effet des inhibiteurs de mannosidase sur l’activité de F508del-CFTR. ............. 144

Figure 49 : Diminution de l’expression protéique d’ERManI ou de Golgi-Man par siRNA. 145

Figure 50 : Effet du siRNA ERManI et Golgi-ManII sur l’activité de F508del-CFTR. ........ 146

Figure 51 : Effet de siRNA ERManI sur la maturation de F508del-CFTR. .......................... 147

Figure 52 : Effet du siRNA ERManI sur l’expression protéique des EDEMs. ...................... 149

Figure 53 : Effet du siRNA ERManI sur l’interaction de F508del-CFTR avec les EDEMs. 150

Figure 54 : Effet du siRNA ERManI sur l’expression protéique de CHIP et RNF5/RMA1. 151

Figure 55 : Effet du siRNA ERManI sur l’interaction de F508del-CFTR avec CHIP ou

RNF5/RMA1. ................................................................................................................. 152

Figure 56 : Effet du siRNA ERManI sur l’activité du protéasome 20S intracellulaire. ........ 153

Figure 57 : Hypothèses de la restauration de F508del-CFTR à la membrane cellulaire sous sa

forme immature par le trivalent-DMJ. ........................................................................... 161

Liste des figures

8

Figure 58 : Principales protéines impliquées dans le repliement et/ou la dégradation de CFTR.

........................................................................................................................................ 163

Figure 59 : Modèle d’ubiquitinylation séquentielle de F508del-CFTR par des complexes

contenant RMA1/RNF5 et Gp78.................................................................................... 164

Figure 60 : Les trois principales ligases identifiées chez les mammifères. ............................ 165

Figure 61 : Devenir des glycoprotéines correctement- ou mal-repliées. ................................ 167

Figure 62 : Récapitulatif des principaux résultats de ce projet de thèse. ............................... 170

Liste des tableaux

9

Liste des tableaux Tableau 1 : Liste non exhaustive des principales protéines du ERQC. .................................... 11

Tableau 2 : Composition du milieu de culture pour les lignées cellulaires Hela WT- et

F508del- CFTR. ............................................................................................................... 74

Tableau 3 : Composition du milieu de culture pour la lignée cellulaire CFBE41o-. ............... 75

Tableau 4 : Composition du milieu de décontamination pour échantillons CF. ...................... 77

Tableau 5 : Composition du milieu de culture primaire CF. .................................................... 78

Tableau 6 : Composition du tampon de lyse cellulaire. ........................................................... 82

Tableau 7 : Composition des gels d’électrophorèse des protéines. .......................................... 84

Tableau 8 : Composition des tampons 4X Lower et Upper. .................................................... 84

Tableau 9 : Composition du tampon de transfert. .................................................................... 84

Tableau 10 : Récapitulatif des anticorps utilisés en western blot. ........................................... 85

Tableau 11 : Récapitulatif des anticorps utilisés en western blot. ........................................... 86

Tableau 12 : Récapitulatif de l’ensemble des anticorps primaires utilisés. ............................. 90

Tableau 13 : Récapitulatif de l’ensemble des anticorps secondaires utilisés. .......................... 90

Tableau 14 : Récapitulatif de l’ensemble des anticorps utilisés en Duolink. ........................... 92

Tableau 15 : Composition du milieu d’efflux utilisé. .............................................................. 93

Tableau 16 : Composition de la solution Krebs sans Cl-.......................................................... 96

Tableau 17 : Composition de la solution de Krebs « normale ». ............................................ 99

Introduction

10

Introduction Dans toutes les cellules vivantes, des programmes génétiques différents contrôlent

toutes les étapes de la naissance, de la vie et de la mort des protéines. Avant de pouvoir exercer

sa fonction biologique, une protéine va subir un ensemble de processus biochimiques

complexes entre sa naissance (au moment de la lecture de l’ARN) et sa localisation définitive

le temps qu’elle soit fonctionnelle.

Nous allons examiner dans cette introduction quelques-uns des mécanismes et déterminants

moléculaires généraux avant d’aborder les particularités de notre protéine d’intérêt, CFTR

(Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator).

I. Le contrôle qualité des glycoprotéines

Le contrôle qualité du réticulum endoplasmique (RE), ERQC (Endoplasmic Reticulum

Quality Control) est un mécanisme de surveillance de la biosynthèse et du repliement des

protéines dans le RE. Ce processus est composé de deux voies : la voie ERAF (ER Associated

Folding) qui assiste les protéines au cours de leur repliement et s’assure que seules les protéines

correctement repliées puissent quitter le RE, et la voie ERAD (ER Associated Degradation) qui

séquestre les protéines mal repliées et/ou mutées dans le RE puis les dirige vers la dégradation

(Araki and Nagata, 2011).

Ce système est composé de diverses protéines chaperonnes et enzymes dont les principaux

acteurs ainsi que leur fonction sont présentés dans le tableau 1.

Introduction

11

Familles Principaux membres Fonctions

α-glucosidase I et II

Clivage des résidus glucoses permettant l’entrée des glycoprotéines dans le cycle calnexine ou calréticuline

Enzymes de glycosylation

UGGT (UDP–glucose glycoprotein: glucosyltransferase)

Reconnaissance des glycoprotéines mal repliées et re-glycosylation afin de permettre leur entrée dans un nouveau cycle de repliement calnexin ou calréticuline

ER α-1,2 mannosidase Clivage du résidu mannose permettant la sortie des glycoprotéines du cycle calnexine ou calréticuline

Malectine

Empêche l’agrégation des polypeptides naissants et recrutement de l’α-glucosidases II

Calnexine, Calréticuline Repliement des glycoprotéines

Lectines EDEM1 à 3

Reconnaissance des glycoprotéines mal repliées, clivage des résidus mannoses afin de les diriger vers ERAD

OS-9, XTP3-B

Reconnaissance des glycoprotéines mal repliées et adressage vers le complexe de rétrotranslocation

Hsp70, BiP/grp78, Hsp90, Grp94

Empêche l’agrégation des protéines et aide au repliement

Hsp40 : ERdj1 à 7 Co-chaperonnes qui régulent BiP

Chaperonnes Hsp40 : DNAJB12

Co-chaperonne qui dirige les protéines mal repliées vers ERAD

CHIP (carboxy terminus of Hsc70 interacting protein)

E3 ubiquitine ligase, co-chaperonne qui se lie à Hsc70 ou Hsp70 et dirige les protéines mal repliées vers ERAD

Oxydo- réductases

PDI (protéine disulfure isomérase), ERp57

Formation et isomérisation des ponts disulfures

PPIase Cyclophilines Co-chaperonnes qui facilitent le repliement tardif des substrats de Hsp90

Tableau 1 : Liste non exhaustive des principales protéines du ERQC.

A. La voie ERAF

Chez les eucaryotes, les protéines solubles ou membranaires de la voie de sécrétion sont

synthétisées au niveau du RE. Ces protéines doivent alors être transloquées à travers la

membrane de ce compartiment, et dans le cas des protéines transmembranaires, s’intégrer dans

la bicouche lipidique. Pour cela, les peptides naissants destinés à cette voie de sécrétion

présentent une courte séquence hautement hydrophobe qui assure leur adressage vers la

membrane du RE. Selon le type de la protéine, soit cette séquence est appelée peptide signal,

lorsqu’elle est située dans l’extrémité N-terminal (cas des protéines sécrétées et certaines

protéines transmembranaires de type I), soit elle correspond au premier segment

transmembranaire de la protéine (McCaffrey and Braakman, 2016).

Introduction

12

Dès sa sortie du ribosome, le peptide signal est reconnu par une particule ribonucléoprotéique

SRP (signal-recognition particle) qui après sa fixation provoque un arrêt temporaire de la

traduction en bloquant l’accès aux facteurs d’élongation (Figure 1).

Figure 1 : Reconnaissance du peptide signal par la SRP.

Le peptide signal (rose) de la séquence peptidique (bleu) est reconnu par la SRP. Cette dernière interrompt la traduction et favorise la fixation du ribosome au translocon (Sec61). Cela, permet la dissociation de la SRP de son récepteur, le relâchement du peptide signal, son entré dans le translocon et enfin la reprise de la translocation de manière co-traductionnelle (Modifié d’après http://biochemprotein.blogspot.fr).

La SRP est une GTPase qui possède une faible affinité intrinsèque pour le GTP. Son récepteur

est à la fois ancré dans la membrane du RE et lié au translocon, un complexe hétérotrimérique

de protéines Sec61 (Figure 1).

La fixation de la SRP au complexe « ribosome-chaîne polypeptidique naissante » augmente son

affinité pour le GTP ce qui favorise sa fixation à son récepteur. Le ribosome interagit alors avec

le translocon Sec61 et permet l’hydrolyse du GTP de la SRP et de son récepteur. Cette hydrolyse

provoque la dissociation de la SRP de son récepteur, le relâchement du peptide signal et la

reprise de la translocation qui s’effectue de manière co-traductionnelle.

Le peptide signal est clivé après son intégration dans la membrane du RE par l’enzyme signal

peptidase et est ensuite dégradé par la signal peptide peptidase (SPP). Dans le cas du signal

d’ancrage, la séquence ferait partie de la protéine et permettrait son ancrage dans la bicouche

lipidique (Ng and Walter, 1994; McCaffrey and Braakman, 2016).

Introduction

13

1) Les modifications co- et post-traductionnelles

Dans la lumière du RE, la protéine naissante intègre un processus de repliement lui

permettant d’acquérir une structure tridimensionnelle précise (forme native), indispensable à sa

transition du RE vers l’appareil de Golgi et à sa fonction. Ce processus commence alors que la

chaine polypeptidique est toujours en cours de translocation et de traduction. Il consiste en des

modifications post traductionnelles telles que la N-glycosylation et la formation de ponts

disulfures sur la protéine cliente.

a) N-glycosylation

Dans les cellules eucaryotes, la grande majorité des polypeptides naissants qui entrent

dans la lumière du RE sont glycosylés sur leur résidu asparagine (Asn) contenu dans la séquence

consensus -Asparagine-X-Sérine/Thréonine-, où X correspond à n’importe quel acide aminé

autre que la proline (Caramelo and Parodi, 2015). Elle se caractérise par le transfert en bloc sur

le résidu Asparagine, d’un groupement oligosaccharidique appelé N-glycan. Ce groupement est

constitué de 2 résidus N-acetylglucosamine (GlcNAc), 9 mannoses (Man) et 3 glucoses (Glc)

(Glc3Man9GlcNAc2) réparti en trois branches A, B et C (Figure 2).

Figure 2 : Structure du motif oligosaccharidique N-glycan. L’oligosaccharide préformé est composé de 3 glucoses, 9 mannoses et 2 N-acetylglucosamines. Les branches oligosaccharidiques sont représentées par A, B et C. Les enzymes qui modifient ce motif sont listées sur la figure et leur action est représentée. Le type de liaison glycosidique est représenté en couleur (D'après Tannous et al., 2015).

Introduction

14

Le N-glycan est préalablement assemblé au niveau d’un dolichol-phosphorylé (-PP-

dolichol) ancré dans la membrane du RE (Schwarz and Aebi, 2011; Lannoo and Van Damme,

2015). Il est ensuite transféré sur le résidu Asparagine par l’oligosaccharyl transférase (OST),

un complexe protéique multimérique situé dans la membrane du RE et associé au ribosome et

au translocon sec61 (Harada et al., 2009) (Figure 3).

Figure 3 : Glycosylation d’une protéine naissante. Le motif oligosaccharidique N-glycan Glc3Man9GlcNAc2 est préassemblé sur un dolichol-phosphorylé ancré dans la membrane du RE. Au cours de sa translocation dans le RE via un canal de translocation, le polypeptide néosynthétisé glycosylé par le complexe OST (oligosaccharyl transférase). Ce complexe transfert le motif N-glycan sur le résidu asparagine (Asn) contenu dans la séquence consensus -Asn-X-Sérine/Thréonine-, où X correspond à n’importe quel acide aminé autre que la proline (Modifié d'après Mazola et al., 2011).

Immédiatement après son transfert sur le polypeptide, le N-glycan est modifié par

différentes enzymes glycoside hydrolases (α-glucosidases I et II) et par une glucosyl

transférase, l’UGGT (UDP-Glucose:glycoprotein glycosyltransferase) dans une cascade de

réactions générant différentes structures qui servent de ligand spécifique aux protéines

chaperonnes du RE. Ainsi l’état de glycosylation d’une protéine peut nous renseigner sur son

stade de repliement par le contrôle de qualité.

Les N-glycans jouent un rôle majeur à la fois direct et indirect dans les processus de

repliement et de contrôle qualité des protéines qui les portent. En effet, de part leur nature

encombrante et hydrophile, ces motifs augmentent la solubilité intrinsèque des polypeptides

naissants auxquels ils sont attachés et préviennent leur agrégation. De plus, leur fixation aux

polypeptides pourrait affecter la structure secondaire locale de la protéine en stabilisant la

conformation des résidus proximaux au site de glycosylation. L’analyse de la structure

Introduction

15

secondaire autour de ce dernier a soulevé, en effet, la possibilité que les glycans puissent agir

comme marqueurs des points où des changements se produisent dans la structure secondaire

(Petrescu et al., 2004). De plus, il a été montré que l’interaction du N-glycan avec la chaîne

polypeptidique facilite l’acquisition de structures secondaires particulières telles que les

feuillets β (O’Connor and Imperiali, 1996; Petrescu et al., 2004; Vagin et al., 2008). D’autre

part, il a été observé que des acides aminés aromatiques éloignés dans la séquence, deviennent

proches aux sites de glycosylation dans la structure tertiaire. Ceci suggère que les N-glycans

liés pourraient avoir un rôle encore plus direct dans le repliement, en agissant comme des sites

de nucléation pour des parties éloignées de la chaîne protéique riche en acides aminés

aromatiques. Cette hypothèse est soutenue par des expériences in vitro indiquant que les N-

glycans favorisent le repliement basé sur les interactions hydrophobes glycan-protéine

(Nishimura et al., 1998; Jitsuhara et al., 2002). D’autres études comparant des glycoprotéines

et leur homologues non glycosylés ont montré que la présence du N-glycan augmentait la

stabilité et la résistance à la protéolyse (Beggah et al., 1997; Imperiali and O’Connor, 1999;

Kundra and Kornfeld, 1999; Crothers et al., 2004). Une résistance probablement due à la

restriction d’accès des sites de clivage à la protéase (Vagin et al., 2008). Enfin, les N-glycans

favorisent également le repliement et le contrôle qualité de manière indirecte en recrutant de

manière spécifique les chaperonnes et les enzymes impliquées dans le repliement et la

dégradation des glycoprotéines (Slominska-Wojewodzka and Sandvig, 2015).

b) Formation et réarrangement des ponts disulfures

La formation des ponts disulfures entre deux résidus de cystéine est essentielle pour le

repliement correct et la maturation de beaucoup de protéines de sécrétion. En effet, il s’agit des

liaisons covalentes qui stabilisent les structures des protéines et garantissent le maintien de leur

conformation tridimensionnelle fonctionnelle. Ce processus, appelé repliement oxydatif, prend

place dans le RE et est catalysé par les protéines de la famille PDI (Protein Disulfide-

Isomerase).

Les PDIs sont des protéines localisées principalement dans le RE et sont essentielles

pour le maintien de son environnement oxydatif et son homéostasie. Elles sont dotées d’une

activité oxydoréductase/isomérase et interviennent de manière co- et post-traductionnelle pour

catalyser la formation de ponts disulfures (oxydation des groupements thiols des cystéine), leur

coupure (réduction) et/ou le réarrangement des liaisons incorrectement établies entre deux

cystéines proches (isomérisation) (Wallis and Freedman, 2013) (Figure 4).

Introduction

16

Figure 4 : Formation des liaisons disulfure par les protéines PDI. Mécanismes d’oxydation, de réduction et d’isomérisation des liaisons disulfure catalysées par les

protéines PDI (D'après Tannous et al., 2015).

En plus de leur activité oxydoréductase/isomérase, la majorité des membres de PDI présentent

une fonction chaperonne et jouent un rôle crucial dans l’ERQC. Elles peuvent en effet se lier

sur des protéines nouvellement synthétisées pour contribuer à leur repliement, ou bien sur des

protéines mal repliées pour faciliter leur dégradation (Ushioda et al., 2008; Lee et al., 2010;

Parakh and Atkin, 2015). Ainsi, certains membres de la famille PDI sont des protéines

multifonctionnelles, dont leur fonction comme oxydoréductase ou chaperonne est dépendante

du substrat (Kozlov et al., 2010a). A noter, l’activité chaperonne du PDI semble être

indépendante de son activité enzymatique (Fu and Zhu, 2010).

Plus de 20 membres ont été découverts chez les mammifères. La nécessité d’un si grand

nombre de membres de la famille PDI demeure une question ouverte. Cependant, plusieurs

membres, les plus abondants ont des spécificités de substrat distinctes (Jessop et al., 2009). Bien

que ces membres présentent des séquences en acides aminés et des fonctionnalités diverses, ils

présentent tous au moins un site catalytique qui contient un domaine homologue à la

thiorédoxine (Trx) (Edman et al., 1985; Appenzeller-Herzog and Ellgaard, 2008; Kojima et al.,

2013). PDI est la première oxydoréductase découverte et la plus abondante dans le RE.

Ubiquitaire et très fortement exprimée dans les cellules sécrétoires, PDI a la particularité

d’assurer les diverses fonctions de la famille : oxydase, réductase, isomérase et chaperonne

(Määttänen et al., 2010; Irvine et al., 2014; Okumura et al., 2015).

La protéine ERp57 présente une similarité de séquence significative avec PDI (Oliver

et al., 1997). Cependant, au lieu du domaine assurant l’activité de chaperon pour PDI, ERp57

présente une région de liaison pour les domaines P de calnexine et calréticuline, chaperonnes

impliquées dans le repliement et le contrôle qualité des glycoprotéines (Zapun et al., 1998;

Frickel et al., 2002; Russell et al., 2004; Kozlov et al., 2006). Un rôle spécifique et essentiel

dans l’isomérisation de liaisons disulfure non-natives des glycoprotéines néo-synthétisées lui a

était attribué (Oliver et al., 1997; Jessop et al., 2007) ; cependant, ERp57 ne semble pas avoir

Introduction

17

des propriétés intrinsèques de lectine (Zapun et al., 1998). Ces observations suggèrent

qu’ERp57 fonctionne de concert avec la calnexine et la calréticuline pour moduler

spécifiquement le repliement des glycoprotéines (Oliver et al., 1997; Zapun et al., 1998; Oliver

et al., 1999).

Il a été observé qu’ERp57 peut s’associer à des glycoprotéines qui ne présentent pas de résidu

de cystéines et ne nécessitent donc pas d’isomérisation de disulfure intramoléculaire (Elliott et

al., 1997; Oliver et al., 1997). Le rôle d’ERp57 ne semble donc pas se limiter à la catalyse de

la formation et de l’isomérisation de liaisons disulfure. Mais comme PDI, ERp57 peut avoir un

rôle plus vaste en tant que chaperonne moléculaire. Son extinction in vivo est létal chez des

souris KO (knockout) ERp57 ; en revanche, elle est tolérée in vitro sur des cellules en culture,

suggérant que certaines glycoprotéines peuvent engager d’autres assistants de repliement afin

d’acquérir leur conformation native. Comme par exemple, ERp72 qui semble pouvoir

remplacer ERp57 pour assurer une maturation efficace des glycoprotéines du virus forestier

Semliki (Soldà et al., 2006).

c) Les liaisons peptidiques

Les liaisons peptidiques, reliant n’importe quel acide aminé avec un résidu proline

peuvent adopter une conformation cis ou trans, avec une faible préférence pour la conformation

trans (Fischer and Aumüller, 2003). Les peptidyl-prolylisomérases (PPIases) sont des protéines

ubiquitaires capables de catalyser l’isomérisation des acides aminés prolines des protéines de

conformation trans en cis et inversement (Figure 5). Cela permet le changement d’orientation

de la chaine peptidique dans l’espace.

Figure 5 : Réaction d’isomérisation peptidyl-prolyl cis-trans catalysée par des PPIases. (Tannous et al., 2015)

La correction de l’orientation des liaisons proline a lieu tardivement pendant le

processus de repliement et intervient lorsque la protéine a atteint une conformation quasi-

complète. L’isomérisation de liaisons peptidyl-prolyle mal placées peut-être une étape limitante

pour la vitesse du repliement des protéines (Kiefhaber et al., 1990).

Introduction

18

La famille PPIase des mammifères comprend trois sous-groupes, parvulines, cyclophilines

(Cyps) et protéines de liaison FK506 (FKBPs) (Göthel and Marahiel, 1999; Fischer and

Aumüller, 2003; Stocki et al., 2014). Le RE des mammifères contient 6 membres de FKBP et

2 membres de Cyps. La cyclophiline B est la PPIase la plus caractérisée (Bernasconi et al.,

2010; Bergeron et al., 2011; Jansen et al., 2012; Stocki et al., 2014). Elle a été identifiée dans

un complexe protéique incluant les chaperonnes calnexine et calréticuline. L’absence de site de

fixation chaperonne-like sur cette PPIase suggère son interaction avec ses substrats via d’autres

chaperonnes. Cette hypothèse a été confirmée par des études de cristallographie identifiant un

site d’interaction de CypB à l’extrémité du domaine P de calnexine et calréticuline (Kozlov et

al., 2010b). Ces données supportent le rôle actif de CypB dans le cycle calnexine ou

calréticuline en favorisant l’orientation correcte des liaisons peptidyl-prolyl dans les protéines

en cours de repliement (Kozlov et al., 2010a).

2) Les interactions avec les protéines chaperonnes

a) Les lectines calnexine/calréticuline et les glycosidases

La calnexine et son homologue soluble, la calréticuline, sont deux lectines chaperonnes

responsables du repliement et du contrôle qualité des glycoprotéines dans le RE (Fliegel et al.,

1989; Wada et al., 1991; Michalak et al., 1992; Hebert et al., 1996). La calnexine est une

protéine transmembranaire de type I, de 90 kDa qui interagit avec les glycoprotéines solubles

et transmembranaires ; tandis que la calréticuline interagit préférentiellement avec les

glycoprotéines solubles (Hebert et al., 1997). Ces deux lectines partagent une organisation

générale similaire. Chacune possède dans sa partie N-terminale un domaine globulaire de

liaison aux glucides, permettant la liaison spécifique des glycoprotéines monoglucosylées de

type Glc1Man9GlcNAc2 (Kozlov et al., 2010c; Schrag et al., 2001). À partir de ce domaine

s’étend une longue boucle en forme de bras appelé domaine P pour sa richesse en résidus de

proline. Ce domaine a pour rôle de recruter l’oxydoreductase ERp57 (Frickel et al., 2002;

Kozlov et al., 2006) et la PPIase CypB (Kozlov et al., 2010b). Le domaine globulaire des deux

lectines contient également des sites de liaison pour les ions Ca2+ et l’ATP, deux cofacteurs

régulateurs importants pour la stabilisation des lectines chaperonnes. Le Ca2+ régule également

la liaison des lectines aux substrats (pour revue Lamriben et al., 2016).

Bien que réticulaires, ces deux chaperonnes ont également été localisées hors du RE où elles

joueraient d’autres fonctions. La calréticuline a été localisée dans le cytoplasme, à la surface

Introduction

19

externe de la cellule et la matrice extracellulaire ; et la calnexine à la surface cellulaire de

nombreuses cellules (Michalak et al., 2009; Wang et al., 2012; Lamriben et al., 2016).

i. Cycle de la calnexine/calréticuline

La forme tri-glucosylée Glc3Man9GlcNAc2 du N-glycan des protéines nouvellement

synthétisées a une demi-vie de quelques secondes. Immédiatement après son transfert sur le

résidu asparagine de la chaine polypeptidique naissante, son glucose terminal est clivé avec une

t1/2 < 2 min par l’action de l’α-glucosidase I, une enzyme faisant partie du complexe translocon

avec l’OST (Helenius and Aebi, 2004; Dejgaard et al., 2010; Roth and Zuber, 2017).

Le carbohydrate di-glucosylé Glc2Man9GlcNAc2 ainsi généré recrute et s’associe avec la

malectine, une lectine transmembranaire de type I du RE (Figure 6). Le rôle de cette protéine

induite par le stress du RE serait de prévenir l’agrégation des polypeptides naissants durant la

période de synthèse précoce et de recruter l’α-glucosidase II (Schallus et al., 2008; Galli et al.,

2011).

Figure 6 : Interaction des glycoprotéines avec la chaperonne calnexine. OST : oligosaccharyl transférase, BiP : chaperonne réticulaire, PDI et ERp57 : oxydoréductases, SPC : signal peptide peptidase, GlcI et GlcII : α-glucosidases I et II, Points et traits rouges : liaisons disulfures (D'après Braakman and Hebert, 2013).

L’α-glucosidase II ainsi recrutée clive le deuxième glucose avec une t1/2 ~ 5 min et génère un

carbohydrate mono-glucosylé Glc1Man9GlcNAc2 qui devient ainsi un substrat pour la calnexine

ou la calréticuline (Roth and Zuber, 2017). La calnexine ou calréticuline interagit avec ce N-

glycan au niveau de son domaine globulaire, tandis que sa chaîne polypeptidique forme des

liaisons disulfures mixtes transitoires avec ERp57. Ces interactions aident au repliement de la

glycoprotéine d’une part en réduisant son espace de repliement et en conséquence le nombre de

conformations potentielles, et d’autre part, en prévenant son agrégation et en facilitant

l’isomérisation des ponts disulfures grâce à l’ERp57 (Jessop et al., 2007; Gidalevitz et al., 2013;

Introduction

20

Lamriben et al., 2016). Ce dernier semble jouer un rôle supplémentaire dans la stabilisation de

l’ensemble de ces interactions.

À la fin de son repliement, la glycoprotéine doit être relâchée de la calnexine ou la calréticuline.

L’α-glucosidase II clive alors le dernier glucose du N-glycan et génère le motif Man9GlcNAc2,

avec une t1/2 ~ 20 min (Roth and Zuber, 2017). Le motif généré n’est ainsi plus reconnu par les

deux chaperonnes. Cependant, il pourra être reglucosylé par l’enzyme UGGT afin de restaurer

son affinité pour ces lectines, on parle alors de « cycle calnexine/calréticuline » (Figure 7).

Figure 7 : Le Cycle de la calnexine/calréticuline. (1) Assemblage de l’oligosaccharide Glc3Man9GlcNAc2, (2) Glycosylation de la protéine par l’OST, (3) Clivage de glucose par les α-glucosidases I et II, (4) Liaison de la glycoprotéine à la calnexine ou calréticuline, (5 et 8) Clivage du dernier glucose par l’α-glucosidase II, (6) Re-glucosylation des protéines n’ayant pas atteint leur conformation native par UGGT et (7) leur réentrée dans le cycle calnexine ou calréticuline pour un nouveaux cycle de repliement, (9 et 10) Les protéines correctement repliées sont démannosylées en Man8GlcNAc2 par les mannosidases du RE puis dirigées vers l’appareil de Golgi, (11) Les protéines définitivement mal repliées sont extensivement démannosylées par les mannosidases du RE puis conduites vers la dégradation hors du RE (D'après Lamriben et al., 2016).

Introduction

21

L’UGGT apparait comme étant un senseur de repliement crucial dans le RE extrêmement

sensible, qui peut reglucosyler les glycoprotéines mal repliées pour un nouveau cycle de

repliement et ignorer les glycoprotéines natives et fortement mal conformées. Cependant,

comment cette spécificité est accomplie reste encore mal comprise.

ii. Distinction des protéines correctement repliées des mal repliées

Une des questions importantes dans l’ERQC est de savoir comment ce processus

distingue les glycoprotéines définitivement mal repliées de celles ayant acquis leur

conformation native et surtout des intermédiaires de repliement. Il a été proposé que la présence

de résidus d’acides aminés hydrophobes exposés sur la protéine mal repliée serait le motif de

distinction entre les différentes formes de repliement. Ces motifs seraient reconnus par un

« senseurs de repliement », l’enzyme UGGT (Lamriben et al., 2016) ou BiP, une protéine de la

famille des Hsp70 (Heat Shock Protein at 70 kDa) (Flynn et al., 1991). En effet, tant qu’une

protéine présente des séquences hydrophobes exposées, elle restera retenue dans le RE afin de

subir d’autres cycles de repliement et d’atteindre la bonne conformation. A la fin de chaque

cycle, soit la protéine est correctement repliée et pourra donc quitter le RE pour transiter vers

l’appareil de Golgi, soit elle est reconnue comme définitivement mal repliée et sera alors

envoyée vers le système de dégradation, ou bien, cette protéine présente toujours un repliement

intermédiaire, elle subira dans ce cas-là, une autre tentative de repliement. Le système basé sur

BiP est utilisé principalement pour les protéines non glycosylées ou les glycoprotéines dans

lesquelles le N-glycan se produit relativement tard (Otero et al., 2010). Ainsi, nous détaillerons

ici uniquement le deuxième système, propre aux glycoprotéines.

Le système de contrôle de qualité des glycoprotéines est basé non seulement sur la

reconnaissance des séquences hydrophobes exposées sur la surface des glycoprotéines par

l’enzyme UGGT, mais également sur la structure de leur chaine glycanique, d’où le nom de

« système basé sur le code glycan ». En effet, comme nous l’avons abordé dans la partie

précédente, au cours de son processus de repliement, la glycoprotéine sous sa forme mono

glucosylée Glc1Man9GlcNAc2 interagit avec la chaperonne calnexine/calréticuline et subit un

cycle de repliement « cycle de calnexine/calréticuline ». Suite au clivage de son résidu glucose

par la glucosidaseII, la glycoprotéine sous la forme Man9GlcNAc2 n’est plus reconnue par la

calnexine. A cet instant, elle va être « scannée » par l’enzyme UGGT qui reconnaît et interagit

préférentiellement avec les régions protéiques hydrophobes exposées à la surface des

glycoprotéines n’ayant pas atteint leur conformation native. Ainsi, trois cas de figures sont

Introduction

22

possibles (Braakman and Hebert, 2013) : (1) la glycoprotéine n’expose pas de séquences

hydrophobes, elle est donc correctement repliée et pourra quitter le RE et transiter vers

l’appareil de Golgi (Geva and Schuldiner, 2014a), (2) la glycoprotéine expose des séquences

hydrophobes, elle est donc mal repliée et sera reglucosylée par l’UGGT. Elle reforme alors un

complexe avec calnexine-ERp57 afin de subir un nouveau cycle de repliement (Hebert et al.,

1995), ou (3) la glycoprotéine présente toujours des séquences hydrophobes avec un repliement

anormal, elle sera donc extensivement démannosylée par les mannosidases du RE afin de

fournir un signal pour sa prise en charge par le système de dégradation (Helenius and Aebi,

2004).

b) Les protéines de choc thermique (Hsp)

Le système Hsp (Heat Shock Protein) est un système chaperon majeur dans le RE en

plus du complexe calnexine/calréticuline (Otero et al., 2010; Balchin et al., 2016). Localisées

dans le cytoplasme, le noyau ou même dans le RE, les Hsps sont des chaperonnes inductibles

par le stress (Shastry et al., 2002; McClung et al., 2008). Elles sont recrutées pour aider à la

maturation des protéines non glycosylées ou des domaines sur des protéines glycosylées

(Beckmann et al., 1990). Certains d’entre eux identifient les protéines immatures, aberrantes ou

favorables à l’agrégation de par la présence de segments hydrophobes exposés sur ces protéines

(Glover and Lindquist, 1998; Ben-Zvi et al., 2004; Li and Srivastava, 2004). Ce système est

également impliqué dans la transduction du signal, la régulation du cycle cellulaire, la

différenciation et la mort cellulaire programmée (pour revue Jacob et al., 2017). Leur liaison

est régulée par des cofacteurs adénine-nucléotidiques et cofacteurs spécialisés. Malgré ces

similitudes, leur gamme de substrats et leurs rôles sont divers. Ici, nous allons nous intéresser

principalement aux chaperonnes et co-chaperonnes les plus pertinentes pour notre étude.

i. Hsp70 et Hsp40

La famille des Hsp70 regroupe des protéines d’environ 70 kDa inductibles par un choc

thermique. Les chaperonnes de ce système se lient à des séquences enrichis en résidus

hydrophobes, typiquement exposés par des protéines mal repliées (Rüdiger et al., 1997; Swain

et al., 2007; Qi et al., 2013). Leur rôle dans le repliement des protéines néo-synthétisées se

caractérise par la prévention de l’agrégation, l’aide au repliement et la solubilisation des

protéines agrégées.

Introduction

23

Les membres de cette famille partagent une séquence composée de deux domaines : un

domaine ATPase, nommé NBD (Nucteotide Binding Domain) localisé en N-terminal et un

domaine de liaison au substrat SBD (Substrate Binding Domain) localisé en C-terminal. Ce

dernier domaine contient une région hydrophobe appropriée en forme de poche à laquelle se

fixe la protéine à replier (Mayer and Bukau, 2005). Cette poche est sous le contrôle d’un

couvercle étendu, ATP-dépendant, qui peut s’ouvrir et se fermer en emprisonnant le substrat

dans la poche (Mayer et al., 2000). Suite à la fixation de l’ATP au domaine NBD, le couvercle

s’ouvre, permettant la liaison du substrat au domaine SBD avec une faible affinité. Cette liaison

de substrat stimule l’activité ATPase de la chaperonne et par conséquent l’hydrolyse d’ATP

(Flynn et al., 1989). Hsp70 lié à l’ADP acquiert ainsi une forte affinité pour son substrat et le

couvercle se ferme, isolant la partie de substrat fixé au SBD. Cette liaison avec une haute

affinité protège les substrats d’un repliement prématuré et de l’agrégation. Cependant,

l’échange de l’ADP par un ATP résulte en l’ouverture du couvercle et par conséquent la

libération de la protéine qui peut alors poursuivre son repliement.

Ce cycle de Hsp70 est régulé par des protéines de la famille Hsp40 et des facteurs d’échange

de nucléotides NEF (nucleotide exchange factors). Les co-chaperonnes Hsp40 (DnaJ chez les

bactéries), connue aussi sous le nom de protéines à domaine-J contiennent une région, appelée

domaine J requise pour leur liaison avec les différents membres de Hsp70. Leur liaison stimule

et accélère fortement l’hydrolyse de l’ATP, générant l’état fermé de Hsp70 piégeant le substrat

(Kityk et al., 2012; Nunes et al., 2015). La liaison ultérieure des NEF au NBD quant à elle,

facilite l’échange ADP en ATP, ouvrant le SBD et permettant la libération du substrat pour le

repliement ou le transfert vers les chaperonnes en aval ou vers la machinerie de dégradation

(Sharma et al., 2010; Braakman and Hebert, 2013).

Parmi les membres de la famille Hsp70, on retrouve la protéine GRP78 (Glucose

Regulated Protein), connue sous le nom de BiP pour Binding Immunoglobulin Protein. Il s’agit

d’une protéine soluble réticulaire de 78 kDa qui se lie à la plupart des chaines peptidiques

naissantes qui transitent dans le RE. BiP est l’une des chaperonnes du RE les plus abondantes

et possède de multiples rôles allant du repliement productif à une participation dans le processus

ERAD. Il a été proposé que BiP serait un senseur de repliement qui distingue entre les

différentes formes de repliement des protéines non glycosylées ou des glycoprotéines dans

lesquelles le N-glycan se produit tardivement (Flynn et al., 1991; Otero et al., 2010).

Introduction

24

L’activité ATPase de BiP, mais aussi sa localisation et ses diverses fonctions, nécessitent

l’assistance des co-chaperonnes de la famille Hsp40 connues sous le nom de ERdj 1 à 7 (ER-

localized DnaJ proteins) (Braakman and Hebert, 2013). Certains membres d’ERdj jouent un

rôle dans le processus de repliement (Shen and Hendershot, 2005; Otero et al., 2010), alors que

d’autres s’associent au protéines mal repliées et aident dans l’accélération de leur dégradation

(Dong et al., 2008; Lai et al., 2012). Il a été démontré par exemple qu’ERdj5 interagit avec

EDEM (ER-degradation enhancing alpha-mannosidase like protein), protéine de type α-

mannosidase impliquée dans la dégradation des protéines mal repliées (Ushioda et al., 2008).

De même, ERdj4 et ERdj5 surexprimés interagissent avec p97, une composante de la

machinerie ERAD (Dong et al., 2008).

Les membres de Hsp70 cytoplasmiques participent aussi au bon repliement des

protéines, mais des domaines exposés dans la face cytosolique du RE. Il a été démontré que

Hsp70 en association avec Hsp40 et d’autres co-chaperonnes (telles que Hdj1/2, CHIP (C-

terminus of Hsp70 interacting protein), HspBP1 (Heat Shock Protein Binding 1)) interviennent

en complexe sur des domaines cytoplasmiques des protéines du RE. En fonction du complexe

formé, la protéine sera envoyée soit vers la voie de sécrétion soit vers la voie de dégradation

(Figure 8).

Figure 8 : Influence des co-chaperonnes du complexe Hsp70 sur le devenir des protéines. CHIP : C-terminus of Hsp70 interacting protein. Hdj : Human DnaJ2. Hop : Hsp-organising protein

Hsp : Heat Shock Protein. (Modifié d'après Goldberg, 2003).

Hdj1 et Hdj2 semblent faciliter le repliement des protéines (Meacham, 1999; Farinha et al.,

2002). HspBP1 quant à elle, régule négativement la co-chaperonne CHIP qui augmente

l’activité du système ERAD (Connell et al., 2001; Meacham et al., 2001a; Alberti et al., 2004).

CHIP est une E3 ligase qui interagit avec une famille d’enzymes de conjugaison d’ubiquitine

E2 (E2 ubiquitin conjugating enzymes) et se lie sur Hsp70 ou sa forme constitutivement

exprimée, Hsc70 (heat shock cognate) mais également sur Hsp90 (Cyr et al., 2002). Même si

Introduction

25

les deux chaperonnes lient CHIP de la même affinité, elles présentent des effets opposés sur

l’ubiquitinylation de protéines. En effet, il a été proposé que Hsp70 favorise l’ubiquitinylation

et la dégradation de substrats, tandis que Hsp90 les inhibe (Peng et al., 2009).

ii. Hsp90

La famille des Hsp90 regroupe des protéines d’environ 90 kDa et qui sont présentes

dans la plupart des compartiments cellulaires tels que le cytosol, le RE et les mitochondries.

Elles jouent un rôle dans la prévention de l’agrégation des protéines néo-synthétisées et

facilitent leur repliement ou leur dégradation. Cette famille de protéine joue également un rôle

essentiel dans de nombreux autres processus cellulaires, y compris la réponse de la cellule au

stress, le contrôle du cycle cellulaire, la survie cellulaire et d’autres voies de signalisation (Pour

revue Jackson, 2012; Mayer and Le Breton, 2015; Schopf et al., 2017).

Les membres de HSP90 fonctionnent comme des homodimères et la dimérisation est

essentielle pour leur fonction in vivo (Wayne and Bolon, 2007). Un monomère de HSP90 se

compose de trois domaines hautement conservés : un domaine N-terminal NTD, un domaine

intermédiaire MD et un domaine C-terminal CTD. Le domaine NTD permet la fixation de

l’adénine, du calcium, des co-chaperonnes et régule l’hydrolyse d’ATP (Prodromou et al.,

1997). Le domaine MD possède une large boucle hydrophobe qui contrôle la fixation de l’ATP

et permet la liaison de substrats. Ces 2 domaines NTD et MD sont connectés par un connecteur

long, flexible et chargé qui module les contacts NTD-MD et affecte la fonction de Hsp90

(Hainzl et al., 2009; Tsutsumi et al., 2012; Jahn et al., 2014). Le domaine CTD quant à lui, est

responsable de la dimérisation (Harris et al., 2004; Cunningham et al., 2008). Il contient

également un motif C-terminal important pour l’interaction avec certaines co-chaperonnes

(Buchner, 1999). En l’absence d’ATP, Hsp90 favorise une conformation ouverte. En revanche,

lors de la liaison d’ATP, un segment de couvercle de NTD se ferme sur le nucléotide lié,

conduisant à une dimérisation de NTD. Après l’hydrolyse de l’ATP et la libération de

nucléotides, Hsp90 revient à son état ouvert (Shiau et al., 2006; Hellenkamp et al., 2017).

Hsp90 coopère avec divers co-chaperonnes qui régulent son activité ATPase et recrutent les

substrats (Li et al., 2012; Röhl et al., 2013) . Ces facteurs agissent en séquentiel le long du cycle

Hsp90 et, dans certains cas, forment des complexes mixtes avec la chaperonne (Li et al., 2011).

Parmi ces co-chaperonnes, Hop (Hsp-organising protein) et Cdc37 qui stabilisent la

conformation ouverte du dimère Hsp90, inhibent l’hydrolyse d’ATP et facilitent la liaison avec

le substrat. Hop facilite le transfert de substrat de Hsp70 vers Hsp90, alors que Cdc37

Introduction

26

fonctionne comme un adaptateur pour les substrats kinase. Une autre co-chaperonne, Aha1

(Activator of Hsp90 ATPase protein 1) se lie asymétriquement au MD et NTD du dimère

Hsp90, facilitant la transition vers la conformation fermée et accélérant ainsi l’hydrolyse d’ATP

(Panaretou et al., 2002; Meyer et al., 2004; Koulov et al., 2010; Retzlaff et al., 2010). Quant à

la co-chaperonne P23, elle agit vers la fin du cycle et facilite la maturation du substrat en

stabilisant l’état fermé des domaines N de Hsp90 et en inhibant l’hydrolyse de l’ATP

(Prodromou, 2000; Ali et al., 2006; Li et al., 2012). Hsp90 coopère avec une gamme d’autres

cofacteurs contenant des domaines TPR (Tetratricopeptide). Certains de ces facteurs

contiennent également des domaines peptidyl-prolyl-isomérase (PPIase) et participent au

repliement du substrat sur Hsp90 (Taipale et al., 2012). D’autres facteurs contiennent un

domaine avec une activité ubiquitine ligase comme CHIP, qui se lie aux deux chaperonnes

Hsc70 et Hsp90 à travers son domaine Tetratricopeptide (TPR) (Pratt et al., 2010).

Le mécanisme d’interaction de Hsp90 avec ses substrats et comment son cycle ATPase est

couplé à leur maturation n’est pas encore bien compris. Il a été cependant postulé que

l’hydrolyse de l’ATP de Hsp90 régulerait le transfert du substrat de Hsp70 vers Hsp90,

probablement grâce à un couplage des cycles d’ATP des deux chaperonnes (Kirschke et al.,

2014). Des études avaient démontré en effet que Hsp70 et Hsp90 agiraient ensemble mais en

séquentiel pour prévenir l’agrégation des chaines polypeptidiques en cours de repliement et que

Hsp90 agirait en aval en se liant sur les intermédiaires de repliement tardifs (Kosano et al.,

1998). De plus, le rôle de Hsp40, une co-chaperonne de Hsp70 pour l’activité de Hsp90 a été

démontré in vivo par des études de génétiques dans la levure montrant que des mutations dans

Ydj1 (yeast dnaJ) compromettent la capacité de Hsp90 à chaperonner les récepteurs de stéroïdes

ou la protéine kinase pp60v-src (Caplan et al., 1995; Kimura et al., 1995). Sa nécessité pour

l’activité de Hsp90 a également été démontrée par des études in vitro sur des complexes de

Hsp90 avec le récepteur progestérone (PR) (Kosano et al., 1998; Hernández et al., 2002) ou

glucocorticoïde (GR) (Dittmar et al., 1998; Kirschke et al., 2014). Il a été constaté que cette co-

chaperonne se lie beaucoup plus facilement à PR dans sa forme native que sous sa forme

dénaturée, suggérant que sa liaison serait la première étape pour la voie de chaperon HSP90

pour PR (Hernández et al., 2002).

Parmi les membres de la famille Hsp90, Grp94 (glucose-regulated protein 94),

fortement exprimée dans la lumière du RE (Marzec et al., 2012). Il présente de nombreuses

similitudes avec les Hsp90 cytosoliques. Cependant, Grp94 lie le calcium dans le RE, possède

un ensemble distinct de substrats à plusieurs domaines, tous liées avec des disulfures et ne

Introduction

27

présente pas de motif Tetratricopeptide (TPR) (Soldano et al., 2003; Dollins et al., 2007; Frey

et al., 2007; Immormino et al., 2009; Marzec et al., 2012). Les co-chaperonnes qui pourraient

moduler son activité n’ont pas encore été identifiés. Il a été démontré que GRP94 est souvent

associée à BiP. L’inhibition par voie pharmacologique ou moléculaire de l’une des deux

chaperonnes induit une up-régulation de l’autre chaperonne. GRP94 agirait après BiP en se liant

sur les intermédiaires de repliement tardifs. Cette distinction semble être due à des indices

structurels différents auxquels la GRP94 est sensible (Gidalevitz et al., 2013). Il a été observé

que le knockdown de GRP94 stabilise le substrat classique d’ERAD, α-1-antitrypsin NHK (Null

Hong Kong), suggérant que tout comme BiP, cette chaperonne jouerait un rôle dans l’adressage

de cette protéine mal repliée vers la voie de dégradation ERAD (Christianson et al., 2008). De

plus, une interaction de GRP94 avec OS-9 (OsteoSarcoma amplified 9), une protéine qui

reconnait les glycoprotéines mal repliées et les envoie vers la voie ERAD a été observée

(Christianson et al., 2008; Braakman and Hebert, 2013).

Tout comme Hsp70 cytosolique, Hsp90 cytosolique interagit avec les domaines

cytoplasmiques de différentes protéines insérées dans la membrane du RE, dont la protéine

CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), et influence leur stabilité.

c) Les chaperonnes de transport hors le RE

La sortie des protéines correctement repliées du RE se produit au niveau de sites

spécifiques de la membrane du RE, appelés sites de sortie du RE (ERES pour ER-exit sites),

qui sont séparés spatialement des régions où la translocation active a lieu. Au niveau de ces

sites, les protéines correctement repliées sont empaquetées dans des vésicules pour leur

adressage vers un compartiment situé entre le RE et l’appareil de Golgi appelé ERGIC (ER-

Golgi Intermediate Compartment) selon un transport antérograde (Appenzeller-Herzog, 2006;

McCaffrey and Braakman, 2016). Ces vésicules de transport sont appelées vésicules COPII

(COatomer protein II), en référence à leur complexe de revêtement spécifique qui entraîne

l’assemblage et le bourgeonnement de la vésicule. Les vésicules COPII sont composées d’une

enveloppe externe comprenant entre autre les protéines Sec13 et Sec31 qui favorisent la

polymérisation de revêtement (Coat) ainsi que le processus de bourgeonnement. Elles sont

également composées d’une enveloppe interne comprenant les protéines Sec23 et Sec24 qui

trient les protéines néosynthétisées par absorption sélective (Lederkremer et al., 2001; Miller et

al., 2002, 2003; D’Arcangelo et al., 2013). Les protéines correctement repliées sont en effet

Introduction

28

sélectivement concentrées par liaison directe ou indirecte à la sous-unité Sec24 afin de

permettre leur exportation. Les protéines résidentes du RE et les protéines mal/non repliées ne

sont pas reconnues par ce système et ne vont donc pas sortir du RE (Geva and Schuldiner,

2014a).

L’empaquetage des protéines dans les vésicules COPII suivrait deux modèles (Figure 9) :

Figure 9 : Modes de transport des protéines hors du réticulum endoplasmique.

(Geva and Schuldiner, 2014b)

Le transport « bulk flow » : pour ce mode de transport, les protéines sont incorporées

de manière non sélective dans les vésicules COPII. Il est proposé pour ce modèle que les

protéines quittent le RE en suivant le fluide de la membrane des vésicules formées sans

l’intervention de récepteurs. Ce flux de protéines hors du RE est complètement contrôlé par les

chaperonnes et autres composants de l’ERQC qui retiennent les protéines mal/non repliées

telles que les chaperonnes calnexine et calréticuline. Ces interactions réduiraient en effet la

mobilité des protéines dont la mise en conformation n’est pas terminée, leur accès aux vésicules

COPII et ainsi leur sortie du RE. Les protéines ayant atteint leur conformation native, quant à

elles, sont libérées de ces interactions et peuvent ainsi pénétrer dans les vésicules COPII d’une

manière non sélective et quitter le RE (Balch and Gist Farquhar, 1995; Geva and Schuldiner,

2014b).

Introduction

29

Le transport médié par un récepteur membranaire : ce mode de transport implique

l’interaction des glycoprotéines avec un récepteur membranaire présent aux sites de sorties du

RE et capable d’interagir avec le manteau de la vésicule (Balch et al., 1994). Parmi ces

récepteurs sont retrouvés ERGIC53, VIP36 (36 kDa Vesicular Integral membrane Protein) et

VIPL (VIP36-Like) (Yamamoto, 2014). Ces récepteurs sont classés comme lectines type-L car

ils possèdent un domaine homologue de CRD (Carbohydrate Recognition Domain) (Kamiya et

al., 2008). Des études antérieures ont révélé qu’ERGIC53 et VIP36 présentent des spécificités

et affinités aux substrats différentes malgré des similitudes structurelles dans leur CRD (46%

de similitude), suggérant leurs rôles biologiques distincts dans le trafic intracellulaire.

La lectine ERGIC53 est localisée principalement dans le compartiment ERGIC. Ce

récepteur qui forme des homodimères et des homohexamères, possède un grand domaine

lectine luminale dans la partie N-terminale qui aurait pour rôle de lier les protéines glycosylées,

et un domaine dans sa partie cytosolique qui permet la liaison avec les molécules COPII.

Constitutivement recyclé entre le RE et l’ERGIC, ERGIC53 facilite le transport du RE vers

l’ERGIC de nombreux substrats présentant un motif N-glycan à haute teneur en mannose, de

manière dépendante du Ca2+ et du pH (Kamiya et al., 2008; Satoh et al., 2014a; Yamamoto,

2014) (Figure 10). ERGIC-53 semble lier efficacement le mannose de ses substrats à un pH de

7.4 minimum (Kamiya et al., 2005). Il présente une affinité de liaison plus faible et une

spécificité plus large que VIP36 et VIPL et peut se lier aux glycans avec une branche A

déglucosylée ou monoglucosylée (Kamiya et al., 2008; Satoh et al., 2014b). Il a été révélé que

l’expression d’ERGIC53 avec d’autres chaperonnes du RE est surexprimée dans des conditions

de stress du RE (Qin et al., 2012).

Introduction

30

Figure 10 : Transport des glycoprotéines dans la voie sécrétoire (Yamamoto, 2014). Les protéines ayant acquis leur structure correctement repliée dans le cycle de calnexine/calréticuline sont transportées vers le compartiment ERGIC via le récepteur ERGIC53 dans des vésicule COPII. Une fois dans le compartiment ERGIC, les glycoprotéines sont libérées puis transportées vers l’appareil de Golgi, et ERGIC53 est recyclé vers le RE via des vésicules de type COPI. Dans le cis-Golgi, les glycoprotéines sont soit clivées en Man5 avant la reglucosylation par les glycosyltransférases de Golgi, soit marquées avec le signal lysosomale Man-6-P par l’action séquentielle de phosphotransférase (PT) et phosphodiesterase (PD). Certaines glycoprotéines échappent aux clivages, mais elles peuvent être reconnues par VIP36 dans le trans-Golgi et recyclées au cis-Golgi pour une autre tentative de clivage ou bien recyclées au RE pour les transmettre à la chaperonne BiP. Les protéines transportant des résidus Man-6-P sont reconnues par les MPR (mannose 6-phosphate receptors) dans le trans-Golgi et transportées vers les endosomes via des vésicules revêtues de clathrin. Les glycoprotéines correctement repliées sont transportées vers leur localisation physiologique. Ce processus peut être médiés par des lectines qui sont cependant inconnues (Modifié d'après Hauri et al., 2000; Yamamoto, 2014).

Introduction

31

Une fois dans l’appareil de Golgi, la glycoprotéine est démannosylée par l’α-

mannosidase I de Golgi formant la structure Man5GlcNAc2, qui est un substrat pour N-

acetylglucosaminyltransferases (GnT-I), une enzyme clé dans le développement d’organismes

multicellulaires. L’addition du premier résidu GlcNAc par GnT-I génère

GlcNAcMan5GlcNAc2, substrat pour GnT-III ou α-mannosidase II. La GnT-III oriente la voie

vers des structures hybrides, alors que l’α-mannosidase II clive deux résidus mannose et génère

GlcNAcMan3GlcNAc2. Ce dernier peut être encore modifié par une série de GnTs (GnT-II, IV,

V et VI) qui génèrent différentes branches de complexes N-glycans (Vasconcelos-dos-Santos

et al., 2015) (Figure 11).

Figure 11 : Représentation schématique de la maturation des oligosaccharides N-liés. GNT-I à V : N-acetylglucosaminyltransferases. FucT : Fucosyltransferase. α-Mann I/II : α-Mannosidase I. DMJ : 1-deoxymannojirimycin. LacNac : N-Acetyl-D-lactosamine. Lex : LewisX. SLex : Sialyl LewisX. Ley : Lewisy (D'après Vasconcelos-dos-Santos et al., 2015).

Les protéines mal repliées qui « accidentellement » se retrouvent transportées par les vésicules

COPII jusqu’à l’appareil de Golgi sont recyclées vers le RE selon un transport rétrograde par

des vésicules de type COPI (Hsu et al., 1991; Teasdale and Jackson, 1996). Cela est assuré par

des molécules de capture, tels que les récepteurs de protéines ou le complexe COPI lui-même

qui servent de médiateur à la récupération sélective de protéines mal/non repliées. Ainsi, le

compartiment ERGIC est considéré comme un point de contrôle laissant transiter vers l’appareil

de Golgi uniquement les protéines correctement repliées (Kukushkin et al., 2011).

Introduction

32

VIP36 a été découvert dans un criblage pour les protéines impliquées dans le tri apical

du réseau trans-Golgi (Fiedler et al., 1994). Contrairement à ERGIC53 qui est non glycosylé,

VIP36 a un site de N-glycosylation et acquiert une glycosylation complexe. Cette lectine est

localisée principalement dans l’appareil de Golgi et seulement dans une certaine mesure dans

le compartiment ERGIC (Füllekrug et al., 1999; Reiterer et al., 2010; Hoang et al., 2015).

D’autres études l’ont cependant localisé dans des vésicules sécrétoires post-Golgienne et au

niveau de la membrane plasmique (Hara-Kuge et al., 2002; Shimada et al., 2003). VIP36 se lie

aux oligosaccharides hautement glycosylés ayant la branche A déglucosylée. Elle présente une

dépendance au pH pour lier ses substrats, avec des valeurs de pH optimales d’environ 6.5

(Kamiya et al., 2005, 2008). A noter, les valeurs de pH typiques du réseau RE, cis-Golgi et

trans-Golgi correspondent respectivement aux 7.2, 6.4 et 5.4 (Wu et al., 2001; Weisz, 2003). Il

a été suggéré que VIP36 présente des résidus d’acides aminés « senseurs de pH », responsables

de la détection du pH (Kamiya et al., 2005). Bien que les propriétés de liaison aux

oligosaccharides de VIP36 aient été élucidées de façon assez détaillée, la fonction biologique

de cette lectine reste une énigme. En effet, il a été suggéré d’une part que VIP36 interagit avec

l’α-amylase de rat et la clusterine, et par conséquent, un rôle dans le transport antérograde post-

Golgi lui a été postulé. D’autre part, basé sur l’observation d’une liaison entre VIP36 et l’α1-

antitrypsin mal/non repliée dans l’appareil de Golgi et le RE, il a été suggéré que cette lectine

agirait dans le contrôle de qualité post-ER en se liant à cette protéine qui s’est échappée de

l’ERQC pour la recycler de nouveau dans le RE pour un contrôle de qualité supplémentaire

(Reiterer et al., 2010). De plus, il a été observé que le complexe VIP36/α1-antitrypsine co-

immunoprécipite avec la chaperonne BiP (Reiterer et al., 2010). A noter, VIP36 semble lier un

complexe avec BiP indépendamment de son activité de liaison N-glycan (Nawa et al., 2007).

Enfin, la protéine VIPL a été identifiée lors d’un criblage de structure sur le domaine

CRD (Neve et al., 2003). Comme VIP36, VIPL se lient aux oligosaccharides hautement

glycosylés ayant la branche A déglucosylée. Bien que possédant une séquence génique plus

proche de VIP36 que d’ERGIC53, VIPL est localisée principalement dans le RE (Nufer et al.,

2003; Qin et al., 2012). L’équipe de Pettersson a démontré que l’extinction par siRNA (small

interfering RNA) de VIPL diminue la sécrétion de deux glycoprotéines, proposant ainsi un rôle

de VIPL dans le transport médié par un récepteur membranaire (Neve et al., 2003). Une autre

étude a démontré que VIPL ne transporte pas les protéines du RE et que son rôle serait de

contrôler la fonction d’ERGIC53 en modulant sa sortie du RE (Nufer et al., 2003). Kamiya et

ses collaborateurs quant à eux proposent un autre modèle selon lequel VIPL lie les

Introduction

33

glycoprotéines déglucosylées à haute teneur en mannose immédiatement après leur sortie du

cycle calnexin/calréticuline étant donné sa localisation dans le RE et sa sélectivité élevée pour

lier la branche A complètement déglucosylée. Ainsi, VIPL aurait un rôle pour protéger les

glycoprotéines correctement repliées de la dégradation en empêchant leur démannosylation par

les manosidases du RE et leur interaction avec la famille de protéines EDEM (Kamiya et al.,

2008). Basé sur leur résultats et les études démontrant que la surexpression de VIPL redistribue

ERGIC53 dans le RE (Neve, 2003; Nufer et al., 2003), la même équipe propose que les

glycoprotéines liées au VIPL seraient remises à ERGIC-53 (Kamiya et al., 2008).

B. La voie ERAD

Bien que certaines protéines acquièrent leur conformation native avec une efficacité

proche de 100% telle que la protéine HA de la grippe (Braakman et al., 1991), une grande

partie (environ 75%) de protéines telles que le CFTR, l’apolipoprotéine A ou le récepteur

d’érythropoïétine ont une faible efficacité de repliement avec une dégradation des protéines

n’atteignant pas la bonne conformation (Araki and Nagata, 2011).

Chez les mammifères, il existe plusieurs mécanismes de dégradation des protéines

n’arrivant pas à atteindre leur conformation native. Ces mécanismes peuvent fonctionner d’une

manière parallèle (Fu and Sztul, 2009; Le Fourn et al., 2013) :

La voie de macro-autophagie du RE (réticulophagie) : Il s’agit d’une forme

particulière de l’autophagie qui élimine des protéines en les enveloppant dans des

vésicules à double membrane « les autophagosomes ». Ces dernières fusionnent avec

des lysosomes contenant des hydrolases afin de dégrader les substrats. Ce processus

était attribué à la dégradation des protéines agrégées, afin de remédier aux contraintes

de taille, les empêchant d’être dégradées par la voie ERAD. Cependant, des études ont

démontré que la macro-autophagie n’est pas liée à l’accumulation de protéines dans

l’ERQC. En effet, il a été reporté que la forme mutante de GnRHR (Gonadotropin-

Releasing Hormone Receptor) est dégradée spécifiquement par la voie de l’autophagie

même si elle ne forme pas d’agrégats (Houck et al., 2014). Ceci, suggère que ce

processus de dégradation pourrait être spécifique du substrat. De plus, il a été proposé

que l’autophagie peut être impliquée dans l’élimination des protéines CFTR mal

repliées et qu’elle jouerait un rôle compensatoire lorsque la fonction protéasomique est

surchargée (Fu and Sztul, 2009; Luciani et al., 2011, 2012).

Introduction

34

La voie des vésicules EDEM « EDEMosomes » : cette voie correspond à la

ségrégation des régulateurs d’ERAD dans des vésicules distinctes des autophagosomes

afin de les ségréger hors du RE et de les transporter vers la dégradation en fusionnant

avec des lysosomes. Cependant, des protéines mal repliées ainsi que des complexes

multiprotéiques destinés à la dégradation ont été identifiés dans ces vésicules (Zuber et

al., 2007; Le Fourn et al., 2013). Cette partie sera plus développée en page 46.

La voie de dégradation associée au RE, ERAD:

ERAD est la voie majoritaire de dégradation des protéines mal repliées. Elle consiste en

la rétro-translocation de ses substrats vers le cytosol pour leur dégradation dépendante de

l’ubiquitine-protéasome (Hegde et Ploegh 2010). Un certain nombre de substrats

physiologiques et pathologiques ciblé par ce processus ont été identifiés, dont l’alpha-1

antitrypsine et la protéine CFTR (Vij et al., 2006; Needham and Brodsky, 2013). Ce processus

comprend 4 étapes : la reconnaissance de substrat, son ubiquitinylation, sa rétrotranslocation

vers le cytosol et sa dégradation par le protéasome (Figure 12).

Introduction

35

Figure 12 : Etapes de la dégradation ERAD des glycoprotéines. Reconnaissance : la reconnaissance est médiée par des chaperons réticulaires ou cytoplasmiques, en fonction de l’emplacement de la lésion (étoile rouge). Les lectines sont représentées en rouge. Ubiquitinylation : après la reconnaissance, la machine d’ubiquitinylation est recrutée sur le substrat mal replié, soit directement dans la membrane, soit par des interactions avec des chaperons cytoplasmiques. Une enzyme d’activation de l’ubiquitine (E1) transfère l’ubiquitine (cercle gris) vers un site actif d’une enzyme de conjugaison d’ubiquitine (E2) dans un processus ATP-dépendant. L’ubiquitine est ensuite transférée sur le substrat via une ubiquitine ligase (E3). L’ubiquitinylation à la membrane du RE peut se produire via des E3-ligases cytoplasmiques ou membranaire, toutes deux montrées. Rétro-translocation : la retro-translocation dépend presque toujours du complexe p97/Cdc48, qui comprend Ufd1 et Npl4 et interagit avec l’ubiquitine et les régions mal repliées sur un substrat. P97/Cdc48 fournit la force mécanique par hydrolyse d’ATP pour l’élimination du substrat. Dégradation : suite à leur retro-translocation, les protéines mal repliées sont introduites dans le protéasome 26S et doivent être maintenues solubles pour éviter l’agrégation (Modifié d'après Guerriero and Brodsky, 2012).

Introduction

36

La première étape de la voie ERAD est l’identification des substrats à dégrader. Selon

la localisation du défaut de repliement, ces substrats sont reconnus soit par les chaperonnes

cytosoliques tel que Hsp70 (défaut de repliement dans la partie cytoplasmique) (Grove et al.,

2011) ; ou bien par BiP et des lectines d’ERAD dont EDEM, OS-9 ou XTP3B (XTP3-

transactivated gene B protein) (défaut de repliement dans la partie luminale) (Groisman et al.,

2011).

Malgré les progrès dans la compréhension d’ERAD fait au cours des dernières années, la fin

des cycles de reglucosylation/déglucosylation des glycoprotéines n’est pas à ce jour

complètement comprise. Il est considéré cependant, que chaque glycoprotéine présente un

certain laps de temps pour le repliement correct. Si ce temps de repliement est dépassé et que

la glycoprotéine ne peut pas atteindre sa conformation appropriée, elle est finalement ciblée

pour l’ERAD. Toutefois, certains substrats tels que des polypeptides extensivement mal repliés

ne passent le cycle calnexine/calréticuline qu’une seule fois et ne sont pas reconnus par le

senseur de repliement UGGT.

L’extraction des glycoprotéines identifiées comme définitivement mal repliées du cycle

calnexine/calréticuline semble être effectuée par le/les α1,2-mannosidase(s) dans le RE. Le

clivage de résidus mannose joue en effet un rôle crucial dans la génération de signaux de

dégradation des glycoprotéines mal repliées (Herscovics, 2001; Helenius and Aebi, 2004;

Molinari, 2007). Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, deux étapes de clivage de mannose

sont cruciales pour ce processus. La première étape est assurée par l’α1,2-mannosidase Mns1

qui clive un résidu mannose de la branche B du motif Man9GlcNAc2 (M9) et génère ainsi le

motif Man8GlcNAc2 (M8B) ; et la seconde étape est catalysée par l’α1,2-mannosidase Htm1

(homologous to mannosidase I) qui assure la conversion du M8B en un oligosaccharide

exposant le résidu mannose j (Jakob et al., 2001; Clerc et al., 2009) (Figure 13), un ligand pour

la lectine Yos9p qui le dirige vers la dégradation (Quan et al., 2008). Dans les cellules

mammifères, ce processus est cependant beaucoup plus complexe, du fait qu’elles expriment la

protéine ER mannosidase I (ERmanI) comme le seul homologue de MnsI, mais expriment de

multiples homologues pour HtmI, nommés EDEM1, EDEM2 et EDEM3. La contribution

exacte de chaque α1,2-mannosidase au processus de clivage de mannose n’est pas encore

complètement définie (Gonzalez et al., 1999; Hosokawa et al., 2003; Mast et al., 2005; Hirao

et al., 2006; Hosokawa et al., 2010).

Introduction

37

Figure 13 : Structure du motif oligosaccharide N-glycan Glc3Man9GlcNAc2. A, B et C : les branches oligosaccharidiques. Les enzymes qui modifient ce motif sont listées sur la figure et leur action est représentée. Le type de liaison glycosidique est représenté en couleur (D'après Słomińska-Wojewódzka and Sandvig, 2015).

Bien qu’initialement la génération de l’isomère M8B a été supposée comme le signal

pour la dégradation, cet isomère est également porté par les glycoprotéines correctement

repliées qui transitent vers l’appareil de Golgi. Ainsi, il est proposé que d’autres clivages de

résidu mannose, éventuellement trois ou quatre α1,2-mannoses, sont nécessaires pour dériver

les glycoprotéines mal repliées vers la voie ERAD (Frenkel et al., 2003; Clerc et al., 2009).

L’élimination du mannose g (Figure 13) empêche en effet la restauration de l’état

monoglucosylé de la structure glycanique, ce qui extrait de façon irréversible les substrats

ERAD du cycle calnexine/calréticuline. Le clivage du mannose k, quant à lui, expose le

mannose j à liaison α1,6 qui devient une cible pour les régulateurs ERAD cruciaux (Hosokawa

et al., 2009; Yamaguchi et al., 2010; Groisman et al., 2011; Hebert and Molinari, 2012). Le

mannose f peut lui aussi être éliminé. L’accumulation d’évidences indique que les protéines

EDEMs sont les principaux acteurs de ces clivages. Ainsi, ces protéines peuvent contrôler le

statut de repliement/mauvais repliement des glycoprotéines d’une manière très spécifique, ce

qui contribue à éviter une destruction inutile de protéines encore en cours de repliement.

Suite à l’exposition du mannose j, les lectines d’ERAD : OS-9 et XTP3-B (transactivated

protein ou erlectin), deux homologues de Yos9p de la levure, sont recrutées (Christianson et

al., 2008; Hosokawa et al., 2008, 2009; Groisman et al., 2011). Ce sont des protéines solubles

Introduction

38

dans la lumière du RE et qui semblent avoir un phénomène de compensation. En effet,

l’extinction des deux gènes simultanément diminue la dégradation des substrats, alors que le

knockdown d’un des deux gènes n’a que peu d’effet (Christianson et al., 2008). Ces lectines se

lient aux substrats grâce à leur domaine homologue au récepteur mannose-6-phosphate MRH

(Mannose 6-phosphate Receptor Homology) qui reconnait préférentiellement les glycans ayant

un mannose j exposé. Cela leur permet ainsi de distinguer les glycoprotéines mal repliées de

celles ayant acquis leur conformation native. OS-9 peut également reconnaître les mannose e

et c exposés (Figure 13) (Hosokawa et al., 2009; Satoh et al., 2010; Yamaguchi et al., 2010;

Groisman et al., 2011).

Une fois prise en charge par OS-9 ou XTP-3, les glycoprotéines sont délivrées vers l’E3

ubiquitine-ligase du complexe de rétro-translocation. Chez les mammifères, plusieurs ligases

ont été identifiées, dont les trois majeurs : l’ubiquitine ligase HRD1 (HMG-CoA Reductase

Degradation protein 1), RMA1 (RING-finger protein with membrane anchor-1) et TEB4.

Chaque ligase fait partie d’un complexe avec l’enzyme E2-ubiquitine-conjugué et d’autres

facteurs (Houck et al., 2012) (Figure 14).

Figure 14 : Les trois principales ligases identifiées chez les mammifères. Chaque ligase (en orange claire) fait partie d’un complexe avec une enzyme E2 ubiquitine-conjugué (en vert) et d’autres facteurs. Les substrats (en rose) sont ubiquitylés, extraits dans le cytoplasme par AAA+ATPase p97 et enfin dégradés par le protéasome (Modifié d'après Houck et al., 2012).

Introduction

39

Pour la ligase TEB4, les seules protéines adaptatrice connues sont des enzymes de conjugaison

E2 ubiquitine UBE2G1/2 et UBE2J1/2. Bien que peu d’informations sont disponibles pour cette

ligase, son homologue chez la levure, Doa10, ubiquitinyle des substrats ERAD avec des défauts

de repliement dans les domaines cytosoliques (Hirsch et al., 2009; Houck et al., 2012). La ligase

RMA1 forme un complexe avec Derlin-1, l’enzyme de conjugiason E2 ubiquitine UBE2J1 et

DNAJB12 (DnaJ Hsp40 family member B12), une chaperonne de la famille Hsp40 qui coopère

avec le Hsp70 cytosolique pour faciliter l’ubiquitinylation dépendante de RMA1 des substrats

(Yamamoto et al., 2010; Grove et al., 2011). Les protéines de la famille Derlin (Derlin 1-3) sont

des protéines adaptatrices membranaire qui seraient impliquées dans la reconnaissance des

défauts de repliement dans les domaines membranaires de protéines (Houck et al., 2012). Le

complexe de la ligase HRD1 est le complexe le mieux caractérisé. Cette ligase forme un

complexe avec de nombreuses protéines adaptatrices incluant SEL1L (Suppressor/Enhancer of

Lin-12-Like), OS-9, Derlin-1 et les enzymes de conjugaison E2 ubiquitine UBE2G1 et

UBE2G2. Les protéines SEL1L et OS-9 sont impliquées dans la reconnaissance des défauts de

repliement de protéine dans la lumière du RE. SEL1L joue le rôle de récepteur de substrats pour

ce complexe. Il interagit avec d’autres lectines EDEM1, OS-9, XTP3B et BiP. Suite à la

réception du substrat, le complexe HRD1 s’assemble grâce à la protéine Herp (Endoplasmic

Reticulum stress-inducible protein) (Leitman et al., 2014).

Afin d’assurer leur délivrance au protéasome 26S, les substrats sont ubiquitinylés dans

le cytosol, principalement au niveau des résidus lysine (Sadowski and Sarcevic, 2010).

Plusieurs protéines assistent à la rétro-translocation de la protéine dont BiP et des membres de

la famille PDI et PPIase qui déplient la protéine pour faciliter sa rétro-translocation. À la face

cytosolique du complexe ERAD, l’hexamère AAA+ ATPase p97/VC, présent dans tous les

complexes de rétro-translocation, permet l’incorporation des substrats dans le cytosol

(Chapman et al., 2010) (Figure 14). P97 recrute plusieurs modificateurs de chaîne ubiquitine, y

compris les E3 ligases et les facteurs d’allongement de la chaîne (Liang et al., 2006, Mueller et

al., 2008, Schuberth et Buchberger, 2008, Ernst et al., 2009).

Les substrats ubiquitinylés sont transférés au protéasome par des protéines de transport,

connues sous le nom de HR23A/B ou Ubiquilin-1. Ces protéines contiennent des domaines de

type ubiquitine-associated (UBA) et ubiquitine-like (UBL) qui se lient respectivement aux

chaînes poly-ubiquitiques et les sous-unités de protéasome (Rpn10/13, Rpt5) (Deveraux et al.,

1994; Lam et al., 2002; Raasi and Wolf, 2007; Husnjak et al., 2008; Lim et al., 2009).

Introduction

40

1) ERMnI et son rôle dans ERAD

ERManI est une glycoside hydrolase 47 (GH47), une famille qui inclut également les

trois EDEMs et trois α1,2-mannosidases de Golgi (Golgi ManIA, IB et IC). Excepté le domaine

mannosidase, il existe peu ou pas de conservation parmi les membres de cette famille (Figure

15). Ces α-mannosidases de classe I hydrolysent spécifiquement les résidus de mannose liés à

l’α1,2 et nécessitent du calcium pour leur activité enzymatique. Elles sont inhibées par le

1- déoxymannojirimycine (DMJ) et la kifunensine, mais pas par la swainsonine (Tulsiani and

Touster, 1983; Weng and Spiro, 1996; Gonzalez et al., 1999; Tremblay and Herscovics, 1999;

Moremen, 2002).

Figure 15 : Représentation schématique des membres de la famille GH47. La famille GH47 comprend trois sous-familles de protéines, y compris ER α1,2 mannosidase I (ERManI), les Golgi α1,2 mannosidases (GolgiManIA, IB et IC) et les trois EDEMs (EDEM1, EDEM2 et EDEM3). Le domaine de l’homologie de la mannosidase conservé est représenté en rose. EDEM3 contient un domaine associé à la protéase (PA) et le signal de rétention KDEL. Les régions transmembranaires d’ERManI et des GolgiManIA, IB et IC, sont représentées en noir. La région transmembranaire putative d’EDEM1 est indiquée en gris (Modifié d'après Olivari and Molinari, 2007).

ERManI est une protéine transmembranaire de type II qui a initialement été décrite

comme une protéine résidente du RE (Gonzalez et al., 1999; Tremblay and Herscovics, 1999).

L’équipe de Sifers a démontré cependant que cette protéine réside principalement dans

l’appareil de Golgi, où elle est soumise à une O-glycosylation. Il a été suggéré que le ciblage

des substrats, basé sur le code glycan pour ERManI, a lieu dans l’appareil de Golgi (Pan et al.,

2011). Deux ans plus tard, la même équipe a identifié une interaction directe entre ERManI et

γ-COP, la sous-unité gamma du complexe de protéine d’enveloppe I (COPI) (Pan et al., 2013).

Introduction

41

Selon cette étude, les deux protéines assurent une dégradation du substrat d’ERAD, AAT (α-1-

antitrypsin) et son mutant NHK (Null Hong Kong), suggérant qu’ERManI, par son interaction

directe avec γ-COP, contribue à la récupération vers le RE des substrats ERAD capturés,

indépendamment de son activité mannosidase. Cette hypothèse a été appuyée par

l’identification d’une séquence de décapeptide luminale non-enzymatique spécifique aux

vertébrés et hautement conservée, qui contribue à la rétention et à l’élimination du substrat

ERAD (Iannotti et al., 2014). Cependant, cette étude a été controversée par l’équipe de

Lederkremer, qui a démontré que la localisation d’ERManI dans le complexe de Golgi était un

résultat artificiel d’une perturbation de la membrane lors de la fixation cellulaire et de la

perméabilisation (Benyair et al., 2015a). Cette équipe propose que des sous-régions spécialisées

du RE existent, où la concentration de mannosidase atteint des niveaux beaucoup plus élevés

que dans le reste du compartiment (Frenkel et al., 2003; Huyer et al., 2004; Benyair et al.,

2015a). Il semble que la concentration d’ERManI dans ces régions soit similaire aux niveaux

expérimentaux in vitro et provoque une élimination extensive du mannose (Wu et al., 2003;

Hebert and Molinari, 2007). Ainsi, un modèle a été proposé, selon lequel ERManI peut être

séquestré à l’état stationnaire, dans des vésicules dynamiques de contrôle de qualité QCV

(Quality Control Vesicles), et que sous des conditions d’accumulation de substrat (stress du

RE), ces vésicules convergent vers le compartiment ERQC (Benyair et al., 2015b, 2015a).

L’interaction transitoire d’ERManI avec ses substrats semble avoir lieu dans ces vésicules

QCVs (Benyair et al., 2015a) (Figure 16). Ainsi, tout en étant soumises à un contrôle de qualité

dans le but d’obtenir un repliement approprié, les glycoprotéines transitent entre le RE et les

QCV. Ce cycle permet la compartimentation de l’étape de clivage du mannose dans le contrôle

de la qualité, ce qui permet aux glycoprotéines dans le RE d’avoir un repliement approprié sans

subir de coupure de mannose.

Introduction

42

Figure 16 : Modèle de compartimentation du RE dans les cellules de mammifères. Après leur glycosylation (1), les protéines subissent le clivage de 2 résidus glucoses par les α-glucosidases I et II (GlcI et II) afin de rentrer dans le cycle calnexine/calréticuline (CNX/CRT) (2 et 3). Après un cycle de repliement, le dernier glucose est clivé par GlcII (4) permettant la libération des glycoprotéines. Les glycoprotéines correctement repliées (5) subissent un clivage du résidus mannose terminal de la branche B par l’α-mannosidase I (ERManI) (6), permettant leur adressage vers l’appareil de Golgi (7). Les glycoprotéines n’ayant pas atteint leur conformation native (8) seront reglucosylées par l’UGGT (UDP-Glc: glycoprotéine glucosyltransférase) afin de rentrer dans un nouveau cycle de repliement (9). Ces glycoprotéines vont être transportées entre les vésicules de contrôle qualité (QCV) (9) et les compartiments de contrôle qualité, dérivés du RE (ERQC) (10), sous des conditions de stress du RE. Les glycoprotéines identifiées comme définitivement mal repliées subiront un clivage des résidus mannoses à liaison de type α1,2-Man (11), favorisant leur liaison avec les lectines OS-9 (osteosarcoma amplified 9) et XTP3-B (XTP3-transactivated gene B protein) qui les ciblent vers la voie ERAD pour dégradation par le protéasome (12). ERManI résidant dans les QCVs et les composantes d’EDEMosome sont dégradés par un mécanisme autophagique/lysosomal (13 et 14) (adapté de Leitman et al., 2013). ERManI a été désignée comme le « minuteur » qui déclenche la première étape de la

dégradation en clivant le premier résidu mannose de la branche B de l’oligosaccharide N-glycan

(Araki and Nagata, 2011; Caramelo and Parodi, 2015; Zhou et al., 2015). Cependant, d’autres

résultats permettent de proposer un mécanisme entièrement nouveau impliquant un « double

contrôle » des substrats glycosylés d’ERAD dans les cellules de mammifères (Ninagawa et al.,

2014). Selon ce modèle, le clivage du mannose de Man9GlcNAc2 à la forme Man8GlcNAc2 est

effectué principalement par EDEM2, et la transformation de glycan en aval de Man8GlcNAc2

en Man7GlcNAc2 est réalisée principalement par EDEM3 et dans une moindre mesure par

EDEM1.

Introduction

43

2) EDEMs et leurs rôles dans ERAD

Les trois variantes d’EDEM appartiennent à la famille GH47. EDEM1-HA a été

initialement identifiée dans les cellules Cos-7 comme une protéine transmembranaire de type

II qui est insérée dans la membrane sous une forme de 69 kDa. Cette forme est par la suite

convertie en une glycoprotéine de 78 kDa par la fixation d’un motif de glycosylation sur 5

asparagines (Hosokawa et al., 2001). Il a été décrit qu’EDEM1 possède une séquence signal

non clivée qui sert de région transmembranaire liant la région associée à la membrane de la

calnexine et formant un complexe fonctionnel (Oda et al., 2003). Cependant, d’autres

expériences, confirmées aussi par des algorithmes informatiques, ont révélé qu’EDEM1 est une

protéine luminale dans les cellules de rein embryonnaire humain HEK293 (Human Embryonic

Kidney 293) (Olivari et al., 2005; Zuber et al., 2007). Ces résultats contradictoires pourraient

être expliqués par des variations probables dans le clivage du peptide signal dans différentes

lignées cellulaires (Olivari and Molinari, 2007a). Il a été suggéré en effet dans une étude menée

par Tamura et ses collaborateurs que la glycosylation co-traductionnelle et le clivage de la

séquence signal d’EDEM1 sont inefficaces, conduisant à une hypoglycosylation de la protéine

et à la génération de 2 formes de la protéine, soluble et membranaire (Tamura et al., 2011). Les

topologies d’EDEM2 et d’EDEM3 ne sont pas si controversées. Ce sont toutes les deux des

protéines solubles du RE. EDEM2 est une glycoprotéine de 64 kDa avec des oligosaccharides

N-liés au niveau de 4 asparagines (Mast et al., 2005; Olivari et al., 2005) et EDEM3 est une

protéine de 104 kDa glycosylée au niveau de 7 asparagines (Hirao et al., 2006). Comme pour

la séparation spatiale d’ERManI, des travaux ont révélé la présence d’EDEM1 dans des petites

vésicules nommées « EDEMosomes » qui auraient pour rôle la ségrégation de certains acteurs

de la machinerie ERAD hors du RE (détaillé en p.46).

Les membres du groupe des protéines de la famille GH47 partagent un domaine

d’homologie de mannosidase unique et similaire (Figure 15). De plus, tous les résidus

catalytiques nécessaires à l’activité glycolytique et à la liaison de l’inhibiteur spécifique des

α1,2-mannosidases, la kifunensine, sont conservés dans les protéines EDEM (Hosokawa et al.,

2001; Mast et al., 2005; Hirao et al., 2006; Olivari and Molinari, 2007a). Malgré cette

homologie, il y a eu une controverse quant à savoir si les protéines EDEM fonctionnent comme

des enzymes mannosidases ou des lectines. En effet, selon les études initiales sur EDEM1 chez

la levure (Htm1p) (Jakob et al., 2001) et les orthologues chez les mammifères, EDEM1 et

EDEM2, n’ont pas révélé d’activité hydrolytique (Hosokawa et al., 2001, 2003; Molinari et al.,

2003; Oda et al., 2003; Mast et al., 2005; Olivari and Molinari, 2007a). Cependant, d’autres

Introduction

44

études ont indiqué que les orthologues d’EDEM chez les protistes (Banerjee et al., 2007) et les

levures (Frenkel et al., 2003; Quan et al., 2008; Gauss et al., 2011) présentent une activité

mannosidase, et qu’EDEM1 surexprimé dans les cellules humaines accélère la

démannosylation des glycoprotéines mal repliées de la branche A et C des N-glycans. De plus,

il a été démontré qu’EDEM3 possède une activité α1,2-mannosidase in vivo, et qu’EDEM1 et

EDEM3 portant une mutation dans un résidu catalytique conservé parmi les α1,2-mannosidases,

n’accélèrent pas la démannosylation de N-glycan (Hirao et al., 2006; Olivari et al., 2006;

Hosokawa et al., 2010). Cela peut suggérer qu’EDEM1 et EDEM3 sont des mannosidases

actives. L’activité de l’α-mannosidase d’EDEM2 a été la plus controversée, mais les résultats

récemment publiés suggèrent que le clivage du mannose de Man9GlcNAc2 à la forme

Man8GlcNAc2 est effectué principalement par cette protéine et la transformation de glycan en

aval de Man8GlcNAc2 est réalisée principalement par EDEM3 et EDEM1 (Ninagawa et al.,

2014). Il a été observé qu’un traitement avec de la kifunensine diminue l’interaction d’EDEM1

avec SEL1L, suggérant que cette protéine ciblerait ses substrats vers le complexe de dislocation

contenant SEL1L (Cormier et al., 2009). Malgré toutes ces études sur l’activité catalytique des

protéines EDEM, l’activité mannosidase avec les EDEMs purifiées n’a pas encore été

démontrée.

Les protéines EDEMs présentent d’autres fonctions qui n’impliquent pas leur activité

catalytique. En effet, la reconnaissance du substrat à dégrader par EDEM1 et EDEM2 pourrait

être indépendante du glycan et donc non liée à l’activité catalytique des protéines EDEM,

suggérant que ces deux protéines reconnaissent probablement les régions mal repliées ou les

protéines aberrantes (Marin et al., 2012; Slominska-Wojewodzka et al., 2014; Tang et al.,

2014). Une interaction protéine-protéine d’EDEM1 ou EDEM2 a été observée avec certains

substrats tels que : rodopsin (Kosmaoglou et al., 2009), la chaine-A de ricin (Slominska-

Wojewodzka et al., 2006; Sokołowska et al., 2011; Slominska-Wojewodzka et al., 2014), sonic

hedgehog (Tang et al., 2014) et des substrats non-glycosylés de BiP (Shenkman et al., 2013).

D’autre part, il a été démontré qu’EDEM1 inhibe la formation d’agrégats covalents lors de la

libération de protéines mal repliées du cycle calnexine/calréticuline, et cette activité chaperonne

d’EDEM1 est indépendante de son activité catalytique (Hosokawa et al., 2006; Olivari et al.,

2006; Ron et al., 2011; Guiliano et al., 2014). Par mutagenèse dirigée il a également été

démontré qu’EDEM1 régule le taux d’ERManI indépendamment de son activité mannosidase

(Termine et al., 2009).

Introduction

45

Les protéines en cours de repliement sont protégées de la dégradation prématurée par

un processus nommé « ERAD tuning », qui assure la ségrégation des acteurs d’ERAD hors du

RE et d’ERQC. Les protéines mal repliées peuvent s’accumuler dans le RE et engendre ainsi

un stress du réticulum endoplasmique qui déclenche une réponse UPR (Unfolded protein

response).

3) Régulation des régulateurs d’ERAD « ERAD tuning »

Le processus « ERAD tuning » pour régulation d’ERAD consiste en la dégradation

sélective des régulateurs d’ERAD afin de réduire la capacité d’ERAD à des niveaux qui

n’interfèrent pas avec la maturation des protéines nouvellement synthétisées (Calì et al., 2008).

Ce modèle est basé sur des données montrant que de nombreux régulateurs d’ERAD (tels que

ERManI, EDEM1, OS-9, XTP3-B, HERP et SEL1L) sont rapidement éliminés du RE dans des

cellules non stressées, contrairement aux facteurs de repliement (tels que calnexin, calréticuline,

BiP, PDI, ERp57, ERp72 et GRP94). De plus, il a été démontré que la concentration d’EDEM1

dans le RE est strictement régulée en fonction de l’état cellulaire en ce qui concerne le stress

du RE et que cette protéine peut être disloquée dans des compartiments dérivés du RE. Ainsi,

il a été proposé que sous une production extensive et une accumulation de substrats d’ERAD,

la surproduction d’EDEM1 avec PERK (Protein kinase RNA-like ER Kinase) et IRE1 (Inositol

Requiring 1) est dirigée vers le compartiment ERQC (Kondratyev et al., 2007; Groisman et al.,

2011; Benyair et al., 2015b) afin d’améliorer la capacité d’ERAD lorsque les protéines mal

repliées s’accumulent (Ron et al., 2011). En revanche, à l’état d’équilibre, le niveau d’EDEM1

de la même façon que celui d’ERManI doit être réduit. Alors qu’ERManI est concentrée dans

les QCVs (Benyair et al., 2015b), EDEM1 est séparée dans des vésicules couvertes de LC3-I

(LC3 Microtubules-associated protein-light chain 3), nommées EDEMosomes (Calì et al.,

2008; Reggiori et al., 2010). Le fractionnement subcellulaire et les études de microscopie

électronique ont révélé qu’à l’état stationnaire environ 80% d’EDEM1 endogène se localise

dans ces vésicules (Zuber et al., 2007; Calì et al., 2008) (Figure 17).

Introduction

46

Figure 17 : Le processus ERAD tuning. (Modifié d'après Bernasconi and Molinari, 2011)

À l’origine, ces vésicules étaient considérées comme étant impliquées dans l’élimination

des protéines mal repliées de la lumière du RE (Zuber et al., 2007). Cependant, des études ont

démontré qu’EDEM1 et OS-9 s’accumulent dans ces vésicules lorsque les cellules sont

exposées à des drogues lysosomotropiques ou lorsqu’elles sont infectées par des coronavirus

(Calì et al., 2008; de Haan et al., 2010; Reggiori et al., 2010). Ainsi, il a été proposé que les

EDEMosomes sont plutôt impliqués dans l’élimination des régulateurs ERAD de courte demi-

vie de la lumière du RE. Ces vésicules ne sont pas recouvertes de manteau COPII et sont plus

grandes que les vésicules impliquées dans le transport de protéines du RE vers l’appareil de

Golgi (Zuber et al., 2007). Bien que la ségrégation d’EDEM1 dans ces vésicules soit suivie

d’une dégradation rapide par des enzymes lysosomales, les EDEMosomes sont distincts des

autophagosomes revêtus de LC3-II et, selon cette étude, l’inactivation de l’autophagie n’est pas

suffisante pour prévenir l’élimination d’EDEM1. Cependant, contrairement à ces observations,

EDEM1 a été observée dans des structures contenant LC3A et LAMP1 (Lysosomal-Associated

Membranes Proteins) correspondant aux autophagosomes, suggérant que l’autophagie sélective

est impliquée dans sa dégradation. Ainsi, malgré la nature des vésicules impliquées dans

l’élimination d’EDEM1, il semble que la dégradation de ce régulateur se fasse par une voie

différente de celle suivie par les substrats ERAD, dégradés par le protéasome 26S (Le Fourn et

al., 2009; Bernasconi and Molinari, 2011; Le Fourn et al., 2013; Park et al., 2014).

Introduction

47

De manière intéressante, les EDEMosomes peuvent aussi contenir des protéines mal

repliées ou des complexes multiprotéiques à plusieurs sous unités à dégrader (Zuber et al.,

2007; Le Fourn et al., 2013). Ainsi, il a été suggéré que les vésicules EDEM constituent une

autre voie de dégradation des protéines du RE, en parallèle de la voie ERAD et de la voie de

réticulophagie. Cependant, à l’heure actuelle, on ne sait pas si cette voie de sortie du RE

fonctionne uniquement comme une voie pour la dégradation d’EDEM1 ou si elle est d’une

importance générale pour un ensemble plus large de mécanismes impliquant la dislocation de

protéines de RE au cytoplasme (Le Fourn et al., 2013).

4) Réponse à l’accumulation des protéines mal repliées UPR

Lorsque la capacité de repliement des protéines dans le RE est dépassée, elles

s’accumulent et peuvent générer un stress du RE qui est toxique pour la cellule. Cette dernière

dispose donc d’un système de secours nommé UPR (Unfolded Protein Response) capable de

déclencher une réponse adaptative permettant de restaurer l’homéostasie du RE : réduction de

la traduction des protéines, diminution de la charge protéique, amélioration de la machinerie

ERQC et augmentation de la capacité du repliement et de dégradation.

Chez les mammifères, l’UPR classique se compose de trois voies de signalisation

initiées par les protéines senseurs de stress : IRE1α, PERK, et ATF6 (Activating Transcription

Factor 6). Il s’agit des facteurs de transcription insérés dans la membrane du RE et maintenus

inactifs dans les conditions standard par leur liaison avec la protéine BiP. Cette liaison se fait

via le domaine luminale des trois facteurs et le site ATPase de BiP. Durant un stress du RE, BiP

se lie aux domaines hydrophobes exposés des protéines mal repliées et se dissocie ainsi des

trois senseurs d’UPR afin de les activer (Figure 18).

Introduction

48

Figure 18 : Représentation des trois voies de l’UPR. (D'après Brambilla Pisoni et al., 2016)

La dissociation de BiP d’ATF6 libère le signal de la localisation golgienne, GLS (Golgi-

Localization Signal) de cette dernière, permettant sa translocation du RE vers l’appareil de

Golgi. Dans ce compartiment, ATF6 subit des protéolyses par les protéases de site 1 et 2 (S1P

et S2P) qui libèrent son domaine cytosolique. Ainsi, ce dernier se dirige vers le noyau où il va

agir comme un facteur de transcription et induire la transcription de plusieurs gènes qui codent

les chaperonnes résidentes du RE et les assistants du repliement, y compris BIP, calnexine,

calréticuline, PDI, CHOP (CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein) et XBP1

(X-box-binding protein 1).

La libération d’IRE1α de BiP induit son homodimérisation puis son

autophosphorylation, permettant ainsi d’activer son domaine endoribonucléase. Ce facteur

catalyse l’épissage de l’ARNm de XBP1 qui, sous sa forme épissée XBP1s, se transloque dans

le noyau et régule les gènes impliqués dans l’UPR et ERAD.

Introduction

49

De façon similaire, PERK est activée suite à la dissociation de BiP et subit une

homodimérisation et une autophosphorylation. Cette protéine kinase phosphoryle alors le

facteur d’initiation de traduction eIF2α (Eukaryotic Initiation Factor), provoquant une

diminution de la traduction globale et donc de la charge de protéines dans le RE. eIF2α

augmente spécifiquement la traduction du facteur de transcription ATF4, qui a un rôle à la fois

dans l’adaptation au stress et également dans l’apoptose quand le stress du RE ne peut être

résolu (Brambilla Pisoni et al., 2016).

De part de leur rôle dans la dégradation des glycoprotéines mal repliées, les protéines

EDEM sont des cibles majeures de la voie Ire1/Xbp1 d’UPR (Yoshida et al., 2003; Guiliano et

al., 2014). L’expression d’ERManI quant à elle n’est pas affectée par le stress du RE, ce qui

suggère que son rôle est moins important dans des conditions qui exigent un clivage extensif

du mannose des glycoprotéines mal repliées (Avezov et al., 2008).

II. Exemple du contrôle qualité : la protéine CFTR vs F508del-

CFTR

Le repliement de la protéine CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance

regulator) est étroitement régulé pour permettre une insertion correcte de la protéine dans la

membrane du RE et une maturation appropriée. Tout comme pour les protéines de la voie de

sécrétion, les protéines CFTR ne parvenant pas à obtenir une conformation native sont retenues

dans le RE. Une rétention favorisée par le mécanisme ERQC, qui reconnaît les protéines mal

repliées et les dirige vers la dégradation par la voie ERAD.

A. Du gène à la protéine CFTR

1) Le gène CFTR

Le locus du gène responsable de la mucoviscidose a été localisé par l’équipe de Tsui sur

le bras long du chromosome 7, grâce à la technique de marqueurs RFLP (Restriction Fragment

Linked Polymorphism) (Tsui et al., 1985). Quatre ans plus tard, la même équipe a déterminé et

caractérisé ce gène, grâce à la technique de clonage positionnel. Ce gène qui fut nommé CFTR

est localisé précisément sur le locus q31 du bras long du chromosome 7 et mesure 250 kb

réparties en 27 exons. Il est transcrit en un ARNm de 6500 pb qui se traduit en une protéine

Introduction

50

membranaire de 1480 acides aminées nommée CFTR (environ 170 kDa lorsqu’entièrement

glycosylée) (Kerem et al., 1989; Riordan et al., 1989; Rommens et al., 1989) (Figure 19).

Figure 19 : Du gène à la protéine CFTR. (D’après Girodon-Boulandet et Costa., 2005)

2) Structure de la protéine CFTR

L’analyse de la séquence polypeptidique primaire de CFTR a permis de prédire sa

structure et là classé parmi les transporteurs ABC (ATP-Binding Cassette) (Riordan J.R. et al.,

1989). Il s’agit d’une famille qui regroupe les protéines transmembranaires dont le rôle est de

transporter de manière active des molécules variables telles que des peptides, des lipides, des

sucres, des métaux ou encore des médicaments. A noter que CFTR est le seul canal ionique de

cette famille et transporte des ions au travers la membrane cytoplasmique (pour revue Dean et

al., 2001; ter Beek et al., 2014; Wilkens, 2015).

Au niveau structural, les transporteurs ABC présentent une architecture commune

composée de 2 domaines transmembranaires MSD1 et MSD2 (Membrane-Spanning Domain)

et 2 domaines cytoplasmiques NBD1 et NBD2 (Nucleotide Binding Domain) (ter Beek et al.,

2014). Cependant, CFTR est un membre à part, car il est composé d’un domaine supplémentaire

appelé le domaine R pour regulatory domain (Riordan et al., 1989) (Figure 20).

Introduction

51

Figure 20 : Représentation schématique de la structure de CFTR. MSD: Membrane Spanning Domain, NBD: Nucleotide Binding Domain, TM: Transmembrane segment, RD: Regulatory Domain, ICLs: IntraCellular Loops, ECLs: ExtraCellular Loops (d'après Farinha and Canato, 2017).

Les domaines MSDs sont des domaines d’ancrage à la membrane et sont composés chacun de

6 segments transmembranaires TMD (TransMembrane domain) : TMD1 à TMD6 pour MSD1

et TMD7 à TMD12 pour MSD2. Organisés en hélice α, ces segments ont pour rôle la formation

du pore hydrophile du canal, laissant passer les anions de manière sélective (Ge et al., 2004;

Linsdell, 2006; Hwang and Kirk, 2013). Ces segments transmembranaires sont reliés deux à

deux par des boucles intra- ou extracellulaires, dont la quatrième boucle extracellulaire reliant

TMD7 à TMD8 présente deux sites de N-glycosylation de la protéine (Patrick et al., 2011). Le

domaine NBD1 est localisé au niveau de la boucle intracellulaire reliant les deux MSDs, et le

domaine NBD2 est localisé dans la partie carboxy-terminale de la protéine (Lewis et al., 2004,

2010). Ces deux domaines ont pour rôle de fixer et hydrolyser des molécules d’ATP afin

d’apporter l’énergie nécessaire pour l’ouverture du canal. Comme pour NBD1, le domaine

régulateur R est présent lui aussi dans la boucle intracellulaire reliant les deux MSDs plus

précisément entre NBD1 et TMD7. Ce domaine présente de multiples sites de phosphorylation

par des protéines kinases, principalement la PKA (protéine kinase dépendante de l’AMPc) et la

PKC (protéine kinase C) (Rich et al., 1991; Csanády et al., 2000). La phosphorylation de ces

sites joue un rôle important dans l’expression du CFTR, son trafic via la voie de biosynthèse,

les interactions intramoléculaires, sa stabilité au niveau de la membrane cellulaire et son

ouverture (pour revue voir Chin et al., 2017).

Introduction

52

3) Les fonctions de la protéine CFTR

Le CFTR est un canal ionique dont la fonction principale est de permettre la diffusion

passive des ions chlorures (Cl-) à travers la membrane apicale des cellules épithéliales

(Anderson et al., 1991). Il permet également le passage des petits anions iodures (I-), fluorures

(F-) et bromures (Br-) avec une sélectivité qui s’établie de la manière suivante : Br- ≥ Cl- > I- >

F- (Anderson et al. 1991). De plus, CFTR permet le passage du glutathion, un tripeptide

antioxydant, impliqué dans la protection des cellules des espèces réactives de l’oxygène (ROS)

(Linsdell and Hanrahan, 1998). De nombreuses autres études décrivent le CFTR comme une

protéine régulatrice. Il régule en effet, une large variété de canaux ioniques : ENaC (Epithelial

Na+ Channel) (Stutts et al., 1995; Awayda, 1996; Letz and Korbmacher, 1997), CaCC

(Calcium-activated Cl− Channels) (Kunzelmann, 2001; Wei et al., 2001), ORCC (Outwardly

Rectifying Chloride Channel) (Gabriel et al., 1993; Jovov et al., 1995; Schwiebert et al., 1995,

1998), ROMK1(potassium channel) (Lu et al., 2006; McNicholas et al., 1996) et l’échangeur

Cl/HCO3 (Lee et al., 1999; Shcheynikov et al., 2006; Wang et al., 2006b) (Figure 21). De plus,

il présente un rôle régulateur d’aquaporines (Schreiber et al., 1999; Pietrement et al., 2008) et

certaines connexines, du trafic vésiculaire et fusion des endosomes et du pH intracellulaire. Il

joue également un rôle dans l’infection et l’inflammation, et dans les jonctions cellulaires (pour

revue Saint-Criq and Gray, 2017).

Figure 21 : Régulation des canaux ioniques par la protéine CFTR. (Modifié d’après hopkinscf.org)

Introduction

53

4) Les mutations du CFTR

Des mutations au niveau du gène CFTR sont à l’origine de la mucoviscidose (Kerem et

al., 1989; Riordan et al., 1989; Rommens et al., 1989). Il s’agit d’une maladie génétique létale

à transmission autosomique récessive répandue dans les populations caucasiennes. Elle touche

en moyenne une naissance sur 2500 en Europe et en Amérique du nord. En France, 6585

patients ont été recensés en 2015, selon le registre français de la mucoviscidose. L’absence du

canal CFTR ou l’altération de sa fonction entraine une dérégulation des transports au sein des

épithéliums, provoquant en conséquence, une atteinte fonctionnelle de plusieurs organes :

poumon, intestin, pancréas, l’arbre biliaire, les organes génitaux masculin ainsi que les glandes

sudoripares de la peau. L’atteinte des voies respiratoire est la principale cause de mortalité chez

les malades. L’absence du CFTR à la membrane cellulaire ou l’altération de sa fonction

provoque en effet une déshydratation et un épaississement du mucus favorisant l’accumulation

des micro-organismes opportunistes et des poussières. Il en résulte en conséquence une

infection bactérienne, principalement par Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa,

et provoque une obstruction chronique des bronches associée à une inflammation chronique.

Ces facteurs conduisent à la destruction des tissus pulmonaires provoquant une perte

progressive de la fonction respiratoire chez le patient jusqu’à son décès (Collawn and Matalon,

2014). A l’heure actuelle, il n’existe toujours pas de traitement curatif pour soigner cette

maladie. Seuls les traitements symptomatiques ayant pour but de soulager les patients et une

meilleure prise en charge sont proposés. Aujourd’hui, l’espérance de vie en France est de 47

ans alors qu’elle n’était que de 7 ans en 1965. La transplantation pulmonaire reste le traitement

de dernier recours en cas d’insuffisance respiratoire grave.

La sévérité des manifestations cliniques chez les patients atteints de cette maladie

polyviscérale dépend des conséquences des mutations sur la structure et la fonction de la

protéine CFTR mais également des facteurs génétiques et environnementaux (Wang et al.,

2014; Elborn, 2016). Plus de 2000 mutations ont été identifiées sur le gène CFTR (Cystic

Fibrosis Genetic Analysis Consortium: http://www.genet.sickkids.on.ca./cftr/app). Ces

mutations peuvent affecter la biosynthèse de la protéine CFTR, son trafic, sa fonction ou sa

stabilité à la membrane cellulaire. Ainsi, basées sur les mécanismes moléculaires à l’origine de

la dysfonction du canal CFTR, l’ensemble des mutations identifiées a été répartie en 6 classes

(Welsh and Smith, 1993; Zielenski and Tsui, 1995) (Figure 22).

Introduction

54

Figure 22 : Classification des mutations du CFTR et leurs conséquences sur la protéine CFTR. La classe I regroupe les mutations non-sens et de décalage de cadre de lecture, associées à une absence totale de CFTR dans la cellule. La classe II regroupe les mutations faux sens et des délétions qui perturbent le repliement de la protéine CFTR, qui se trouve séquestrée dans le RE puis dégradée. La protéine est synthétisée, mais absente à la surface cellulaire. La classe III et IV regroupent les mutations faux sens et de substitution qui affectent la régulation du canal Cl- (classe III) ou sa conductance (classe IV). La protéine est présente à la membrane cellulaire mais présente des défauts de régulation ou de conductance. La classe V regroupe les mutations d’épissage faux sens et substitution qui conduisent à la réduction de la synthèse de CFTR et en conséquence la réduction de la protéine au niveau de la membrane cellulaire. La classe VI correspond aux mutations qui touchent la partie C-terminale de CFTR et altèrent sa stabilité à la membrane cellulaire (d'après Lopes-Pacheco, 2016).

Parmi ces mutations, celles appartenant aux classes I et II sont les plus sévères car elles

se caractérisent par une absence du canal CFTR au niveau de la membrane cellulaire.

La délétion d’une phénylalanine en position 508 de la séquence polypeptidique du CFTR

(F508del) est la mutation la plus fréquente chez les malades atteints de mucoviscidose. Elle est

retrouvée chez environ 89% des malades et est à l’origine d’un phénotype sévère. Bien que

cette mutation, située dans le domaine NBD1 ne modifie ni le cadre de lecture du gène, ni la

fixation d’ATP, elle perturbe le repliement post-traductionnelle de F508del-CFTR dans le RE

et provoque sa dégradation et donc son absence à la membrane plasmique (Figure 23). A la

membrane cellulaire, F508del-CFTR est cependant capable d’assurer une conductance chlorure

mais plus faible que celle du CFTR sauvage et aussi moins stable à la membrane (Dalemans et

al., 1991; Lukacs et al., 1993; Moran, 2017). Ainsi, cette mutation de classe II, appartient aussi

à la classe III et à la classe VI.

Introduction

55

Figure 23 : Localisation de la protéine WT- et F508del-CFTR. Localisation de la protéine CFTR (vert) dans des cellules épithéliales primaires hautement différenciées non CF (à gauche) et CF (à droite). Contrairement au CFTR de type sauvage qui présente une localisation au niveau de la membrane apicale, la protéine mutée F508del-CFTR présente une localisation intracellulaire. Les noyaux cellulaire sont marqués en bleu (Riordan, 2008).

B. Biosynthèse et repliement : F508del-CFTR vs WT-CFTR

Comme pour les protéines de la voie de sécrétion, la protéine CFTR ainsi que son mutant

F508del-CFTR sont synthétisées et assemblées dans le RE. Ces deux protéines se traduisent à

raison de 2,7 acide aminés/seconde et par conséquent, la synthèse complète de la protéine se

réalise en 9 minutes environ (Ward and Kopito, 1994). Le repliement de CFTR se fait de

manière co-traductionnelle suivi et/ou complété par un processus post-traductionnel afin

d’acquérir la conformation native (Lu et al., 1998; Kleizen et al., 2005).

Bien que certaines étapes de repliement ne soient pas claires, les données disponibles

soutiennent l’idée que chaque domaine de CFTR se replie indépendamment avec insertion

simultanée de segments transmembranaires dans la membrane du RE. Ce processus nécessite

des interactions domaine-domaine qui commencent dès les premières étapes de repliement de

CFTR et impliquent une interaction spécifique de NBD1 avec MSD2 par ICL4 (intracellular

loops) et NBD2 avec MSD1 par ICL2 (Serohijos et al., 2008). Il est intéressant de noter qu’in

vivo, les domaines CFTR sont reconnus comme mal repliés s’ils sont exprimés seuls ou en

combinaisons incomplètes. Cela suggère que les interactions interdomaines sont essentielles

pour atteindre la conformation native de la protéine. Cette hypothèse est supportée également

par l’observation que les mutations CFTR résidant dans un domaine particulier conduisent à

des défauts conformationnels dans d’autres domaines (Du and Lukacs, 2009), à savoir, les

mutations MSD affectant le repliement de NBD et les mutations NBD affectant l’acquisition

d’une structure MSD compacte (Loo et al., 2008).

Introduction

56

Le déroulement de ce processus complexe se fait dans l’ordre suivant (Figure 24) :

1. Translocation du domaine transmembranaire MSD1 et son positionnement dans la

membrane du RE (Lu et al., 1998),

2. Synthèse du domaine NBD1 et sa liaison transitoire par les deux chaperonnes Hdj2 (Hsp40)

et Hsc70 (Hsp70) qui ont pour rôle de favoriser son repliement et sa stabilisation pendant le

temps nécessaire à la synthèse du domaine R,

3. Synthèse du domaine R puis son interaction avec la moitié de la région N-terminale

synthétisée. Cela conduit en une réduction de la liaison des Hsp40,

4. Synthèse du domaine transmembranaire MSD2 et son insertion dans la membrane du RE.

Cette étape semble stabiliser les interactions NBD1-R, qui conduisent à la libération de la

plupart des Hsp40 de la protéine,

5. La formation d’un complexe MSD1-MSD2 dans la membrane du RE qui pourrait

également stabiliser les domaines NBD1 et R (Ostedgaard et al., 1997). La formation de ce

complexe pourrait elle-même être facilitée par la chaperonne calnexine (Pind et al., 1994),

6. La synthèse du domaine NBD2,

7. Enfin, les modifications post-traductionnelles afin d’acquérir la conformation native.

Figure 24 : Biosynthèse de WT- et F508del-CFTR et assemblage des domaines.

(d'après Farinha and Canato, 2017)

Introduction

57

Au cours de sa translocation et en parallèle des étapes d’assemblage des domaines, la

protéine CFTR est glycosylée sur deux résidus asparagines (N) dans la boucle extracellulaire

ECL4 du domaine MSD2 (N894 et N900) et rentre dans le cycle calnexine (Pind et al., 1994;

Okiyoneda et al., 2004, 2008; Chang et al., 2008). Des études ont démontré que la liaison à la

calnexine est essentielle pour obtenir la conformation appropriée des sous-domaines de CFTR,

y compris les MSDs, qui semblent être stabilisés par le processus de liaison de cette lectine

(Rosser et al., 2008). Cependant, une étude a démontré que la diminution de l’expression

protéique de la calnexine ou bien l’expression d’un CFTR non glycosylé (délétion des N894 et

N900), incapable donc de se lier à cette chaperonne, n’a pas d’effet sur la fonction du WT-

CFTR ni sur son trafic à la membrane plasmique ; néanmoins la protéine peut être moins stable

(Chang et al., 2008). De la même manière, la protéine F508del-CFTR non glycosylée reste

incapable de s’échapper du contrôle de qualité et demeure séquestrée dans le RE (Chang et al.,

2008). D’autres études de susceptibilité aux protéases, agrégation thermique et ubiquitinylation

ont identifié un rôle important de la glycosylation dans la stabilité de CFTR mais pas

nécessairement pour sa fonction ou bien son trafic à la membrane cellulaire (Glozman et al.,

2009). Il a également été constaté que la N-glycosylation est nécessaire pour un recyclage

efficace de CFTR à partir de la membrane apicale et par conséquent, pour le renouvellement du

CFTR de surface (Cholon et al., 2010).

Durant ce cycle calnexine, seules les protéines CFTR ayant atteint leur conformation

native transitent vers l’appareil de Golgi via des vésicules COPII (Wang et al., 2004), où elles

subiront d’autres modifications de glycosylation. La glycoprotéine est ensuite adressée vers la

membrane apicale où elle acquiert sa fonction de canal chlorure et ses autres fonctions de

régulation avant d’être recyclée ou dégradée. Ainsi, au cours de son processus de biosynthèse

et de maturation, CFTR adopte quatre formes de glycosylation distinctes (Cheng et al., 1990).

La forme A d’environ 130 kDa qui correspond au CFTR non glycosylé. La forme B d’environ

140 kDa, nommée « core-glycosylé » ou encore forme immature et qui correspond au CFTR

réticulaire glycosylé. La forme B’ qui correspond à une population de la forme B (environ 30%)

correctement repliée et prête à quitter le RE. En fin, la forme C d’environ 170 kDa qui

correspond au CFTR mature, ayant transité dans l’appareil de Golgi et maturé par glycosylation

(Cheng et al., 1990; Lukacs et al., 1994; Bertrand and Frizzell, 2003). Selon la littérature, de

part de sa grande taille, ses nombreux domaines transmembranaires, et la nécessité de nombreux

contacts intramoléculaires, la biogénèse de CFTR est inefficace et lente, avec 60 à 75% des

protéines séquestrées par l’ERQC puis dégradées (Ward and Kopito, 1994; Abriel and Staub,

2005). De la même manière, la protéine mutée F508del-CFTR, de part sa mutation qui

Introduction

58

l’empêche d’acquérir sa forme native, reste retenue par l’ERQC avant d’être envoyée vers la

voie de dégradation (Cheng et al., 1990).

Plusieurs études tentent de comprendre comment l’absence de la phénylalanine perturbe

le repliement de F508del-CFTR à l’origine de son défaut d’adressage à la membrane cellulaire

(Cheng et al., 1990; Thomas et al., 1992; Lukacs et al., 1993; Welsh and Smith, 1993; Du and

Lukacs, 2009; He et al., 2010; Wang et al., 2014). Il a été suggéré que le défaut de repliement

est dû à un défaut d’interaction du domaine NBD1 avec les autres domaines (défaut

d’assemblage de la protéine) et que la chaîne latérale de l’acide aminée F508 semble être le

point central de ces interactions, en particulier entre NBD1 et les TMDs (Du et al., 2005; Cui

et al., 2007). En effet, un problème de repliement local dans le domaine NBD1 a été observé à

proximité de la mutation. De plus, il a été démontré que l’absence de F508 empêche

l’établissement de contacts entre le domaine NBD1 et la boucle cytoplasmique ICL4 dans le

domaine MSD2 et entraine un mauvais repliement de la partie carboxy-terminale de la protéine,

incluant le domaine NBD2 (Du et al., 2005; Pissarra et al., 2008; Du and Lukacs, 2009; He et

al., 2010; Rabeh et al., 2012; Mendoza et al., 2012; He et al., 2015). Ainsi, au cours de son

processus de repliement dans le RE, F508del-CFTR est reconnue comme une protéine mal

repliée par le système ERQC avant d’être dégradée (Cheng et al., 1990; Chang et al., 1999;

Meacham et al., 2001b; Younger et al., 2006; Riordan, 2008; Määttänen et al., 2010).

C. Le contrôle qualité de CFTR dans le RE et sa dégradation par ERAD

La machinerie ERQC est composée de lectines et de chaperonnes cytosoliques et

réticulaires. Ces protéines interagissent avec le CFTR immature, facilitent son repliement et son

assemblage en structure native et contrôlent son état de repliement. Bien qu’il ne soit pas

complètement compris comment l’ERQC distingue une conformation de protéine native d’une

mal repliée, pour la protéine CFTR, certains acteurs ont été décrits pour être impliqués dans ce

processus.

1) Les principales chaperonnes et lectines

La chaperonne cytosolique Hsp70 et ses co-chaperonnes de la famille Hsp40 ont été

décrites dans le contrôle qualité de CFTR. Comme vu précédemment, Hsc70 et sa

co- chaperonne Hdj-2 interviennent dans les premières étapes de biosynthèse du WT-CFTR au

moment de l’expression du domaine NBD1, afin de faciliter son processus de repliement

Introduction

59

(Figure 25-A). Via son interaction au domaine NBD1, Hsc70 augmente l’efficacité de

repliement du domaine et empêche la formation d’agrégat (Meacham, 1999). Dans le cas de

F508del-CFTR, une association prolongée de Hsc70 avec ce mutant comparée à celle avec le

WT-CFTR a été rapportée (Scott-Ward and Amaral, 2009). Ceci, suggère que l’absence de

F508 augmente l’accessibilité de Hsc70 à un ou plusieurs sites de liaison sur NBD1 provoquant

ainsi sa rétention dans le RE.

Figure 25 : Rôle de Hsp70/90 et leur partenaires dans le contrôle de qualité de CFTR. (A) Lorsque CFTR est synthétisé, de nombreuses chaperonnes et co-chaperonnes (certaines illustrées ici) s’associent au polypeptide naissant sur les côtés luminale et cytosolique de la membrane du RE. Hsp70 et co-chaperonnes interagissent avec NBD1, suivis de l’association de calnexine (CNX) avec TMD2. Hsp90 est recrutée ensuite pour aider à l’assemblage du domaine en conjonction avec la CNX. (B) Le défaut de repliement de la protéine à n’importe quelle étape de la voie de repliement est détecté par la liaison persistante de Hsp70, qui sert à recruter des ligases E3 (RMA1 et CHIP) qui ubiquitinylent CFTR et le ciblent vers le protéasome pour dégradation (Modifié d'après Kim and Skach, 2012).

L’implication du système de chaperon Hsp90 dans la régulation du repliement du CFTR

a également était proposé, bien qu’à un stade ultérieur de sa biogenèse (Loo et al., 1998) (Figure

25-A). Les intermédiaires de repliement de CFTR sont stabilisés en effet en se liant à Hsp90,

ce qui prolonge leur demi-vie et aide à leur trafic et à leur maturation (Loo et al., 1998; Fuller

et Cuthbert, 2000; Wang et al., 2006). Il a été constaté que les protéines WT- et F508del-CFTR

Introduction

60

interagissaient de manière similaire avec Hsp90. Cependant, sa co-chaperonne Aha1 présente

une interaction plus forte avec le F508del-CFTR qu’avec le WT-CFTR (Sun et al., 2008). De

plus, une autre co-chaperonne présentant une activité de peptidylprolyl isomérase, FKBP8

(FK506-binding proteins) semble assister au repliement de CFTR. Cette protéine interagit avec

le CFTR WT ou F508del, et les stabilise via un mécanisme qui requiert une activité isomerase-

prolyl. Hutt et collaborateurs ont démontré que FKBP8 est capable de se lier au CFTR

indépendamment de Hsp90 et présente une préférence pour le pool de CFTR prêt à

l’exportation. Cela suggère que cette protéine est une chaperonne à action tardive et qu’elle

fonctionne en aval de l’étape de repliement dépendante de Hsp90. FKBP8 peut en effet affiner

ou compléter le repliement de la conformation du CFTR à transiter du RE (Hutt et al., 2012).

Les systèmes de chaperonnes Hsp70/40/90 semblent ainsi former un piège chaperonne

(Coppinger et al., 2012) responsable, au moins partiellement, de la délivrance du CFTR mutant

vers la voie de repliement ou de dégradation. En effet, lorsque le CFTR est retenu trop

longtemps dans ce piège, les co-chaperonnes de pro-dégradation remplacent celles qui sont

productives, ciblant ainsi le CFTR vers la dégradation (Matsumura et al., 2013) (Figure 25-B).

L’ubiquitine ligase E3 CHIP, co-chaperonne de Hsc70 a été proposée pour jouer un rôle clé

dans ce processus (Meacham et al., 2001b; Younger et al., 2004). En effet, il semble que Hsp70

maintient les substrats mal repliés dans un état soluble et, lors de l’interaction avec CHIP, le

complexe Hsp70-CHIP détourne le CFTR vers la voie de dégradation. CHIP favorise

l’ubiquitinylation et la dégradation de CFTR en association avec l’enzyme conjuguée

cytosolique E2 ubiquitin UbcH5a. Elle permet la fixation de l’ubiquitine sur le CFTR présenté,

stimulant ainsi sa dégradation par le protéasome (Hohfeld et al., 2001; Meacham et al., 2001a;

Murata et al., 2003; Younger et al., 2004).

En plus du complexe CHIP-Hsp70, qui surveille les domaines cytosoliques de CFTR, il existe

également des protéines transmembranaires qui peuvent éventuellement surveiller l’assemblage

des domaines membranaires de CFTR en séquentiel. Le repliement aberrant de CFTR dans la

bicouche lipidique du RE est proposé pour être identifié par le facteur ERQC Derlin-1 et ses

protéines associées (Sun et al., 2006; Younger et al., 2006) (Figure 25-B). Il a été démontré

qu’un complexe formé par RMA1, appelé aussi RNF5 (RING finger protein), s’associe avec

Derlin-1 et la ligase E2 Ubc6e afin d’ubiquitinyler le CFTR (Younger et al., 2006). Ceci est

suivi par le recrutement d’autres partenaires, tels que Gp78 (Glycoprotein 78), BAP31 (B-cell

receptor-associated protein 31), et p97, qui délivrent le CFTR ubiquitinylé pour le protéasome

(Goldstein et al., 2007; Morito et al., 2008; Wang et al., 2008). Il est intéressant de noter que le

Introduction

61

complexe RMA1 peut détecter l’état d’assemblage des régions N-terminales du substrat CFTR

(Younger et al., 2006).

Les protéines du domaine J, la famille des co-chaperonnes qui potentialisent l’activité ATPase

de Hsp70, jouent également un rôle dans cette voie de dégradation. Prenons comme exemple,

le DNAJB12 qui semble diriger Hsc70 pour agir avec RMA1 dans la dégradation de F508del-

CFTR et du WT-CFTR mal repliée. Une interaction de cette dernière avec Hsc70 et RMA1 a

été en effet observée (Grove et al., 2011). Un autre exemple, les protéines Csp (Cysteine String

Proteins) qui semblent réguler la sortie de CFTR du RE et coordonner la formation du complexe

qui facilite la dégradation du CFTR, à savoir Hsc70/Hsp70 et CHIP (Schmidt et al., 2009). A

noter, une interaction directe entre Csp et CHIP a été observée (Schmidt et al., 2009).

La lectine calnexine a également été proposée pour être impliquée dans le contrôle de

repliement de CFTR. Alors que les deux protéines CFTR, WT et F508del-CFTR interagissent

avec cette lectine, une interaction prolongée avec le CFTR muté a été observée (Pind et al.,

1994; Rosser et al., 2008), suggérant son implication dans la rétention de F508del-CFTR dans

le RE.

2) Motif de rétention dans le RE : AFT (Arginine-Framed Tripeptides)

L’exportation du RE à l’appareil de Golgi de la protéine CFTR dépend de la détection

par la machinerie du trafic, des signaux spécifiques de rétention : tripeptides à arginine AFT

(Arginine-Framed Tripeptides) (Michelsen et al., 2005).

Les AFT sont des motifs de rétention/récupération transitoires avec une séquence consensus :

R-X-R (R correspond à l’arginine et X correspond à n’importe quel acide aminé) (Michelsen et

al., 2005). Le CFTR possède 4 motifs de ce type, répartis sur la queue N-terminale (Arginine29-

Glutamine-Arginine31), le domaine NBD1 (Arginine516-Tyrosine-Arginine518 et Arginine553-

Alanine-Arginine555) et le domaine RD (Arginine764-Arginine-Arginine766). Il a été suggéré que

F508del-CFTR reste séquestrée dans le RE en raison de l’exposition de tels motifs. En effet, la

mutation simultanée des 4 AFT dans la protéine F508del-CFTR par la substitution de l’arginine

par une lysine aux positions 29, 516, 555 et 766 (F508del-4RK-CFTR) restaure un F508del-

CFTR mature et fonctionnel à la membrane cellulaire en favorisant son échappement à l’ERQC

(Chang et al., 1999). Cette restauration d’adressage ne correspond pas à une correction de

repliement de la protéine mais plutôt à la suppression des facteurs de trafic spécifiques qui

peuvent être impliqués dans la rétention (Roxo-Rosa et al., 2006).

Introduction

62

3) Code de sortie du RE : le code diacide

Le compartiment ERGIC constitue un point de contrôle à partir duquel les protéines

correctement repliées progressent vers l’appareil de Golgi tandis que les protéines mal repliées

sont recyclées vers le RE par un transport rétrograde dans des vésicules COPI. Les CFTR WT

et F508del ont été localisées dans l’ERGIC, bien que, seul le WT-CFTR soit transporté jusqu’à

la surface cellulaire (Gilbert et al., 1998). Cette transition repose sur un motif d’exportation

spécifique, le code de sortie diacide, composé de deux acides aspartiques (D) en position 565

et 567 (D565-Alanine-D567), situé dans le domaine NBD1. Cette séquence est en effet nécessaire

pour l’empaquetage, médié par Sec24 des protéines CFTR dans les vésicules de transport

COPII. Autrement dit, pour que CFTR puisse quitter le RE, cette séquence doit être exposé à la

surface de NBD1, afin qu’elle puisse être détectée par Sec24. Il a été démontré que la

substitution du second résidu aspartate de cette séquence par le résidu alanine (A) n’affecte pas

le repliement du CFTR, mais elle réduit son association avec Sec24 et donc sa sortie du RE

(Wang et al., 2004). La mutation simultanée des deux résidus aspartate en alanine (AAA) quant

à elle, inhibe totalement l’exportation de CFTR du RE et en conséquence inhibe sa maturation.

La co-transfection des cellules exprimant DAA-CFTR ou F508del-CFTR, avec Sar1-GTP, une

protéine impliquée dans le trafic du RE vers l’appareil de Golgi ne restaure pas l’exportation ni

la stabilisation du CFTR muté à partir d’ERAD. Cela, suggère que la mutation du motif diacide

dissocie le CFTR de COPII (Wang et al., 2004).

La structure du domaine NBD1 de CFTR a révélé que le motif DAD est situé dans la boucle

extracellulaire contenant l’acide aminé F508. Compte tenu de l’importance probable de la

chaîne latérale aromatique de F508 dans la stabilisation du repliement du domaine NBD1, la

délétion de F508 peut modifier l’orientation de la boucle contenant le motif diacide,

compromettant ainsi son interaction avec Sec24 (Barlowe, 2003; Lewis et al., 2004). Des

expériences de co-immunoprécipitation ont en effet démontré que la liaison de la bande B de

F508del à Sec24 était beaucoup plus faible que celle du WT-CFTR. Ainsi, l’interaction

F508del-CFTR/Sec24 et le transport vers la membrane cellulaire pourrait être restaurés en

favorisant le repliement à 30°C (Wang et al., 2004).

D. F508del-CFTR et la réponse UPR

Les cellules épithéliales CF sont exposées à une inflammation chronique, une rétention

de CFTR mal repliée dans le RE, une surcharge du protéasome et des niveaux élevés de ROS,

facteurs susceptibles d’activer le stress du RE et l’UPR (Blohmke et al., 2012). Cependant, il y

Introduction

63

a encore une certaine controverse quant à savoir si l’UPR est induit dans les cellules CF ou non.

En effet, il a été suggéré que la dégradation rapide de la protéine mutante n’entraine pas une

accumulation importante dans le RE. Toutefois, l’analyse des cellules épithéliales bronchiques

primaires CF n’a pas abouti à des résultats cohérents. En effet, en culture à court terme, ces

cellules présentaient une réponse UPR active ; cependant, les différences observées entre les

cellules témoins et les cellules CF doivent être interprétées avec précaution, car cette réponse

pourrait résulter d’une infection chronique et d’une hyper-inflammation in vivo (Ribeiro and

Boucher, 2010; Ribeiro et al., 2005). En revanche, les cultures à long terme ne présentent pas

de réponse UPR classique dans les conditions basales. Aucune différence dans l’expression de

Grp78/BiP ou la phosphorylation de PERK n’a été observée (Nanua et al., 2006). De plus, une

diminution de la phosphorylation des deux protéines PERK et eIF2α a été rapportée dans des

cellules CF, suggérant une fois de plus l’absence d’activation de l’UPR (Blohmke et al., 2012).

D’autre part, il a été rapporté que la surexpression de F508del-CFTR, mais pas de WT-CFTR

dans diverses cellules, produit le stress du RE et induit l’UPR. En effet, une surexpression de

Grp78/BiP dans des cellules BHK surexprimant F508del-CFTR, mais pas WT-CFTR a été

observée (Gomes-Alves et al., 2010). Kerbiriou et ses collaborateurs ont également observé

l’activation des senseurs de stress du RE, ATF6 et Grp78/BiP dans des cellules épithéliales

humaines transfectées avec la protéine F508del-CFTR. Inversement, la diminution du niveau

d’expression d’ATF6 induit aussi une restauration de F508del-CFTR fonctionnel à la

membrane cellulaire (Kerbiriou et al., 2007). L’augmentation de l’expression de F508del-

CFTR dans des cellules épithéliales séreuses de la glande post-muqueuse humaine non CF,

Calu-3ΔF, exprimant les protéines WT-CFTR endogène et F508del-CFTR recombinant aussi

induit un stress du RE et une activation d’UPR (augmentation des ARNm des marqueurs sXBP1

et BiP). Ce résultat n’a pas été observé lors de l’augmentation d’expression du WT-CFTR

(Bartoszewski et al., 2008a).

L’activation d’UPR, à son tour, inhibe la biogenèse du WT- et F508del-CFTR endogènes en

diminuant les niveaux d’ARNm, et l’efficacité de traduction et de maturation. Le niveau

d’ARNm diminué n’est pas un résultat de l’amélioration de la dégradation, mais de l’inhibition

de la transcription par des mécanismes impliquant la liaison d’ATF6 au promoteur du CFTR,

ainsi que la dés-acétylation des histones et la méthylation du promoteur (Bartoszewski et al.,

2008b; Rab et al., 2007).

Introduction

64

III. Le système de contrôle qualité du RE comme cible

thérapeutique

Le mécanisme ERQC joue un rôle important dans la surveillance du repliement des

protéines et leur trafic soit vers la voie de sécrétion ou de dégradation. Cependant, certaines

protéines, même si elles n’acquièrent pas leur conformation native, conservent leur activité

physiologique si elles gagnent leur destination finale. La destruction « inutile » de ces protéines

est parfois à l’origine de certaines maladies, appelées « maladies conformationnelles », car

résultent d’une conformation anormale des protéines. Ces pathologies peuvent être réparties en

deux groupes distincts (Meusser et al., 2005) :

Le premier groupe correspond aux maladies liées à une perte de fonction des acteurs de

la voie de dégradation ERAD suite à des mutations. Les protéines mutées ou mal

repliées ne sont pas correctement dégradées, elles s’accumulent dans le RE et forment

des agrégats qui peuvent être toxiques pour la cellule. On retrouve dans ce groupe la

maladie de Parkinson, causée par une mutation dans la Parkine, une ubiquitine ligase

impliquée dans la dégradation du récepteur Pael-R. Ce dernier s’accumule dans sa forme

mal repliée et forme des agrégats toxiques pour la cellule (Kahle and Haass, 2004).

Le second groupe de pathologies est causées par une dégradation prématurée des

protéines mal repliées dans le RE, suite à des mutations gain de fonction des acteurs

d’ERAD, ou bien, des mutations dans les substrats, causant leur mauvais repliement.

Les protéines, retenues dans le RE puis envoyées vers la dégradation sont alors

incapables de remplir leur fonction, affectant ainsi l’activité biologique normale de la

cellule. Dans ce groupe on retrouve la mucoviscidose causée par les mutations de CFTR

de la classe II (cf. chapitre II), et une des sarcoglycanopathies, celle causée par la

mutation la plus fréquente chez les patients, R77C. Les sarcoglycanopathies sont des

pathologies génétiques à transmission autosomique récessive. Elles font partie de la

famille des dystrophies de ceintures et sont causées par des mutations d’un des gènes

codant un sarcoglycan (Hack et al., 2000).

Introduction

65

Dans le but de développer des stratégies thérapeutiques pour ces maladies

« conformationnelles », de nombreuses études visant à perturber le système ERQC ont été

menées. En effet, l’augmentation de l’activité de la voie ERAF pourrait favoriser le repliement

des protéines mal repliées/mutées et prévenir leur dégradation inutile par la voie ERAD. De la

même manière, l’augmentation de l’activité d’ERAD pourrait réduire la sécrétion des protéines

déstabilisées et susceptibles de former des agrégats liés aux pathologies dégénératives (Figure

26).

Figure 26 : Adaptation de la capacité des voies ERAF et ERAD pour corriger les défauts impliqués dans les pathologies conformationnelles.

(Modifié d'après Ryno et al., 2013)

Dans le cas d’un ciblage d’ERQC, les chaperonnes Hsp, jouant un rôle crucial dans la

rétention de F508del-CFTR dans le RE. Il a été démontré que la réduction de Hsc70 et

l’induction simultanée de l’expression de Hsp70 par le 4-phénylbutyrate de sodium (4-PBA, un

dérivé non toxique du sodium butyrate) restaure F508del-CFTR à la membrane cellulaire sous

sa forme mature et fonctionnelle (Rubenstein and Zeitlin, 2000; Choo-Kang and Zeitlin, 2001,

2001; Meacham et al., 2001b; Zhang et al., 2001; Singh et al., 2006). En effet, l’interaction avec

Hsc70 est considérée comme une étape clé pour cibler un certain nombre de protéines pour la

dégradation protéasomale. Par conséquent, le 4- PBA corrigerait l’adressage défectueux de

Introduction

66

F508del-CFTR en inhibant sa reconnaissance par la voie de dégradation. Cette molécule est un

des premiers correcteurs à avoir été testé dans un essai clinique pour les patients homozygotes

pour la mutation F508del. Cependant, malgré une amélioration légère de l’activité du CFTR au

niveau de l’épithélium nasal, le 4-PBA n’a pas réduit la concentration en ions chlorure de la

sueur (Rubenstein and Zeitlin, 1998). Le 4-PBA a aussi été testé avec succès sur d’autres

protéines, comme par exemple le récepteur de LDL. Il a été observé en effet, que cette molécule

restaure l’expression membranaire du récepteurs LDL mal conformé, séquestré dans le RE en

ciblant le manteaux COPII (Ma et al., 2017).

Une restauration de l’expression membranaire de F508del-CFTR a été observée dans des

cellules traitées avec la matrine ou l’apoptazole, deux autres inhibiteur de Hsc70. La matrine

régule négativement l’expression de Hsc70 entrainant ainsi une diminution de la dégradation

de F508del-CFTR (Basile et al., 2012). L’apoptazole quant à elle, semble perturber l’activité

ATPase de Hsc70 et en conséquence, diminue l’ubiquitinylation de F508del-CFTR en bloquant

l’interaction de Hsc70 avec sa co-chaperonne, l’ubiquitine ligase CHIP (Cho et al., 2011).

Grove et ses collaborateurs ont démontré que le ciblage d’une autre co-chaperonne de Hsp70,

DNAJB12, entraîne une augmentation significative de l’efficacité de repliement de CFTR et

permet la restauration d’une forme mature de F508del-CFTR. La surexpression de cette co-

chaperonne augmente l’association de CFTR avec Hsc70 et l’ubiquitine ligase RMA1 (Grove

et al., 2011).

D’autre part, il a été démontré que la sous expression de Aha1, la co-chaperonne de Hsp90

restaure l’adressage de F508del-CFTR ainsi que sa fonction de canal chlorure à la membrane

cellulaire ; en revanche sa surexpression diminue sa stabilité (Wang et al., 2006a; Koulov et al.,

2010). De plus, une inhibition pharmacologique spécifique de Hsp90 par la Geldanamycine, un

antibiotique de la famille des ansamycines, perturbe son interaction avec CFTR. Cependant son

effet sur l’adressage de F508del-CFTR est controversé. En effet, la Geldanamycine accélère le

renouvellement du CFTR en augmentant sa dégradation dans des cellules BHK et CHO

(Chinese Hamster Ovary) surexprexprimant stablement la protéine CFTR wt ou F508del (Loo

et al., 1998), Toutefois, Fuller et Cuthbert ont constaté sur des lysats de réticulocytes de lapin

que ce composé interfère avec la dégradation de F508del-CFTR en perturbant son

ubiquitinylation (Fuller and Cuthbert, 2000). Ainsi, d’autres investigations du rôle de Hsp90

dans la restauration de F508del-CFTR à la membrane cellulaire se révèlent nécessaires. A noter,

la Geldanamycine a donné des résultats encourageants sur ErbB2, un récepteur tyrosine kinase

qui est surexprimé dans 20 à 30% des cancers du sein (Slamon et al., 1987; Barr et al., 2008;

Cortese et al., 2013).

Introduction

67

L’inhibition des deux chaperonnes Hsp70 et Hsp90 semble donc rétablir l’expression

membranaire de F508del-CFTR. Il a été observé que la désoxyspergualine, un composé connu

pour perturber l’interaction de CFTR avec Hsc70 et Hsp90, restaure une activité canal chlorure

dans des cellules homozygotes pour la mutation F508del (Nadler et al., 1992; Nadeau et al.,

1994; Jiang et al., 1998; Norez et al., 2008).

Par ailleurs, il a été démontré qu’une protéine calcium-dépendante, la calumenin, agit comme

un modulateur de pompe SERCA (sarco/ER Ca2+-ATPase) dans les cellules épithéliales

bronchiques. La diminution de son taux d’expression restaure l’activité de CFTR à la membrane

cellulaire dans des cellules CF sans modifier la teneur en Ca2+ dans le RE (Philippe et al., 2017).

Cette étude suggère que la calumenin agit comme une chaperonne pour le CFTR régulant son

trafic et sa maturation indépendamment du contenu du calcium réticulaire.

D’autres études se sont intéressées aux complexes de rétrotranslocation et leurs

partenaires impliquées dans la dégradation protéasomale des protéines mal repliées. Par

exemple, dans le cas des sarcoglycanopathies, l’inhibition pharmacologique de l’activité de

HRD1, une E3 ubiquitine ligase, restaure l’expression membranaire du mutant V247M à la fois

dans un modèle cellulaire hétérologue et dans des myotubes de patients portant les mutations

L31P/V247M (Bianchini et al., 2014). Cette restauration a aussi été observée pour plusieurs

mutants suite à l’inhibition du protéasome (Gastaldello et al., 2008). Ainsi, dans le cas de la

mucoviscidose, la surexpression de HspBP1 (inhibiteur de l’activité de CHIP et facteur

d’échange de nucléotides qui favorise la libération de substrats de Hsp70) favorise la maturation

de CFTR (Alberti et al., 2004) ; au contraire, sa surexpression retient le CFTR dans le RE et

facilite son ubiquitinylation et sa dégradation (Meacham et al., 2001a). De même, l’inhibition

de l’activité ubiquitine ligase de CHIP par BAG-2 (BCL2 Associated Athanogene 2), co-

chaperonne de Hsp70 et qui inhibe la coopération CHIP-E2 favorise aussi la maturation de

CFTR (Arndt et al., 2005). De la même manière, il a été suggéré que Bag-1 joue un double rôle

sur la stabilisation de F508del-CFTR : d’une part en contribuant à sa libération de la machinerie

Hsp70 (Meacham et al., 2001a), et d’autre part, en empêchant sa liaison avec l’ubiquitine en

rentrant en compétition avec cette dernière (Mendes et al., 2012). D’autres études sur des

cellules humaines ont montré que le siRNA de la protéine Derlin-1 augmente la stabilité de

F508del-CFTR, tandis que sa surexpression conduit à la rétention de CFTR dans le RE (Sun et

al., 2006; Younger et al., 2006).

Introduction

68

La calnexine a elle aussi fait l’objet d’études dans la voie de biosynthèse de F508del-

CFTR. L’équipe de Kai a démontré que la surexpression de la calnexine augmente à la fois la

stabilité de la bande immature et la bande mature du WT-CFTR, suggérant un rôle protecteur

vis-à-vis de la dégradation (Okiyoneda et al., 2004). Cette surexpression augmente la rétention

de F508del-CFTR et diminue partiellement l’ERAD. Cependant, la même équipe a démontré,

mais cette fois-ci dans un système KO, que l’extinction de la calnexin n’affecte pas la rétention

de F508del-CFTR dans les cellules fibroblastes embryoniques de souris calnexin-KO,

certainement dû à la mise en place par la cellule d’un nouveau contrôle de qualité afin de

compenser l’extinction totale de sa calnexine. Ainsi, une inhibition pharmacologique partielle

de cette lectine semble être un bon compromis pour corriger F508del-CFTR. Dans notre

laboratoire, des études ont montré que l’inhibition de l’entrée de F508del-CFTR dans le cycle

calnexine par un iminosucre inhibiteur de l’α-1,2-glucosidase, le Miglustat (NB-DNJ pour N-

butyldeoxynojirimicyn) restaure partiellement la protéine à la membrane cellulaire dans des

cellules épithéliales mais aussi dans du tissu iléale de souris CF, homozygotes pour la mutation

F508del (Norez et al., 2006a; Noel et al., 2008; Norez et al., 2009). Ces résultats ont été

confirmés par une autre étude montrant que le miglustat appliqué directement sur l’épithélium

respiratoire de souris homozygotes pour la mutation F508del restaure l’activité canal chlorure

dépendante de CFTR (Lubamba et al., 2009). Au regard des résultats prometteurs obtenus avec

ce composé, le Miglustat a été testé lors d’essai clinique de phase 2 afin d’évaluer ses effets sur

la différence du potentiel nasal chez des patients adultes atteints de mucoviscidose et

homozygotes pour la mutation F508del (http://www.clinicaltrials.gov). A noter, ce composé est

déjà indiqué pour les patients atteints de maladie de Gaucher de type I sous le nom de Zavesca®

(Cox et al., 2000; Elstein et al., 2004). Une autre étude réalisée par notre laboratoire a également

démontré que la diminution de l’interaction de F508del-CFTR avec la calnexine par des

inhibiteurs de la pompe Ca2+-ATPase du RE rétabli l’expression membranaire de F508del-

CFTR (Norez et al., 2006b). Ces résultats sont en adéquation avec ceux obtenus précédemment

démontrant que le traitement avec la thapsigargine ou curcumin, inhibiteurs de SERCA restaure

F508del-CFTR fonctionnel à la membrane des cellules épithéliales et chez les souris CF (Egan

et al., 2002, 2004; Berger et al., 2005). Cela a ouvert la porte à l’identification d’autres

modulateurs de l’homéostasie protéique comme par exemple la roscovitine (pour revue Meijer

et al., 2016), qui est en essais cliniques de phase 2 dans le traitement des cancers, de la

polyarthrite rhumatoïde et de la maladie de Cushing. Démontrant de multiples propriétés

thérapeutiques sur les cellules CF, cette molécule est en essai clinique de phase 2 afin d’évaluer

sa tolérance et son efficacité chez les patients atteints de mucoviscidose, homozygotes pour la

http://www.clinicaltrials.gov/

Introduction

69

mutation F508del et présentant une infection chronique par Pseudomonas aeruginosa

(http://www.clinicaltrials.gov). En effet, la roscovitine est capable d’améliorer les propriétés

bactéricides des macrophages alvéolaires des patients CF, en abaissant le pH dans les

phagolysosomes, qui présentent un pH anormalement élevé dans les macrophages CF (Di et al.,

2006; Riazanski et al., 2015). De plus, la roscovitine a un effet anti-inflammatoire probablement

par sa capacité à réduire la dégranulation des neutrophiles, de favoriser l’apoptose et la

différenciation des cellules auxiliaires CD4+ T helper en anti-inflammatoires (Rossi et al.,

2006; Koedel et al., 2009; Meijer et al., 2016). Enfin, la roscovitine est capable de rétablir

potentiellement l’expression membranaire de F508del-CFTR dans des cellules CF (Norez et

al., 2014). Bien qu’inhibiteur de protéine kinase, l’effet correcteur de la roscovitine sur

F508del-CFTR est indépendant de ses effets sur les protéines kinases. En effet, il a été démontré

que la roscovitine d’une part empêche l’interaction de F508del-CFTR avec la calnexine en

diminuant la concentration du calcium réticulaire, et d’autre part, inhibe directement l’activité

du protéasome via un mécanisme d’action indépendant du calcium (Norez et al., 2014). Cette

molécule semble corriger l’adressage de F508del-CFTR en modulant à la fois l’ERQC et

l’ERAD.

D’autres études ont révélé que l’inhibition par la Kifunensine d’autres enzymes cette fois-ci

impliquées dans la voie ERAD, α-mannosidases I, corrige l’adressage défectueux de plusieurs

mutants sarcoglycans dans la pathologie des sarcoglycanopathies (Bartoli et al., 2008; Soheili

et al., 2012). Il serait donc intéressant de tester cette stratégie thérapeutique sur l’adressage de

la protéine F508del-CFTR dans des cellules mucoviscidosiques.

http://www.clinicaltrials.gov/

Contexte, problématiques et objectifs

70

Contexte, problématiques et objectifs Au cours de ces dernières années, divers correcteurs de CFTR ont été identifiés. Certains

d’entres eux peuvent cibler une ou plusieurs des nombreuses protéines qui orchestrent et

contrôlent son repliement, son adressage et sa stabilité au niveau de la membrane cellulaire (cf.

chapitre III). D’autres correcteurs peuvent interagir avec le CFTR lui-même (pour revue : Cai

et al., 2011; Farinha and Matos, 2016; Schmidt et al., 2016; Fajac and De Boeck, 2017; Zegarra-

Moran and Galietta, 2017), comme par exemple le correcteur pharmacologique VX-809 ou

lumacaftor, qui a fait l’objet d’études cliniques. Cette molécule semble agir tôt dans la

biogenèse de CFTR en interagissant directement avec MSD1 et éviterait ainsi les défauts de

repliement en améliorant les interactions entre les domaines NBD1, MSD1 et MSD2 (Van Goor

et al., 2011; He et al., 2013; Loo et al., 2013; Ren et al., 2013; Okiyoneda et al., 2013; Eckford

et al., 2014; Hudson et al., 2017). Les résultats des essais cliniques de phase II ont révélé que

ce correcteur diminue la concentration d’ions Cl- dans la sueur chez les patients homozygotes

pour la mutation F508del mais n’améliore cependant pas les signes cliniques (Clancy et al.,

2012). Cependant, sa combinaison avec le potentiateur VX-770 (Ivacaftor) connu pour

améliorer l’ouverture du canal muté de classe III, G551D-CFTR a donné de meilleurs résultats

cliniques (Boyle et al., 2014; Ratjen et al., 2017; Rowe et al., 2017; Schneider et al., 2017).

Cette combinaison appelée Orkambi a été approuvée en 2015 pour les patients homozygotes

pour la mutation F508del aux Etats Unis et en France. Une autre combinaison d’Ivacaftor avec

un correcteur de seconde génération, le VX-661 (Tezacaftor) est également en essai clinique.

L’efficacité clinique de cette combinaison est légèrement améliorée par rapport au VX-809

chez des patients âgés d’au moins 12 ans, homozygotes pour la mutation F508del (Pilewski et

al., 2015). Cette combinaison VX-661/Ivacaftor a été à son tour combinée avec VX-152 ou

VX-440, deux autres correcteurs de seconde génération. In vitro, l’activité canal chlorure

obtenu par ces triples combinaison est d’environ trois fois plus élevée que celle obtenue par la

combinaison lumacaftor/ivacaftor dans des cellules HBE. Ces triples combinaison sont en cours

d’evaluation chez les patients homozygotes pour la mutation F508del et les patients avec une

mutation F508del associé à une seconde mutation qui se traduit par une fonction CFTR

minimale (Schmidt et al., 2016).

Bien que les résultats obtenus avec ces correcteurs soient encouragent, la recherche de

correcteurs pour la mutation F508del-CFTR reste toujours primordiale.


71

Des études précédemment menées au sein de notre équipe ont révélé que l’inhibition

des α-1,2-glucosidases du RE par le Miglustat ou le maintien d’une faible concentration en

calcium par des inhibiteurs des pompes SERCA, restaure la protéine F508del-CFTR à la

membrane plasmique (Norez et al., 2006b, 2006a) (Figure 27). Ces études ont également

montré une perturbation de l’interaction de la protéine F508del-CFTR avec la chaperonne

calnexine en concomitance avec cette restauration, amenant à penser que l’inhibition de l’entrée

du F508del-CFTR dans le cycle calnexine empêcherait son envoi vers la voie de dégradation

ERAD au profit de la membrane cellulaire.

Figure 27 : Représentation schématique des principales étapes de la biosynthèse de F508del-

CFTR et les sites d’action du Miglustat et des inhibiteurs de pompes Serca.

Sur la base de ces résultats, nous avons émis l’hypothèse dans ce travail de thèse que l’inhibition

de l’interaction de F508del-CFTR avec d’autres partenaires d’ERQC, et notamment ceux jouant

un rôle majeur dans la voie de dégradation ERAD, pourraient aussi rétablir l’expression

membranaire de F508del-CFTR (Figure 28). Cette étude pourrait contribuer d’une part à une

meilleure compréhension du mécanisme ERQC responsable de la rétention réticulaire de


72

F508del-CFTR, et d’autre part, à apporter de nouvelles pistes thérapeutiques pour la recherche

pharmacologique dans la mucoviscidose mais aussi pour d’autres maladies humaines associées

à un trafic défectueux des glycoprotéines mal repliées et partiellement fonctionnelles.

Figure 28 : Objectifs de notre travail.

Le premier objectif de ce travail de thèse a donc été d’étudier la potentielle implication

de la famille des protéines EDEMs dans la rétention réticulaire de F508del-CFTR par une

stratégie de siRNA. Ces protéines jouent un rôle majeur dans la voie de dégradation ERAD et

leur implication dans la rétention de F508del-CFTR dans les cellules de mammifères n’a à ce

jour pas encore été démontré. Notre attention s’est ensuite focalisée sur l’identification d’une

stratégie pharmacologique qui permettrait de cibler cette famille de protéines. Tout comme les

autres membres de la famille GH47, les trois protéines EDEMs ont un domaine d’homologie

de mannosidase (Olivari and Molinari, 2007a; Ninagawa et al., 2014). Le 1-

Deoxymannojirimycin (DMJ) étant un inhibiteur non compétitif de l’activité mannosidase des

membres de la famille GH47, il a donc été choisi pour notre étude. Une collaboration avec

l’équipe du Pr. Philippe Compain de l’Université de Strasbourg a été mise en place afin de


73

synthétiser à partir du DMJ des composés multivalents et de tester leur effet correcteur. En

effet, lors d’une collaboration antérieure, les deux équipes avaient démontré qu’il était possible

d’améliorer l’efficacité du DNJ (un dérivé du miglustat) par une approche de « click-

chemistry », une stratégie qui permet de coupler des composés en une seule molécule (Compain

et al., 2013). Il a ainsi été démontré que les dérivés multivalents du DNJ corrigeaient l’activité

de F508del-CFTR de manière plus efficace que le DNJ. Le composé trivalent-DNJ, qui

correspond à 3 molécules de DNJ associées par un bras chimique, est environ 1000 fois plus

efficace que son monovalent-DNJ, correspondant au DNJ associé au bras chimique (Compain

et al., 2013).

Toujours dans l’optique d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, nous nous

sommes intéressés par la suite à l’α1,2-mannosidase du RE (ERManI), décrite comme le «

minuteur » qui déclenche la première étape de la dégradation ERAD des glycoprotéines mal

repliées (Araki and Nagata, 2011; Zhou et al., 2015). En effet, on sait que son inhibition

(pharmacologique ou par siRNA) prévient la dégradation des substrats luminaux AAT (α1-

antitrypsin) et NHK (null Hong Kong) (Hosokawa et al., 2003; Wu et al., 2003; Avezov et al.,

2008; Pan et al., 2013). De même, un traitement avec la Kifunensine, un inhibiteur spécifique

de l’α1,2-mannosidase restaure l’expression membranaire de l’α-sarcoglycane R77C in vitro et

in vivo (Bartoli et al., 2008; Soheili et al., 2012). Ainsi, notre deuxième objectif dans cette étude

a été de déterminer si ERManI était impliquée ou non dans la rétention réticulaire de la protéine

mutée F508del-CFTR.

Enfin, lors d’une dernière étude, nous avons tenté de comprendre pourquoi la

multivalence augmentait l’efficacité de nos correcteurs. Ce travail toujours en cours (présentée

en annexe) a nécessité de générer des composés fluorescents par ajout d’une sonde fluorescente,

le BODIPY, abréviation de bore-dipyrométhene (Lepage et al., 2015).

Matériels et méthodes

74

Matériels et méthodes I. Matériel cellulaire

Fiche technique N°1 :

Lignées cellulaires, culture et entretien

Les différentes lignées cellulaires sont manipulées en conditions stériles sous une hotte

à flux laminaire verticale. Elles sont maintenues et cultivées à 37°C sous une atmosphère

humide composée de 5% de CO2 et 95% d’O2.

1- Culture des lignées cellulaires

a) Lignées Hela WT- et F508del-CFTR

La cellule Hela est une lignée cellulaire humaine immortelle issue d’un adénocarcinome

du col utérin de la jeune femme Henrietta Lacks. N’exprimant pas la protéine CFTR, cette

lignée a été stablement transfectée avec un plasmide codant la protéine CFTR sauvage (WT-

CFTR) ou mutée (F508del-CFTR). Le plasmide porte également un gène de résistance à la

zéocin. Les lignées sont mises en culture dans le milieu de culture décrit dans le tableau 2 :

Milieu de culture pour cellules Hela WT- et F508del-CFTR

Milieu DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium (Gibco) 500 ml

Sérum de veau fœtal (SVF) (Fisher Scientific) 10%

Pénicilline (Sigma Aldrich) 100 U/ml

Streptomycine (Sigma Aldrich) 100 µg/ml

Agent de pression de sélection : Zéocin (Invitrogen) 125 mg/ml

Tableau 2 : Composition du milieu de culture pour les lignées cellulaires Hela WT- et

F508del- CFTR.

b) Lignée CFBE41o-

Il s’agit d’une lignée cellulaire épithéliale bronchique homozygote pour la mutation

F508del-CFTR. Elle a été mise au point par l’équipe du Professeur Gruenert pour étudier le

canal CFTR (Cozens et al., 1994). Cette lignée a la capacité de former une monocouche

polarisée lorsqu’elle est cultivée in vitro en condition air/liquide. Le milieu de culture utilisé

pour cette lignée est décrit dans le tableau 3 :


75

Milieu de culture pour cellules CFBE41o-

Milieu MEM Eagle with Earle's BSS, without L-glutamine (Lonza) 500 ml

Sérum de veau fœtal (SVF) (Fisher Scientific) 10%

L-Glutamine (Sigma) 2 mM

Plasmocyne (Invitrogen) 5 µg/ml

Tableau 3 : Composition du milieu de culture pour la lignée cellulaire CFBE41o-.

2- Entretien des lignées cellulaires

Lorsque les cellules atteignent environ 80% de confluence, elles sont réensemencées

dans une nouvelle flasque de culture appelée flasque « de routine » et si nécessaire, également

dans des supports adaptés aux manipulations envisagées. Ce repiquage s’effectue une seule fois

par semaine pour tout type cellulaire, selon le protocole suivant :

- Rincer les cellules avec une solution PBS (Phosphate Buffer Saline) dépourvue de

calcium et magnésium (Lonza).

- Répartir sur le tapis cellulaire la trypsine (T4049, Sigma) à raison de 1 ml/25 cm2 et

placer dans l’incubateur (37°C) durant 1 minute pour les lignées Hela WT- ou F508del-

CFTR et 4 minutes pour la lignée CFBE41o-.

- Une fois les cellules décrochées de leur support, stopper l’action de la trypsine en

ajoutant 5 ml de milieu de culture.

- Finir le décollement des cellules en effectuant des aspirations et des refoulements du

milieu puis, transférer la totalité des cellules dans un tube contenant 30 ml de milieu de

culture.

- Centrifuger pendant 7 minutes à 1100 rpm puis éliminer le surnageant.

- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de milieu de culture.

- Après avoir complété avec 5 ml de milieu de culture supplémentaire, dénombrer les

cellules puis les ensemencer à la dilution souhaitée sur les supports adéquats et selon le

type d’expériences envisagées.

- Tous les 2 jours, aspirer le milieu des cellules et le remplacer par du milieu frais afin de

renouveler les nutriments.


76


Congélation et décongélation des lignées cellulaires

1- La congélation

Il est possible de constituer un stock des différentes lignées cellulaires pour toute

utilisation ultérieure en les congelant dans de l’azote liquide à -180°C. Le protocole suivi pour

la congélation des cellules utilisées dans cette étude est le suivant :

- Décrocher les cellules de leur support par de la trypsine puis les centrifuger comme

indiqué en fiche technique N°1.

- Resuspendre le culot cellulaire obtenu dans un milieu de congélation qui correspond à

du milieu de culture supplémenté avec 10% de DMSO (DiMéthylSulfOxyde), un agent

cryoprotecteur qui permet d’empêcher la formation de cristaux.

- Transférer de manière très rapide les cellules dans des cryotubes.

- Congeler pendant 24 heures à -80°C.

- Le lendemain, stocker les cellules dans de l’azote liquide (-196°C).

2- La décongélation

La décongélation des cellules doit se faire de manière très rapide afin que les cellules

restent le moins longtemps possible en contact avec le DMSO, toxique à température ambiante.

Le protocole suivi est le suivant :

- Plonger le cryotube dans un bain marie (37°C) le temps de décoller le « glaçon » de

cellules de la paroi du cryotube.

- Transvaser le « glaçon » de cellules dans environ 35 ml de milieu de culture afin de bien

diluer le DMSO.

- Centrifuger l’ensemble à 1100 rpm pendant 7 minutes.

- Remettre en suspension le culot cellulaire obtenu dans 6 ml de milieu de culture.

- Ensemencer la totalité des cellules dans une flasque de culture de 25 cm2 (T25) puis la

placer dans l’incubateur.

- Une fois les cellules adhérentes, aspirer le milieu et le remplacer par du milieu frais.


77


Isolement des cellules épithéliales bronchiques des patients CF

1- Origine des prélèvements

Les fragments de tissus pulmonaires mucoviscidosiques sont fournis par le service de

chirurgie cardiothoracique de l’hôpital FOCH de Suresnes lors d’une transplantation

pulmonaire sur des patients mucoviscidosiques (collaboration avec le Docteur Bonnette). Une

fois prélevés, les fragments sont conservés à 4°C dans une solution dite de « décontamination

CF » (Tableau 4) jusqu’au moment de la dissection.

Milieu de décontamination CF

Milieu DMEM-HAM F12 500 ml

Pénicilline-streptomycine 1 mg/ml

Amphotéricine B 100 µg/ml

Gentamicine 0.5 mg/ml

Ceftazidine 500 µg/ml

Ticarcilline 500 µg/ml

Tableau 4 : Composition du milieu de décontamination pour échantillons CF.

Durant ces 3 années de thèse, nous n’avons malheureusement reçu que deux

prélèvements provenant de 2 patients hommes (29 et 35 ans), homozygotes pour la mutation

F508del-CFTR. La récupération de ces prélèvements est conforme à la législation française et

approuvée par le comité de protection de personne OUESTIII.

2- Dissection et isolement des cellules épithéliales bronchiques :

Une fois arrivés au laboratoire, les fragments pulmonaires sont rapidement disséqués et

les cellules épithéliales bronchiques sont isolées selon le protocole suivant :

- La manipulation doit être effectuée sous une hôte à flux laminaire.

- Mettre le prélèvement pulmonaire reçu dans une boîte contenant le milieu de

décontamination CF.

- A l’aide des ciseaux de microdissection, dissocier les bronches et bronchioles du

parenchyme puis les transférer dans une boîte propre contenant du PBS (Lonza) froid.

- Ouvrir les bronches et bronchioles dans leur longueur puis effectuer trois bains

successifs dans du PBS.


78

- A l’aide d’une pince courbe, gratter la surface interne de chaque bronche/bronchiole

afin de décoller l’épithélium puis transférer l’ensemble dans un tube de 50 ml.

- Centrifuger à 2 000 rpm pendant 6 minutes puis remettre le culot cellulaire délicatement

en suspension avec 1 ml de milieu de culture primaire CF (Tableau 5).

Milieu de culture primaire CF

Milieu DMEM-HAM F12 500 ml

Pénicilline-streptomycine 1 mg/ml

Tobramycine 500 µg/ml

Ceftazidine 500 µg/ml

Transferrine 7.5 µg/ml

Insuline 5 µg/ml

EGCS 2 µg/ml

T3 0.03 µg/ml

EGF 2.5 ng/ml

L-Glutamine 1 µM

Hydrocortisone 1 µM

Tableau 5 : Composition du milieu de culture primaire CF.

- Dénombrer les cellules épithéliales sur cellule de Malassez puis les ensemencer sur les

supports adéquats pour les manipulations envisagées.

- Incuber les cellules à 37°C sous une atmosphère humide composée de 5% de CO2 et

95% d’O2 jusqu’au moment de leur manipulation.


79

II. Techniques de biologie moléculaire et de biochimie

Fiche technique N°4

Mesure de l’activité du protéasome

1- Principe

L’analyse de l’activité enzymatique du protéasome a été effectuée par le kit « 20S

Proteasome Activity Assay kit ». Elle repose sur la détection du fluorophore-7-Amino-4-

methylcoumarin (AMC) libéré après clivage par le protéasome du substrat marqué Leu-Leu-

Val-Tyr-AMC. La fluorescence peut être mesurée par un couple de filtre 380/460 nm d’un

fluoromètre.

2- Protocole

L’activité enzymatique du protéasome est mesurée sur des cellules cultivées dans une

plaque 96 puits jusqu’à atteindre une confluence d’environ 100%, ou bien sur le protéasome

20S purifié du kit. Le test a été réalisé selon les instructions du kit :

- Oter le milieu de culture

- Ajouter 10 µl de 10X Assay Buffer et 80 µl d’H2O.

- Déposer dans l’obscurité, 10 µl de substrat LLVY-AMC.

- Après une incubation de 2h à 37°C, mesurer la fluorescence en utilisant un fluoromètre

(filtre 380/460).

- Pour la mesure de l’activité enzymatique du protéasome purifié 20S, suivre les

instructions du kit.


80


Transfection de siRNA (small interfering RNA)

1- Principe

Le siRNA est un ARN double brin de petite taille capable de se lier de manière

spécifique sur une séquence d’ARN messager (ARNm) et de le cliver afin d’inhiber sa

traduction en protéine. Il est introduit dans la cellule par lipofection, électroporation ou par des

vecteurs plasmidiques ou viraux. Une fois dans le cytoplasme, le siRNA active le complexe

RISC « RNA Induced Silencing Complex » et le guide jusqu’à l’ARNm cible pour le dégrader.

Ainsi, l’expression protéique de la protéine cible est diminuée dans les cellules transfectées

(Figure 29).

Figure 29 : Principe de la transfection de siRNA.

2- Protocole

Les siRNA et les réactifs de transfection (siRNA Transfection Reagent et siRNA

transfection medium) utilisés dans cette étude proviennent de Santa Cruz Biotechnology. La

transfection a été effectuée sur des cellules cultivées jusqu’à 60% de confluence dans des boites

de culture de 35 mm de diamètre :


81

- Préparer : Solution A = 100 µl milieu de transfection + 8 µl siRNA

Solution B = 100 µl milieu de transfection + 6 µl agent de transfection

- Mélanger la solution B avec la solution A et incuber pendant 45 minutes à température

ambiante.

- Ajouter 800 µl de milieu de transfection au mélange AB.

- Laver les cellules avec 2 ml de milieu de transfection.

- Déposer le mélange AB sur les cellules.

- Incuber les cellules pendant 7 heures dans l’incubateur (37°C et 5% de CO2).

- Rajouter sur les cellules 1 ml de milieu de culture cellulaire 2 fois supplémenté en milieu

de croissance et en antibiotiques.

- Après 24 heures de transfection, éliminer la solution de siRNA et la remplacer par le

milieu de culture cellulaire standard.

- Effectuer les manipulations envisagées 48 heures après la transfection.


82


Western blot

1- Principe

Le western blot est une technique qui permet de détecter la présence d’une protéine

particulière dans un extrait cellulaire. Les protéines sont séparées par électrophorèse en fonction

de leur poids moléculaire sur un gel de polyacrylamide dénaturant puis transférées sur une

membrane (nitrocellulose ou PVDF (polyvinylidene difluoride)). Sur cette dernière, la protéine

d’intérêt est reconnue par un anticorps spécifique qui à son tour est reconnu par un second

anticorps couplé à une enzyme, un fluorochrome ou un isotope (Figure 30).

Figure 30 : Principe de la technique du western blot.

2- Protocole

a) Extraction des protéines

L’extraction protéique est effectuée sur des cellules cultivées jusqu’à 100% de

confluence dans des boites de 35 mm de diamètre. Toutes les étapes du protocole sont réalisées

sur glace afin de limiter la dégradation des protéines :

- Rincer les cellules trois fois avec du PBS (Lonza) froid.

- Déposer sur le tapis cellulaire 100 µl de tampon de lyse (Tableau 6) additionné d’un

cocktail d’inhibiteurs de protéase (Roche).

Tampon de lyse

DOC (deoxycholate) 0.5% (w/v) Nonidet P-40 1% (v/v) Tris HCL 10 mM Pefabloc SC 1 mM pH 7,5

Tableau 6 : Composition du tampon de lyse cellulaire.


83

- À l’aide d’un grattoir, récupérer les cellules puis les transférer dans un tube eppendorf.

- Vortexer pendant 30 secondes puis incuber le lysat cellulaire pendant 30 minutes sur

glace.

- Vortexer de nouveau pendant 30 secondes puis centrifuger le lysat cellulaire pendant 5

minutes à 14 000 rpm et 4°C.

- Récupérer le surnageant (lysat clarifié) puis doser la concentration en protéine totale.

b) Dosage et dénaturation des protéines

La concentration des protéines est déterminée par la méthode BCA (acide

bicinchoninique), un dosage colorimétrique basé sur la capacité des protéines à réduire des ions

cuivriques Cu2+ en Cu+ lorsqu’elles sont dans un milieu alcalin. Les Cu+ libérés forment avec

le BCA un complexe pourpre mesurable à 562 nm. Le protocole utilisé est le suivant :

- Dans un tube, diluer 3 µl de lysat clarifié dans 47 µl d’eau. Pour la solution « blanc »,

mettre uniquement 50 µl d’eau.

- Ajouter dans chaque tube, 1 ml de la solution BCA préalablement préparée (BCA +

sulfate de cuivre dilué au 1/50ème, Thermo Scientific) et incuber pendant 30 minutes à

37°C.

- Mesurer la densité optique à 562 nm.

- La concentration en protéines totales est à déterminer à partir de la densité optique

obtenue grâce à une courbe étalon BSA (Bovine Serum Albumin) préalablement établie.

- Dénaturer les lysats clarifiés :

o Pour la détection de la protéine CFTR : pendant 1h à 37°C dans du Laemmli

2x [125 mM Tris, 4.5% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), 30% glycerol, 0.002%

bleu de bromophenol, 5% α-monothioglycerol].

o Pour les autres protéines : pendant 5 min à 95°C dans du Laemmli 5x (ID1624,

Dgel sciences).

c) Electrophorèse et transfert sur membrane

La séparation des protéines est réalisée par électrophorèse SDS-PAGE (Sodium

DodécylSulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis). Il s’agit de séparer les protéines

chargées en fonction de leur poids moléculaire qui migrent au travers d’un gel de

polyacrylamide en présence de SDS, sous l’influence d’un champ électrique. Le protocole

utilisé est le suivant :


84

- Préparer le gel de migration selon les tableaux 7 et 8.

Gel de séparation Gel de concentration

5% 10% 4%

Eau distillée 2.5 ml 2 ml 1.3 ml

Tampon 4X Lower 1 ml 1 ml -

Tampon 4X Upper - - 500 µl

Acrylamide-Bisacrylamide (40%) 500 µl 1 ml 200 µl

Persulfate d’ammonium (APS) 10% 40 µl 20 µl TEMED (N,N,N',N' tétraméthyléthylènediamine)

4 µl 2 µl

Tableau 7 : Composition des gels d’électrophorèse des protéines. (Le gel de séparation 5% de polyacrylamide est utilisé pour la migration de la protéine CFTR et le gel

de 10% de polyacrylamide pour la migration des autres protéines)

Tris SDS 10% pH

Tampon 4X Lower 1.5 M 0.4% 8,8

Tampon 4X Upper 0.5 M 0.4% 6,8

Tableau 8 : Composition des tampons 4X Lower et Upper.

- Une fois polymérisé, placer le gel dans une cuve à électrophorèse, puis remplir la cuve

avec le tampon de migration TG-SDS 10X (UP91495E, Interchim) dilué au 1/10ème.

- Déposer 50 µg des lysats protéiques dénaturés dans les puits du gel. Afin de faciliter le

suivi de la migration, déposer dans un puits un marqueur de taille coloré RPN800E (GE

Healthcare).

- Appliquer un champ électrique de 180 V et 30 mA pendant 1h40 à l’exception de la

migration de la protéine CFTR (270 V et 30 mA pendant 1 heure).

- Une fois la migration terminée, récupérer le gel puis réaliser le montage dit en «

sandwich » dans le tampon de transfert (Tableau 9), selon la figure 31. La membrane

utilisée est de type nitrocellulose (GE Healthcare).

Tampon de transfert

TG-SDS10X (UP91495E, Interchim) 5%

Ethanol 100% 20%

Tableau 9 : Composition du tampon de transfert.


85

Figure 31 : Assemblage du sandwich de western blot.

- Mettre le « sandwich » dans la cassette de transfert puis placer l’ensemble dans la cuve

de transfert.

- Après avoir rempli la cuve avec le tampon de transfert froid, appliquer un courant de

170 V et 80 mA pendant 1h30 à l’exception du transfert de la protéine CFTR (400 V et

200 mA pendant 1 heure).

d) Immunodétection

Toutes les étapes de cette partie doivent être réalisées à 4°C et sous agitation :

- A l’issu du transfert, récupérer la membrane et la laver trois fois 5 minutes avec du PBS-

Tween [tampon PBS contenant 0.01% de Tween-20].

- Incuber la membrane pendant 1 heure dans une solution de saturation, PBS-T contenant

0.5% de lait écrémé.

- Après 3 lavages de 5 minutes, incuber la membrane pendant toute une nuit avec

l’anticorps primaire spécifique de la protéine d’intérêt, dilué dans la solution de

saturation (Tableau 10).

Anticorps primaires Fournisseur Dilution

Mouse anti-CFTR monoclonal Merck Millipore 1/1000 Mouse anti- Na+/K+-ATPase α1 monoclonal 1/1000 Goat anti-EDEM1 polyclonal 1/1000 Rabbit anti-EDEM2 polyclonal Santa Cruz 1/2000 Goat anti-EDEM3 polyclonal Biothechnology 1/10 000 Rabbit anti-ERGIC53 polyclonal 1/10 000 Rabbit anti-VIP36 polyclonal 1/1000 Rabbit anti-Hsp70 polyclonal 1/10 000 Rabbit anti-Hsp90 polyclonal Enzo Life Sciences 1/1000 Rabbit anti-Calnexine polyclonal 1/2000 Rabbit anti-Actine monoclonal Sigma-Aldrich 1/10 000

Tableau 10 : Récapitulatif des anticorps utilisés en western blot.


86

- Le lendemain, laver 3 fois 5 minutes la membrane puis l’incuber pendant 1 heure avec

l’anticorps secondaire dilué dans la solution de saturation (Tableau 11). Cet anticorps

est couplé à la HRP (horseradish peroxidase) et est dirigé contre les IgG de l’organisme

dans lequel l’anticorps primaire utilisé a été produit.

Anticorps secondaires Fournisseur Dilution

Goat anti-Mouse HRP-linked Sigma-Aldrich 1/10 000 Goat anti-Rabbit HRP-linked 1/10 000

Donkey anti-Goat IgG-HRP Santa Cruz

Biothechnology 1/10 000

Tableau 11 : Récapitulatif des anticorps utilisés en western blot.

- Laver la membrane 3 fois 5 minutes.

- La révélation des protéines d’intérêt est réalisée en chambre noire par autoradiographie

à l’aide du kit Enhanced ChemiLuminescence (ECL) (WBKLS0500, Merck Millipore):

o Incuber la membrane pendant 1 minute avec la solution ECL préalablement

préparée (selon les instructions du kit).

o Couvrir la membrane à l’aide d’un plastique (très fin et transparent), puis

appliquer au-dessus un film autoradiographique (GE Healthcare) pendant

quelques minutes.

o Récupérer le film, le plonger dans une solution révélatrice, le rincer avec de

l’eau, le plonger dans une solution fixatrice puis le rincer avec de l’eau distillée.

- Scanner le film et mesurer l’intensité de chaque bande à l’aide du logiciel Photoshop.


87


Biotinylation de surface

1- Principe

La biotinylation de surface permet de détecter la présence d’une protéine particulière à

la surface cellulaire, de l’isoler et d’estimer sa quantité à un moment donné. Elle est basée,

d’une part, sur la capacité de la biotine, une vitamine soluble à se fixer exclusivement aux

protéines présentes à la surface cellulaire; et d’autre part, sur sa haute affinité avec la

streptavidine, une protéine d’origine bactérienne. La biotine peut être alors utilisée comme

appât pour isoler les protéines membranaires à partir d’un lysat cellulaire. Basée sur ce système,

plusieurs réactifs de biotinylation de propriétés différentes ont été créés. Dans notre étude, le

réactif EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin a été choisi pour ses propriétés qui répondent aux critères

pour la détection du canal CFTR. Ce réactif présente en effet, un groupement sulfonate (sulfo-

NHS) qui l’empêche de franchir les membranes cellulaires intactes et aussi permet sa fixation

covalente aux groupements amines primaires des protéines. De plus, il marque de manière

efficace des protéines qui ont une lysine résiduelle accessible et qui sont suffisamment

exposées. Le canal CFTR possède 3 lysines, présentes dans les boucles extracellulaires ECL1,

ECL3 et ECL4. Et enfin, ce réactif présente un pont disulfure intramoléculaire permettant une

élution facile des protéines biotinylées à partir des billes de streptavidine (Figure 32).

Figure 32 : Principe de la biotinylation de surface. A. Structure du EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin.

B. Principe de purification des protéines membranaires par la biotinylation.


88

2- Protocole

Pour notre étude, le kit de réactifs « Pierce™ Cell Surface Protein Isolation Kit »

(Thermo Fisher Scientific) a été utilisé. La technique est réalisée sur des cellules cultivées

jusqu’à 100% de confluence dans des boites de 35 mm de diamètre selon le protocole suivant :

- Rincer les cellules avec du PBS froid.

- Diluer la EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin dans du PBS à 0.5 mg/ml.

- Déposer 3 ml de la solution de biotine sur les cellules et incuber sous agitation pendant

30 minutes à 4°C.

- Stopper la réaction par 2 bains successifs avec le tampon Quenching Solution froid.

- Rincer les cellules pendant 5 minutes sous agitation à 4°C avec le TBS (Tris Buffer

Saline) froid.

- Effectuer une lyse cellulaire et doser la concentration des protéines récupérées, comme

indiqué dans la fiche technique N°6.

- Déposer la NeutrAvidin Agarose dans la colonne, et effectuer des lavages avec la

solution Wash Buffer selon les instructions du Kit.

- Déposer le lysat protéique dans la colonne et laisser incuber pendant 1 heure à

température ambiante sous rotation.

- Centrifuger les colonnes pendant 1 minute à 1 000 x g et jeter l’éluât.

- Déposer 500 µl de Wash Buffer additionné d’un cocktail d’inhibiteurs de protéase

(Roche) puis centrifuger pendant 1 minute à 1 000 x g.

- Après avoir jeté l’éluât, répéter cette dernière étape encore 3 fois.

- Eluer les protéines par dénaturation, en incubant les billes avec le tampon Laemmli 2x

[125 mM Tris, 4.5% SDS, 30% glycerol, 0.002% bleu de bromophenol, 5% α-

monothioglycerol] (à raison de 15 µl pour 100 µg de protéines) pendant 1 heure à 37°C.

- Placer les colonnes dans de nouveaux tubes collecteurs et récupérer les protéines

biotinylées par une centrifugation de 2 minutes à 1 000 x g.

- Analyser par western blot (voir la fiche technique N°6) le contenu des échantillons

biotinylés ou stockés à -20°C.


89


Immunomarquage indirect

1- Principe

L’immunomarquage est une technique qui permet de détecter et/ou localiser un antigène

au sein d’un tissu ou une cellule au moyen d’anticorps. Après fixation et perméabilisation des

membranes cellulaires, un anticorps primaire se fixe par spécificité sur l’antigène étudié. Cet

anticorps est à son tour reconnu par un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome (Figure

33). Le complexe ainsi formé « protéine-anticorps primaire-anticorps secondaire » est ensuite

visualisé par microscopie à fluorescence suite à une excitation lumineuse du fluorochrome qui

va émettre une fluorescence.

Figure 33 : Principe d’immunomarquage indirect.

2- Protocole

La technique est réalisée sur des cellules cultivées jusqu'à 80% de confluence sur

lamelles de verre de 12 mm (déposées dans les puits d’une plaque 24 puits). Toutes les étapes

du protocole suivi sont réalisées sous agitation et, sauf contre-indication, à température

ambiante :

- Laver les cellules 3 fois 5 minutes avec le tampon TBS [157 mM NaCl, 20 mM Tris

Base, pH 7.4].

- Fixer les cellules avec du méthanol froid pendant 20 min à -20°C.

- Après 3 lavages de 5 minutes, perméabiliser les membranes cellulaires pendant 15

minutes à température ambiante avec 0.1% de Triton X-100 dilué dans le TBS.

- Laver 3 fois 5 minutes les cellules puis les incuber pendant 1 heure en présence d’une

solution de saturation TBS contenant 1% de BSA (Bovine Serum Albumine) et 0.05%

de saponine (TBS-BSA-Saponine).


90

- Eliminer la solution et incuber les cellules pendant toute une nuit à 4°C en présence

de/des anticorps primaire(s) approprié(s) dilué(s) dans la solution de saturation (Tableau

12).

Anticorps primaires Fournisseur Dilution

Mouse anti-CFTR monoclonal R&D system 1/100 Goat anti-EDEM1 polyclonal 1/50 Rabbit anti-EDEM2 polyclonal Santa Cruz 1/50 Goat anti-EDEM3 polyclonal Biothechnology 1/50 Mouse anti calnexin polyclonal 1/50 Rabbit anti calnexin polyclonal Enzo Life Sciences 1/200

Tableau 12 : Récapitulatif de l’ensemble des anticorps primaires utilisés.

- Laver les cellules 3 fois 5 minutes puis les incuber pendant 1 heure en présence de/des

anticorps secondaire(s) (dirigé contre les IgG de l’organisme dans lequel l’anticorps

primaire a été produit) dilué(s) dans la solution de saturation (Tableau 13).

Anticorps secondaires Fournisseur Dilution

Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 555 1/100 Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 555 Thermo Fisher 1/50 Donkey anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 647 Scientific 1/50 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 647 1/50

Tableau 13 : Récapitulatif de l’ensemble des anticorps secondaires utilisés.

- Après 2 lavages au TBS, monter les lamelles sur des lames de verre à l’aide d’un milieu

de montage avec DAPI (Sigma-Aldrich). Le DAPI, un agent qui s’incorpore dans le

noyau et se lie préférentiellement aux bases A-T de l’ADN (acide désoxyribonucléique)

permet de marquer les noyaux des cellules.

- Conserver les lames à 4°C jusqu’à leur observation au microscope.

Les observations microscopiques ont été réalisées à la plateforme ImageUp (Université de

Poitiers), sur un microscope confocal FV1000 Olympus équipé d’un microscope inversé à

fluorescence (IX-81, Olympus). Les marquages fluorescents ont été obtenus par une excitation

des échantillons à 543 nm (rouge), 633 nm (rouge lointain) et 405 nm (DAPI). La fluorescence

émise a été détectée entre 555-655 nm pour le rouge, 650 nm pour le rouge lointain et entre

425-475 nm pour le DAPI. Les images ont été obtenues à l’aide d’un objectif x60. Le logiciel

Fluoview v1.6 a été utilisé pour l’acquisition des signaux et le traitement des images.


91


In situ Proximity Ligation Assay (Duolink)

1- Principe

La méthode in situ Proximity Ligation Assay (PLA) est une technique hautement

spécifique et sensible qui permet de détecter, visualiser et quantifier au sein d’un tissu ou d’une

cellule des interactions protéine/protéine, l’expression des protéines seules, ou encore, des

modifications post traductionnelles, telle que la phosphorylation. La détection de l’interaction

entre deux protéines cibles est basée sur l’utilisation de deux anticorps secondaires (PLA-probe

PLUS et PLA-probe MINUS), conjugués chacun avec un fragment d’oligonucléotides. Ces

deux fragments étant complémentaires entre eux, s’hybrident lorsque la distance entre les deux

protéines cibles est inférieure ou égale à 40 nm. Cette hybridation est maintenue grâce à une

ligase puis amplifiée grâce à une polymérase qui incorpore des bases qui fluorescent dans le

rouge (Figure 34).

Figure 34 : Principe de la technique de Duolink.

2- Protocole

La manipulation est effectuée sur des cellules cultivées jusqu’à 80% de confluence sur

lamelles de verre de 12 mm (déposées dans les puits d’une plaque 24 puits). Le kit Duolink in

situ kit (Olink Biosciences) a été utilisé :

- Laver les cellules 3 fois 5 minutes avec le tampon TBS.

- Fixer les cellules pendant 20 minutes à température ambiante avec une solution de

paraformaldéhyde (PAF) diluée à 3% dans le TBS.

- Après 3 lavages de 5 minutes, perméabiliser les membranes cellulaires pendant 10

minutes à température ambiante avec du Triton X-100 dilué à 0.1% dans le TBS.

- Après 3 nouveaux lavages, incuber les cellules pendant 1 heure à température ambiante

avec la solution de saturation TBS contenant 1% de BSA et 0.05% de saponine.


92

- Ôter la solution de saturation et incuber les cellules à 4°C pendant toute une nuit sous

agitation avec les anticorps primaires dilués dans le tampon de saturation (Tableau 14).

Ces anticorps, dirigés chacun contre une des deux protéines d’intérêt doivent être

produits dans deux espèces différentes.

Anticorps Fournisseur Dilution

Duolink CFTR avec les protéines :

Goat anti-EDEM1 polyclonal 1/200 Rabbit anti-EDEM2 polyclonal Santa Cruz Biotechnology 1/500 Goat anti-EDEM3 polyclonal 1/1000 Rabbit anti-Hsp70 polyclonal 1/300 Rabbit anti-Hsp90 polyclonal Enzo Life Sciences 1/300 Rabbit anti-Calnexin polyclonal 1/300 Mouse anti-CFTR monoclonal Merck Millipore 1/100

Duolink CFTR avec les protéines :

Rabbit anti-VIP36 polyclonal Santa Cruz 1/500 Rabbit anti-ERGIC53 polyclonal Biotechnology 1/1000 Mouse anti-CFTR monoclonal Merck Millipore 1/500

Tableau 14 : Récapitulatif de l’ensemble des anticorps utilisés en Duolink.

- Le lendemain, mélanger les deux sondes PLA PLUS et PLA MINUS diluées à 1/5 dans

la solution de saturation et laisser incuber pendant 20 minutes à température ambiante.

Chaque sonde doit être dirigée contre l’espèce de l’un des anticorps primaires utilisés.

- Laver les cellules 2 fois 5 minutes avec la solution de saturation puis les incuber pendant

1 heure à 37°C en présence du mélange PLA PLUS + PLA MINUS.

- Après 2 lavages avec la solution de lavage A [0.01 M Tris, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween

20], incuber les cellules pendant 30 minutes à 37°C en présence d’une solution d’eau

purifiée contenant la solution de ligation et la ligase, à 1/5 et 1/40 respectivement.

- Après deux nouveaux lavages de 2 minutes avec la solution de lavage A, incuber les

cellules pendant 100 minutes à 37°C en présence d’une solution d’eau purifiée

contenant la solution d’amplification et la polymérase, diluées à 1/5 et 1/80

respectivement.

- Laver les cellules 2 fois 10 minutes avec une solution de lavage B 1X [0.2 M Tris, 0.1

M NaCl] puis 1 fois 1 minute avec la solution de lavage B à 0,01X.

- Monter les lamelles sur des lames de verre à l’aide d’un milieu de montage contenant le

DAPI (marqueur des noyaux cellulaires).

- Une fois séchées, les lames sont observées en microscopie comme décrit précédemment

en fiche technique N°8.


93

III. Techniques de physiologie cellulaire


Efflux d’iodure

1- Principe

Il s’agit d’une technique qui permet d’étudier la fonctionnalité des canaux chlorures

dans une population cellulaire. Elle repose sur la mesure du changement de concentration en

radiotraceur de part et d’autre de la membrane cellulaire. L’iodure radioactif 125I présente de

nombreux avantages qui font de lui le traceur idéal pour l’étude de l’activité des canaux

chlorure, comparé au chlore radioactif 36Cl-. En effet, la plupart de ces canaux présentent une

sélectivité pour l’iodure et pour les ions chlorure. De plus, l’125I présente une durée de vie qui

est beaucoup plus faible que celle du 36Cl- (60 jours contre 300 000 ans) et son utilisation est

beaucoup moins coûteuse (environ 10 fois moins chère).

2- Protocole

La technique est effectuée par le docteur Caroline NOREZ. Elle est réalisée sur des

cellules cultivées jusqu’à 100% de confluence dans une plaque 24 puits selon le protocole

suivant :

- Rincer les cellules avec le milieu d’efflux (Tableau 15) puis déposer un milieu dit « de

charge », composé de milieu d’efflux complémenté par 1 µCi/ml de 125INa (NEN Life

Sciences).

Tableau 15 : Composition du milieu d’efflux utilisé.

- Laisser incuber pendant 1 heure à 37°C, afin de permettre à l’iode radioactif de

s’équilibrer de part et d’autre de la membrane cellulaire.

Milieu d’efflux

NaCl 136.9 mM KCl 5.4 mM CaCl2 1.8 mM MgCl2 0.8 mM NaHCO3 4.2 mM NaH2PO4 0.3 mM KH2PO4 0.3 mM MgSO4 0.4 mM HEPES 10 mM D-glucose 5.6 mM pH 7.5


94

- A l’issus de cette incubation, les étapes qui suivent sont à réaliser par le robot

MultiPROBE II (Packard).

- Rincer les cellules avec le milieu d’efflux afin d’éliminer l’iodure non incorporé, puis

déposer 500 µl de ce milieu.

- Une minute après, collecter le milieu dans un tube à hémolyse et déposer un volume

équivalent de milieu « propre ».

- Répéter cette dernière étape encore 8 fois :

o Les 3 premiers tubes à collecter correspondent à l’efflux basal de l’iode radioactif

sortit de la cellule de manière passive.

o Les 6 autres prélèvements correspondent aux milieux collecté après l’addition

d’agents pharmacologiques : pour notre étude, il s’agit d’un cocktail activateur de

CFTR composé de 10 µM de forskoline (Fsk), un activateur d’adénylate cyclase et

30 µM de génistéine (Gst), qui active directement le CFTR).

- A la 10ème minute, incuber les cellules pendant 30 minutes en présence d’une solution

de lyse composée de 0,1% SDS et 0,1 M NaOH afin de récupérer et d’évaluer la

radioactivité résiduelle des cellules (restes).

- Mesurer la radioactivité contenue dans les tubes collectés ainsi que dans le lysat (restes)

à l’aide d’un compteur gamma (Cobra II, Packard) en coups par minute (cpm).

3- Analyse des résultats

Les résultats en cpm obtenus par le compteur sont présentés sous la forme de vitesse de

sortit d’iodure radioactif (k) par minute (k (min-1)) (Figure 35) grâce à la formule suivante :

k = [In(125I t1) - In(125I t2))] / (t1-t2). Les 125I t1 et 125I t2 correspondent à la radioactivité

(cpm) mesurée à temps t1 et t2 respectivement. Les résultats présentés en histogrammes sont

représentés en kpeak-kbasal afin de s’affranchir de la sortie passive de l’iodure radioactif.

Figure 35 : Exemple de représentation graphique des résultats d’efflux d’iodures.

kbasal

kpeak Agent pharmacologique


95


Etude des variations du potentiel membranaire avec la sonde oxonol

1- Principe

La Sonde Oxonol ou bis-(1,3-diethylthiobarbituric acid) trimethine oxonol

(DiSBAC2(3) Molecular Probes, Eugene, OR) est un fluorochrome hydrophobe anionique avec

les longueurs d’ondes d’excitation et d’émission de 546 nm et 580 nm respectivement (Figure

36). L’oxonol est sensible aux variations du potentiel de membrane. En présence des cellules

dépolarisées, la sonde traverse leur membrane et se lie aux protéines membranaires

intracellulaires. Ainsi, l’accumulation d’oxonol dans la cellule au cours de sa dépolarisation se

traduit par une augmentation de la fluorescence émise. A l’inverse, la diminution de la quantité

d’oxonol dans la cellule lors de l’hyperpolarisation provoque une diminution de la fluorescence

émise. Il est donc possible d’explorer l’état d’activation d’un canal ionique en suivant les

changements du potentiel de membrane cellulaire, induits par le mouvement des ions du canal

étudié. Dans le cas du canal CFTR, une augmentation de la fluorescence suite à son activation

sera associée à une dépolarisation de la cellule, induite par la sortie d’ions chlorure par CFTR.

Ainsi, la quantité de fluorescence émise est proportionnelle à l’activité de CFTR.

Figure 36 : Structure de la sonde oxonol [DiSBAC2(3)].

2- Protocole

La mesure de fluorescence est effectuée à température ambiante à l’aide d’une station

de microscope inversé ZEISS Axio observer ZI, et l’acquisition des signaux et le traitement des

images est opéré grâce au module Physiology du logiciel Carl Zeiss AxioVision Release 4.8.2.

La technique est réalisée sur des cellules cultivées dans des boites à fond verre jusqu’à environ

100% de confluence selon le protocole suivant :

- Rincer les cellules 2 fois avec la solution de Krebs dépourvue de Cl- (Tableau 16).


96

Tableau 16 : Composition de la solution Krebs sans Cl-.

- Incuber les cellules pendant 20 minutes à température ambiante et à l’obscurité avec

250 nM d’oxonol, dilué dans la solution de Krebs dépourvue de Cl-.

- Déposer la boite de cellules sur le microscope et choisir une zone du tapis cellulaire =

zone de travail.

- Prendre une photo de la zone afin d’avoir une référence correspondante à l’intensité de

la fluorescence basale (F0) de chaque pixel de la zone.

- Sélectionner (grâce aux outils du logiciel) 10 à 12 cellules de cette zone afin de suivre

et d’enregistrer les variations de fluorescence de leur sonde avant et après ajout d’agents

pharmacologiques. Ici, il s’agit du cocktail activateur de CFTR (forskoline 10 µM +

génistéine 30 µM) et l’inhibiteur sélectif de CFTR (CFTRinh172).

- Appliquer une excitation par une lampe fluorescente à 546 nm toutes les 30 secondes

(durant 800 ms). À chaque exposition une photo F(t) est prise. Les variations de

fluorescence sont retransmises sous la forme intensité de fluorescence en fonction du

temps.

3- Analyse des résultats

Les résultats obtenus sont présentés en pourcentage de variation de fluorescence (Fx)

selon l’équation suivante : Fx = ([Ft – F0] / F0) x 100. Les Ft et F0 correspondent à l’intensité

de fluorescence au temps t et t0 respectivement (Figure 37).

0 2 4 6 8 10

-2

0

2

4

6

8

10

12

Activateur

Inhibiteur

Temps (min)

[(F

t-F

0)/

F0]*

10

0

Figure 37 : Exemple de représentation graphique de la fluorescence de la sonde oxonol.

Solution de Krebs dépourvue de Cl-

Na-gluconate 101 mM K-acetate 5 mM Ca-gluconate 2 mM Mg-acetate 2 mM Mannitol 50 mM Glucose 5 mM pH 7.4


97


Chambre de Ussing

1- Principe

La chambre de Ussing est une technique in vitro et ex vivo, qui permet d’étudier le

transport des électrolytes, des éléments nutritifs et de drogues à travers les tissus épithéliaux.

Elle représente donc un bon outil dans les domaines de physiologie et de pharmacologie. Son

principe repose sur la propriété d’étanchéité de l’épithélium, ainsi que sur la distribution

asymétrique des protéines de transport entre le côté apical et basolatéral des cellules. Le

mouvement d’ions se produisant au travers d’une membrane confère à la cellule une polarité

qui se traduit par la ddp (différence de potentiel). L’amplitude de courant électrique annulant

cette ddp (0 mV) appelé courant de court-circuit Isc (short circuit current) traduit donc le

mouvement d’ions se produisant au travers de l’épithélium étudié (Figure 38).

Figure 38 : Principe de la technique de chambre de Ussing.

2- Préparation des cellules

L’expérimentation est réalisée sur des cellules cultivées sur des inserts de type

Transwell 6 puits (Transwell® permeable Supports, Corning). Chaque insert est formé d’une

membrane microporeuse sur laquelle les cellules vont pouvoir se multiplier pour atteindre la

confluence et former une monocouche de cellules, délimitant un pôle apical et un pôle basal «

pseudo-épithélium ». Grâce à la configuration suspendue des inserts, il est possible de cultiver

les cellules en interface air/liquide (coté apical des cellules en contact de l’air environnant, et

coté basal en contact du milieu du puits) permettant ainsi de reproduire l’épithélium bronchique.


98

L’intégrité de l’épithélium peut être vérifiée en mesurant la résistance électrique transépithéliale

(Rte). En effet, la Rte augmente avec le temps de la culture jusqu’à atteindre un maximum, puis

commence à décroitre.

Dans notre étude, les cellules sont ensemencées à raison de 500 000 cellules/insert et sont

cultivées en condition air/liquide jusqu’à avoir une résistance de 500 Ω/cm² (environ 10 jours

de culture). Les inserts utilisés sont formés d’une membrane en polycarbonate de 12 mm et

constituée de pore de 0.4 μm (Corning Costar Snapwell™, Sigma). La faible taille des pores

permet d’éviter la colonisation de la face basale de la membrane par les cellules.

3- Système expérimental et protocole utilisé dans le laboratoire

Le système utilisé dans notre laboratoire (Easymount, EM-CSYS-6, Physiologic

Instruments) est composé de 6 chambres en plexiglas constituées chacunes de deux hémi-

chambres indépendantes. Chaque insert contenant la culture cellulaire est monté entre deux

hémi-chambres qui peuvent contenir la même solution expérimentale ou deux solutions

différentes. Afin de garder les tissus étudiés en conditions physiologiques tout au long des

expérimentations, le système est relié à un bain-marie, qui permet de maintenir les solutions

des hémi-chambres à 37°C. Il est également relié à une bouteille de gaz contenant un mélange

de 95% d’O2 et 5% de CO2, afin de créer un système de bullage qui sert à l’oxygénation des

tissus et à la circulation des solutions.

Les paramètres électriques du tissu sont déterminés grâce à deux couples d’électrodes

(constituées d’agar 4% et KCl 3M) situées chacun de part et d’autre de l’insert : (i) le couple

d’électrodes de voltage, placé au plus près de l’insert, permet de mesurer la différence de

potentiel (ddp) du tissu en cours d’étude et (ii) le couple d’électrodes de courant, placé plus loin

de l’insert, permet de déterminer le courant de court-circuit Isc. La technique de « voltage clamp

» a été utilisée afin de déterminer ce courant Isc. Le tissu est « court-circuité » par l’injection

d’un courant imposant une ddp de 0 mV au tissu. La valeur de ce courant correspond au courant

de court-circuit (Figure 39).


99

Figure 39 : Chambre de Ussing.

Les électrodes sont reliées à un préamplificateur, lui-même relié au VCC MC2 (multichannel

voltage-current clamp, Physiologic Instruments), un système composé d’un amplificateur, un

millivoltmètre, un générateur de courant et un microampèremètre. L’amplificateur est relié à

son tour à un ordinateur par le biais d’une interface d'acquisition de données (DI-720-P,

Physiologic Instruments) permettant de transformer les informations électriques ou analogique

reçues de l’amplificateur en données numériques enregistrées grâce au logiciel “Acquire &

Analyse 2.3”.

4- Protocole

- Equilibrer les électrodes :

o Monter un insert vide sans cellules entre les deux hémi-chambres remplies de la

solution apicale et basale (Tableau 17).

Solution de Krebs « normale »

NaCl 107 mM KCl 5 mM CaCl2 1.2 mM MgSO4 1.2 mM NaH2PO4 0.2 mM Na2HPO4 1.8 mM NaHCO3 25 mM Glucose 12 mM pH 7.4

Tableau 17 : Composition de la solution de Krebs « normale ».

o Clamper les cellules pour leur imposer une ddp de 0 mV, puis retirer l’insert.


100

- Monter l’insert contenant les cellules polarisées et attendre quelques minutes pour que

les échanges et donc le courant de court-circuit basal soit stable.

- Injecter un courant d’une valeur déterminée et non nulle (ici, +2 mV) afin de déterminer

la résistance transépithéliale (Rte) du tissus, grâce à l’équation d’Ohm :

Rte(Ω)=ΔU(mV)/ΔIsc(µA).

- Clamper les cellules afin de maintenir une ddp de 0 mV et commencer l’enregistrement

des courants résultants avant et après ajout d’agents pharmacologiques. Ici, il s’agit du

cocktail activateur de CFTR (forskoline 10 µM + génistéine 30 µM) et l’inhibiteur

sélectif de CFTR (CFTRinh172).

Résultats

101

Résultats I. Les protéines EDEMs comme cibles thérapeutiques dans la

mucoviscidose

A. Contexte

Le contrôle qualité du RE, ERQC, joue un rôle majeur dans l’adressage défectueux de

la protéine mutée F508del-CFTR. Ce processus est devenu la cible de plusieurs études ayant

pour objectif l’identification de correcteurs capables de rétablir l’expression membranaire de

cette protéine mutée. Notre équipe a par exemple démontré que l’inhibition de l’interaction de

F508del-CFTR avec la lectine calnexine restaure son expression membranaire (Norez et al.,

2006b, 2006a, 2009). Suite à ces résultats, nous avons voulu savoir si la modulation d’autres

acteurs de l’ERQC pouvait en faire de même. Dans cette nouvelle étude, nous nous sommes

donc intéressés à la famille des protéines EDEM, jouant un rôle majeur dans la voie de

dégradation ERAD des protéines mal/non-repliées. En effet, EDEM1 a été détectée dans des

complexes protéiques à la fois du WT- et du F508del-CFTR chez les mammifères (Farinha and

Amaral, 2005). Cette protéine a également été identifiée comme étant impliquée dans la

dégradation de la protéine WT-CFTR dans la levure Saccharomyces cerevisiae (Gnann et al.,

2004). Concernant les protéines EDEM2 et EDEM3, leur éventuel lien avec la dégradation de

CFTR, WT ou F508del n’a à ce jour pas été exploré. L’objectif de notre étude était donc de

déterminer si les 3 protéines EDEMs sont impliquées dans la rétention de F508del-CFTR et si

c’est le cas, d’identifier une stratégie pharmacologique qui permettrait de rétablir l’expression

membranaire du canal CFTR en ciblant ces protéines.

B. Résultats

1) Article

Rescue of Cystic Fibrosis and Sarcoglycan Mutations by Inhibition of ER

degradation, enhancing -mannosidase-like proteins EDEM.

K.Sidelarbi, A.Joosten, C.Patissier, J.Bertrand, F.Stauffert, A.Bodlenner, I.Richard, P.Compain,

F.Becq & C.Norez

Résultats

102

Role of the inhibition of ER degradation enhancing -mannosidase-like proteins EDEM in CFTR rescue

K.Sidelarbi1, A.Joosten2, J.Bertrand1, F.Stauffert2, A.Bodlenner2, P.Compain2, F.Becq1 & C.Norez1

1Laboratoire de Signalisation et Transports Ioniques Membranaires, Université de Poitiers, CNRS,

Poitiers, France 2Laboratoire de Synthèse Organique et Molécules Bioactives, CNRS, Université de Strasbourg,

Strasbourg, France

Résultats

103

ABSTRACT

Numerous genetic diseases are directly associated with the recognition of misfolded

proteins by the Endoplasmic Reticulum Quality Control (ERQC), leading to their retention in

the ER and subsequently their retrotranslocation to the cytosol for degradation. In the case of

mutated glycoproteins such as F508del-CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance

Regulator), causing CF pathology, mannose trimming is a key step of this process. It has been

proposed that EDEM family proteins (EDEM1, EDEM2, and EDEM3) play a key role in this

process. Thus, we investigated their involvement in F508del-CFTR trafficking defect using

siRNA strategy. We showed that the knockdown of EDEM1 or EDEM2 restores F508del-

CFTR chloride activity in CF cells, which highlight these proteins as potential pharmacological

targets to correct the F508del-CFTR trafficking defect. Hence, we tested multivalent

derivatives, based mainly on Deoxymannojirimycin (DMJ), an inhibitor of α-mannosidases I

and revealed their better corrective effect on F508del-CFTR. Interestingly, we confirmed the

corrector effect of the most effective derivative on human respiratory epithelial cells freshly

isolated from CF patients and identified its mechanism of action. In conclusion, this study

highlights EDEM proteins as potential pharmacological targets to develop correctors for the

F508del-CFTR trafficking defect. We propose the DMJ series, water soluble and non-toxic as

correctors of F508del-CFTR.

Keywords: F508del-CFTR, endoplasmic reticulum quality control, mannosidase activity,

EDEM.

Résultats

104

INTRODUCTION

The proteins ER degradation, enhancing α mannosidase-like (EDEM), comprising

EDEM1, EDEM2 and EDEM3 are lectins belonging to the glycosyl hydrolase 47 (GH47)

family that also includes ER α 1,2-mannosidase I and the Golgi α 1,2-mannosidases (Olivari

and Molinari, 2007). Overexpression of EDEM1, EDEM2 or EDEM3 in mammalian cells was

shown to accelerate ER-Associated Degradation (ERAD) of misfolded glycoproteins, whereas,

kifunensine and 1-deoxymannojirimycin (DMJ), two inhibitors of α-mannosidase activity

stabilize them (Zhou et al., 2015). In addition, it has been proposed that EDEM1 binds to the

adapter protein SEL1L through its mannosidase-like domain for delivering aberrant proteins to

the ER membrane ubiquitin-ligase complex HRD1-SEL1. Comparing to this interaction,

EDEM2 seems to bind more strongly to SEL1L, whereas EDEM3-SEL1L binding was found

to be very weak. On the other hand, studies revealed that the three variants EDEM1, EDEM2

and EDEM3, initially considered as lectins, can also function as mannosidases and molecular

chaperones (Frenkel et al., 2003; Hirao et al., 2006; Olivari et al., 2006; Banerjee et al., 2007;

Quan et al., 2008; Cormier et al., 2009; Hosokawa et al., 2010; Gauss et al., 2011; Ninagawa et

al., 2014; Jang et al., 2015). EDEMs recognize different classes of substrates (Slominska-

Wojewodzka and Sandvig, 2015). In the case of F508del-CFTR degradation process, Gnanns

and collaborators observed a disturbance in yeast cells deleted from Htm1p lectin, an orthologue

of mammalian EDEM. This defect was complemented by the expression of EDEM, suggesting

that both Htm1p or EDEM are important in the recognition and degradation process of F508del-

CFTR (Gnann et al., 2004). In addition, EDEM was detected in complexes of both WT and

F508del-CFTR in mammalian cells (Farinha and Amaral, 2005). However, the implication of

the three variants of EDEM in F508del-CFTR degradation has still not been described.

Cystic fibrosis (CF) is an autosomal recessive genetic disease caused by mutations in

the gene encoding for the CFTR (CF Transmembrane conductance Regulator), a cAMP-

dependent chloride channel that regulates salt and fluid transports at the apical membrane of

epithelial cells (Riordan, 1993). The most common mutation, found in ~90% of CF patients and

responsible of the severe form of the disease is the deletion of a phenylalanine at position 508

(F508del) (Riordan et al., 1989). This mutation disrupts CFTR folding that remains retained in

the ER resulting in an absence of CFTR channels at the plasma membrane (Du et al., 2005).

Consequently, it results a disruption of ions transport through the cell membrane, depletion of

airway surface liquid, impaired clearance of mucus and bacterial infections in lungs. F508del-

CFTR mutant is recognized as aberrant product by the ER Quality Control (ERQC), which

Résultats

105

delivers it to the proteasomal degradation via a series of event collectively called ER-Associated

Degradation (ERAD) (Ward et al., 1995).

Here, we investigated the role of EDEM in the trafficking defect of F508del-CFTR in

mammalian cells using pharmacological and silencing strategies. We identified by click

chemistry methodology, new iminosugars, multivalent derivative of the DMJ able to rescue

F508del-CFTR mutation.

MATERIALS AND METHODS

Cell culture. Stably transfected Hela cell lines expressing wild-type CFTR (spTCF-wt) or

F508del-CFTR (spTCF-ΔF) were grown in Dulbecco's modified Eagle's medium

(DMEM)+Glutamax supplemented with 10% of fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin,

100 µg/ml streptomycin and 125 mg/ml Zeocine (all from Invitrogen). Human bronchial

epithelial cell lines CFBE41O- were cultured in minimum essential medium Eagle (MEM,

Lonza) containing 10% FBS (Lonza), 2 mM L-glutamine (Gibco) and 5 µg/ml plasmocyne

(Invitrogen). CF human lung tissues were obtained from 2 patients homozygotes for F508del

mutation (the study was approved by our local institutional ethics committee). Following

lobectomy, lung tissues were quickly dissected. Bronchial tubes were removed from connective

tissues, washed three times in PBS (Phosphate Buffered Saline) and then opened along the

length. Epithelium was mechanically dissociated by scraping and then recovered by

centrifugation at 2000 rpm for 5 min. After resuspension in 1 ml of culture medium [Dulbecco’s

modified Eagle medium/HAM-F12, insulin 5 µg/ml, transferrin 7.5 µg/ml, hydrocortisone

10- 6 M, endothelial cell growth supplement 2 µg/ml, epithelial growth factor 25 ng/ml, T3

3.10- 5 M, l-glutamine 200 mM and penicillin + streptomycin 100 µg/ml], dissociated ciliated

epithelial cells were plated onto dishes for 4 hours before experiments. Cells were maintained

at 37°C in a humidified incubator with 5% CO2.

Gene silencing. Small Interfering RNA (siRNA) transfection was performed for 48 hours

according to the manufacturer’s instructions, on cells at 60-70% of confluence. All siRNAs

used in this study were purchased from Santa Cruz Biotechnology: EDEM1 siRNA (sc-43745),

EDEM2 siRNA (sc-77226), EDEM3 siRNA (sc-78683) and control siRNA (sc-37007).

Western blot. Cells were washed with PBS then mechanically harvested in 100 µl of lysis

buffer [10 mM Tris-HCl, 0.5% sodium deoxycholate, 1% Nonidet P-40, 1 mM Pefabloc SC,

pH 7.5, supplemented with protease inhibitor cocktail from Roche]. After incubation on ice for

Résultats

106

30 min, lysates were centrifuged for 5 min at 16,500 g and 4°C. Clarified lysates were recovered

and total proteins were denatured at: 37°C for 1 hour in Laemmli sample buffer 2X [125 mM

Tris-HCl, 4,5% SDS, 30% glycerol, 0.002% bromophenol blue and 5% α-monothioglycerol],

for CFTR protein immunoblotting; or 95°C for 5 min in Laemmli 5X (DGel Sciences) for the

detection of the other proteins studied. 50 µg of total protein extract was then separated in 10%

SDS-PAGE gel (5% for CFTR) and then transferred onto nitrocellulose membrane at 4°C for

1 hour. After saturation with PBS containing 0.1% Tween20 and 5% skimmed milk powder,

membranes were incubated overnight at 4°C with primary antibodies: mouse anti-human CFTR

(MAB3480, 1/1000, Merck Millipore), mouse anti-Na+/K+-ATPase α1 subunit (1/1000), goat

anti-EDEM1 (1/1000), rabbit anti-EDEM2 (1/2000), goat anti-EDEM3 (1/10000), rabbit anti-

VIP36 (1/1000), rabbit anti-ERGIC-53 (1/10000) (Santa Cruz Biotechnology) or mouse anti-

β-actin (1/5000, Sigma-Aldrich). The membrane was then incubated at 4°C for 1 hour with

corresponding horseradish peroxidase conjugated secondary antibodies: anti-mouse, anti-rabbit

(1/10000, Sigma-Aldrich) or anti-goat (1/10000, Santa Cruz Biotechnology). After washing

with PBS, bands antibodies were visualized by chemiluminescence using ECL western blotting

detection reagent (GE Healthcare, UK), and then quantified by densitometry using Photoshop

software.

Cell surface biotinylation. Cells were washed with PBS and then incubated for 30 min at

4°C with sulfo-NHS-SS-biotin diluted at 0.5 mg/ml in PBS. Cells were then rinsed two times

with quenching solution and then harvested in 300 µl of lysis buffer. After 30 min of incubation

on ice, lysates were centrifuged at 16,500 g for 5 min at 4°C. Clarified lysate was recovered

and total proteins concentration was determined using the BCA (bicinchoninic acid) assay

(Pierce Biotechnology). Biotinylated proteins were added in the column containing

NeutrAvidin Agarose beads (100 µg of protein for 15 µl of NeutrAvidin Agarose), pre-

equilibrated with the wash buffer as indicated in manufacturer’s instructions. After an

incubation for 1 hour at room temperature on a rotator, column was centrifuged for 1 min at

1000 g to remove the supernatant and to keep only the biotinylated proteins attached to the

beads. Beads were then washed four times with wash buffer containing protease inhibitor

cocktail. Biotinylated proteins were eluted from the beads with an incubation for 1 hour at 37°C

in the presence of Laemmli sample buffer 2X (15 µl for 100 µg of proteins added to column).

Biotinylated CFTR was then analyzed by western blot.

Immunofluorescence staining. Cells cultured on coverslips were washed with TBS (Tris

Buffered Saline) [157 mM NaCl, 20 mM Tris Base, pH 7.4] then fixed for 5 min at -20°C with

Résultats

107

cold methanol. The plasma membrane was permeabilized for 10 min with triton diluted at 0.1%

in TBS, and non-specific binding sites were blocked for 1 hour at 4°C with TBS containing

0.5% of bovine serum albumin (BSA) and 0.05% of saponine. Cells were then incubated

overnight at 4°C with primary antibodies: Goat anti-EDEM1, Rabbit anti-EDEM2, Goat anti-

EDEM3, Mouse anti calnexin (1/50, Santa Cruz Biotechnology), Rabbit anti calnexin (1/50,

Enzo Life Sciences). After washing with TBS, cells were incubated for 1 hour with secondary

antibodies: Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555, Donkey

anti-Goat Alexa Fluor 647 or Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 647 (1/50, Thermo Fisher

Scientific). Coverslips were finally mounted on slides using a mounting medium with DAPI to

label nuclei. Fluorescence was examined using a spectral confocal station FV1000 installed on

an inverted microscope CV100 IX-81 (Olympus, Tokyo, Japan) and data acquisition was made

with FV10-ASW 3.0 software.

Proximity Ligation Assay (PLA). The proximity ligation assay was used to detect proteins

interactions: PLA probe anti-mouse PLUS (DUO92001), PLA probe anti-rabbit MINUS

(DUO92005), PLA probe anti-goat MINUS (DUO92006) and detection reagents ORANGE

(DUO92007). Cells cultured on coverslips were fixed for 20 min with TBS-0.3%

paraformaldehyde, permeabilized for 10 min with TBS-0.1% triton and then saturated with

TBS-0.5% BSA-0.05% saponine. Cells were incubated overnight at 4°C with primary specific

antibodies: mouse anti-human CFTR (MAB25031, R&D Systems) at 1/100 with goat anti-

EDEM1 (1/200), rabbit anti-EDEM2 (1/500), goat anti-EDEM3 (1/10000) (Santa Cruz

Biotechnology), Rabbit anti-Hsp70 (1/300), Rabbit anti-Hsp90 (1/300) or Rabbit anti-Calnexin

(1/300) (Enzo Life Sciences); or mouse anti-human CFTR (MAB25031, R&D Systems) at

1/500 with Rabbit anti-VIP36 (1/500) or Rabbit anti-ERGIC53 (1/1000) (Santa Cruz

Biotechnology). After three washes with the blocking solution, cells were incubated for 1 hour

at 37°C in a pre-heated humidity chamber with a PLA mixture (PLA probes PLUS detecting

mouse and PLA probes MINUS detecting rabbit or goat antibodies diluted beforehand at 1/5 in

the blocking solution for 20 min). After two times of washing for 5 min with a wash buffer A

[0.01 M Tris, 0.15 M NaCl and 0.05% Tween 20], samples were incubated for 30 min at 37°C

with a ligation solution consisting of Ligation stock and Ligase diluted in high purity water at

1/5 and 1/40 respectively. Cells were washed again with a wash buffer A and incubated for 100

min with a mixture of Amplification stock (1/5) and Polymerase (1/80) diluted in high purity

water. Samples were then washed two times for 10 min with 1X wash buffer B [0.2 M Tris and

0.1 M NaCl], one time for 1 min in 0.01X wash buffer B, and then, coverslips were mounted

Résultats

108

on slides using a mounting medium with DAPI to label nuclei. Samples were examined on a

spectral confocal station and quantification of fluorescent spots and nuclei number was done

with ImageJ software. Results were done as mean of spots number per nuclei.

Measurements of CFTR transport activity. CFTR-mediated flux was assayed by measuring

the rate of iodide (125I) efflux from cell population using a MultiPROBE IIex robotic liquid

handling system (Perkin Elmer Life Sciences) as previously described (Norez et al., 2004).

Time-dependent rates of 125I efflux of initial intracellular 125I lost during each time point was

calculated from: In(125It1/125It2)/(t1-t2), where 125It is the intracellular 125I at time t, and t1 and t2

successive time points. Curves were constructed by plotting rate of 125I versus time. All

comparisons were based on maximal values for the time-dependent rates (k peak rates, min-1)

excluding the points used to establish the baseline (k peak-k basal, min-1).

CFTR activity was measured by single-cell fluorescence imaging using the potential-sensitive

probe, bis-(1,3-diethylthiobarbituric acid) trimethine oxonol (DiSBAC2[3]; Molecular Probes,

Eugene, OR) as previously described (Norez et al., 2009). Briefly, cells were washed with free

Cl- krebs solution [101 mM Na gluconate, 5 mM K acetate, 2 mM Ca gluconate, 2 mM Mg

acetate, 50 mM Manitol, 5 mM Glucose, 5 mM Hepes-Tris, pH 7.4] and then labeled for 20

min with Bis-oxonol probe diluted at 250 nM in krebs. Fluorescence signal was recorded by

Zeiss Axio observer Z1 inverted microscope. Recordings were performed under Carl Zeiss

AxioVision Release 4.8.2 software, with physiology acquisition Module. Results are presented

as ([Ft−F0]/F0)×100, where Ft and F0 are, respectively, the fluorescent values at the time t and

F0 the fluorescence at the time of addition of CFTR activator.

We used Ussing chambers applied to polarized monolayers of CFBE41O- cells cultured at

air–liquid interface onto 12-mm-diameter Costar Snapwell cell culture inserts (Corning Costar,

Acton, MA; 3801). The apical bath solution contained (in mM) (107 K-gluconate, 4.5 KCl,

25 NaHCO3, 1 MgSO4, 1.8 Na2HPO4, 0.2 NaH2PO4, 5.75 Ca-gluconate, 12 D-glucose, pH 7.4)

and basolateral bath solution (in mM) (111.5 KCl, 25 NaHCO3, 1 MgSO4, 1.8 Na2HPO4, 0.2

NaH2PO4, 1.25 CaCl2, 12 D-glucose pH 7.4). Ussing chambers were connected to the

preamplifier head stage of an amplifier (Physiologic Instruments, USA). Data were collected

with the Acquire and Analyze package software (Physiologic Instruments, USA). CFTR-

dependent current (Isc) was stimulated by addition of the cocktail forskolin (10 µM) + genistein

(30 µM) (to both the apical and basolateral bath solutions for Ussing chamber) and inhibited

with CFTRinh-172 (10 µM) (Ma et al., 2002).

Résultats

109

Statistics. Results are expressed as means ± SEM. Data sets were compared using one-way

ANOVA or a Student’s t-test (Prism 5.0, GraphPad Software). All experiments were done at

least three times, and differences were considered statistically significant when p<0.05.

Chemicals. Forskolin and genistein were purchased from LC laboratories (Wobum, MA,

USA). VX-809 and VX-770 were obtained from Selleck Chemicals (Houston, TX, USA),

CFTRinh-172 from VWR International (Fontenay/bois, France) and all other chemicals from

Sigma-Aldrich.

Résultats

110

RESULTS

Expression of EDEM variants in cell model and their interaction with F508del-CFTR.

First, we investigated the expression and the localization of the three variants of EDEM

in our cell model, HeLa cell line stably transfected with F508del-CFTR. Using immunoblot

techniques, EDEM1 was detected at 69 kDa and 74 kDa, corresponding respectively to a

soluble- and membrane associated-forms (Fig. 1A up), EDEM2 and EDEM3 were detected

respectively at 70 kDa and 110 kDa (Fig. 1A middle and bottom). We applied then an

immunocytochemistry experiments to observe their subcellular distribution. Confocal

immunofluorescence of EDEM1 (green) showed a localization in punctate structures, which

overlap with the localization of the ER-marker, calnexin (red) (Fig. 1B up). No colocalization

of EDEM1 and calnexin could be observed in our cell model. This result is consistent with

previous studies demonstrating a localization of EDEM1 in vesicles and tubular structures

budding from the ER, called EDEMosomes (Zuber et al., 2007; Calì et al., 2008). Confocal

immunofluorescence of EDEM2 and EDEM3 also showed a localization in structures, which

were distinct from the calnexin and seem to be localized as for EDEM1, in ER-budding vesicles

(Fig. 1B middle and bottom).

EDEM variants play a central role in the recognition and sorting of misfolded proteins to ERAD

pathway (Slominska-Wojewodzka and Sandvig, 2015). In order to determine if these lectins

are involved in the degradation of F508del-CFTR, we examined their interactions using the In

Situ Proximity Ligation Assays. The results from these experiments show the presence of

EDEM1/, EDEM2/ and EDEM3/F508del-CFTR interactions (red spots) (Fig. 1C), suggesting

that these lectins seem to be involved in the trafficking defect of F508del-CFTR.

Résultats

111

FIGURE 1

Figure 1. The three variants EDEM1, EDEM2 and EDEM3 are expressed in Hela F508del-CFTR cell line and interact with F508del-CFTR. (A) The expression of EDEM variants: EDEM1 (up), EDEM2 (middle) and EDEM3 (bottom) in Hela F508del-CFTR cells was assessed by western blot analysis. Actin was used as a loading control. (B) Representative confocal immunofluorescence images of Hela F508del-CFTR cells co-stained with antibodies against an ER marker, the calnexin and EDEM1 (up), EDEM2 (middle) or EDEM3 (bottom) (C) Representative confocal images of proximity ligation assay showing interactions (red spots) between F508del-CFTR and EDEM1 (up), EDEM2 (middle) or EDEM3 (bottom). Nuclei were stained with Dapi (blue). Scale bars: 20 µm. Experiments were repeated more than three times.

Résultats

112

Are EDEM variants implicated in F508del-CFTR retention?

To investigate whether EDEM variants are involved in F508del-CFTR retention, we

used a siRNA strategy to decrease their protein expression level. First, we transfected our cell

model, Hela F508del-CFTR with EDEM1 siRNA and assessed the effect on F508del-CFTR

(Fig. 2). The results show that knockdown of EDEM1 protein level (by about 45%,

supplementary data 1) led to decreased F508del-CFTR/EDEM1 interaction by 34%, compared

to control siRNA condition (Fig. 2A and 2B). To assess the influence of this interaction

decrease on the processing of F508del-CFTR, we analyzed its maturation profile and channel

activity using respectively western-blot and iodide efflux assays. EDEM1 siRNA transfection

did not restore the mature form of CFTR (band C); however, it induced a chloride efflux

response to a cocktail of forskoline+genistein, two well-known activators of CFTR (Fig. 2C

and 2E). Thus, we postulate from our results that decreasing F508del-CFTR/EDEM1

interaction restores an immature but functional F508del-CFTR to the plasma membrane.

The same experiments were performed to investigate the effect of EDEM2 and EDEM3

siRNAs on F508del-CFTR. EDEM2 siRNA transfection decreased F508del-CFTR/EDEM2

interaction by 23%, concomitant with the decrease of EDEM2 protein expression (decrease of

40%, supplementary data 1). Whereas this decrease did not influence the glycosylation state of

F508del-CFTR (Fig 3C and 3D), it restored its chloride activity (Fig.3E and 3F), suggesting

that as for EDEM1, the decrease of EDEM2/F508del-CFTR interaction allows F508del-CFTR

to reach the cell surface in its immature form but functional. In the same way, the decrease of

EDEM3 protein expression level by siRNA (by 50%, supplementary data 1) decreased

F508del- CFTR/EDEM3 interaction by 25% (Fig. 4A and 4B). However, decreasing this

interaction had no effect, neither on F508del-CFTR maturation nor on its function (Fig. 4C and

4E).

All together, these results demonstrate that EDEM1 and EDEM2 are involved in the retention

of F508del-CFTR and highlight these lectins as potential pharmacological targets to develop

new classes of correctors for the F508del-CFTR retention.

Résultats

113

FIGURE 2

Figure 2. Impact of EDEM1 protein Knockdown on F508del-CFTR in HeLa F508del-CFTR cell line. (A) Representative confocal images of proximity ligation assay showing the effect of EDEM1 siRNA on F508del-CFTR/EDEM1 interaction (red dots). Nuclei were stained with Dapi (blue). Scale bars: 20 µm. (B) The histogram reports the quantification of dots/nuclei, representative of the amount of F508del-CFTR/EDEM1 interaction per cell. (C) Immunoblot analysis showing the effect of EDEM1 siRNA on F508del-CFTR protein, compared to control siRNA and untransfected conditions. Treatment with VX809 (10 µM for 24h) was used as a positive control. The α1 NaK-ATPase was used as a loading control. (D) Histogram reporting the relative quantification of [band-C/(band-B+band-C)]. (E) Representative traces of iodide efflux technique showing the effect of EDEM1 siRNA on F508del-CFTR activity. VX809 treatment (10 µM, 24 h) was used as a positive control. The cocktail Forskolin 10 µM + Genistein 30 µM was used to activate CFTR. (F) The histogram summarizes CFTR chloride activity for each condition. All results are presented as normalized of mean ±S.E.M. ns: no significant difference; *P<0.05; ***P<0.001. Experiments were performed 3 times.

Résultats

114

FIGURE 3


Résultats

115

FIGURE 4


Résultats

116

Effect of Deoxymannojirimycin and its multivalent derivatives on F508del-CFTR.

As decreasing EDEM1 or EDEM2 protein expression readdresses F508del-CFTR to the

plasma membrane, we sought subsequently to identify a pharmacological approach that targets

these proteins. It is known that the Deoxymannojirimycin (DMJ), a cell permeable iminosugar

is a potent noncompetitive inhibitor of mannosidase activity that target members of GH47

family including EDEM1, EDEM2, EDEM3, Golgi α1,2 mannosidases IA, IB, IC and ER α1,2

mannosidase I (Olivari and Molinari, 2007; Ninagawa et al., 2014). In a first step, using the

iodide efflux, we tested the DMJ on F508del-CFTR activity in our cell model. As shown in

Fig. 5B, the DMJ revealed a corrector effect on F508del-CFTR by a restoration of a cAMP-

activated chloride current in response to forskolin+genestein, with a half-maximal effective

concentration (EC50) of 139,7 µM. Next, with the challenge to obtain compounds that restores

F508del-CFTR activity more efficiently than the DMJ, we adapted the concept of multivalency,

reported as a powerful and simple concept to design and synthesis a potent class of molecules

(Compain et al., 2013). Thereby, based on the DMJ cluster (Fig. 5A(1)), four multivalent

iminosugars nontoxic and water soluble were synthesized: the monovalent-DMJ, corresponding

to the DMJ grafted to an alkyl spacer (length C6) (Fig. 5A(2)), the divalent-DMJ, corresponding

to two associated monovalent-DMJ (Fig. 5A(3)) and the trivalent- and tetravalent-DMJ,

corresponding respectively to three or four associated monovalent-DMJ (Fig. 5A(4) and (5)). We

assessed thereafter in our cell model the concentration-response effect of each DMJ-derivative

on F508del-CFTR. Experiments determined an EC50 in a multivalency-increasing order of

112 µM, 86 µM, 0.8 µM and 0.7 µM (Fig. 5B). With its EC50 140-fold more efficient than the

corresponding monovalent, it is evident that the trivalent-DMJ is the best potential corrector of

F508del-CFTR.

Résultats

117

FIGURE 5

Figure 5. Deoxymannojirimycin (DMJ) and its multivalent derivatives as correctors of F508del-CFTR. (A) Structure of multivalent derivatives of the DMJ compound (1) synthesized with a “click’chemistry” methodology: monovalent-DMJ (2), divalent-DMJ (3), trivalent-DMJ (4) and tetravalent-DMJ (5). (B) Concentration-response curves obtained with iodide efflux technique on Hela F508del-CFTR cells showing the half maximal effective concentration (EC50) of each compound. Data points report the normalization of the relative radioactivity collected for each condition.

Résultats

118

The trivalent-DMJ as a corrector of F508del-CFTR.

In the goal to confirm that, the trivalent-DMJ inhibits the interaction of EDEMs with

F508del-CFTR, we studied its effect in our cell model, Hela F508del-CFTR. Confocal images

showed that in cells treated with the trivalent-DMJ, EDEM1/, EDEM2/ and EDEM3/F508del-

CFTR interactions were decreased by 35%, 29% and 16% respectively (Fig. 6A, 6B and 6C).

Moreover, this treatment did not alter the expression level of any EDEM variant (supplementary

data 2), suggesting that the trivalent-DMJ targets the interaction of F508del-CFTR with

EDEMs. Next, we investigated the effect of our compound on the main chaperones of ERQC

and their interaction with F508del-CFTR. Any effect was observed neither on calnexin, Hsp70

or Hsp90 expression level nor on their interaction with F508del-CFTR (supplementary data 3).

Together, these results demonstrates that the trivalent-DMJ has an EDEM dependent

mechanism of action.

In order to confirm its corrector effect, the trivalent-DMJ was tested on F508del-CFTR rescue

using single-cell fluorescence imaging (oxonol probe) and western-blot techniques. In cells

treated with the trivalent-DMJ, the recorded fluorescence signal increased in response to

forskoline+genistein activator and then fully inhibited by CFTRinh-172, which selectively

inhibited the CFTR channel (Ma et al., 2002) (Fig. 6D). However, the trivalent-DMJ did not

restore the maturation (band C) of F508del-CFTR (Fig. 6E), suggesting that as for results

obtained with EDEM1 or EDEM2 siRNA, the trivalent-DMJ rescues F508del-CFTR to the cell

surface in its immature form.

Résultats

119

FIGURE 6

Figure 6. The trivalent-DMJ decreases the interaction of F508del-CFTR with EDEM variants and restores its function. HeLa F508del-CFTR cells were treated or not with the trivalent-DMJ (100 µM, 4h). (A) Representative proximity ligation assay images showing the effect of the trivalent-DMJ on F508del-CFTR/EDEM1 interaction (red dots). The corresponding histogram shows the quantification of dots/nuclei. The same experiment was also performed to investigate the effect of the trivalent-DMJ treatment on the interaction of F508del-CFTR with EDEM2 (B) or with EDEM3 (C). Nucleus were stained with Dapi (blue). Scale bars: 20 µm. (D) Representative time courses of relative CFTR-dependent fluorescence (Fx) of DiSBAC2 after CFTR stimulation with the cocktail forskoline 30 µM + genistein 10 µM on cells treated or not with the trivalent-DMJ. CFTR was inhibited using 10 µM of CFTRinh172. The histogram summarizes mean ± S.E.M of CFTR functionality. (E) Representative immunoblot analysis showing the effect of trivalent-DMJ on F508del-CFTR. Untreated and DMSO (0.1%) conditions were used as negatives controls and VX809 (10 µM, 24 h) was used as a positive control. The α1 Na,K-ATPase was used as a loading control. The histogram reports the quantification of the ratio [band-C/(band-B+band-C)], (3<n<8). All results are presented as mean ± S.E.M. ns: no significant difference; *P<0.05. ***P<0.001.

Résultats

120

The trivalent-DMJ restores F508del-CFTR to the plasma membrane in its immature

form.

In order to confirm that the trivalent-DMJ rescues F508del-CFTR retention, we

observed its effect on the interaction of F508del-CFTR with cargo receptor lectins: ERGIC53

(ER-Golgi Intermediate Compartment protein of 53 kDa) and VIP36 (Vesicular Integral

membrane Protein of 36 kDa). ERGIC-53, the most popular marker of ERGIC, is involved in

the ER export of glycoproteins (Appenzeller et al., 1999). VIP36, distributed to either the pre-

Golgi early secretory pathway or post-Golgi pathway, plays significant roles in vesicular

transport from the ER to the Golgi complex and also from the trans-Golgi network to the plasma

membrane (Satoh et al., 2007; Reiterer et al., 2010). Fig. 7A and 7C show that in cells treated

with the trivalent-DMJ, both F508del-CFTR/ERGIC53 and F508del-CFTR/VIP36 interactions

were significantly increased of about 1.7 times. In order to verify that this increase is not due

to the increase of the expression level of ERGIC53 and VIP36, we investigated the effect of the

trivalent-DMJ on these lectins. Immunoblot analysis showed that ERGIC53 or VIP36 were

equally expressed in untreated and treated cells (Fig.7B and 7D), suggesting that our corrector

did not alter their expression level. From these results, we suggest that the trivalent-DMJ

treatment leads to the exit of F508del-CFTR from the ER and to its transport to the Golgi

apparatus. Moreover, these observations made us to dismiss the hypothesis of F508del-CFTR

rescue via an unconventional secretory proteins pathway.

On the other hand, to further validate our hypothesis, rescue to the cell surface of an immature

F508del-CFTR under the trivalent-DMJ treatment, we performed the cell surface biotinylation

assay. Membrane proteins were biotinylated and then isolated from the cell lysate with

NeutrAvidin beads. F508del-CFTR biotinylated, and hence present at the cell surface was then

detected using immunoblot technique. As expected, no CFTR bands were observed in untreated

Hela F508del-CFTR cells, since this protein considered by the ERQC as misfolded protein

remains retained in the ER. However, once treated with the trivalent-DMJ, the core glycosylated

F508del-CFTR (band B) was detected, suggesting the presence of the immature form of

F508del-CFTR on plasma membranes of these cells. The experiment was also performed on

untreated Hela WT-CFTR cells, and as expected, only the complex glycosylated form of CFTR

(band C) was detected (Fig. 7E).

Based on all these observations, we confirm that the trivalent-DMJ restores an immature but

functional F508del-CFTR to the plasma membrane via a conventional secretory pathway.

Résultats

121

FIGURE 7

Figure 7. The trivalent-DMJ rescue F508del-CFTR in its immature form. HeLa F508del-CFTR cells were treated or not with the trivalent-DMJ (100 µM, 4h). (A,C) Representative proximity ligation assay images showing the effect of the trivalent-DMJ on the interaction of F508del-CFTR with ERGIC53 (A) or VIP36 (C) (red dots). Nucleus were stained with Dapi (blue). Scale bars: 20 µm. Histograms report the quantification of the amount of interactions. (B,D) Representative immunoblots analysis showing the effect of the trivalent DMJ on ERGIC53 (B) or VIP36 (D) protein expression. Actin was used as a loading control. Histograms report the quantification of ratio ERGIC53/actin or VIP36/actin density band. (E) Representative immunoblots analysis showing as indicated, the detection of CFTR and control proteins in total lysates and in biotinylated fractions treated or not with the trivalent-DMJ. Absence of the cytosolic protein ezrin in the biotinylated fraction confirms surface protein-specific labeling in each experiment. Absence of proteins detection in no-biotin condition confirms NeutrAvidin Agarose specificity. The α1 NaK-ATPase was used as a loading control. All experiments were repeated three times, except for (B) and (D) n=5.

Résultats

122

Effect of the Trivalent-DMJ on F508del-CFTR in CFBE cells.

In a second way, we confirmed the corrector effect of the trivalent-DMJ on F508del-

CFTR in more physiological cell models. First, we tested our corrector in polarized monolayers

of CFBE41o− cells, by measuring the short-circuit current on the Ussing chamber. Fig 8.A

shows that in cells treated with the trivalent-DMJ, the addition of forskoline+genistein induced

an increase of Isc current 20 µA.cm2. This signal was fully inhibited following the addition of

CFTRinh-172, reflecting the expression of F508del-CFTR channels on the plasma membrane of

treated cells. Interestingly, we tested the trivalent-DMJ on human bronchial epithelial cells

freshly isolated from CF patients, homozygotes for the mutation F508del, using single-cell

fluorescence imaging (oxonol probe). An increase of the recorded fluorescence signal was

observed following the addition of the cocktail forskoline+genestein only in cells treated with

the trivalent-DMJ. The signal was decreased and then fully inhibited in the presence of

CFTRinh-172 (Fig. 8C and D). These results confirm that the trivalent-DMJ correct the

trafficking defect of F508del-CFTR in CF cells.

Résultats

123

FIGURE 8

Figure 8. The trivalent-DMJ rescues F508del-CFTR in CFBE41o- cell line and freshly isolated human CF bronchial epithelial cells. (A) Representative short-circuit current (Isc) measured with the Ussing chamber technique showing transepithelial conductance responses to Fsk 10µM+Gst 30µM and CFTRinh-172 (0.1µM) in CFBE41o- cells treated or not with the trivalent-DMJ (100µM, 4h). (B) The histogram reports the Isc of each condition (n=2). (C) Typical time courses of relative CFTR-dependent fluorescence (Fx) of DiSBAC2 after CFTR activation with Fsk 10µM+Gst 30µM or inhibition with CFTRinh-172 (0.1µM) on freshly isolated human CF bronchial epithelial cells treated or not with the trivalent-DMJ (100µM, 4h). Data points reports the relative fluorescence collected for each condition. (D) The histogram summarizes mean ± S.E.M for each condition. All results are presented as mean ± S.E.M. ns: no significant difference; *P<0.05; ***P<0.001.

Résultats

124

DISCUSSION

Our study highlights a role for inhibition of EDEM affecting the trafficking defect of

F508del-CFTR in CF cells and proposes water soluble and nontoxic mannosidase inhibitors as

potential candidates to rescue F508del-CFTR. We showed, using siRNA strategy, that

decreasing the interaction of F508del-CFTR with endogenous EDEM1 or EDEM2 but not with

EDEM3 might restores a functional F508del-CFTR, but as the core glycosylated form

(immature form, band B). In the Yeast model, among the three EDEMs, only EDEM1 was

shown playing a role in the degradation process of F508del-CFTR. Our study is thus the first

showing the involvement of EDEM1 and EDEM2 in F508del-CFTR retention in mammalian

cells. Concerning the EDEM3 siRNA transfection, several hypothesis can be formulated for the

absence of a corrector effect on F508del-CFTR: (i) the loss/decrease of EDEM3 function is

compensated by other EDEMs, (ii) F508del-CFTR has already been engaged in tardive steps

of ERAD pathway, (iii) the decrease level of F508del-CFTR/EDEM3 interaction is not

sufficient to restore F508del-CFTR or (iv) EDEM3 is not involved in the retention of F508del-

CFTR. Further studies on EDEM3 knockout (KO) cells would be needed to answer these

questions. Therefore, our observations suggested EDEM1 and/or EDEM2 as new potential

pharmacological targets to further develop correctors to rescue F508del-CFTR.

In a second part of our study, we focused on the identification of a pharmacological

approach that could targets these lectins to rescue F508del-CFTR to the cell surface. Because

all endogenous EDEMs have a mannosidase activity, we tested DMJ, a general inhibitor of α-

mannosidases and shown its corrector effect on F508del-CFTR. However, this result is not

consistent with that observed by Chang and collaborators, which reported that the inhibition of

EDEM with the DMJ or kifunensine does not rescue F508del-CFTR to the cell surface (Chang

et al., 2008). However, the authors used cells transiently expressing HA-tagged EDEM, and

performed treatments of 20 hours with DMJ, whereas we used endogenous EDEM expressing

cells and 4h treatment with DMJ. Secondly, in order to obtain more efficient correctors of

F508del-CFTR, we synthesized using multivalency (Compain et al., 2013) from the DMJ

clusters, four multivalent derivatives, and showed the best efficiency obtained with the

trivalent-DMJ compound. Trivalent-DMJ decreased the interaction of F508del-CFTR with

EDEM1, EDEM2 and EDEM3 and had no effect on the interaction of F508del-CFTR with the

main chaperones of the ERQC, such as Hsp70, Hsp90 and calnexin, confirming an EDEM-

dependent mechanism of action. Then, we tested our compound on F508del-CFTR to confirm

its corrector effect and showed that treatment of our cell model does not restore the complex

glycosylation form of F508del-CFTR. However, despite the absence of the maturation, using

Résultats

125

oxonol fluorescence, we recorded CFTR-dependent rescue, suggesting a plasma membrane

expression of F508del-CFTR. Therefore, either (i) the trivalent-DMJ is a derivative of the DMJ,

an inhibitor of ER-mannosidases but also of Golgi-mannosidases, which are involved in the

maturation process of glycoproteins (their inhibition block the F508del-CFTR maturation but

not its traffic to the cell surface) or (ii) corrected F508del-CFTR is delivered to the cell surface

via an unconventional secretion pathway. Indeed, it has been reported that F508del-CFTR

surface expression can be rescued in vitro and in vivo by directing it to an unconventional

GRASP-dependent secretion pathway (Gee et al., 2011). Therefore, we investigated the exit of

F508del-CFTR following treatment with the trivalent-DMJ. Interestingly, we found that the

trivalent-DMJ increased the interaction of F508del-CFTR with the cargo receptor lectins

ERGIC53 and VIP36, indicating the exit of F508del-CFTR from the ER, and the rescue of

F508del-CFTR via the conventional pathway. To further confirm that Trivalent-DMJ restores

an immature F508del-CFTR to the cell surface, we observed the glycosylation status of surface

CFTR using a Biotinylation assay. Only the core glycosylated form, corresponding to the

surface-immature F508del-CFTR was observed in cells treated with Trivalent-DMJ.

Interestingly, this result is consistent with that of Morris and collaborators, obtained in both

polarized and unpolarized HT-29 cells showing that treatment of WT-CFTR with the DMJ

reduced the molecular mass of its mature form (170 kDa) by 30 kDa without altering its

transepithelial Cl- current and conductance (Morris et al., 1993). The lack of the complex

glycosylated form (mature form, band C) is without effect on F508del-CFTR. The

glycosylation status of endogenous CFTR does not affect its function (Chang et al., 2008) since

unglycosylated CFTR functions as a chloride channel using membrane vesicles prepared from

stably transfected BHK cells (Chang et al., 2008). However, using similar methods, Chang et

al. also shown that unglycosylated F508del cannot escape ER quality control. Moreover, it was

also shown that the inhibition of EDEM interaction with F508del cannot rescue F508del but

after 20h-treatment with DMJ, kifunensine or tunicamycine (Chang et al., 2008).

Finally, we confirmed the corrector effect of the trivalent-DMJ on human polarized bronchial

epithelial cells (CFBE) using the Ussing Chamber technique and more interestingly, we

confirmed its corrector effect on human respiratory epithelial cells freshly isolated from two

different CF patients using the fluorescent probe oxonol.

In conclusion, we showed that both EDEM1 and EDEM2 are involved in F508del-

CFTR retention and propose them as targets for therapeutically approach in CF. We identified

that the trivalent-DMJ partially restores the trafficking defect of F508del-CFTR as core

Résultats

126

glycosylated immature band B form with an EDEM-dependent mechanism of action and we

propose a new series of water soluble and non-toxic correctors.

ACKNOWLEDGMENTS

We thank association “Vaincre La Mucoviscidose” for their support.

Résultats

127

Supplementary data 1

Supplementary data 1. Knockdown of EDEM1, EDEM2 and EDEM3 proteins with specific siRNAs. (A) Up: Knockdown of EDEM1 by specific siRNA transfection on F508del-CFTR cells. Actin was used as a loading control. Down: Histogram showing the quantification of EDEM1 protein extinction compared to control siRNA. The same experiment was performed to verify EDEM2 (B) or EDEM3 (C) protein extinction by their specific siRNA. All results are presented as mean ± S.E.M. ns: no significant difference; *P<0.05.

Résultats

128


Supplementary data 2. Effect of the trivalent-DMJ on EDEM1, EDEM2 and EDEM3 proteins expression. (A) Representative immunoblot analysis showing EDEM1 protein expression in Hela F508del-CFTR cells treated or not the trivalent-DMJ (100 µM, 4h). Actin was used as a loading control. Corresponding histogram shows the quantification of ratio EDEM1/actin density band. The same experiment was performed to investigate the effect of the trivalent-DMJ treatment on EDEM2 (B) or EDEM3 (C) protein expression. All results are presented as mean ± S.E.M. ns: no significant difference.

Résultats

129


Supplementary data 3. Effect of the trivalent-DMJ on the main chaperones of ERQC. Hela F508del-CFTR cells were treated or not with the trivalent-DMJ (100µM, 4h) (A) Representative proximity ligation assay images showing the effect of the trivalent-DMJ on F508del-CFTR/Calnexin interaction (red dots). Nucleus were stained with Dapi (blue). Scale bars: 20 µm. The histogram reports the quantification of dots/nuclei, representative of F508del-CFTR/calnexin interaction per cell. The same experiment was performed to investigate the effect of the trivalent-DMJ on the interaction of F508del-CFTR with HSP70 (C) or HSP90 (E). (B) Representative immunoblot analysis showing the effect of the trivalent DMJ on calnexin protein expression. Actin was used as a loading control. The corresponding histogram reports the quantification of ratio calnexin/actin density band. The same experiment was performed for the effect of the trivalent-DMJ on HSP70 (D) or HSP90 (F) protein expression. All results are presented as mean ± S.E.M. (n=3). ns: no significant difference.

Résultats

130

REFERENCES

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Résultats

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Résultats

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Résultats

133

2) Résultats complémentaires

Nos résultats présentés dans l’article suggèrent que le trivalent-DMJ restaure F508del-

CFTR à la membrane cellulaire en diminuant son interaction avec les protéines EDEMs. Afin

d’élucider d’avantage le mécanisme d’action de ce correcteur et son effet sur le stress du RE,

des expériences additionnelles ont été conduites.

a) Effet du trivalent-DMJ sur l’interaction de F508del-CFTR avec les principales

ubiquitines ligases RNF5/RMA1 et CHIP

Les protéines CHIP et RNF5 (connue aussi sous le nom de RMA1) sont deux ubiquitines

ligases identifiées comme étant impliquées dans l’ubiquitinylation du F508del-CFTR (Hohfeld

et al., 2001; Meacham et al., 2001b; Murata et al., 2003; Younger et al., 2004, 2006; Morito et

al., 2008) (Figure 40).

Figure 40 : Implication de RMA1/RNF5 et CHIP dans la dégradation de F508del-CFTR. (Modifié de Kim and Skach, 2012)

La protéine RNF5 détecte les défauts de repliement cytosolique de F508del-CFTR pendant la

traduction alors que la protéine CHIP agit de manière post-traductionnelle (Younger et al.,

2006). Afin d’explorer l’effet du trivalent-DMJ sur la dégradation du F508del-CFTR, nous

avons étudié son effet sur l’interaction du F508del-CFTR avec ces protéines. Pour cela, des

expérimentations préliminaires de proximity ligation assay ont été conduites sur des cellules

Hela F508del-CFTR traitées ou non avec le trivalent-DMJ. Les résultats obtenus sont présentés

dans la figure 41.

Résultats

134

A B

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

Inte

racti

on

F5

08

del-

CF

TR

/RN

F5

Figure 41 :Effet du trivalent-DMJ sur l’interaction de F508del-CFTR avec RNF5/RMA1 ou

CHIP. (A) Images représentatives de l’interaction (points rouges) de F508del-CFTR avec RNF5/RMA1 (en bas) ou CHIP (en haut) obtenues par la technique de Proximity Ligation Assay sur des cellules Hela F508del-CFTR traitées ou non avec 100 µM de trivalent-DMJ (4h, 37°C). Echelle : 20 µm. Bleu : noyau cellulaire (B) Histogramme reportant le nombre de points rouges par noyau, représentatif du nombre d’interactions par cellule. Les résultats sont présentés en moyenne +/- SEM normalisés par rapport à la condition NT (non traitée) (N = 2, n = 30).

Comme nous pouvons le voir, F508del interagit bien avec les protéines CHIP et RNF5/RMA1.

Une diminution du taux d’interaction entre F508del-CFTR et CHIP est observée après

traitement avec le trivalent-DMJ ; cependant, il apparait que cette diminution n’est pas

significative et des expériences supplémentaires pour augmenter le nombre d’échantillons

(nombre de N) doivent être réalisées pour conclure.

Concernant la protéine RNF5/RMA1, une augmentation d’environ 78% du nombre

d’interactions avec F508del-CFTR a été observée après traitement avec le trivalent-DMJ. Ce

résultat est surprenant car on s’attendait à avoir une diminution du taux d’interaction, dans la

mesure où des études avaient démontré que l’extinction de RNF5/RMA1 diminuait le

phénotype F508del-CFTR (Tomati et al., 2015). Notre composé semblerait donc favoriser

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Inte

racti

on

F5

08

del-

CF

TR

/CH

IP

NT Trivalent-DMJ

Interaction F508del-CFTR/CHIP

NT Trivalent-DMJ

Interaction F508del-CFTR/RNF5

Résultats

135

l’interaction de F508del-CFTR avec cette ligase, probablement en bloquant de manière directe

ou indirecte sa rétro-translocation.

En conclusion, le trivalent-DMJ ne semble pas perturber l’interaction de F508del-CFTR

avec CHIP, mais augmenterait son interaction avec RNF5/RMA1.

b) Effet du trivalent-DMJ sur le protéasome 20S

Nous avons étudié l’effet du trivalent-DMJ sur l’activité enzymatique du protéasome

20S, responsable de la dégradation de F508del-CFTR rétro-transloqué dans le cytosol par le

système ERAD.

i. Effet du trivalent-DMJ sur le protéasome 20S intracellulaire

Dans un premier temps, nous avons évalué l’effet du trivalent-DMJ sur l’activité

enzymatique du protéasome intracellulaire sur des cellules Hela F508del-CFTR. Les résultats

obtenus sont présentés dans la figure 42.

NT

Trivale

nt-DM

J

Lactac

ystin

Blanc d

e sub

strat

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 *****

RF

U d

'AM

C (

46

0 n

m)

Figure 42 : Effet du trivalent-DMJ sur l’activité du protéasome 20S intracellulaire. L’activité enzymatique du protéasome 20S est évaluée à l’aide du kit « 20S Proteasome Activity Assay kit » sur des cellules Hela F508del-CFTR traitées ou non avec le trivalent-DMJ (100 µM, 4h). Le traitement avec la Lactacystin est utilisé comme contrôle positif. La condition « blanc de substrat » correspond aux réactifs dans un puits vide (sans cellules). La fluorescence du substrat AMC libre est quantifiée à l’aide d’un couple de filtre 380/460 nm dans un lecteur de fluorescence, ici Mithras. Les résultats présentés sont les moyennes des triplicats de trois expérimentations indépendantes +/- SEM.

Résultats

136

Les résultats obtenus sont normalisés par rapport à la condition NT « non traité »,

considérée comme égale à 1 et le 0 ou « blanc de substrat » correspondant au réactif sans

cellules.

La Lactacystine, un métabolite de Streptomyces connue entre autres comme un inhibiteur

spécifique et irréversible du protéasome 20S (Fenteany et al., 1995; Tomoda and Omura, 2000)

a été utilisée comme contrôle positif inhibant l’activité du protéasome. Comme attendu, une

diminution d’environ 99% de la fluorescence du substrat AMC a été constatée dans les cellules

traitées avec ce composé, comparée aux cellules non traitées. Cette diminution de fluorescence

est en effet le résultat de la diminution du taux de clivage d’AMC et donc de l’activité du

protéasome intracellulaire.

Concernant les cellules traitées avec le trivalent-DMJ, une diminution de 37% de la

fluorescence d’AMC a été observée, comparée aux cellules non traitées. Cela suggère que notre

correcteur, connu comme un inhibiteur des α 1,2-mannosidases du RE, diminue l’activité

enzymatique intracellulaire du protéasome 20S. Cependant, s’agit-il d’une inhibition directe du

protéasome intracellulaire ou juste d’une conséquence de l’inhibition des α 1,2-mannosidases

du RE ? Un test du trivalent-DMJ sur l’activité enzymatique du protéasome 20S purifié est alors

apparu nécessaire afin de répondre à cette question.

ii. Effet du trivalent-DMJ sur le protéasome 20S purifié

Dans un deuxième temps, nous avons étudié l’effet du trivalent-DMJ sur l’activité

enzymatique du protéasome purifié afin de s’affranchir de l’effet de notre composé sur d’autres

cibles intracellulaires. La fluorescence du substrat AMC a alors été mesurée en présence du

protéasome 20S purifié (Merck millipore) traité ou non avec 100 µM du trivalent-DMJ pendant

4h à 37°C (condition des traitements cellulaires) ou pendant 15 min à température ambiante

(condition de traitement avec l’inhibiteur Lactacystin). Les résultats obtenus à l’aide du lecteur

Mithras (filtre 380/460 nm) sont présentés dans la figure 43.

Résultats

137

NT

Trivale

nt-DM

J

Lactac

ystin

Trivale

nt-DM

J san

s 20S

Blanc d

e sub

strat

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 *****

ns

*

RF

U d

'AM

C (

DO

460 n

m)

NT

Triv

alent-

DMJ

Lactac

ystin

e

Blanc d

e sub

strat

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0*

***

nsRF

U d

'AM

C (

DO

46

0 n

m)

Figure 43 : Effet du trivalent-DMJ sur l’activité du protéasome 20S purifié.

L’activité enzymatique du protéasome 20S est évaluée à l’aide du kit « 20S Proteasome Activity Assay kit ». Le protéasome 20S purifié est traité avec le trivalent-DMJ pendant 4h à 37°C (à gauche) ou 15 min à température ambiante (à droite). Le traitement avec la Lactacystine est utilisé comme contrôle positif. La condition « blanc de substrat » correspond aux réactifs sans le protéasome 20S. La fluorescence du substrat AMC est quantifiée dans un lecteur de fluorescence (380/460 nm). Les résultats présentés sont les moyennes des triplicats de trois expérimentations indépendantes +/- SEM.

Les résultats sont normalisés par rapport à la condition « non traité » (égal à 1) et « blanc de

substrat », correspondant aux réactifs sans le protéasome 20S (égal à 0).

Comme nous pouvons le voir, nous avons vérifié que le trivalent-DMJ seul ne présente aucun

effet sur la fluorescence du substrat AMC. Aucune différence significative n’a été observée

entre les conditions « blanc de substrat » et « trivalent-DMJ sans protéasome ».

Nous avons constaté une diminution d’environ 65% de la fluorescence d’AMC lorsque le

protéasome 20S est traité pendant 4h à 37°C avec notre composé. Cette diminution de

fluorescence témoignerait d’une inhibition directe du protéasome par le trivalent-DMJ. Ainsi,

afin de vérifier que cette inhibition n’est pas le résultat d’une exposition trop prolongée à 37°C

du protéasome avec notre molécule, nous avons testé le trivalent-DMJ dans les mêmes

conditions de traitement que la Lactacystin, utilisée comme contrôle positif. Comme nous

pouvons le voir, le traitement du protéasome 20S pendant 15 min à température ambiante

diminue aussi le taux de fluorescence d’AMC, confirmant que le trivalent-DMJ inhibe le

protéasome 20S de manière directe.

4 heures à 37°C 15 minutes à température ambiante

Résultats

138

En conclusion, ces résultats mettent en évidence que le trivalent-DMJ inhibe de manière

directe le protéasome 20S. Cependant, l’hypothèse d’une inhibition indirecte du protéasome

intracellulaire en parallèle de l’inhibition directe n’est pas exclue.

Nous nous sommes demandés suite à ces résultats, si l’augmentation de l’effet

correcteur du trivalent-DMJ sur F508del-CFTR était corrélée à l’augmentation de son effet

inhibiteur sur le protéasome. Pour cela, nous avons comparé l’effet inhibiteur du trivalent-DMJ

et de son monovalent sur le protéasome 20S purifié. La fluorescence de son substrat AMC a été

mesurée à l’aide du lecteur Mithras en utilisant un couple de filtre 380/460 nm (Figure 44).

NT

Mon

ovale

nt-DM

J

Trivale

nt-DM

J

Lactac

ystin

e

Blanc d

e sub

strat

Mon

ovale

nt-DM

J san

s 20S

Trivale

nt-DM

J san

s 20S

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

RF

U d

'AM

C (

DO

46

0 n

m)

NT

Mon

ovale

nt-DM

J

Trivale

nt-DM

J

Lactac

ystin

e

Blanc d

e sub

strat

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2R

FU

d'A

MC

(D

O460 n

m)

Figure 44 : Effet du DMJ et ses dérivés multivalent sur l’activité du protéasome 20S purifié.

L’activité enzymatique du protéasome 20S est évaluée à l’aide du kit « 20S Proteasome Activity Assay kit ». Le protéasome 20S purifié est traité avec le monovalent- ou le trivalent-DMJ pendant 4h à 37°C (à gauche) ou 15 min à température ambiante (à droite). Le traitement avec la Lactacystin est utilisé comme contrôle positif. La condition « blanc de substrat » correspond aux réactifs sans le protéasome 20S. La fluorescence du substrat AMC est quantifiée à l’aide d’un couple de filtre 380/460 nm dans un lecteur de fluorescence, ici Mithras. Les résultats présentés sont les moyennes des triplicats +/- SEM.

Les résultats sont normalisés par rapport aux conditions « non traité » (égal à 1) et « blanc de

substrat », correspondant aux réactifs sans le protéasome 20S (égal à 0).

4 heures à 37°C 15 minutes à température ambiante

Résultats

139

Nous avons vérifié que le monovalent- ou le trivalent-DMJ seul ne présente pas d’effet sur la

fluorescence du substrat AMC. Nous n’avons constaté aucune différence significative entre les

conditions « blanc de substrat » et « monovalent-DMJ sans protéasome » ou « trivalent-DMJ

sans protéasome ».

Nous avons détecté une diminution d’environ 40% de la fluorescence d’AMC lorsque le

protéasome 20S est traité pendant 4 heures à 37°C avec le monovalent- ou le trivalent-DMJ.

Aucune différence significative n’a été observée entre les effets inhibiteurs de ces deux

composés. Nous avons ainsi, testé ces 2 composés dans les mêmes conditions de traitement

que la Lactacystin, utilisée comme contrôle positif. Comme nous pouvons le voir, le traitement

du protéasome 20S pendant 15 min à température ambiante avec le monovalent-DMJ n’a révélé

aucun effet apparent avec la condition non traitée. Au contraire le traitement avec le trivalent-

DMJ diminue l’activité enzymatique du protéasome d’environ 30%. Ces résultats suggèrent

que le trivalent-DMJ pourrait inhiber l’activité enzymatique du protéasome 20S de manière

plus rapide que son monovalent.

En conclusion, ces résultats apporteraient une hypothèse expliquant pourquoi l’effet

correcteur sur F508del-CFTR du trivalent-DMJ est plus efficace que celui de son monovalent.

Il semblerait que la multivalence augmente l’efficacité de l’effet inhibiteur sur le protéasome

20S.

c) Effet du trivalent-DMJ sur la réponse au stress du RE : UPR

Il nous est apparu important de vérifier si le trivalent-DMJ déclenchait la réponse au

stress du RE, l’UPR. Nous avons alors mesuré son effet sur des protéines connues pour être

surexprimées lors d’une réponse UPR, à savoir : BiP/GRP78 et eIF2α phosphorylée (Harding

et al., 1999; Li et al., 2008; Wang et al., 2009; Nishitoh, 2012; Wang and Kaufman, 2014).

i. Effet de la tunicamycine sur l’expression protéique de BiP/GRP78 et eIF2α

Nous avons vérifié dans un premier temps, que le niveau d’expression des protéines

BiP/GP78 et eIF2α est augmenté dans notre modèle cellulaire Hela F508del-CFTR, en réponse

à un stress du RE. La tunicamycine, un antibiotique inhibiteur de la N-glycosylation des

protéines, est utilisée comme contrôle pour l’induction de stress du RE (Samali et al., 2010;

Bartoszewski et al., 2011; Chawla et al., 2011; Wang et al., 2015). Les cellules ont alors été

traitées ou non pendant 6 heures avec des concentrations croissantes de tunicamycine et

l’expression protéique de BiP/GRP78 et d’eIF2α a été testée par western blot (Figure 45).

Résultats

140

A

B

NT

1 µg/m

l

2,5 µ

g/ml

5 µg/m

l

7 µg/m

l

10 µ

g/ml

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

Tunicamycine

Rati

o P

ho

sph

o-e

IF2

/Act

ine

Figure 45 : Effet de la tunicamycine sur l’expression protéique de BiP/GRP78 et eif2α. (A) Western blot représentatif de l’expression protéique de BiP/GRP78 (à gauche) et eif2α (à droite) dans les cellules Hela F508del-CFTR traitées ou non avec de la tunicamycine à 1, 2.5, 5, 7 ou 10 µg/ml (6h, 37°C). L’actine est utilisée comme un contrôle de charge. (B) Histogramme reportant la quantification de la protéine BiP/GRP78 et eif2α dans les différentes conditions testées. Les résultats sont présentés en moyenne +/- SEM normalisés par rapport à la condition NT (non traitée) (N=2).

La protéine BiP/GRP78 a été détectée à environ 78 kDa. Comme nous pouvons le voir, aucune

différence significative du taux d’expression de la chaperonne BiP/GRP78 n’est observée entre

les cellules non traitées et celles traitées avec de la tunicamycine à 1 µg/ml pendant 6h. Au

contraire, avec des traitements à 2.5 µg/ml, 5 µg/ml, 7 µg/ml et 10 µg/ml, une différence

significative est apparue.

De même, une augmentation du taux d’expression d’eIF2α phosphorylée a été observée à partir

de 1 µg/ml, ce qui est en accord avec la littérature (Brambilla Pisoni et al., 2016).

Ces résultats montrent que les taux d’expression des protéines BiP/GRP78 et d’eIF2α

phosphorylée augmentent bien en réponse à un stress du RE dans les cellules Hela F508del-

CFTR, et que nous pouvons, en conséquence, considérer ces protéines comme des indicateurs

de l’état de nos cellules vis-à-vis du stress du RE.

NT

1 µg/m

l

2,5 µ

g/ml

5 µg/m

l

7 µg/m

l

10 µ

g/ml

0.00.20.4

0.60.81.0

1.21.4

1.6

Tunicamycine

Rati

o B

iP/A

ctin

e

BiP/GRP78 78 kDa

Actine

Tunicamycine

Actine

Tunicamycine

eIF2α-T 36 kDa

eIFα-P 38 kDa

Résultats

141

ii. Effet du trivalent-DMJ sur l’expression protéique de BiP/GRP78 et d’eIF2α

Dans un deuxième temps, nous avons regardé l’effet du trivalent-DMJ sur l’expression

de BiP/GRP78 et eIF2α phosphorylée afin d’examiner son effet sur le stress du RE. Les résultats


0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 ns

Rati

o B

iP/A

cti

ne

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Ra

tio

Ph

osp

ho

-eif

2 /A

ctin

e

Figure 46 : Effet du trivalent-DMJ sur l’expression de la protéine BiP/GRP78 et eIF2α. (A) Western blot représentatif de l’expression protéique de BiP/GRP78 (à gauche) et eIF2α (à droite) dans les cellules Hela F508del-CFTR traitées ou non avec le trivalent-DMJ (100 µM, 4h, 37°C). L’actine est utilisée comme un contrôle de charge. (B) Histogramme reportant la quantification de la protéine BiP/GRP78 et eIF2α dans les différentes conditions testées. Les résultats sont présentés en moyenne +/- SEM normalisés par rapport à la condition NT (non traitée) (N=5 pour BiP/GRP78 et N=2 pour eIF2α). ns : non significatif.

Aucune différence significative du taux d’expression de la protéine BiP/GRP78 ou d’eIF2α

phosphorylée n’a été détectée entre les cellules non traitées et celles traitées avec le trivalent-

DMJ. Ces résultats montrent que le trivalent-DMJ n’a aucun effet sur l’expression protéique de

BiP/GRP78 ni sur la phosphorylation d’eIF2α.

En conclusion, le trivalent-DMJ ne semble pas induire un stress du RE dans notre

modèle cellulaire.

BiP/GRP78 78 kDa

Actine Actine

eIF2α-P 38 kDa

A

B

Résultats

142

d) Combinaison du trivalent-DMJ avec le potentiateur VX-770

Comme expliqué précédemment, les résultats des essais cliniques du correcteur ciblant

de manière directe la protéine CFTR, VX-809 (Lumacaftor) n’ont pas révélé d’amélioration des

signes cliniques chez les patients homozygotes pour la mutation F508del. En revanche, son

association avec le VX-770 (Ivacaftor) en Orkambi® a apporté une amélioration selon les

études de phase III. Cette combinaison a même obtenu une autorisation de mise sur le marché

pour des patients âgés de 12 ans et plus et homozygotes pour la mutation F508del par l’Agence

Européenne du Médicament (AEM) (d’après https://www.has-sante.fr et http://www.

clinicaltrials.gov).

Comme vu précédemment, le VX-770 est un potentiateur qui augmente la probabilité

d’ouverture du canal CFTR et en conséquence le transport des ions chlorures à la surface

cellulaire. Nous avons évalué l’efficacité de ce composé sur l’activité canal chlorure de

F508del-CFTR restauré à la membrane cellulaire par le trivalent-DMJ. Les résultats obtenus

par la technique des efflux d’iodure sont présentés dans la figure 47.

Figure 47 : Efficacité du potentiateur VX-770 sur F508del-CFTR corrigé par le trivalent-DMJ. Evaluation de l’activité de F508del-CFTR par la technique des efflux d’iodure sur les cellules Hela F508del-CFTR traitées pendant 4h avec 100 µM de trivalent-DMJ. F508del-CFTR est activé en aigu par VX-770 (10 µM), Forskoline (Fsk) (10 µM), Fsk+VX-770, Fsk + Génistéine (Gst) (10 µM) ou Fsk+VX-770+Gst (n=4). ns : non significatif, ***P<0.001.

Comme attendu, l’ajout de la Forskoline seule à une concentration de 10 µM sur les cellules

traitées avec du trivalent-DMJ ne montre pas d’effet activateur sur le canal F508del-CFTR ; au

contraire, son addition en cocktail avec le potentiateur Génistéine induit une activité canal

chlorure. De même, l’addition du potentiateur VX-770 seul ne présente aucun effet sur l’activité

de F508del-CFTR étant donné que cette dernière n’est pas activée.

https://www.has-sante.fr/

http://www.vaincrelamuco.org/

http://www.vaincrelamuco.org/

Résultats

143

L’addition du potentiateur VX-770 en cocktail avec la Fsk induit une activité canal chlorure de

F508del-CFTR similaire à celle induite avec le cocktail Fsk+Gst, suggérant que le VX-770

potentialise l’activité de F508del-CFTR aussi bien que la Gst. Leur association avec la Fsk ne

montre pas de différence significative par rapport aux autres combinaisons.

En conclusion, une combinaison du trivalent-DMJ avec le potentiateur VX-770 pourrait

être envisagée afin d’obtenir un effet thérapeutique plus pertinent in vivo.

II. Implication de l’α1,2-mannosidase du RE dans la rétention de

F508del-CFTR

A. Contexte

Nous avons démontré, dans la première partie de ce travail de thèse, qu’inhiber

l’interaction de F508del-CFTR avec les protéines EDEM permet de rétablir son expression

membranaire. Ces protéines jouent un rôle majeur dans l’envoi des glycoprotéines vers la voie

de dégradation ERAD. Selon la littérature, l’α1,2-mannosidase I du RE (ERManI) serait le

« minuteur » qui déclenche la première étape de cette voie de dégradation en clivant le premier

résidu mannose de la branche B de l’oligosaccharide (Liu et al., 1999; Araki and Nagata, 2011;

Caramelo and Parodi, 2015; Zhou et al., 2015). Il semblerait que l’inhibition de son activité par

siRNA ou par la Kifunensine, un inhibiteur spécifique de l’α1,2-mannosidase, empêche la

dégradation intracellulaire des substrats luminaux d’ERAD, AAT (α1-antitrypsin) et son

mutant NHK (null Hong Kong) (Hosokawa et al., 2003; Wu et al., 2003; Avezov et al., 2008;

Pan et al., 2013). De manière plus intéressante, il a été démontré que le traitement avec de la

Kifunensine restaure in vitro et in vivo l’expression membranaire de l’α-sarcoglycane R77C,

une protéine mutée qui reste séquestrée dans le RE par l’ERQC (Bartoli et al., 2008; Soheili et

al., 2012). D’autre part, le DMJ qui a servi de base à la synthèse du trivalent-DMJ est

commercialisé en tant qu’inhibiteur des mannosidases du RE et de l’appareil de Golgi. Il nous

est alors apparu important de déterminer l’implication d’ERManI dans la rétention réticulaire

de F508del-CFTR. Ceci permettrait de corréler l’effet correcteur du trivalent-DMJ avec un

potentiel effet inhibiteur de mannosidase et aussi une meilleure compréhension du mécanisme

impliqué dans l’adressage défectueux de F508del-CFTR.

Résultats

144

B. Résultats

1) Effet des inhibiteurs des mannosidases sur la fonction de F508del-CFTR

Différents inhibiteurs de mannosidases du RE ont été testés sur l’activité canal chlorure

de F508del-CFTR afin de déterminer l’implication d’ERManI dans sa rétention réticulaire. Les

résultats obtenus par la technique des efflux d’iodure sont présentés dans la figure 48.

Figure 48 : Effet des inhibiteurs de mannosidase sur l’activité de F508del-CFTR. Evaluation de l’activité canal chlorure de F508del-CFTR par la technique des efflux d’iodure sur les cellules Hela F508del-CFTR traitées ou non pendant 4h avec 100 µM de DMJ (Deoxymannojirimicine), NB-DMJ (N-butyl-deoxymannojirimycin), Swainsonine ou Kifunensine. L’activité de CFTR est stimulée par le cocktail Forskoline 10 µM + Génistéine 30 µM. Les résultats sont présentés en moyenne +/- SEM (n=4). ns : non significatif, ***P<0.001.

Comme nous pouvons le voir, les 4 inhibiteurs de l’activité mannosidase induisent une

restauration de la fonction du flux anionique F508del-CFTR. Une différence significative de

cette activité a été observée entre les cellules non traitées et celles traitées avec les différents

composés. Ces résultats suggèrent qu’inhiber l’activité mannosidase rétablit potentiellement la

fonction de F508del-CFTR.

2) Effet du siRNA d’ERManI sur F508del-CFTR

Parce que les inhibiteurs de mannosidase ne sont pas spécifiques de l’enzyme ERManI,

et afin de s’affranchir de leur effet pharmacologique qui pourrait agir sur d’autres cibles dans

la cellule, nous avons opté pour la stratégie de siRNA. Celle-ci nous permettra de réduire de

manière spécifique l’expression protéique d’ERManI, et par conséquent son activité dans les

cellules. Par la même occasion, nous avons étudié l’effet de l’extinction de l’expression

protéique de Golgi-Mannosidases II (Golgi-ManII) sur F508del-CFTR.

untre

ated

DMJ

NB-DM

J

swain

sonin

e

kifun

ensin

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20***

ns

*

k pea

k-k b

asal

(m

in-1

)

Résultats

145

a) Efficacité des siRNA ERManI et Golgi-ManII

Afin de vérifier l’extinction de la protéine ERManI et Golgi-ManII après transfection

des cellules Hela F508del-CFTR avec leur siRNA spécifique, nous avons réalisé des

expériences de western blot. La transfection par du siRNA contrôle a servi de contrôle négatif.

Les résultats obtenus sont présentés dans la figure 49.

NT

Contrô

le

ERMan

I0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50 ns **

siRNAR

ati

o E

RM

an

I/A

cti

ne

NT

Contrô

le

Golgi

-Man

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

siRNA

ns *

Ra

tio

Go

lgiM

an

II/A

cti

ne

Figure 49 : Diminution de l’expression protéique d’ERManI ou de Golgi-Man par siRNA.

(A) Western blot représentatif de l’extinction de la protéine ERManI (en haut) ou Golgi-Man (en bas) par siRNA dans les cellules Hela F508del-CFTR après 48 heures de transfection. Le siRNA contrôle est utilisé comme un contrôle négatif de la transfection. L’actine est utilisée comme un contrôle de charge. (B) Histogramme reportant la quantification de la protéine ERManI (en haut) ou Golgi-Man (en bas) dans les différentes conditions. Les résultats sont présentés en moyenne +/- SEM normalisés par rapport à la condition NT (non transfectées) (N=5). ns : non significatif, *P<0.05, **P<0.01.

Les protéines ERManI et Golgi-ManII sont détectées respectivement à environ 80 kDa et 130

kDa. Comme nous pouvons le voir, une extinction d’environ 90% de l’expression protéique

d’ERManI a été constatée dans les cellules transfectées par des siRNAs ERManI, comparée aux

siRNA

Actine

ERManI

siRNA

Actine

Golgi-ManII

A B

Résultats

146

cellules transfectées par des siRNAs contrôle. Ces résultats démontrent que le siRNA utilisé

dans notre étude éteint de manière efficace et quasi-totale l’expression de la protéine ERManI.

De même, une extinction d’environ 40% du taux d’expression de la protéine Golgi-ManII a été

détectée dans les cellules transfectées avec du siRNA Golgi-ManII, suggérant que le siRNA

utilisé éteint de manière partielle l’expression de la protéine Golgi-ManII.

b) Effet de la transfection de siRNA ERManI ou Golgi-ManII sur F508del-CFTR

Dans un premier temps, nous avons exploré l’effet du siRNA ERManI et Golgi-ManII

sur la fonction de transport de F508del-CFTR par la technique des efflux d’iodure. Le cocktail

Forskoline 10 µM + Génistéine 30 µM a été utilisé pour stimuler l’activité du canal CFTR au

niveau de la membrane cellulaire. Les résultats obtenus sont présentés dans la figure 50.

Figure 50 : Effet du siRNA ERManI et Golgi-ManII sur l’activité de F508del-CFTR. Evaluation de l’activité canal chlorure de F508del-CFTR par la technique des efflux d’iodure sur les cellules Hela F508del-CFTR transfectées (48 heures) ou non avec des siRNA ERManI ou siRNA contrôle. L’activité de CFTR est stimulée par le cocktail Forskoline 10 µM+ Génistéine 30 µM. Les résultats sont présentés en moyenne +/- SEM (n=4). ns : non significatif, ***P<0.001.

Comme nous pouvons le voir, aucune activité du transport de F508del-CFTR n’a été détectée

dans les cellules non transfectées ou les cellules transfectées avec du siRNA contrôle, ce qui est

en accord avec la rétention de cette protéine dans le RE. Au contraire, suite à la transfection par

le siRNA ERManI, une augmentation de l’activité de F508del-CFTR est observée, témoignant

de la restauration de cette protéine à la membrane cellulaire. Ces résultats suggèrent ainsi, que

la diminution de l’expression protéique d’ERManI par siRNA restaure l’activité de F508del-

CFTR.

untra

nsfec

ted

siRNA C

trl

siRNA E

R man

.

siRNA G

olgi m

an.

0.00

0.05

0.10

0.15

basalFsk+Gst

nsns

ns

***

k pea

k-k b

asal

(m

in-1

)

Résultats

147

Au contraire, l’inhibition par siRNA des mannosidases de classe II de l’appareil de Golgi ne

semble pas agir sur la rétention du F508del-CFTR. Ainsi, cette protéine ne fera pas partie du

reste de l’étude.

Dans un deuxième temps, nous avons étudié l’effet du siRNA ERManI sur la maturation

de F508del-CFTR par western blot. En effet, au cours de son processus de biosynthèse et de

maturation, CFTR adopte trois formes de glycosylation (voir partie II-B, page 58). Les résultats


NT

Contrô

le

ERM

an I

VX809

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0**

nsns

siRNA

Inte

nsi

té r

ela

tive C

/(B

+C

)

Figure 51 : Effet de siRNA ERManI sur la maturation de F508del-CFTR. (A) Western blot représentatif des deux formes de glycosylation de F508del-CFTR (forme immature (bande B) et forme mature (bande C) dans les cellules Hela F508del-CFTR transfectées ou non avec du siRNA contrôle ou siRNA ERManI. La condition WT-CFTR a servi pour montrer l deux formes de glycosylation de F508del-CFTR ; et VX-809 (10 µM, 24h) a servi de contrôle positif de restauration de la maturation. α1 NaK ATPase est utilisée comme un contrôle de charge. (B) Histogramme reportant la quantification relative de [bande C/(bande B+bande C)] de F508del-CFTR dans les différentes conditions. Les résultats sont présentés en moyenne +/- SEM normalisés par rapport à la condition VX-809 (N=3). ns : non significatif. ** P<0.05.

Comme attendu, pour les cellules Hela WT-CFTR, les deux bandes B et C correspondant

respectivement à la forme immature faiblement glycosylée et mature hautement glycosylée sont

détectées. De même, pour les cellules Hela F508del-CFTR non transfectées et celles

transfectées avec du siRNA contrôle, uniquement la bande B immature, séquestrée dans le RE,

a été détectée. Le traitement avec le composé VX-809, un correcteur de F508del-CFTR, a été

utilisé comme contrôle positif de correction et comme nous pouvons le voir, une restauration

de la bande C mature a été visualisée.

bande C bande B

α1 NaK ATPase

F508del-CFTR siRNA

A B

Résultats

148

Concernant les cellules transfectées avec du siRNA ERManI, seule la bande immature B a été

visualisée. Aucune restauration de la bande mature C n’a été observée. Cependant, d’après les

résultats de fonctionnalité précédemment obtenus, une activité CFTR-dépendante a été

observée dans ces cellules (Figure 50), suggérant une restauration de F508del-CFTR à la

surface cellulaire sous sa forme immature mais fonctionnelle.

En conclusion, la diminution de l’expression de la protéine ERManI par siRNA restaure

un F508del-CFTR immature mais fonctionnel à la surface cellulaire. Ces résultats suggèrent

l’implication de l’enzyme ERManI dans la rétention réticulaire de F508del-CFTR.

3) Comprendre l’effet correcteur sur F508del-CFTR de l’extinction d’ERManI

Afin de comprendre comment et pourquoi la diminution de l’expression protéique

d’ERManI rétablit l’expression membranaire de F508del-CFTR, nous avons étudié l’effet du

siRNA ERManI sur les principaux acteurs connus pour être impliqués dans le contrôle de

qualité de F508del-CFTR.

a) Effet du siRNA ERManI sur l’interaction de F508del-CFTR avec les protéines de

la famille EDEM

Comme nous l’avons démontré dans notre première étude, les protéines de la famille

EDEM, principaux acteurs de l’envoi des protéines mal repliées vers la voie de dégradation,

sont impliquées dans la rétention de F508del-CFTR dans le RE. Nous avons alors étudié l’effet

du siRNA ERManI sur leur niveau d’expression protéique. Les résultats obtenus par western

blot sont présentés dans la figure 52.

Résultats

149

NT

Contrô

le

ERMan

I0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4 ns

siRNA

Rati

o E

DE

M1

/Acti

ne

NT

Contrô

le

ERMan

I0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4ns

siRNA

Rati

o E

DE

M2

/Acti

ne

NT

Contrô

le

ERMan

I0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0ns

siRNA

Rati

o E

DE

M3

/Acti

ne

Figure 52 : Effet du siRNA ERManI sur l’expression protéique des EDEMs. (A) Western blot représentatif du niveaux d’expression protéique d’EDEM1, EDEM2 ou EDEM3 dans les cellules Hela F508del-CFTR transfectées (48 heures) ou non avec du siRNA ERManI ou contrôle. L’actine est utilisée comme un contrôle de charge. (B) Histogramme reportant la quantification du niveau d’expression de la protéine EDEM1, EDEM2 ou EDEM3 dans les différentes conditions. Les résultats sont présentés en moyenne +/- SEM normalisés par rapport à la condition NT (non traitée) (N=3). ns : non significatif.

Comme nous pouvons le voir, la protéine EDEM1 est détectée sous deux formes : une forme

soluble à environ 69 kDa, et une forme membranaire à environ 74 kDa. Les protéines EDEM2

et EDEM3 sont quant à elles détectées respectivement à environ 70 kDa et 110 kDa.

Aucune différence significative du niveau d’expression de ces trois protéines n’a été observé

entre les cellules transfectées avec le siRNA ERManI et celles transfectées avec le siRNA

contrôle ou les non transfectées. Le siRNA ERManI ne présente donc aucun effet sur

l’expression protéique totale d’EDEM1, EDEM2 et EDEM3.

EDEM3 EDEM2

siRNA siRNA

EDEM1

siRNA

Actine

A

B

Résultats

150

Dans un deuxième temps, nous avons regardé par la technique de Proximity Ligation

Assay, si le siRNA ERManI perturbait l’interaction de F508del-CFTR avec les 3 protéines

EDEMs (Figure 53).

Contrô

le

ERMan

I0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

siRNA

ns

Inte

racti

on

F5

08

del-

CF

TR

/ E

DE

M1

Contrô

le

ERMan

I0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2 ns

siRNA

Inte

racti

on

F5

08

del-

CF

TR

//E

DE

M2

Contrô

le

ERMan

I0.00.20.40.60.81.01.21.41.6

Inte

racti

on

F5

08

del-

CF

TR

//E

DE

M3 ns

siRNA

Figure 53 : Effet du siRNA ERManI sur l’interaction de F508del-CFTR avec les EDEMs. (A) Images représentatives des interactions (points rouges) de F508del-CFTR avec EDEM1 (en haut), EDEM2 (au milieu) ou EDEM3 (en bas) obtenues par la technique de Proximity Ligation Assay sur des cellules Hela F508del-CFTR transfectées (48 heures) ou non avec du siRNA ERManI ou contrôle. Echelle : 20 µm. Bleu : noyau cellulaire (B) Histogramme reportant le nombre de points rouge par noyau, représentatif du nombre d’interaction par cellules. Les résultats sont présentés en moyenne +/- SEM normalisés par rapport à la condition siRNA contrôle (N=3). ns : non significatif.

siRNA Contrôle siRNA ERManI

Interaction F508del-CFTR/EDEM1





A B

Résultats

151

Les résultats obtenus ne montrent aucune différence significative du taux d’interaction de

F508del-CFTR avec EDEM1, EDEM2 ou EDEM3 entre les cellules transfectées avec du

siRNA ERManI et les cellules transfectées avec du siRNA contrôle. Le siRNA ERManI ne

diminue donc pas l’interaction de F508del-CFTR avec cette famille de protéine.

En conclusion, le siRNA ERManI semble restaurer F508del-CFTR à la membrane

cellulaire via un mécanisme d’action indépendant de l’interaction de F508del-CFTR avec les

protéines EDEMs.

b) Effet du siRNA ERManI sur les ubiquitines ligases CHIP et RNF5/RMA1

Toujours dans le but d’identifier le mécanisme d’action du siRNA ERManI, nous avons

exploré son effet sur l’expression protéique de CHIP et RNF5/RMA1 (voir Figure 40). Les

résultats obtenus par western blot sont présentés dans la figure 54.

NT

Contrô

le

ERMan

I0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0ns

siRNA

Rati

o C

HIP

/Acti

ne

NT

Contrô

le

ERMan

I0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0ns

siRNA

Rati

o R

NF

5/A

cti

ne

Figure 54 : Effet du siRNA ERManI sur l’expression protéique de CHIP et RNF5/RMA1. (A) Western blot représentatif du niveau d’expression protéique de CHIP (à gauche) et RNF5/RMA1 (à droite) dans les cellules Hela F508del-CFTR transfectées (48 heures) ou non avec du siRNA ERManI ou contrôle. L’actine est utilisée comme un contrôle de charge. (B) Histogramme reportant la quantification du niveau d’expression de la protéine CHIP ou RNF5/RMA1 dans les différentes conditions. Les résultats sont présentés en moyenne +/- SEM normalisés par rapport à la condition NT (non traitée) (N=3). ns : non significatif.

siRNA

Actine

CHIP

siRNA

Actine

RNF5/ RMA1

A

B

Résultats

152

L’immunoblot révèle la protéines CHIP à 35 kDa environ. Une seconde bande plus légère,

correspondant à sa forme glycosylée a également été détectée. La protéine RNF5/RMA1, quant

à elle, a été détectée à environ 18 kDa.

Les résultats obtenus démontrent que le siRNA ERManI ne présente aucun effet sur

l’expression protéique des ubiquitines ligases CHIP et RNF5/RMA1.

Ensuite, nous avons étudié par la technique de Proximity Ligation Assay, si le siRNA

ERManI perturbait l’interaction de F508del-CFTR avec ces protéines (Figure 55).

Contrô

le

ERMan

I0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

siRNA

Inte

racti

on

F5

08

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CF

TR

/CH

IP

Contrô

le

ERMan

I0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Inte

racti

on

F5

08

del-

CF

TR

/RN

F5

siRNA

Figure 55 : Effet du siRNA ERManI sur l’interaction de F508del-CFTR avec CHIP ou RNF5/RMA1.

(A) Images représentatives des interactions (points rouges) de F508del-CFTR avec CHIP (en haut) ou RNF5/RMA1 (en bas) obtenues par la technique de Proximity Ligation Assay sur des cellules Hela F508del-CFTR transfectées (48 heures) ou non avec du siRNA ERManI ou contrôle. Echelle : 20 µm. Bleu : noyau cellulaire (B) Histogramme reportant le nombre de points rouge par noyau, représentatif du nombre d’interaction par cellules. Les résultats sont présentés en moyenne +/- SEM normalisés par rapport à la condition siRNA contrôle (N=2).


Interaction F508del-CFTR/CHIP


Interaction F508del-CFTR/RNF5

A B

Résultats

153

Aucun effet du niveau de l’interaction de F508del-CFTR avec CHIP ou avec RNF5/RMA1 n’a

été observé entre les cellules non transfectées et les cellules transfectées avec du siRNA

ERManI.

Bien que préliminaires, ces résultats suggèrent que le siRNA ERManI rétablit

l’expression membranaire de F508del-CFTR via un mécanisme d’action indépendant des

ubiquitines ligases CHIP et RNF5/RMA1.

c) Effet du siRNA ERManI sur le protéasome 20S

Nous avons exploré l’effet de la diminution du taux d’expression protéique d’ERManI

sur l’activité enzymatique du protéasome intracellulaire sur des cellules Hela F508del-CFTR.

La fluorescence du substrat du protéasome 20S, AMC a été mesurée à l’aide du lecteur Mithras

en utilisant un couple de filtre 380/460 nm (Figure 56).

NT

Lactac

ystin

Blanc d

e sub

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0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

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1.0

siRNA

RF

U d

'AM

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DO

46

0 n

m)

Figure 56 : Effet du siRNA ERManI sur l’activité du protéasome 20S intracellulaire. (A) L’activité enzymatique du protéasome 20S est évaluée à l’aide du kit « 20S Proteasome Activity Assay kit » sur des cellules Hela F508del-CFTR transfectées ou non pendant 48h avec du siRNA ERmanI. (B) Le traitement avec la Lactacystin est utilisé comme contrôle négatif. La condition « blanc de substrat » correspond aux réactif dans un puits vide (sans cellules). La fluorescence du substrat AMC libre est quantifiée à l’aide d’un couple de filtre 380/460 nm dans un lecteur de fluorescence, ici Mithras. Les résultats présentés sont les moyennes des triplicats de deux expérimentations indépendantes +/- SEM.

Les résultats obtenus sont normalisés par rapport aux conditions « non traité » (égale à

1) et « blanc de substrat » (égale à 0).

A B

Résultats

154

La Lactacystine a été utilisée comme un contrôle positif, inhibant l’activité du protéasome, et

comme attendu, une diminution d’environ 98% de la fluorescence du substrat AMC a été

constatée dans les cellules traitées avec ce composé, comparé aux cellules non traitées.

Concernant les cellules transfectées avec du siRNA ERManI, l’activité enzymatique de leur

protéasome est identique à celle des cellules transfectées avec du siRNA contrôle, suggérant

que le siRNA ERManI ne présente aucun effet sur le protéasome cellulaire.

L’ensemble de ces résultats suggèrent une implication d’ERManI dans la rétention

réticulaire du F508del-CFTR. Cependant, au regard de l’absence d’effet du siRNA ERManI sur

l’interaction de F508del-CFTR avec les protéines EDEMs ou sur l’activité du protéasome, nous

pouvons émettre l’hypothèse que l’inhibition d’ERManI du RE par le trivalent-DMJ n’explique

pas l’effet correcteur de ce composé. Cependant, au regard de l’effet correcteur du siRNA ayant

été observé sur notre modèle, il sera intéressant d’explorer cette voie et de déterminer par quel

mécanisme d’action le siRNA restaure cette protéine à la membrane cellulaire.

Discussion, conclusion et perspectives

155

Discussion, conclusion et perspectives Les études réalisées durant mes trois années de thèse ont permis dans un premier temps,

la conception et la synthèse par nos collaborateurs chimistes de l’équipe du Pr Philippe

Compain, d’une nouvelle classe d’iminosucres multivalents en série DMJ, un inhibiteur de

l’activité enzymatique des α1,2-mannosidases du RE. L’effet multivalent de ces dérivés

observé sur la restauration de l’expression membranaire de F508del-CFTR a permis d’ouvrir

une nouvelle piste thérapeutique pour la mucoviscidose. Nous avons dans un second temps,

apporté de nouveaux éléments concernant le processus de dégradation du F508del-CFTR. Nous

avons montré que la famille des protéines EDEMs ainsi que la mannosidase du RE sont

impliquées dans sa rétention réticulaire. La recherche d’une stratégie pharmacologique ciblant

ces protéines, nous a ensuite conduit à l’identification d’un nouveau correcteur pour F508del-

CFTR, le trivalent-DMJ, et par la même occasion, à la détermination de son mécanisme

d’action. Enfin, au cours d’une étude encore préliminaire, nous avons pu déterminer certains

paramètres impliqués dans l’augmentation d’efficacité des composés avec la multivalence. Pour

plus de facilité, la discussion de l’ensemble de ces études sera présentée en quatre volets. Les

trois premiers volets ayant fait l’objet d’un article scientifique (en cour de soumission), seront

rapidement discutés.

A. Synthèse d’une nouvelle famille d’iminosucres : dérivés multivalents

du Deoxymannojirimycin

Notre première étude, réalisée en collaboration avec l’équipe de chimistes du Pr.

Philippe COMPAIN a permis la synthèse d’une nouvelle classe d’iminosucres multivalents,

solubles dans l’eau et non toxiques. Il s’agit des dérivés du composé DMJ, un inhibiteur de

l’activité mannosidase des membres de la famille GH47 (Olivari and Molinari, 2007b;

Ninagawa et al., 2014). Ces dérivés ont été synthétisés selon la stratégie de « chimie click » qui

consiste à greffer au DMJ un ou plusieurs bras chimiques sur lesquels d’autres composés DMJ

peuvent être fixés.

Les tests de biologie que nous avons réalisés par la suite avec ces composés, nous ont

permis de mettre en évidence leur effet correcteur sur F508del-CFTR. Ceci est en adéquation

avec d’autres études démontrant que les inhibiteurs Kifunensine et DMJ retardent la

dégradation de la protéine NHK (Null Hong Kong), un mutant de la protéine α1-antitrypsin


156

(α1-AT) qui est retenu et dégradé par l’ERQC (Liu et al., 1997, 1999). Ces inhibiteurs

permettent également à la fois la diminution de dégradation de l’α1-ATZ, un autre mutant de

l’α1-AT et l’augmentation de sa sécrétion (Marcus and Perlmutter, 2000).

De manière intéressante, le criblage de ces composés en efflux d’iodure a révélé un effet

croissant sur la restauration de l’activité transporteur de F508del-CFTR avec l’augmentation de

la valence du composé. Le trivalent- et le tétravalent-DMJ, qui correspondent respectivement à

3 molécules et 4 molécules de DMJ associées par un bras chimique, étaient environ 170 fois

plus efficace que le DMJ. Ces résultats apportent de nouveaux arguments quant à l’importance

du concept de multivalence pour la synthèse de correcteurs plus efficaces pour F508del-CFTR.

En effet, lors d’une collaboration antérieure les deux équipes ont démontré que le trivalent-

DNJ, l’inhibiteur des α1,2-glucosidases du RE, était environ 1000 fois plus efficace que son

monovalent (Compain et al., 2013).

En perspectives pour cette étude, et basé sur des études montrant que l’association de

deux ou plusieurs correcteurs agissant à des niveaux différents de la voie de biosynthèse de

F508del-CFTR entraine une augmentation de son activité canal chlorure, il serait intéressant

de combiner des composés permettant de corriger les 3 défauts de F508del-CFTR, à savoir son

adressage, sa fonctionnalité et sa stabilité au niveau de la membrane cellulaire.

Nous avons par la suite cherché à identifier les paramètres impliqués dans

l’amélioration d’efficacité du trivalent-DMJ.

Même si cette étude est en cours de réalisation, certains résultats, encore préléminaires,

obtenus sur les dérivés multivalents fluorescents du composé DNJ (non présentés dans ce

manuscrit), nous ont permis d’identifier quelques paramètres essentiels pour l’augmentation

d’efficacité de composés avec la multivalence. Nous pensons en effet, que l’augmentation

d’efficacité du trivalent pourrait être due à son absorption rapide par les cellules. Le trivalent-

DNJ semble atteindre la saturation dans les cellules plus rapidement que son monovalent.

Cependant, s’agit-il d’une entrée plus rapide dans la cellule ou de sa taille plus importante qui

limiterait la quantité de produit pouvant pénétrer la cellule ?

Nous avons également essayé avec la spectrométrie de masse d’analyser les composés

après leur absorption par les cellules. Notre objectif était de voir si le trivalent-DNJ se fragmente

en plusieurs monovalent-DNJ ou un mélange de monovalent- et divalent-DNJ. Cependant, à ce

jour, nous n’arrivons pas encore à détecter nos composés dans les lysats cellulaires. En effet,


157

après plusieurs tentatives, nous avons remarqué que le tampon de lyse induit l’apparition de

plusieurs pics et masquerait ainsi ceux des composés. Nous avons par la suite opté pour une

lyse mécanique (sonication) dans du H2O et de la trypsine, mais toujours sans succès. Ainsi,

une mise au point de la technique serait nécessaire afin de pouvoir détecter les composés qui

nous intéressent et étudier leur devenir une fois dans la cellule.

Enfin, suite à l’observation de l’effet inhibiteur du trivalent-DMJ sur le protéasome

(Discutée dans la partie C : « Etude du trivalent-DMJ comme correcteur de F508del-CFTR »),

nous nous sommes posé la question à savoir si le trivalent-DMJ inhibait le protéasome de

manière plus importante que son monovalent ? Nous avons observé qu’après 15 minutes de

traitement, le monovalent-DMJ ne présente pas d’effet sur l’activité enzymatique du

protéasome 20S. Ceci ne signifie pas que ce composé ne présente pas d’effet inhibiteur sur le

protéasome, mais que 15 minutes de traitement ne permettent pas son inhibition. Il faut savoir

que nos expérimentations ont été réalisées sur le protéasome 20S purifié, et pour cela, nous

avons opté pour des conditions de traitement identique à celle de la Lactacystine. De manière

intéressante, pour ces mêmes conditions, une diminution d’environ 30% de l’activité du

protéasome a été observée après traitement avec le trivalent-DMJ, suggérant que

l’augmentation d’efficacité de composés multivalents pourrait être due à l’augmentation

d’efficacité sur l’inhibition du protéasome.

B. La famille des protéines EDEMs : de nouvelles cibles thérapeutiques

pour la mucoviscidose

Après avoir souligné l’importance des inhibiteurs de l’activité enzymatique de type

mannosidase dans la correction de l’adressage défectueux de F508del-CFTR, notre attention

s’est focalisée sur les protéines EDEMs et plus particulièrement leur potentielle implication

dans la rétention réticulaire de cette protéine. Nous avons montré la présence de F508del-CFTR

en complexe avec la protéine EDEM1, EDEM2 ou EDEM3 dans des cellules de mammifères,

suggérant d’une potentielle implication de cette famille de protéine dans sa rétention réticulaire.

A notre connaissance, seule l’équipe du Pr. Amaral avait détecté EDEM1 dans des complexes

protéiques à la fois de WT- et de F508del-CFTR (Farinha and Amaral, 2005). Ainsi, c’est la

première fois qu’une interaction de F508del-CFTR avec cette famille de protéine est décrite,

suggérant d’une potentielle implication de cette famille de protéine dans sa rétention réticulaire.


158

Grâce à une stratégie de siRNA, nous avons exploré cette piste, et nous avons montré

que la diminution de l’expression protéique (knockdown) d’EDEM1 ou d’EDEM2 restaure

F508del-CFTR à la membrane cellulaire sous sa forme immature mais fonctionnelle. Ceci n’est

pas le cas du knockdown d’EDEM3. A préciser, l’hypothèse de la restauration de F508del-

CFTR immature mais fonctionnelle à la surface cellulaire est plausible puisqu’il a été décrit

précédemment que la perturbation de l’état de glycosylation de la protéine CFTR-WT endogène

n’impacte pas sa fonction canal chlorure (Chang et al., 2008; Morris et al., 1993). Nos résultats

sont en accord avec d’autres travaux montrant que le knockdown d’EDEM1 inhibe la

dégradation d’un mutant de la protéine hERG (human ether-a-go-go-related gene), Y611H

(Gong et al., 2005). Comme la protéine F508del-CFTR, cette forme mutée du canal hERG

présente un défaut d’adressage, car elle reste séquestrée dans le RE sous sa forme immature

avant d’être dégradée (Zhou et al., 1998). Même si le rôle exact de chacune des trois variantes

d’EDEM n’est pas encore bien établi, il semblerait que le knockdown d’EDEM1 ou d’EDEM2

empêche le clivage extensif des résidus mannoses de F508del-CFTR et par conséquent son

envoi vers le complexe de rétrotranslocation, favorisant sa fuite vers la membrane cellulaire.

Cette hypothèse est soutenue par l’observation que le knockdown d’EDEM1 par siRNA affecte

la voie de dégradation ERAD (Molinari et al., 2003) et réduit la rétro-translocation de la chaîne

A de ricine vers le cytosol (Slominska-Wojewodzka et al., 2006).

Quatre hypothèses ont été émises concernant l’absence d’effet correcteur sur F508del-CFTR

dans les cellules transfectées avec le siRNA d’EDEM3 : (i) EDEM3 n’est pas impliqué dans la

rétention réticulaire de F508del-CFTR, (ii) EDEM3 est impliqué dans cette rétention mais à des

étapes plus tardives, (iii) l’absence d’EDEM3 pourrait être compensée par d’autres protéines,

ou bien encore, (iv) le taux d’extinction d’EDEM3 par siRNA n’était pas suffisant pour rétablir

l’expression membranaire de F508del-CFTR. Il serait alors intéressant d’évaluer l’activité

canal chlorure de F508del-CFTR dans des cellules avec des taux d’expression protéique

d’EDEM3 plus faibles ou sur des cellules EDEM3 KO.

Notre étude propose donc EDEM1 et EDEM2 comme cibles thérapeutiques et ouvre la

porte vers l’identification de stratégies permettant d’inhiber spécifiquement l’interaction de

F508del-CFTR avec ces protéines. En effet, une interaction directe de type protéine-protéine a

été observée entre EDEM1 ou EDEM2 et certains de leurs substrats (Slominska-Wojewodzka

et al., 2006; Kosmaoglou et al., 2009; Sokołowska et al., 2011; Shenkman et al., 2013;

Slominska-Wojewodzka et al., 2014; Tang et al., 2014). Il serait alors intéressant d’étudier si

F508del-CFTR établit ce type d’interactions avec ces protéines. Si c’est le cas, cela nous


159

permettrait d’envisager une stratégie génétique pour inhiber de manière spécifique le site de

fixation de F508del-CFTR avec les protéines EDEMs.

C. Etude du trivalent-DMJ comme correcteur de F508del-CFTR

A la suite de notre étude, nous avons cherché à identifier une stratégie pharmacologique

qui permettrait d’inhiber l’interaction de F508del-CFTR avec les protéines EDEMs. Nous nous

sommes alors intéressé au trivalent-DMJ, celui-ci étant le composé le plus efficace de sa

famille.

Tout d’abord, nous avons vérifié que le trivalent-DMJ diminue l’interaction de F508del-

CFTR avec EDEM1, EDEM2 et EDEM3 dans les cellules Hela F508del-CFTR. Nous avons

également vérifié par western blot que cette diminution n’est pas corrélée à une diminution de

leur niveau d’expression protéique. L’équipe de Hebert a cependant démontré qu’EDEM1 lie

spécifiquement les protéines mal repliées même en présence des inhibiteurs des mannosidases

I (kifunensine et DMJ) et l’inhibiteur de glucosidase (DNJ), et que des mutations sur son site

actif de mannosidase ne semblent pas avoir d’effet sur sa liaison aux glycoprotéines mal repliées

(Cormier et al., 2009). Cependant, il s’agit d’expérimentations réalisées sur les protéines α1AT

et son mutant NHK qui sont toutes les deux des protéines solubles et non membranaires comme

CFTR. EDEM1 est présent dans les cellules sous 2 formes, soluble et membranaire. Il a été

décrit que la forme soluble serait efficace pour accélérer la dégradation des substrats ERAD

solubles, en revanche, la forme membranaire accélèrerait la dégradation de substrats

membranaires (Tamura et al., 2011). Ainsi, il semblerait que c’est la forme soluble d’EDEM1

qui interagit avec son substrat de manière indépendante de son activité catalytique. Une

comparaison de l’effet du trivalent-DMJ sur l’interaction d’EDEM1 avec une protéine soluble

mal repliée telle que l’α1AT et son interaction avec une protéine membranaire mal repliée

confirmerait cela.

Par la suite, nous avons confirmé l’effet correcteur du trivalent-DMJ sur F508del-CFTR

dans différents modèles cellulaires. Sur des cellules Hela F508del-CFTR traitées avec notre

composé, nous avons détecté grâce à la sonde fluorescente Oxonol, une modification de

potentiel de membrane CFTR-dépendant. Nous avons également détecté en chambre de Ussing,

un courant de court-circuit CFTR-dépendant dans un pseudo-épithélium formé par des cellules

CFBE, traitées avec notre composé. De manière plus intéressante, nous avons confirmé l’effet

correcteur du trivalent-DMJ sur des cellules épithéliales bronchiques fraichement isolées de

patients homozygotes pour la mutation F508del.


160

Seule la bande B correspondante à la forme immature de F508del-CFTR a été observée

dans les cellules Hela F508del-CFTR traitées avec le trivalent-DMJ. Nous supposons donc que

notre correcteur adresse le canal F508del-CFTR à la membrane plasmique sous sa forme non

mature mais fonctionnelle. Cette hypothèse a été confirmée par la technique de biotinylation de

surface qui nous a permis de définir le profil de glycosylation de F508del-CFTR, présent au

niveau de la surface cellulaire. Il a déjà été identifié que l’état de glycosylation de CFTR, WT

ou F508del n’affecte pas sa fonction canal chlorure, et que la forme immature de F508del-

CFTR est fonctionnelle si elle est restaurée à la surface cellulaire (Morris et al., 1993; Chang et

al., 2008; Gee et al., 2011). Ainsi, deux hypothèses pourraient expliquer l’absence de

restauration de la forme mature hautement glycosylée (bande C) de cette protéine (Figure 57) :

La première hypothèse est que le F508del-CFTR est restauré à la membrane cellulaire

via la voie non conventionnelle ne passant pas par l’appareil de Golgi. En effet, il a été apporté

que l’expression membranaire de F508del-CFTR pourrait être restaurée in vitro et in vivo en la

dirigeant vers une voie de sécrétion non conventionnelle GRASP-dépendante, activée par le

stress du RE (Gee et al., 2011). Cependant, nous n’avons constaté aucun effet du trivalent-DMJ

sur le niveau d’expression protéique de la chaperonne BiP/GRP78 ou du facteur d’initiation de

la traduction eif2α phosphorylé, connus pour être surexprimés lors d’une réponse UPR

(Harding et al., 1999; Li et al., 2008; Wang et al., 2009; Nishitoh, 2012; Wang and Kaufman,

2014). De plus, nous avons observé que le trivalent-DMJ augmente l’interaction de F508del-

CFTR avec les lectines ERGIC53 et VIP36, deux récepteurs localisés principalement dans le

compartiment ERGIC et l’appareil de Golgi respectivement, suggérant la sortie de F508del-

CFTR du RE et son passage par l’appareil de Golgi. Nous avons également démontré qu’il

s’agissait d’une augmentation du taux d’interaction et non pas du niveau d’expression des

protéines ERGIC53 et VIP36. Ces résultats suggèrent une restauration de F508del-CFTR à la

membrane plasmique via la voie conventionnelle. Néanmoins, il serait intéressant de confirmer

ce point, en vérifiant l’effet du trivalent-DMJ sur F508del-CFTR en inhibant par une stratégie

de siRNA la voie de sécrétion GRASP-dépendent.


161

Figure 57 : Hypothèses de la restauration de F508del-CFTR à la membrane cellulaire sous sa

forme immature par le trivalent-DMJ.

La deuxième hypothèse, la plus plausible, est que le trivalent-DMJ inhibe le processus

de maturation de F508del-CFTR à l’origine de son envoi à la membrane cellulaire sous sa forme

immature. En effet, ce composé est un dérivé du DMJ qui est un inhibiteur de l’activité

mannosidase. Il serait donc possible qu’il puisse inhiber l’activité des mannosidases de

l’appareil de Golgi, impliquées dans le processus de sa maturation. Cette hypothèse est soutenue

par l’étude de Morris et ses collaborateurs montrant que le traitement avec le composé DMJ

d’une ligné cellulaire du côlon humain (HT-29) polarisée ou non, réduit la masse moléculaire

de la forme mature du WT-CFTR par 30 kDa, générant ainsi une forme à 140 kDa,

correspondante à la forme immature de CFTR. De manière intéressante, la localisation

membranaire de CFTR ainsi que le courant chlorure transepithelial n’ont pas été affectés

(Morris et al., 1993). Notre hypothèse est également soutenue par une autre étude montrant que

le DMJ inhibe la conversion du motif oligosaccharidique de type mannose élevé vers un motif

complexe (Fuhrmann et al., 1984). Cette étude a démontré en effet, que les immunoglobulines

IgM et IgD des cellules traitées avec le DMJ, présentaient des niveaux élevés de mannoses et

que cela n’a pas empêché leur sécrétion dans le milieu de culture cellulaire. Les auteurs ont


162

suggéré qu’en présence du DMJ, les modifications terminales ne peuvent pas avoir lieu en

raison de la présence des résidus mannose n’ayant pu être clivés.

Bien que cette hypothèse semble être la plus probable, il serait intéressant de mesurer l’effet

du trivalent-DMJ sur l’activité enzymatique des mannosidases de l’appareil de Golgi

impliquées dans la maturation de CFTR.

Dans un deuxième temps, nous avons cherché à explorer le mécanisme d’action du

trivalent-DMJ mis en place pour la restauration de F508del-CFTR à la membrane cellulaire.

Pour cela, nous avons regardé l’effet du trivalent-DMJ sur les principaux acteurs

impliqués dans le repliement et/ou la dégradation de F508del-CFTR. Les résultats obtenus n’ont

montré aucun effet de notre composé sur le niveau d’expression protéique de la calnexine,

Hsp70 ou Hsp90. De même, aucun effet n’a été observé sur leur interaction avec F508del-

CFTR, suggérant que l’effet correcteur du trivalent-DMJ ne ciblerait pas ces protéines.

Nous avons alors suite à ces résultats cherché à savoir si le trivalent-DMJ diminuait

l’interaction de F508del-CFTR avec l’ubiquitine ligase CHIP, celle-ci, identifiée pour être

impliquée, en complexe avec Hsc70, dans la dégradation de F508del-CFTR (Meacham et al.,

2001a; Alberti et al., 2004; Younger et al., 2006; Grove et al., 2009). En effet, CHIP est une

co-chaperonne de Hsc/Hsp70 et Hsp90 et semble agir de manière post-traductionnelle sur le

CFTR (Younger et al., 2006). Son association avec Hsc/Hsp70 et Hsp90 détourne ces

chaperonnes de la voie de repliement vers la voie de dégradation en liant aux substrats associés

des molécules d’ubiquitine (Figure 58). CHIP semble également jouer un rôle majeur dans la

dégradation de F508del-CFTR restauré à la surface cellulaire ; en revanche elle n’affecte pas la

demi-vie du WT-CFTR (Fu et al., 2012, 2015), suggérant que l’ubiquitinylation médiée par

CHIP permettrait la dégradation sélective du F508del-CFTR mal replié, restauré à la membrane

cellulaire.


163

Figure 58 : Principales protéines impliquées dans le repliement et/ou la dégradation de CFTR. (Modifié d'après Kim and Skach, 2012)

Nous avons constaté dans notre étude encore préliminaire que le trivalent-DMJ n’aurait

pas d’effet sur l’interaction de F508del-CFTR avec cette ligase. Ceci n’est pas étonnant, dans

la mesure où une étude menée par Morito et ses collègues a suggéré que la dégradation de

F508del-CFTR se fasse par au moins deux voie indépendantes (Morito et al., 2008) : une voie

médiée par CHIP et une voie médiée par la coopération de RMA1-Gp78, d’autres ligases

impliquées dans l’ubiquitinylation de F508del-CFTR. RMA1/RNF5 est une E3 ubiquitine

ligase ancrée à l’extérieur de la membrane du RE et semble reconnaitre les défauts de

repliement de CFTR de manière co-traductionnelle ; GP78 quant à elle présente à la fois une

activité E3 et E4 ubiquitine ligase (Vij et al., 2006; Younger et al., 2006; Morito et al., 2008).

Sur des cellules HEK293 sur-exprimant transitoirement F508del-CFTR, cette équipe avait

constaté que le Gp78 favorise l’ubiquitinylation de F508del-CFTR dans les cellules CHIP-

knockdown, mais pas dans les cellules RMA1-knockdown. De plus, le knockdown de Gp78

altère l’ubiquitinylation de F508del-CFTR et provoque un retard dans sa dégradation. Ce délai

de dégradation est plus prononcé suite à la diminution de l’expression protéique de RMA1. De

plus, le knockdown simultané de Gp78 et de RMA1 n’a pas montré d’effet additif sur le retard

de la dégradation de F508del-CFTR. Ainsi, cette équipe suggère que RMA1 est spécifiquement

requis en tant qu’enzyme E3 en amont pour l’activité E4-like de Gp78 et propose un transfert


164

direct de F508del-CFTR d’E3 à E4 dans le même complexe (Figure 59). Les auteurs ont

démontré que la diminution du taux d’expression de la protéine CHIP a provoqué un retard dans

la dégradation de F508del-CFTR, comparable à celui provoqué par Gp78-knockdown, et

suggèrent que la voie de dégradation de F508del-CFTR médiée par CHIP serait indépendante

de celle médiée par RMA1-Gp78.

Figure 59 : Modèle d’ubiquitinylation séquentielle de F508del-CFTR par des complexes contenant RMA1/RNF5 et Gp78.

(Modifié d'après Morito et al., 2008)

Afin de vérifier que le trivalent-DMJ n’a pas d’effet sur l’ubiquitinylation médiée par la ligase

CHIP, il serait alors intéressant de regarder son effet sur l’interaction de Hsc/Hsp70 avec les

co-chaperonnes productives à savoir, Hdj-2 et plus particulièrement HspB1, connue pour

inhiber l’activité ubiquitine ligase de CHIP, et BAG-1, connue pour coopérer avec CHIP afin

de déplacer l’activité de Hsc/Hsp70 du processus de repliement vers la dégradation (Demand

et al., 2001; Alberti et al., 2004). Il serait aussi intéressant de comparer par co-

immunoprécipitation, l’état du complexe protéique formé avec F508del-CFTR avant et après

le traitement cellulaire par le trivalent-DMJ. Cela nous permettrait de caractériser les

protéines qui s’associent ou qui se dissocient du CFTR après traitement avec notre composé.

Une autre étude a démontré que CHIP et RMA1/RNF5 agissent en séquentiel dans la

membrane du RE et le cytosol respectivement, pour détecter et contrôler l’état de repliement de

CFTR (Younger et al., 2006). Nous avons alors regardé l’effet du trivalent-DMJ sur

l’interaction de F508del-CFTR avec RMA1/RNF5, et de manière surprenante, une

augmentation importante (~ 80%) est apparue dans les cellules traitées avec notre correcteur.

Deux hypothèses peuvent être envisagées pour expliquer cette augmentation :


165

La première hypothèse est que le trivalent-DMJ en diminuant l’interaction de F508del-

CFTR avec les protéines EDEMs, empêche l’envoi de F508del-CFTR vers le récepteur SEL1L,

un récepteur des substrats mal repliés au niveau du complexe de retrotranslocation HRD1/Gp78

et par conséquent favorise son envoie vers le complexe RMA1 (Figure 60). Cette hypothèse

repose d’une part, sur le fait que les deux ligases HRD1/Gp78 et RMA1/RNF5 ont été

identifiées pour être impliquées dans la dégradation de F508del-CFTR, et d’autre part, sur la

nécessité du domaine mannosidase d’EDEM1 pour son interaction avec SEL1L (Cormier et al.,

2009). Afin de vérifier cette hypothèse, il serait intéressant de vérifier l’effet du trivalent-DMJ

sur l’interaction de F508del-CFTR avec les acteurs du complexe HRD1/Gp78. Une co-

immunoprécipitation permettrait également de distinguer quels acteurs du complexe de rétro-

translocation précipiteraient avec F508del-CFTR.

Figure 60 : Les trois principales ligases identifiées chez les mammifères. Chaque ligase (en orange claire) fait partie d’un complexe avec une enzyme E2 ubiquitine-conjugué (en vert) et d’autres facteurs. Les substrats (en rose) sont ubiquitylés, extraits dans le cytoplasme par AAA+ATPase p97 et enfin dégradés par le protéasome (Modifié d'après Houck et al., 2012).

La deuxième hypothèse est que le trivalent-DMJ inhibe la voie de dégradation de

F508del-CFTR en aval de RMA1/RNF5, bloquant ainsi sa rétrotranslocation vers le cytosol et

induisant son accumulation au niveau du complexe de rétro-translocation RMA1/RNF5.

Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons regardé l’effet du trivalent-DMJ sur le protéasome,

la voie dominante pour l’élimination du CFTR mal replié dans les cellules de mammifères

(Gelman et al., 2002). Contre toute attente, une diminution de l’activité enzymatique du


166

protéasome intracellulaire et du protéasome purifié a été observée suite au traitement avec le

trivalent-DMJ. Cela suggère que notre correcteur, connu comme un inhibiteur des α 1,2-

mannosidases du RE inhibe de manière directe l’activité enzymatique du protéasome 20S. A

notre connaissance, nos résultats seraient les premiers à démontrer un effet inhibiteur de la série

DMJ sur l’activité enzymatique du protéasome. Cependant, l’origine de cet effet inhibiteur reste

inconnu : s’agit-il de la présence d’un site catalytique dans le composé DMJ, ou bien, d’une

conséquence des modifications chimiques, nécessaires pour la synthèse des composés

multivalents ? Là encore, c’est un tout nouveau domaine à explorer.

L’ensemble de ces résultats nous laisse penser que le mécanisme d’action du trivalent-

DMJ serait dépendant de la famille des protéines EDEM mais également du protéasome

cellulaire.

D. A la recherche d’une autre cible thérapeutique pour la mucoviscidose :

α1,2-mannosidase I du RE

Nous avons mis en évidence dans cette partie de l’étude, l’implication de l’α1,2-

mannosidase I du RE (ERManI) dans la rétention réticulaire de F508del-CFTR. Son extinction

partielle par son siRNA spécifique a été associée avec une restauration de la fonction CFTR-

dépendante. Comme pour le traitement au trivalent-DMJ, ERManI knockdown restaure

F508del-CFTR à la membrane cellulaire sous sa forme immature (bande B). Plusieurs études

décrivent ERManI comme le « minuteur » qui déclenche la première étape de la voie de

dégradation en clivant le premier résidu mannose de la branche B de l’oligosaccharide (Araki

and Nagata, 2011; Caramelo and Parodi, 2015; Zhou et al., 2015). Ainsi, l’absence de

restauration de la forme mature de F508del-CFTR pourrait être expliquée par le fait que

l’extinction d’ERManI par siRNA empêcherait la génération du motif oligosaccharidique de

forme M8GlcNAc2 de F508del-CFTR et favoriserait ainsi son transport vers l’appareil de Golgi

avec le motif M9GlcNAc2, gênant le processus de maturation (Figure 61). En effet, après le

cycle de calnexine/calréticuline, les glycoprotéines natives ou mal repliées subissent par

l’enzyme ERManI un clivage du résidu mannose de la branche B de leur motif M9GlcNAc2

pour générer le motif M8GlcNAc2. Les glycoprotéines mal repliées subissent d’autres clivages

de mannose qui les envoient vers la dégradation ; au contraire, les glycoprotéines natives

transitent vers l’appareil de Golgi (Figure 61).


167

Figure 61 : Devenir des glycoprotéines correctement- ou mal-repliées. L’oligosaccharide Glc3Man9GlcNAc2 : carrés bleu : N-acétylglucosamine, cercles vert : mannoses, cercle bleu glucose. GlcI : α-glucosidases I. UGGT : UDP-glucose: glycoprotein glucosyltransferase. Au regard du rôle d’ERManI dans la dégradation des glycoprotéines mal/non repliées,

nous avons émis l’hypothèse, que son knockdown inhiberait l’envoi de F508del-CFTR vers la

voie de dégradation. Cette hypothèse repose sur des études démontrant que l’inhibition de

l’activité enzymatique de cette protéine, que ce soit par siRNA ou par Kifunensine, stabilise les

substrats luminaux d’ERAD AAT et son mutant NHK (Avezov et al., 2008; Hosokawa et al.,

2003; Pan et al., 2013; Wu et al., 2003). Afin d’apporter la preuve qui confirmerait notre

hypothèse, il serait alors important de suivre le niveau d’expression de F508del-CFTR au cours

du temps par la technique de pulse-chase (marquage métabolique au 35S). Elle repose sur un

marquage des protéines nouvellement synthétisées par incorporation de méthionine et de

cystéine marquées pendant une période déterminée (pulse), puis un suivi au cours du temps

(chase), mais cette fois-ci dans un environnement non marqué, du devenir de ces protéines

marquées.

Nous avons par la suite, entrepris la caractérisation du mécanisme d’action impliqué

dans cette correction. Partant du fait qu’ERManI est le minuteur qui déclenche la première étape

de dégradation en clivant le premier résidu de mannose, nous avions émis l’hypothèse que

l’inhibition de l’interaction de F508del-CFTR avec cette enzyme diminuerait son interaction

avec les protéines EDEMs. Cependant, nous n’avons détecté aucun effet de la diminution du

taux d’expression d’ERManI sur l’expression protéique d’EDEM1, EDEM2 ou EDEM3, ni sur

leur interaction avec F508del-CFTR, suggérant que le mécanisme d’action impliqué dans la

correction de F508del-CFTR n’est pas dépendant des protéines EDEMs. Trois hypothèses ont


168

été émises pour expliquer ces résultats surprenants : (1) ERManI agirait dans une voie de

dégradation indépendante de celle des EDEMs, (2) ERManI n’affecte pas l’interaction des

protéines EDEMs avec F508del-CFTR mais l’inhibition du clivage du premier résidu mannose

inhiberait leur activité mannosidase. Cette hypothèse est basée sur des études montrant que les

protéines EDEMs peuvent interagir avec leur substrat de manière indépendante de leur activité

mannosidase (Slominska-Wojewodzka et al., 2006; Kosmaoglou et al., 2009; Sokołowska et

al., 2011; Shenkman et al., 2013; Slominska-Wojewodzka et al., 2014; Tang et al., 2014), ou

bien, (3) ERManI agirait en aval des protéines EDEMs. En effet, une étude réalisée en 2014 par

l’équipe de Mori sur la lignée de poule DT40 et la lignée tumorale de colon HCT116, a

démontré par un système d’extinction de gènes, que le premier clivage de résidus mannose

serait effectué par EDEM2 et non pas, par ERManI (Ninagawa et al., 2014).

A ce stade de notre étude, il est impossible de trancher entre ces trois hypothèses. En effet, bien

que l’implication des trois EDEMs et d’ERManI dans la démannosylation des glycoprotéines

mal/non repliées soit bien établie, l’ordre de leur action n’est à ce jour pas encore déterminé.

Ainsi, face à la divergence sur le mode d’action d’ERManI, il serait envisageable d’éteindre

les protéines EDEMs ou ERManI séparément par un système KO, et définir ensuite le profil en

résidus mannose du N-glycane de F508del-CFTR comme décrit dans l’étude réalisée par

l’équipe de Mori (Ninagawa et al., 2014). Cela nous permettrait d’identifier dans quel type de

cellules les protéines avec le profil M9 s’accumulent et par conséquent quel type de

mannosidase serait responsable de la catalyse du clivage de premier résidu mannose.

Dans la poursuite de notre étude, mais cette fois-ci du côté cytosolique, une diminution

de l’interaction de F508del-CFTR avec l’ubiquitine ligase CHIP, la co-chaperonne de

Hsp/Hsc70 et Hsp90 a été observée dans les cellules transfectées par le siRNA ERManI. Même

s’il s’agit de résultats encore préliminaires, la diminution observée semble être significative.

Nous nous sommes assurés par western blot que cette diminution n’est pas corrélée à une

diminution du niveau d’expression protéique de CHIP, ce qui suggère qu’ERManI knockdown

restaure F508del-CFTR à la membrane cellulaire en prévenant l’interaction de CHIP au

complexe Hsc/Hsp70. F508del-CFTR n’étant alors pas ubiquitinylé, ne subira pas de

rétrotranslocation vers le cytosol pour dégradation, favorisant sa progression dans la voie de

repliement. Une étude de l’effet du siRNA ERManI sur les co-chaperonne productives tell que

Hdj-2, Hop et Bag1, montrant une augmentation de leur interaction avec F508del-CFTR

confirmerait cela.


169

Suite à ces résultats, nous nous sommes intéressés à l’ubiquitine ligase RMA1/RNF5,

agissant en séquentiel avec CHIP pour la détection et le contrôle du repliement de CFTR. Le

knockdown d’ERManI n’a montré aucun effet sur l’interaction de RMA1/RNF5 avec F508del-

CFTR (résultat préliminaire) ni sur leur niveau d’expression. Au regard de son rôle de détection

des défauts de repliement de CFTR, nous pensons que RMA1/RNF5 reste en permanence

attaché au F508del-CFTR et que c’est sa coopération avec d’autres partenaires tel que

l’ubiquitine ligase Gp78, Derlin-1 ou la co-chaperonne de Hsc/Hsp70, DNAJB12, qui

déclenche le processus de dégradation de F508del-CFTR (Morito et al., 2008; Grove et al.,

2011). Enfin, nous avons démontré que le knockdown d’ERManI ne présente aucun effet sur

l’activité enzymatique du protéasome. Il serait intéressant d’explorer l’effet de knockdown

d’ERManI sur les autres acteurs d’ERAD et les partenaires des complexes de

rétrotranslocation par des techniques de Duolink et/ou de co-immunoprécipitation.

En conclusion, notre travail propose la protéine ERManI et la famille de protéines

EDEM, plus particulièrement EDEM1 et EDEM2 comme cibles pour la recherche de

correcteurs de F508del-CFTR (Figure 62-A). Dans cette optique, nous avons révélé l’effet

correcteur du trivalent-DMJ et avons tenté de comprendre son mécanisme d’action (Figure 62-

B). Il semblerait que ce composé connu comme un inhibiteur de l’activité mannosidase

rétablissent l’expression membranaire de F508del-CFTR sous sa forme immature mais

fonctionnelle en diminuant son interaction avec les protéines EDEMs, mais également en

inhibant l’activité enzymatique du protéasome. Ainsi, la suite logique de ce travail sera de

continuer à élucider le mécanisme d’action de ce correcteur et de le tester dans d’autres cas de

pathologies.


170

A

B

Figure 62 : Récapitulatif des principaux résultats de ce projet de thèse. (A) Implication des protéines ERManI, EDEM1 et EDEM2 dans la rétention réticulaire de F508del-CFTR. (B) L’effet correcteur sur F508del-CFTR du trivalent-DMJ et son mécanisme d’action.

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Annexes

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Annexes Article scientifique

Pushing the limits of catalytic C-H amination in polyoxygenated cyclobutanes

Pierre-Antoine Nocqueta, Raphael Hensiennea, Joanna Wencel-Delord‡a, Eugenie Laigrea, Khadidja Sidelarbib, Frederic Becqb, Caroline Norezb, Damien Hazelarda and Philippe

Compaina

a. Laboratoire de Synthese Organique et Molecules Bioactives (SYBIO), Universite de

Strasbourg/CNRS (UMR 7509), Ecole Europeenne de Chimie, Polymeres et Materiaux

(ECPM), 25 rue Becquerel, 67087 Strasbourg, France. E-mail:[email protected] b. Laboratoire Signalisation et Transports Ioniques Membranaire (STIM), Universite de Poitiers

et CNRS (ERL7368), 1 rue Georges Bonnet, 86000 Poitiers, France.

‡ Present address: SynCat, Universite de Strasbourg/CNRS (UMR 7509), Ecole Europeenne de

Chimie, Polymeres et Materiaux (ECPM), 25 rue Becquerel, 67087 Strasbourg, France

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Khadidja SIDELARBI 32 ans, Célibataire

94 rue de la cathédrale, N° 59 Poitiers 86000

06 95 65 71 86

[email protected]

Formations et diplômes obtenus

2017 : Doctorat en cours ; Biologie Santé, Secteur de recherche Biomolécules, pharmacologie, thérapeutique. Université de Poitiers, France.

2014 : Master 2 en Biologie Santé Science du médicament - Recherche et Ingénierie en Biosanté ; parcours : Biologie Cellulaire et Moléculaire ; Université de Poitiers, France.

2012 : Licence 3 en Biochimie Biologie Moléculaire Cellulaire et Génétique; Université de Poitiers, France.

2006 : Diplôme des études supérieures (Bac+4) en Biologie, spécialité Génétique; Université Es- senia d’Oran, Algérie.

Expériences professionnelles

Emploi

Depuis septembre 2017 : Attaché temporaire d’enseignement et de recherche, section Biologie cellulaire (65ème section) > Université de Poitiers.

Janvier à Juillet 2010 (6 mois) : Ingénieur d’application > Laboratoire d’analyses de biologie médicale; Oran, Algérie. Postes occupés : analyses de sérologie virale, biochimie, hématologie, immunologie, prélèvements sanguins, secrétariat.

Décembre 2006 à Décembre 2008 (2 ans) : Ingénieur d’application > Centre de Transfusion Sanguine (CTS) ; Ain Témouchent, Algérie. Postes occupés : analyses de sérologie virale avec le test ELISA (HIV, hépatite B et C, brucellose Wright), test du groupe sanguin, banque du sang et distribution des produits sanguins, collectes sanguines, prélèvements sanguins, secrétariat.

Stage

2014 – 2017 (3 ans) : Doctorante sur le projet « Implication du chaperome de la protéine F508del-CFTR dans son transport intracellulaire et/ou sa dégradation : Rôle de la lectine EDEM et de la mannosidase du RE ». Laboratoire : Signalisation et Transports Ioniques Membranaires (STIM). Equipe Transports Ioniques et Mucoviscidose (TIM); CNRS ERL7368, Université de Poitiers, France. Sous la direction du Dr Caroline NOREZ et Pr. Frédéric BECQ.

Janvier à Juin 2014 (6 mois) : Stage de master 2 sur le projet « Étude des inhibiteurs de mannosidase comme correcteurs de la protéine F508del-CFTR ». Laboratoire STIM, équipe TIM ; Université de Poitiers, France. Sous la direction du Dr Caroline NOREZ.

Avril à Juin 2013 (2 mois) : Stage de master 1 sur le projet « Étude des gouttelettes lipidiques et leurs implications dans le mécanisme de l’autophagie ». Institut de Physiologie et de Biologie Cellulaires, laboratoire « Génétique des levures », CNRS FRE3511, Université de Poitiers, France.

Avril à Mai 2011 (1 mois) : Stage de licence 3 sur le projet « Étude du mode d'implantation des légionelles dans les biofilms pour leur maîtrise par lutte biologique ». Laboratoire de chimie et microbiologie de l'eau (LCME) ; Université de Poitiers, France.

mailto:[email protected]

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Domaines de compétences

Techniques - Biologie cellulaire et physiologie : Transfection siRNA, immunomarquage, proximity ligation

assay (duolink), transformation des bactéries et des levures, culture de lignées cellulaire, dissection de bronches issues de biopsies pulmonaires humaines, mesure de potentiel membranaire (sonde Oxonol), mesure de courants transépitheliaux sur cellules polarisées en chambre de Ussing.

- Biochimie et biologie moléculaire : Extraction des protéines, western blot, biotinylation de surface, extraction et purification d’ADN et d’ARN, test ELISA, électrophorèse, mini-préparation.

- Microbiologie : Ensemencement et repiquage de bactéries/levures, préparation des milieux de culture.

Autres - Encadrement des stagiaires : Licence 3 CMI (Master en Ingénierie BioSanté) en stage pratique,

Licence 3 BBMCG (Biochimie Biologie Moléculaire Cellulaire et Génétique) et des élèves de 3ème en stage d’observation.

- Membre élu représentante des doctorants dans le conseil de laboratoire.

Informatique : GraphPad prism, Photoshop, ImageJ, AxioVision, logiciels bibliographiques Zotero et Référence Manager, logiciels courants sous Windows.

Langues : Français : bilingue Anglais : Moyen Arabe : langue maternelle

Publications et communications

Publications

Article en cours de soumission : K.Sidelarbi, A.Joosten, J.Bertrand, F.Stauffert, A.Bodlenner, P.Compain, F.Becq & C.Norez. Role of the inhibition of ER degradation enhancing -mannosidase-like proteins EDEM in CFTR rescue.

Article publié : PA.Nocquet, R.Hensienne, JW.Delord, E.Laigre, K.Sidelarbi, F.Becq, C.Norez, D.Hazelard, P.Compain. Pushing the limits of catalytic C-H amination in polyoxygenated cyclobutanes. Organic & Biomolecular Chemistry. 2016. DOI: 10.1039/c5ob02602d

Abstract publié : K.Sidelarbi, J.Bertrand, A.Joosten, F.Stauffert, A.Bodlenner, F.Becq, P.Compain & C.Norez. Involvement of EDEM1 and EDEM2 in F508del-CFTR trafficking defect and identification of a new series of correctors with an EDEM-dependent mechanism of action. Pediatric Pulmonology. 2016, Vol 51, S45, p210.

Communications orales

Mars 2016 : 13th European Cystic Fibrosis Society “Basic Science Conference” : « EDEM1 and EDEM2 lectins are involved in F508del-CFTR trafficking defect in cystic fibrosis ». K.Sidelarbi, F.Becq, & C.Norez; Pise, Italie.

Février 2016 : 10th European CF Young Investigator Meeting : « ERManI/EDEM, a tandem ushering in new insights on F508del-CFTR correction ». K.Sidelarbi, F.Becq, P.Compain & C.Norez; Paris, France.

Janvier 2015 : 2ème Journée du laboratoire STIM : « Les inhibiteurs de l’α1,2-mannosidase I comme correcteurs du défaut d’adressage de la protéine F508del-CFTR » K.Sidelarbi, F.Becq, P.Compain & C.Norez ; Poitiers, France.

Communications posters

Mars 2017 : 14th European Cystic Fibrosis Society “Basic Science Conference” : « Inhibition of F508del-CFTR/EDEMs interaction restores a functional but immature F508del CFTR to the plasma membrane ». K.Sidelarbi, F.Becq, P.Compain & C.Norez ; Faro, Portugal.

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Février 2016 : 17ème colloque Français des jeunes chercheurs en mucoviscidose : « ER α1,2-mannosidase et EDEM comme cibles thérapeutique pour F508del-CFTR dans la mucoviscidose ». K.Sidelarbi, F.Becq, P.Compain & C.Norez ; Paris, France.

Mars 2015 : 12th European Cystic Fibrosis Society “Basic Science Conference” : « Iminosugars acting as mannosidase inhibitors in Cystic Fibrosis : Design of multivalent correctors and identification of new therapeutically targets». K.Sidelarbi, J.Bertrand, F.Becq, P.Compain & C.Norez; Faro, Portugal.

Février 2015 : 16ème colloque Français des jeunes chercheurs en mucoviscidose : « Inhibiting the interaction of F508del-CFTR with the lectin EDEM restores its trafficking defect in cystic fibrosis ». K.Sidelarbi, J.Bertrand, A.Joosten, F.Stauffert, A.Bodlenner, F.Becq, P.Compain & C.Norez ; Paris, France.

Références

Pr. Frédéric Becq > Tél : +33 5 49 45 37 29 / Email : frédé[email protected]

Dr. Caroline Norez > Tél : +33 5 49 45 39 33/ Email : [email protected]

Résumé : De nombreuses maladies génétiques sont directement liées à la reconnaissance de protéines mal repliées par le contrôle qualité du réticulum endoplasmique (RE), conduisant à leur rétrotranslocation vers le cytosol puis leur dégradation. Dans le cas des glycoprotéines mutées, comme la protéine F508del-CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), la démannosylation extensive de leur résidus mannoses constitue une étape clé dans ce processus. L’objectif de ce travail a été d’identifier et de caractériser des molécules capables de rétablir l’expression membranaire de F508del-CFTR en ciblant cette activité enzymatique.

Dans un premier temps, nous avons testé des dérivés multivalents basés sur le Deoxymannojirimycin (DMJ), un inhibiteur spécifique de la classe I des α-mannosidases et révélé leur effet correcteur puissant sur F508del-CFTR. Nous avons par la suite mis en évidence leur mécanisme d’action et tenté d’expliquer l’augmentation d’efficacité observée entre les monovalents et les multivalents. Nous nous sommes enfin focalisés sur le rôle des principales mannosidases dans le RE, l’α1,2-mannosidase I du RE (ERManI) et la famille des lectines EDEM (ER degradation-enhancing α-mannosidase-like protein). Nous avons montré par une stratégie de siRNA qu’ERManI, EDEM1 et EDEM2 sont impliquées dans la rétention réticulaire du F508del-CFTR. Notre étude ouvre ainsi de nouvelles perspectives quant à l’identification de nouveaux agents pharmacologiques ciblant ces protéines. Mots clés : F508del-CFTR, contrôle qualité du réticulum endoplasmique, activité mannosidase, EDEM. Summary: Numerous genetic diseases are directly associated to the recognition of misfolded proteins by the endoplasmic reticulum (ER) quality control, leading to their retention and subsequently their retrotranslocation to the cytosol for degradation. In the case of mutated glycoproteins such as F508del-CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), causing CF pathology, mannose trimming is a key step of this process. Our objective was to identify and characterize molecules targeting ER-mannosidases activity, with the goal to restore F508del-CFTR to the plasma membrane.

First, we tested multivalent derivatives, based mainly on Deoxymannojirimycin (DMJ), an inhibitor of α-mannosidases I and revealed their better corrective effect on F508del-CFTR and their mechanism of action. Then we explored the mechanism explaining the higher efficiency of the multivalents compared to the monovalent. Finally, we focused on the role of key players of mannose trimming, ER-α1,2-mannosidase I (ERManI) and EDEMs (ER degradation-enhancing α-mannosidase-like protein) proteins on F508del-CFTR trafficking defect. We showed the implication of ERManI, EDEM1 and EDEM2 in F508del-CFTR retention, using a siRNA strategy. In conclusion, our study highlights these proteins as potential pharmacological targets to develop correctors for the F508del-CFTR trafficking defect. Keywords: F508del-CFTR, endoplasmic reticulum quality control, mannosidase activity, EDEM.

khadidja sidelarbi implication du chaperome de la protéine

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