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PACES – UE 1 - BIOLOGIE CELLULAIRE – Dr. GHORBAL - IPECO – Travail ETE - 2019

UE1

BIOLOGIE MOLECULAIRE

Dr. M. GHORBAL

ADN – REPLICATION DE L’ADN

Cours présenté sous forme

de fiches (15 fiches) illustrées

57-59 rue Victor Schoelcher

86000 POITIERS

Tel : 0549607669

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ADN – REPLICATION DE L’ADN I- ADN : SUPPORT INFORMATION GENETIQUE

Fiche 1 = Historique Fiche 2 = Expérience de Griffith / Expérience d’Avery

II- STRUCTURE DES ACIDES NUCLEIQUES et DIVERSITE DU GENOME

Fiche 3 = Ribose, Désoxyribose, Nucléoside, Nucléotide Fiche 4 = Structure de l’ADN ? Liaison P-diester ? Fiche 5 = Structure de l’ARN Fiche 6 = Topoisomères et topoisomérases Fiche 7 = Diversité de l’ADN dans le monde vivant Fiche 8 = Propriétés physico-chimiques des acides nucléiques Fiche 9 = Visualisation des acides nucléiques

III- LA REPLICATION DE l’ADN

Fiche 10 = Modèle de réplication Fiche 11 = Enzymologie de la réplication Fiche 12 = Réplication chez les procaryotes (E.Coli) Fiche 13 = Cas des eucaryotes

IV- REPLICATION DES TELOMERES (Fiche 14) V- LA P.C.R (Fiche 15)

VI- QCM corrigés


Fiche 1 = Historique

19ème siècle : Gregor Mendel (1865) : Les principes de l’hérédité (lois de Mendel) ont été établis au 19ème siècle bien avant la découverte de l’ADN. Freidrich Miescher (1869) : Découverte de la nucléine dans le noyau (substance riche en phosphate, azote, hydrogène…) (19ème siècle, Freidrich Miescher). Walther Flemming (1882) : Les premières observations des chromosomes en mitose ont été réalisées au 19ème siècle par Walther Flemming (description de la mitose avant la découverte du lien entre ADN et Chromosome).

20ème siècle : Sutton & Boveri (1902) : Sutton et Boveri ont développé au 20ème siècle la théorie chromosomique de l’hérédité : les chromosomes sont porteurs de l’information génétique. Wilhelm Ludvig Johannsen (1909) : La transmission des caractères de génération en génération est due à la présence de gènes (introduction des notions de gène, génotype et phénotype - 20ème siècle). Griffith (1928) : expériences sur des souches de pneumocoques R et S Griffith (20ème siècle) montre qu’une substance chimique peut être transmise d’un organisme à un autre (voir expérience - Fiche 2) Avery (1944) : Expériences de Griffith sont reprises par Avery qui détermine la nature de la substance chimique ADN = support de l’information génétique (voir expérience - Fiche 2)


Fiche 2 = Expériences de Griffith - Expériences d’Avery

Expériences de Griffith (1928)

Il utilise 2 souches de bactéries (pneumocoques R et pneumocoques S) R (souche rugueuse) NON virulents (non pathogènes) S (souche lisse) virulents (pathogènes) elle possède une capsule (enveloppe polysaccharidique). Leur génome code pour les protéines de cette enveloppe qui protège la bactérie contre le système immunitaire.

Protocole : 1- Injection « souche R » aux souris souris vivantes

2- Injection « souche S » aux souris souris mortes

3- Injection « souche S » tuées par la chaleur aux souris souris restent vivantes

4- Injection mélange « souche R » + « S tuées par la chaleur » aux souris mortes Interprétation : La 4ème expérience montre que les bactéries R (non pathogènes), mélangées aux bactéries S tuées, acquièrent un caractère pathogène. Donc, une substance (?) présente dans la souche S inactivée est passée dans la souche R. Les bactéries R ont été transformées, par cette substance (?), en souche virulente.

Expériences d’Avery (1944) : il reprend les travaux de Griffith

Protocole : 1- Extraits acellulaires de bactéries S + Protéases. Puis il mélange avec bactéries R

vivantes. Il injecte ce mélange aux souris souris mortes

2- Extraits acellulaires de bactéries S + RNases. Il les mélange avec bactéries R vivantes. Il

injecte ce mélange aux souris souris mortes

3- Des extraits acellulaires de bactéries S + DNases. Il les mélange avec bactéries R. Il

injecte ce mélange aux souris souris restent vivantes !

Interprétation : Les expériences 1 et 2 montrent que la substance (?) transformante n’est ni l’ARN, ni les Protéines. L’expérience 3 montre que la substance (?) transformante est l’ADN.

Donc ADN = SUPPORT INFORMATION GENETIQUE


Fiche 2

Expériences de Griffith

Expériences d’Avery


Fiche 3 = Ribose, Désoxyribose, Nucléoside, Nucléotide

Le ribose est un pentose de la série D. Dans l’ARN, la numérotation conventionnelle des carbones du ribose est : 1’, 2’, 3’, 4’, 5’ (les chiffres 1, 2, 3 etc.. étant utilisés pour la base azotée).

Le désoxyribose, composant des acides désoxyribonucléiques (ADN), est dérivé du ribose par une réduction de la fonction alcool du carbone n°2 (il est 2’H, 3’OH). Dans l’ADN la numérotation conventionnelle est : 1’, 2’, 3’, 4’, 5’. Un nucléoside est formé d’un sucre (ribose ou désoxyribose) lié à une base azotée (une purine : A ou G ou alors une pyrimidine : C, T ou U ). Le sucre (ribose ou désoxyribose) se lie à la base azotée par liaison N-osidique. La liaison d’un nucléoside avec un phosphate se fait par une estérification de la fonction alcool (carbone n°5’) du sucre et une des trois fonctions acides du phosphate. L’ester obtenu est un nucléotide. Un nucléotide est donc formé d’une base azotée, liée par une liaison osidique avec un sucre, lui-même lié par une liaison ester avec un phosphate.

La nomenclature utilisée pour les nucléosides et les nucléotides est résumée dans le tableau (voir figure-Fiche 3). Les bases sont désignées par une initiale (A, G, C, T, U). Chaque base peut entrer dans la structure de 2 nucléosides (un ribonucléoside ou un désoxyribonucléoside). Et chaque nucléoside peut être lié à 1, 2 ou 3 phosphates. Exemples (AMP : adénosine monophosphate, ATP : adénosine triphosphate, mais dATP : désoxyadénosine triphosphate etc...)

Dans un nucléotide triphosphate (exemple : ATP, voir formule ci-dessous), les liaisons anhydrides

unissant les acides phosphoriques sont des liaisons riches en énergie (liaisons entre P et P,

entre P et P). La rupture de telles liaisons est source d’énergie (ΔG < 0)


Fiche 3 Ribose, Désoxyribose, Nucléoside, Nucléotide


Fiche 4 = Structure de l’ADN ? Liaison P-diester ?

L’ADN (acide désoxyribonucléique) est le support de l’information génétique des procaryotes et des eucaryotes. Les résultats expérimentaux obtenus par Rosalind Franklin (étude de l’ADN par « diffraction des rayons X ») permettent à Watson & Crick (Prix Nobel) de découvrir la structure en double hélice de l’ADN (double brin hélicoïdal). Les 2 brins complémentaires sont enroulés en Hélice droite (forme B, la plus courante in vivo) Chaque brin d’ADN est un polymère linéaire de désoxyribonucléotides (on dit que l’ADN est un poly-désoxyribonucléotide) reliés entre eux par une liaison phosphodiester (liaison entre le 3’OH d’un désoxyribose et le 5’P du désoxyribose du nucléotide suivant). Les deux brins sont complémentaires. Les bases complémentaires (G/C et A/T) sont reliées par des liaisons hydrogènes qui sont des liaisons faibles (3 liaisons entre G et C ; 2 liaisons entre A et T). L’hybridation G/C est donc plus stable que A/T. Cette complémentarité est importante pour la stabilité de la double hélice (stabilité également liée aux liaisons hydrophobes et aux liaisons de Van Der Walls). La double hélice d'ADN est caractérisée par (voir figure ci-dessous) :

Un diamètre de 20 Å (2 nm) Pas d'hélice de 34 Å (3,4 nm) ; 10 pdb par tour d'hélice; Entre 2 pdb = 3,4 Å Son orientation 5’ 3’

Présence de grands sillons (majeurs) et petits sillons (mineurs) : lieu de fixation des protéines régulatrices de l’expression des gènes (de la transcription)

Antiparallèle (2 brins orientés 5’ 3’ mais opposés) Son pourcentage en pdb GC et AT Bicaténaire et linéaire chez les eucaryotes (circulaire chez les procaryotes).

Dans la molécule d’ADN, les bases azotées ont une structure plane et sont tournées vers l’intérieur de la molécule alors que le squelette pentose/phosphate est tourné vers l’extérieur (hydrophile) La succession des P– confère ainsi une charge globale NEGATIVE (ADN = poly-anion).


Fiche 4 = Structure de l’ADN ? Liaison P-diester ?


Fiche 5 = Structure de l’ARN

L’ARN est un polymère linéaire de ribonucléotides (on dit que l’ARN est un poly-ribonucléotide) reliés entre eux par une liaison phosphodiester. Un ribonucléotide = une base azotée (A ou G ou C ou U) + Ribose + P. Pour former un acide ribonucléique les nucléotides (GMP, AMP, UMP, CMP), sont reliés les uns aux autres par des liaisons phosphodiester entre le carbone 3’(voir flèche sur la diapo) d’un premier nucléotide et le carbone 5’ (voir flèche sur la diapo) du nucléotide suivant. De sorte que ces liaisons définissent un sens (sens 5’ 3’) à la molécule. L’ARN (acide ribonucléique) est monobrin mais il peut y avoir des hybridations intra-chaîne. Selon leur fonction, on distingue : Les ARNr = qui participe à la structure des ribosomes. Impliqué dans la synthèse protéique. Les ARNt = transporteur des acides aminés activés vers le lieu de la synthèse protéique. Les ARNm = le messager, produit de la transcription d’un gène qui porte l’information à traduire (pour la synthèse de protéines) Les ARNsn (small nuclear) : sont uniquement dans le noyau. Il s’agit de petits ARN (U1, U2, …) impliqués dans l’épissage des transcrits primaires (une régulation post-transcription).


Fiche 5 = Structure de l’ARN

La liaison phosphodiester :

Hybridations intra-chaîne de l’ARN :


Fiche 6 = Topologie de l’ADN et topoisomérases

Une même molécule d’ADN procaryote (qui est bicaténaire / circulaire) peut exister sous différentes formes appelées Topoisomères :

Forme relâchée Forme Superenroulée (présence de supertours)

Ces 2 topoisomères peut être séparés par électrophorèse (en gel d’agarose) ; La forme superenroulée migre alors plus loin / forme relâché. L’ADN eucaryote (bien que linéaire) se comporte comme une molécule dont les extrémités sont fixes en raison de ses liens dans le noyau. Il peut donc lui aussi présenter des supertours. In vivo, les super tours sont observés au cours de la réplication. En effet, la séparation des 2 brins de la molécule d’ADN va entraîner des supertours > 0 en avant et des supertours négatifs en arrière. La topologie de l’ADN va être contrôlée in vivo par les enzymes TOPOISOMERASES aussi bien chez les procaryotes que les eucaryotes. Les topoisomérases sont des endonucléases qui peuvent couper 1 brin (Topo I) ou les 2 brins simultanément (Topo II) de la molécule d’ADN. Leur action est réversible.

La topoisomérase I coupe une liaison P-diester au niveau d’un seul brin de la double hélice d’ADN. Chez E.Coli, elle se lie au 5’P du brin coupé par l’intermédiaire d’une tyrosine. Donc le brin coupé va réaliser des rotations autour de l’autre brin ce phénomène permet de relâcher des superhélices sous tension. Exemple : si on fait agir la topoisomérase I sur l’ADN circulaire superenroulé bactérien on obtient un ADN circulaire relâché

La topoisomérase II (Gyrase) est une endonucléase qui coupe les liaisons P-diester au niveau des 2 brins de l’ADN simultanément. Son action nécessite l’énergie d’hydrolyse de l’ATP. La topoisomérase II est capable de créer ou d’enlever des supertours dans l’ADN.

Les topoisomérases sont des cibles thérapeutiques pour inhiber la division cellulaire :

La ciprofloxacine est un inhibiteur de topoisomérase utilisé comme antibiotique L’étoposide est un inhibiteur de topoisomérase utilisé en chimiothérapie anti tumorale


Fiche 6 = Topologie de l’ADN et topoisomérases

Topoisomères de l’ADN procaryote

Super tours dans l’ADN eucaryote


Fiche 7 = Diversité de l’ADN dans le monde vivant

L’ADN = support de l’information génétique chez les eucaryotes et les procaryotes. Mais pour les virus, petit génome de quelques milliers de pdb, c’est soit l’ADN (adénovirus), soit l’ARN (rétrovirus) La structure est en double hélice (sauf certains virus dont le génome est un ADN monobrin ou un ARN monobrin) Il existe des différences pour : Le nombre de molécules d’ADN dans la cellule (1 seul ADN chromosomique pour E.Coli /

46 ADN chez l’humain par exemple) La longueur de l’ADN (quelques milliers de pdb à quelques milliards de pdb) La forme de l’ADN (linéaire chez eucaryote / circulaire chez procaryote) La localisation de l’ADN dans la cellule (noyau eucaryote / cytoplasme chez procaryote) La séquence en bases de l’ADN

Chez les procaryotes : ADN dans le cytoplasme (1 seul ADN chromosomique) ADN bicaténaire, circulaire

Longueur = plusieurs millions de nucléotides

De plus il existe plusieurs ADN extra-chromosomiques appelés = PLASMIDES Les plasmides sont des petits ADN circulaires (3000 / 5000 pdb) ayant 1 origine de réplication. Ils peuvent s’exprimer pour permettre la synthèse de protéines de résistance aux antibiotiques. Ils sont impliqués dans la conjugaison bactérienne (passage du plasmide d’une bactérie à l’autre) passage par exemple du facteur sexuel F+ ou des gènes de résistance aux antibiotiques

En technologie, les plasmides sont utilisés comme vecteur d’expression dans les expériences de transfection (clonage moléculaire)

Chez les eucaryotes : L’ADN est nucléaire L’ADN est bicaténaire, linéaire Longueur = plusieurs milliards de nucléotides

L’ADN est associé aux protéines histones pour former la chromatine. Elle présente plusieurs niveaux de condensation (en allant du collier de perles chromosome métaphasique ; voir cours « chromosoe & caryotype »)

L’ADN mitochondrial (et des plastes) est circulaire / bicaténaire Le code génétique de l’ADN mitochondrial est différent de celui de l’ADN nucléaire L’ADN mitochondrial code pour des ARNm, ARNt et ARNr L’ADN mitochondrial code pour quelques protéines mitochondriales Le génome mitochondrial (et donc les pathologies associées) est transmis par la mère


Fiche 7 = Diversité de l’ADN dans le monde vivant

Compaction de la chromatine eucaryote


Fiche 8 = Propriétés physico-chimiques des acides nucléiques Propriétés importantes pour ISOLER et ETUDIER les acides nucléiques

La stabilité des acides nucléiques dépend :

de la spécificité de l’appariement des bases des interactions hydrophobes des interactions électrostatiques

L’ADN est soluble dans le phénol, les solutions salines, les solutions alcalines L’ADN est précipité par l’alcool, les solutions acides fortes L’ADN est très acide en solution aqueuse Viscosité : l’ADN en solution présente un aspect visqueux L’ADN peut être dénaturé chimiquement (par l’urée, le formamide) L’ADN est dénaturé à pH élevé Les acides nucléiques sont dénaturé par la chaleur

Les ARN sont dénaturés PROGRESSIVEMENT à la chaleur contrairement aux ADN Les ADN sont dénaturés BRUTALEMENT à une certaine température appelé T°m. La température de fusion (T°m) de l’ADN dépend du pourcentage en pdb G/C par rapport à A/T. Plus le % en paires G/C est élevé plus il faut fournir d’énergie pour séparer les 2 brins.

Les propriétés de dénaturation/renaturation de l’ADN sont utilisées dans la P.C.R. L’absorption UV maximale des bases azotées (ou Densité optique) est obtenue à la longueur

d’onde = 260 nm. L’absorption des UV permet de quantifier l’ADN en solution (loi de Beer Lambert)

A = ϵ.l.c ϵ.= coefficient d’extinction molaire / l = longueur / c = concentration de l’ADN en solution

La densité optique (ou absorbance) dépend de la nature de l’acide nucléique et du coefficient d’extinction molaire

Exemple : Si D.O de 1 à 260 nm alors on a 50 µg /ml d’ADN bicaténaire

L’absorption de l’ADN à 260 nm dépend du coefficient d’extinction molaire L’absorption de l’ADN à 260 nm dépend de la nature de l’acide nucléique Le rapport A260 nm / A280 nm permet de déterminer la pureté de l’ADN

Si > 1.8 contamination par ARN Si < 1.8 contamination par protéines


Fiche 9 = Visualisation des acides nucléiques L’ADN est un poly-anion.

L’ADN migre du pôle – vers + dans un gel d’agarose (électrophorèse)

La migration des ADN en gel d’agarose est fonction de la taille des ADN

L’utilisation d’un agent intercalent (B.E.T) permet d’observer les fragments d’ADN en gel d’agarose sous UV.

Il existe une relation linéaire entre la distance de migration des ADN en gel d’agarose et leur taille en pdb (en échelle semi log).

Fiche 9 = Visualisation des acides nucléiques

Gel d’électrophorèse sous U.V

Courbe d’étalonnage (ci-dessous, à droite) avec : En abscisses, les distances de migration par rapport au puits d’inclusion En ordonnées la taille (échelle semi logarithmique). Gel (a gauche), Puit 1 : Marqueur de taille, Puit 2 : échantillon d’ADN de taille inconnue


Fiche 10 = Modèle de réplication (Meselson-Sthal, 1958).

Utilisation de la centrifugation à l’équilibre sur gradient de ClCs

Cette technique de centrifugation permet de séparer des ADN en fonction de leur densité. L'ADN naturel est à base d'azote 14N et a une densité de 1,69 environ. En cas d'incorporation de nucléotides à base d'azote 15N il y a une augmentation de la densité de l'ADN (d = 1,75 environ), cet ADN lourd migre alors différemment (plus loin) dans le gradient de ClCs.

Protocole : a) Culture de bactéries en milieu lourd (15N) pendant un grand nombre de génération le temps que l'ADN bactérien soit constitué de nucléotides à base de 15N exclusivement. Des bactéries sont prélevées afin de récupérer l'ADN en solution en vue d'une centrifugation sur gradient de ClCs. b) Passage du reste de la culture dans un milieu 14N = Temps zéro.

Au bout d’une génération (G1), prélèvement de bactéries et d’échantillons contenant l’ADN puis centrifugation à l’équilibre. Au bout de la 2ème génération (G2), prélèvement d’échantillons contenant l’ADN, puis centrifugation à l’équilibre.

Résultats des centrifugations :

Tube de centrifugation après X générations en (15N): une seule bande à 1,75 (ADN lourd, 15N/15N) Après 1 seule génération en milieu(14N): une seule bande à 1,72 (100% d'ADN mi-lourd/mi-léger, 15N/14N) Après 2 générations en milieu(14N): 1 bande à 1,69 (1/2 ADN léger, 14N/14N) et 1 bande à 1,72 (1/2 ADN mi-Lourd/mi-léger, 15N/14N)

Interprétation : Réplication semi-conservatrice = chaque brin de la molécule parentale sert de matrice pour la synthèse d'une molécule d’ADN fille qui est composée d’un brin parental et d’un brin néosynthétisé. NB: Si la réplication était « conservative » il y aurait 2 bandes dans le tube de centrifugation en G1 : une bande à la densité = 1.69 (50% d'ADN léger) et l'autre à densité = 1.75 (50% ADN lourd).


Fiche 10 = Modèle de réplication (Meselson-Sthal, 1958).


Fiche 11 = Enzymologie de la réplication

Plusieurs activités enzymatiques sont nécessaires au cours de la réplication de l’ADN :

Primase, Hélicase, ADN polymérase, Ligase, topoisomérase . La Primase

La primase est une ARN-polymérase ADN dépendante. Elle synthétise l’amorce d’ARN qui va fournir l’extrémité 3’-OH indispensable au départ de la réplication. L'ADN polymérase pourra alors allonger cette amorce dans le sens 5’3’. L’hélicase

L’hélicase permet l’ouverture de la double hélice (rupture des liaisons hydrogène) au moment de l’initiation de la réplication puis au fur et à mesure que l’ADN polymérase progresse au cours de la réplication (lors de l’élongation). Son action est accompagnée de la fixation de protéines spécifiques (protéines SSB) qui stabilisent, protègent les simples brins et qui empêchent un nouvel appariement des bases qui viennent d’être séparées par l’hélicase. La ligase

La ligase catalyse la liaison d’une extrémité 3’OH d’un brin à une extrémité 5’P d’un brin adjacent :

------Brin-3’-OH + P-5’-Brin------- ----Brin-DNA-3’-O-P-O-5’-Brin DNA----- Son action est importante au cours de la réplication pour lier deux segments d’ADN adjacents lors de la synthèse du brin tardif d’ADN. Les topoisomérases (Topo I et Topo II, voir fiche 6)

Les topoisomérases sont des endonucléases réversibles qui modifient la topologie de l’ADN. Elles sont importantes pour régler notamment le problème lié au super enroulement (tortillement). Elles permettent de réduire les contraintes observées en avant de la fourche de réplication pour que celle-ci progresse dans le sens 5’ 3’. L’ADN polymérase

Le fonctionnement général d’une ADN polymérases nécessite : (1) les 4 dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP); (2) un brin d’ADN matrice à partir duquel sera synthétisé le nouveau brin par complémentarité ; (3) l’extrémité 3’-OH d’une amorce d’ARN.


Une ADN polymérase peut, selon l’ADN polymérase, posséder 1, 2 ou 3 activités enzymatiques (voir le tableau du poly pour les ADN polymérases procaryotes et les ADN polymérases eucaryotes) :

Activité 5' polymérasique (existe chez toutes les ADN polymérases) : En s’appuyant sur la séquence de la matrice, l’enzyme va polymériser un nouveau brin d’ADN dans le sens 5’ 3' en allongeant l’amorce d’ARN. Les nucléotides polymérisés seront unis par des liaisons P-diester. L’énergie nécessaire pour la réaction de polymérisation est apportée par le nucléotide entrant (liaisons riches en ENERGIE entre les

groupements P et P). Le site actif de l’ADN polymérase analyse l’aptitude du nucléotide à s’apparier correctement avec le nucléotide du brin matriciel (A/T ou G/C) ; Un appariement correct permet alors à l’ADN polymérase de catalyser la formation de la liaison P-diester (attaque nucléophile du 3’-OH sur le 5’-P du nucléotide entrant).

Activité 3' exonucléasique (existe chez toutes les ADN polymérases procaryotes et certaines polymérases eucaryotes): En cours de synthèse, l’ADN polymérase peut faire une erreur et incorporer un nucléotide ayant une base incorrecte (non complémentaire = mésappariement). Une telle erreur provoque une distorsion qui est détectée par l’ADN polymérase. L'activité correctrice 3’exonucléasique permet alors d'éliminer la dernière base ajoutée en cours de synthèse. Elle permet donc d'assurer la fidélité de la réplication. Cette correction en cours de synthèse de l’ADN s’appelle "correction sur épreuve" (proofreading). Elle permet de diminuer considérablement le taux d’erreurs de réplication (de 10-4 à 10-9 environ).

Activité 5' exonucléasique (existe chez l’ADN polymérase I procaryote mais pas chez

les eucaryotes) : C’est une activité enzymatique qui élimine plusieurs nucléotides. Au cours de la réplication, par exemple, elle élimine l’amorce d’ARN lorsqu’un fragment d’Okasaki rejoint le fragment précédemment synthétisé.


Fiche 12 = Réplication chez les procaryotes (E.Coli)

La réplication chez les procaryotes débute au niveau d’une seule origine (ORI C). L’œil de réplication formé permet alors de définir 2 fourches de réplication. La réplication est bidirectionnelle (sens 5’ 3’), semi conservatrice. La vitesse de réplication = 1000 bases /s. En fin de réplication, les 2 fourches se rejoignent (car DNA est circulaire).

Initiation

L’initiation débute par la reconnaissance de l’origine de réplication (ORI C) par les protéines DNAA Ceci permet le recrutement de la Primase et de l’hélicase qui forment un complexe multiprotéique = Primosome. Ce complexe est rejoint également par la Gyrase (une Topo II). L’hélicase va ouvrir la double hélice en séparant les 2 brins d’ADN (donc formation de l’œil de réplication). Des protéines SSB stabilisent et protègent les simples brins d’ADN (et empêchent donc leur ré-enroulement).

Deux ADN polymérases III se lient alors au niveau de chaque brin parental. La primase synthétise alors les amorces d’ARN nécessaire à l’initiation de la synthèse d’ADN par l’ADN polymérase III (dans le sens 5’ 3’).

Elongation

Au niveau d’une fourche de réplication, chaque brin d’ADN de la molécule parentale va servir de matrice pour la synthèse d'un nouveau brin. Ces deux brins d’ADN sont répliqués différemment :

Elongation du brin avancé ou précoce (synthèse continue) Après la formation du complexe d’initiation (ou amorçage) au niveau de l’origine de réplication, le brin avancé (précoce) est allongé de façon continue par l’ADN polymérase III (à partir d’une seule amorce d’ARN) dans le sens 5’3’ qui coïncide dans ce cas avec le sens de déplacement de la fourche.

Elongation du brin tardif ou retardé (synthèse discontinue car elle doit se dérouler dans le sens opposé à celui du déplacement de la fourche).

La synthèse du brin tardif est plus compliquée car la croissance de la chaîne doit suivre le déplacement de la fourche alors que l’ADN polymérase ne polymérise que dans le sens 5’3’. Pour cette raison, le brin retardé sera synthétisé de façon discontinue sous forme de petits fragments à partir de plusieurs amorces d’ARN. A mesure que progresse la polymérisation du brin précoce, les sites du brin parental non répliqué seront recopiés en petits ARN par la primase. Ces amorces seront allongées dans le sens 5’3’ par l’ADN polymérase III pour constituer des petits fragments appelés : fragments d’Okasaki (environ 1000 bases chez E.Coli). Lorsque l’extrémité 3’OH d’un fragment d’Okasaki rejoint l’extrémité 5’P du fragment d’Okasaki précédemment synthétisé, l’ADN polymérase I va relayer l’ADN polymérase III. L’ADN polymérase I utilise alors :

son activité 5’-exonucléasique pour éliminer les nucléotides de l’amorce d’ARN puis son activité 5’-polymérasique pour combler l’espace entre 2 fragments d’ADN.

Enfin, c’est la ligase qui va réunir les 2 fragments d’ADN adjacents. Terminaison

La terminaison de la réplication a lieu lorsque le complexe enzymatique de réplication arrive au niveau d’une séquence de terminaison de la réplication. Le complexe enzymatique se détache et la topoisomérase II permet de dissocier les 2 molécules d’ADN filles.


Fiche 12 = Réplication chez les procaryotes (E.Coli) Initiation de la réplication Hélicase : séparation des 2 brins d’ADN Primase : RNA polymerase DNA dépendante Gyrase : topoisomérase


Elongation des brins précoce et retardé lors de l’élongation


Détail pour la synthèse du brin retardé lors de l’élongation Primase , ADN pol III, ADN pol I, Ligase


Fiche 13 = Réplication chez les eucaryotes

Chez les eucaryotes, on retrouve les mêmes mécanismes que ceux décrits chez E.Coli. Pour une fourche de réplication, il y a un brin précoce synthétisé en continu et un brin tardif synthétisé en discontinue (fragments d’Okasaki ici plus courts = 200 bases environ). Mais chez les eucaryotes la réplication débute au niveau de plusieurs origines de réplication Donc une fourche rejoindra la fourche de l’origine de réplication suivante Les ADN polymérases eucaryotes sont différentes (ADN pol alpha, béta…, voir tableau du poly) et présentent toutes une activité 5’ polymérasique.

NB : la DNA pol alpha = synthèse de l’amorce ARN

Certaines possèdent une activité de correction sur épreuve (3’ exonucléasique). Mais aucune ne possède l’activité 5’ exonucléasique. Chez les eucaryotes, les amorces d’ARN sont dégradées par la RNAse H (une ribonucléase) Protéines impliquées lors de réplication eucaryote

ADN polymérase alpha = une primase Le PCNA est un co-facteur de l’ADN polymérase eucaryote. Le PCNA est un marqueur de prolifération cellulaire (utilisé en anatomopathologie) Le facteur de réplication C (RFC) est un co-facteur de l’ADN polymérase eucaryote Le PCNA et le facteur de réplication C permettent la progression de l’ADN polymérase pendant la réplication.

Le facteur de réplication A (RPA : Replication Protéine A) se fixe sur l’ADN simple brin pour le maintenir sous forme monocaténaire. Il est l’équivalent des protéines SSB des procaryotes.

Les amorces d’ARN sont dégradées RNAse H (une ribonucléase) La FEN1 = endonucléase impliquée dans Réparation DNA Les cohésines stabilisent la chromatine Les topoisomérases jouent un rôle pour diminuer les contraintes


Fiche 13 = Réplication chez les eucaryotes

Plusieurs origines de réplication


Fiche 14 : Réplication des télomères

Blackburn, Greider & Jack Szostak (Prix Nobel de médecine 2009 pour leurs travaux sur la réplication des télomères par l'enzyme télomérase). Les télomères sont les extrémités des chromosomes eucaryotes. Il s’agit de régions non codantes. Ils sont formés de répétitions en tandem de 6 nucléotides (N fois) situés aux extrémités 3’ de l’ADN. Ces motifs sont très conservés au cours de l’évolution. Exemples : CCA GGG chez tétrahyména (un protozoaire) et TTA GGG (chez l’humain) ne diffère que d’une seule base. Les télomères sont nécessaires à la protection et à la stabilité des chromosomes. Problème posé ? Au cours de la réplication de l’ADN chromosomique, les amorces d’ARN sont dégradées par une ribonucléase (RNAse H). Pour le brin précoce des 2 fourches les plus externes, la synthèse d’ADN va se poursuivre jusqu’à l’extrémité de l’ADN. Mais pour les brins tardifs (à synthèse discontinue) des 2 fourches les plus externes, se pose le problème de la dernière amorce ARN qui sera dégradée (mais non remplacée par de l’ADN). Ainsi, l’extrémité de ce brin à tendance à se raccourcir au fur et à mesure des cycles de réplication. Ce raccourcissement des télomères rend les chromosomes instables qui finissent par fusionner entre eux, ce qui conduit à l’apoptose. Cela explique le vieillissement cellulaire (sénescence). En effet une cellule normale est incapable d’allonger ses télomères, elle est mortelle (elle va mourir après un certain nombre de cycles de division cellulaire). Comment certaines cellules peuvent conserver les télomères au cours des divisions cellulaires ? : Cellules souches (embryon), cellules germinales La télomérase permet l’intégrité des extrémités télomériques.

La télomérase est un complexe RNP (ribonucléoprotéique) constitué de protéines et d’ARN. Cet ARN possède la séquence complémentaire des motifs nucléotidiques répétés du télomère (exemple : CCC UAA si l’extrémité 3’ télomérique contient : TTA GGG, cas de l’humain). L’ARN de la télomérase va servir de matrice alors que la partie protéique de la télomérase possède l’activité enzymatique (activité de type transcriptase inverse ou reverse transcription) En se plaçant à l'extrémité 3’ télomérique, la télomérase rallonge cette extrémité télomérique en enchainant (TTA GGG) n fois (NB = c’est bien l’extrémité 3’ du brin d’ADN parental qui est allongée). Cela permettra ensuite de compléter le brin néosynthétisé suite à l’action de : Primase (synthèse d’une amorce) ; ADN polymérase ; Ligase. Ainsi, à chaque cycle cellulaire, l'enzyme allonge les télomères (extrémité 3’ du télomère) ce qui permettra de prolonger la durée de vie des cellules. La télomérase est aussi très active dans les cellules cancéreuses et contribue de la sorte à leur prolifération et à les rendre immortelles. Plusieurs biologistes voient dans l'enzyme une cible de choix pour la mise au point de traitements anticancéreux.


NB = problème du brin avancé lors de la réplication des télomères ?

L’ADN parental (en noir) est répliqué (ADN nouvellement synthétisé en bleu). La réplication semi-conservative de l’ADN ne permet pas de régénérer une extension 3’ simple brin à l’extrémité du brin avancé. En revanche, à l’extrémité du brin retardé, l’élimination de la dernière amorce d’ARN (en rouge) produit une courte extension simple brin. La création du substrat de la télomérase à l’extrémité du brin avancé ne peut se faire que par l’intervention d’une exonucléase.


Fiche 14 : Réplication des télomères chez tétrahymena


Fiche 15 : La P.C.R (Polymerase Chain Réaction) Réaction de polymérisation en chaîne :

Méthode de biologie moléculaire pour amplifier de l’ADN génique in vitro. Elle permet de dupliquer en très grand nombre, et en quelques heures, une séquence d'ADN CONNUE, à partir d'une faible quantité (de l'ordre de quelques picogrammes) d'acide nucléique.

Dans le milieu d’étude on met :

L’ADN à amplifier Les dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) Les amorces 5’ et 3’ (amorces spécifiques constituées d'oligonucléotides de synthèse de 20 nucléotides environ) La Taq polymérase (ADN polymérase thermorésistante)

Plusieurs cycles d’amplification sont réalisés avec DENATURATION (chauffage 95°C = pour séparer les 2 brins de l’ADN à amplifier) + RENATURATION (refroidissement 50°C = pour faire hybrider les amorces) puis allongement de l’amorce par la Taq polymérase à 70°C. Au bout de N cycles, le coefficient d’amplification théorique A = 2n

La PCR est utilisée pour :

Tests de paternité

Diagnostic des maladies génétiques

Diagnostics biologiques


Fiche 15 : La P.C.R (Polymerase Chain Réaction)


VI- QCM corrigés sur l’ADN et la réplication

1) Concernant l’ADN :

A) L’ADN est le support de l’information génétique chez les procaryotes

B) L’ADN eucaryote est une double hélice circulaire

C) Les 2 brins complémentaires d’une molécule d’ADN sont réunis par des liaisons phosphodiester

D) Dans l’ADN, le squelette pentose phosphate est orienté vers l’extérieur de la molécule d’ADN

E) La double hélice d’ADN possède un pas d’hélice de 3,4 Angstrüm

2) Dans un désoxyriblonucléotide monophosphate :

A) Le carbone 1’ du désoxyribose est relié à un groupement phosphate

B) Le carbone 2’ est relié à un groupement OH

C) Le carbone 3’ est relié à un groupement OH

D) Le carbone 4’ est relié à un groupement phosphate

E) Le carbone 5’ est relié à une base azotée

3) Concernant les enzymes impliquées dans la réplication chez E.Coli :

A) La primase fabrique des amorces ARN

B) L’hélicase crée des liaisons phosphodiester entre les fragments d’Okasaki

C) La topoisomérase II permet de diminuer les super tours observées en avant de la fourche de

réplication

D) La ligase ouvre la double hélice au niveau de l’origine de réplication

E) La réverse transcriptase permet de remplacer les amorces ARN par de l’ADN

4) Concernant les activités enzymatiques observées lors de la réplication de l’ADN chez E.Coli :

A) Le primosome est un complexe multiprotéique qui comprend notamment l’hélicase et la primase

B) Les protéines DNAA permettent le déroulement et la séparation des 2 brins de la molécule d’ADN

C) La primase est une ARN polymérase-ARN dépendante

D) Les topoisomérases II éliminent les contraintes observées en aval de la fourche de réplication

E) L’ADN polymérase III utilise une amorce d’ARN pour fabriquer de l’ADN

5) Les télomères :

A) Sont situés aux extrémités 3’ de l’ADN chromosomique eucaryote

B) Codent pour la télomérase

C) Sont importants pour la stabilité des chromosomes

D) L’ADN possède 4 télomères

E) Le télomère humain est formé de répétitions TTAGGG


Correction des QCM 1 à 5

1) A D

B : L’ADN eucaryote est une double hélice LINEAIRE (elle est circulaire chez les procaryotes)

C : Les 2 brins complémentaires sont réunis par des liaisons HYDROGENE

E : Le pas d’hélice de 34 Angstrüm (10 paires de base)

2) B C

A : Le carbone 1’ du désoxyribose est relié à une BASE AZOTEE

D et E : C’est le carbone 5’ qui est relié à un groupement phosphate

3) A C

B : L’hélicase permet la séparation des 2 brins d’ADN

D : La ligase réunit 2 fragments d’ADN adjacents

E : La réverse transcriptase n’est pas impliquée dans la réplication de l’ADN

4) A D E

B : Les DNAA permettent la reconnaissance de l’origine de réplication ORI C. Le déroulement +

séparation des 2 brins implique les protéines DNAB (hélicases)

C : La primase est une ARN polymérase-ADN dépendante

5) A C E

B : Le télomère correspond à des séquences répétées NON CODANTES

D : L’ADN possède 2 extrémités télomériques

ue1 biologie moleculairemolécul… · la topoisomérase i coupe une liaison p-diester au niveau...

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