Protéines mal repliées et stress associé au réticulum endoplasmique : implications dans la pathogénèse de la

sclérose latérale amyotrophique

Mémoire

Audrey Labarre

Maîtrise en biologie cellulaire et moléculaire Maître ès sciences (M.Sc.)

Québec, Canada

© Audrey Labarre, 2014

iii

Résumé

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative incurable. Environ

10% des cas de SLA sont familiaux (SLAF) et 90% sont sporadiques (SLAS). À l'heure actuelle, des

mutations dans les gènes SOD1 et TARDBP demeurent parmi les principales causes de SLAF.

Plusieurs évidences tendent à attribuer aux facteurs environnementaux une place de plus en plus

importante dans l'identification de causes probables de la SLAS. Cependant, notre compréhension

des mécanismes menant à des anomalies dans ces gènes ou à l’exposition à divers facteurs

environnementaux et à la mort des neurones moteurs reste limitée. À ce jour, aucun traitement

efficace n’a encore été décrit pour la SLA. C’est pourquoi le développement d’une immunothérapie

avec des anticorps anti-SOD1 mal repliée spécifiques nous permettra de mieux comprendre les

mécanismes et les causes environnementales susceptibles d’être impliqués dans la SLAS. Ceci

ouvrira de nouvelles perspectives diagnostiques et thérapeutiques pour le traitement de cette

maladie encore incurable.

v

Abstract

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease. About 10% of cases are

familial (FALS) and 90% are sporadic (SALS). Currently, mutations in SOD1 and TARDBP genes are

among the main causes of FALS. Many evidences suggest that environmental factors can be an

important element in the identification of probable SALS causes. However, our comprehension of

mechanisms leading to mutations in these genes or exposure to different environmental factors, to

the death of motor neurons is still limited. Currently, there is not efficient cure for ALS. The

development of an immunotherapy with specific anti-misfolded SOD1 antibodies will therefore help us

to understand the mechanisms and environmental factors that may be involved. This can lead to new

perspectives for early diagnosis and prognosis, and new therapeutic approaches for this yet incurable

disease.

vii

Table des matières

Résumé ............................................................................................................................................................... iii

Abstract ............................................................................................................................................................... v

Table des matières ............................................................................................................................................. vii

Liste des tableaux .............................................................................................................................................. ix

Liste des figures ................................................................................................................................................. xi

Liste des abréviations........................................................................................................................................ xiii

Remerciements ................................................................................................................................................ xvii

Avant-propos ..................................................................................................................................................... xix

Chapitre 1 : Introduction et problématique .......................................................................................................... 1

1.1 La sclérose latérale amyotrophique .......................................................................................................... 3

1.1.1 Description générale .......................................................................................................................... 3

1.1.2 La SLA familiale ................................................................................................................................. 4

1.1.3 La SLA sporadique .......................................................................................................................... 10

1.2 L’étiologie de la SLA ............................................................................................................................... 10

1.2.1 La toxicité de la SOD1 ..................................................................................................................... 10

1.2.2 Protéinopathie TDP-43 et FUS ........................................................................................................ 14

1.2.3 Facteurs environnementaux ............................................................................................................ 16

1.3 Le stress associé au réticulum endoplasmique ...................................................................................... 17

1.3.1 La réponse aux protéines mal repliées ............................................................................................ 17

1.3.2 Composés connus pour induire un stress au réticulum endoplasmique .......................................... 21

1.4 Les modèles animaux de la SLA ............................................................................................................ 22

1.5 Immunothérapie ...................................................................................................................................... 25

1.6 Problématique et hypothèses de travail .................................................................................................. 26

Chapitre 2 : Des inclusions cytoplasmiques de TDP-43 sont détectés dans les neurones moteurs murins NSC-

34 traités au curcuma ........................................................................................................................................ 29

2.1 Résumé .................................................................................................................................................. 31

2.2 Abstract ................................................................................................................................................... 32

2.3 Introduction ............................................................................................................................................. 33

2.4 Experimental procedures ........................................................................................................................ 34

2.5 Results .................................................................................................................................................... 36

2.6 Discussion .............................................................................................................................................. 40

2.7 Acknowledgements ................................................................................................................................. 41

viii

2.8 References .............................................................................................................................................. 42

Chapitre 3 : L’immunothérapie pour le traitement de la sclérose latérale amyotrophique ................................ 45

3.1 Résumé ................................................................................................................................................... 46

3.2 Abstract ................................................................................................................................................... 46

3.3 Introduction ............................................................................................................................................. 47

3.4 Éléments cruciaux à considérer pour le développement d’une immunothérapie .................................... 51

3.5 Les approches d’immunisation pour la SLA causée par des mutations dans le gène SOD1 .................. 53

3.6 Discussion et perspectives futures .......................................................................................................... 55

3.7 Remerciements et financements ............................................................................................................. 56

3.8 Références .............................................................................................................................................. 57

Chapitre 4 : Développement d'une immunothérapie ciblant la protéine SOD1 mal repliée pour le traitement de

la SLA ................................................................................................................................................................ 59

4.1 Introduction ............................................................................................................................................. 61

4.2 Matériel et méthode ................................................................................................................................ 62

4.3 Résultats ................................................................................................................................................ 66

4.4 Discussion ............................................................................................................................................... 70

Chapitre 5 : Conclusion et perspectives ............................................................................................................ 73

Bibliographie ...................................................................................................................................................... 77

ix

Liste des tableaux

Tableau 1.1 Principaux loci et gènes mutés identifiés chez les patients atteints de SLAF ................................. 6

Tableau 1.2 Souris transgéniques SOD1 couramment utilisées pour l’étude de la SLAF ................................. 24

Tableau 3.1 Souris transgéniques SOD1 couramment utilisées pour l’étude de la SLA ................................... 48

Tableau 4.1 Grille pour déterminer le score neurologique ................................................................................ 63

Tableau 4.2 Récapitulatif des groupes expérimentaux ..................................................................................... 64

xi

Liste des figures

Figure 1.1 Le système moteur humain et son implication dans la SLA ............................................................... 4

Figure 1.2 Représentation tridimensionnelle de la SOD1 ................................................................................... 5

Figure 1.3 Mutations de la SOD1 en lien avec la SLAF ...................................................................................... 7

Figure 1.4 Mutations de la TDP-43 en lien avec la SLA ..................................................................................... 9

Figure 1.5 Modèle de toxicité de la SOD1 impliquant son mauvais repliement et l'agrégation protéique ......... 12

Figure 1.6 Contribution des différents types cellulaires au développement de la SLA ...................................... 14

Figure 1.7 Modèle de protéinopathie de TDP-43 .............................................................................................. 16

Figure 1.8 Représentation schématique des voies de signalisation initiées par les trois branches de l'UPR ... 19

Figure 2.1 Curcumin treatment causes a increase of the mortality rate ............................................................ 37

Figure 2.2 Curcumin-treated cells induced GRP-78 expression and cytoplasmic TDP-43 accumulation ......... 39

Figure 2.3 Cytoplasmic TDP-43 accumulation detected in curcumin-treated cells ............................................ 40

Figure 3.1 Modèle de toxicité associé au mauvais repliement de la protéine SOD1 et à son agrégation ......... 50

Figure 3.2 Réaction immunitaire spécifique résultant de différentes stratégies d’immunisation ....................... 52

Figure 4.1 Design expérimental ........................................................................................................................ 64

Figure 4.2 Immunisation des souris SOD1G37R et tgSOD1WT avec le peptide cystéine (SOD1cys111) ....... 67

Figure 4.3 Titre des anticorps des souris hSOD1G37R immunisées ................................................................ 68

Figure 4.4 Des agrégats protéiques SOD1 positifs sont détectables chez les souris tgSOD1WT ayant reçu le

peptide KLH-SOD1 cys111 ............................................................................................................................... 69

xiii

Liste des abréviations

ALS: Amyotrophic lateral sclerosis

ANOVA: Analysis of variance

ATF6: Activating transcription factor 6

BGS : Bovine growth serum

BHE: Barrière hémato-encéphalique

CIHR: Canadian Institutes of Health Research

Cu: Cuivre

Cys: Cystéine

DAPI: 4',6-diamidino-2-phenylindole

DLFT: Dégénérescence lobaire frontrotemporale

DMSO: Dimethyl sulfoxide

EDTA: Éthylène diamine tétra acétique

ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay

ER: Endoplasmic reticulum

ERAD: Endoplasmic-reticulum-associated protein degradation

FALS: Familial amyotrophic lateral sclerosis

FRQS: Fonds de recherche du Québec - Santé

FUS: Fused in sarcoma

GRP-78/Bip: Glucose-regulated protein 78/B-cell immunoglobulin binding protein

GTP: N-acétylglucosamine phototransférase

IgG: Immunoglobuline G

Ire1: Inositol-requiring enzyme 1

IRES: Internal ribosome entry site

IVIG: Immunoglobulines intraveineuses

KO: knock out

NFL: Neurofilament light chain

OCT: Optimal Cutting Temperature compound

PERK: Protein kinase RNA-activated (PKR)-like ER kinase

RE: Réticulum endoplasmique

ROS: Espèces réactives d'oxygène

SALS: Sporadic amyotrophic lateral sclerosis

scFv: fragments fonctionnel d’anticorps à domaine unique

SDS: Sodium dodecyl sulfate

SLA: Sclérose latérale amyotrophique

SLAF: Sclérose latérale amyotrophique familiale

SLAS: Sclérose latérale amyotrophique sporadique

SNC: Système nerveux central

SOD: Superoxyde dismutase

SOD1: Cu/Zn superoxyde dismutase 1

xiv

SOD2: Mn superoxyde dismutase 2, mitochondriale

SOD3: Cu/Zn superoxyde dismutase 3, extracellulaire

TDP-43: Tar-DNA binding protein 43

UPR: Unfolded protein response

WT: wild-type

XBP1: X-box binding protein 1

Zn: Zinc

xv

Un adulte créatif est un enfant qui a survécu ...

ou un scientifique qui ira loin.

- Ursula K. Le Guin, avec le grain de sel d'Amélie Langlois

À toi parrain. J'espère que de là-haut, tu es fier de moi.

xvii

Remerciements

J'aimerais tout d'abord remercier Dr François Gros-Louis, mon directeur de recherche, pour la liberté,

le soutien et la confiance qu'il m'a accordé tout au long de ma maîtrise. Merci pour tout, vraiment.

Merci également à Dr François Berthod, mon codirecteur, pour son soutien et ses bons conseils.

Merci aux membres de mon équipe de recherche, plus particulièrement à Lydia Touzel Deschênes et

Bastien Paré, pour leur écoute, leur aide et leur bonne humeur. Merci à Sabrina Bellenfant, de mon

équipe de recherche "étendue", pour ses conseils et ses fous rires.

Un merci tout spécial à Sophie Laffray. Ma belle Sophie, merci de m'avoir enseigné la rigueur, la

passion et la détermination. Et surtout, merci de m'avoir fait réaliser que la bonne science et les bons

scientifiques ne font pas toujours partie des gros journaux. La roue tourne. Merci pour cette phrase

qui me motive sans cesse. Merci à Marie-Josée Beaudet, pour ta patience et ta passion de la

science. Tes enseignements me resteront en mémoire longtemps.

Merci à PETER PETER et Gab Paquet pour votre musique. Crier vos chansons à tue-tête a

grandement contribué à ce que je garde le cap.

Merci à Nad, ma coloc, pour l’ensemble de l’œuvre. Ma vie ne serait pas la même sans toi. Merci

d’avoir ensoleillé mes soirées avec nos fous rires et nos jasettes qui durent des heures. Merci aussi à

Marie-Ève qui, de Montréal, a su m'encourager et me soutenir malgré la distance. Je reviens au

bercail. Nos meilleures années d'amitié sont à venir, j'en suis certaine.

Merci aux amis du LOEX, plus particulièrement à Lorène Mottier, Pascal Morissette-Martin,

Sébastien Cadau, Kim Aubin et Julie Bérubé. Lorène, merci pour tous ces moments à se supporter

l'une l'autre. Merci pour tous nos fous rires et nos conneries. Ton amitié est très précieuse à mes

yeux. Ça valait la peine de faire un saut à Québec pour mes études juste pour te connaître. On skype

mon amie ! Pascal, mon "bro" du baccalauréat, merci pour tous ces beaux moments à rire

simplement qu'en se regardant. On ne se lâche pas. L'Ontario, c'est à côté ! Kim, merci d'avoir égayé

l'ambiance du bureau. J'ai adoré mes 2 années à tes côtés, à rire et à pleurer. Julie, merci pour ces

xviii

soirées "vino-ventilation" qui m'ont fait le plus grand bien. Finalement, merci Seb, tu es vraiment le

grand frère que je n'ai jamais eu.

Merci à vous, papa et maman, de m'avoir encouragé dans mes millions de projets plus fous les uns

que les autres et de m'inciter à repousser sans cesse mes limites. Vous motivez chacune de mes

décisions. Vos encouragements sont ce qui m'est le plus précieux au monde.

Merci à ma soeur, Laurence, pour qui j'ai une admiration sans borne. C'est moi la grande soeur, mais

c'est vraiment toi mon modèle.

Merci à Marraine et Grand-maman, votre amour et votre soutien sont très importants pour moi.

Et finalement, merci à mes amis (qui sauront se reconnaître). Vous êtes la preuve vivante que l’on a

pas besoin d’être des désamorceurs de bombe pour en désamorcer une (genre moi en état de

panique).

xix

Avant-propos

Le chapitre 2, intitulé « Des inclusions cytoplasmiques de TDP-43 sont détectés dans les neurones

moteurs murins NSC-34 traités au curcuma » est le manuscrit d'un article qui sera soumis en

novembre 2014 à la revue Canadian Journal of Neurological Sciences qui aura pour titre TDP-43

cytoplasmic inclusions detected in curcumin-treated NSC-34 motor neurons like cells. Pour cet

article, j'ai réalisé toutes les expériences et la conception de toutes les figures, en plus de contribuer

à environ 80% de la rédaction.

Le chapitre 3, intitulé « L’immunothérapie pour le traitement de la sclérose latérale amyotrophique »

est un article de revue paru dans la revue Médecine Science Amérique, numéro CRCQ 2012 (Vol.2,

No.2) le 18 juin 2013. Cet article est en lien direct avec le chapitre 4, intitulé « Développement d'une

immunothérapie ciblant la protéine SOD1 mal repliée ». J'ai participé à environ 50% de la rédaction.

1

Chapitre 1 : Introduction et problématique

3

1.1 La sclérose latérale amyotrophique

1.1.1 Description générale

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative incurable caractérisée

par la dégénérescence sélective des neurones moteurs supérieurs et inférieurs de la moelle épinière

et du cerveau. Les neurones moteurs communiquent directement avec les muscles par la formation

d’une synapse neuromusculaire (aussi appelée jonction neuromusculaire) et sont chargés de

contrôler les muscles volontaires du corps humain. La neurodégénérescence et les dysfonctions qui

y sont associées conduisent progressivement à une faiblesse des muscles et une atrophie, qui

conduira à son tour à une paralysie puis à la mort du patient (Mulder, Kurland et al. 1986; Ilieva,

Polymenidou et al. 2009) (Figure 1.1). Cette maladie, caractérisée pour la première fois en 1874 par

Jean-Martin Charcot, est la maladie des neurones moteurs, se déclenchant à l'âge adulte, la plus

fréquente (Tandan and Bradley 1985; Rowland 2001; Wijesekera and Leigh 2009). Elle est

également appelée maladie de Charcot en France et maladie de Lou Gehrig aux États-Unis, en

l'honneur du célèbre joueur des Yankees de New York qui en est décédé (Rowland 2001). Les

patients développant les premiers symptômes de la maladie sont âgés, en moyenne, entre 50 et 60

ans et le décès survient généralement 3 à 5 ans suite au diagnostic de la maladie, principalement

causé par des défaillances au niveau du système respiratoire (Mulder, Kurland et al. 1986; Shaw

2001; Boillee, Vande Velde et al. 2006).

La SLA se présente sous deux formes, soit la SLA familiale (SLAF), avec des antécédents familiaux

répertoriés, et la SLA sporadique (SLAS), majoritairement avec une étiologie non identifiée. Près de

10% des patients souffrent de la forme familiale et 90% de la forme sporadique, avec une prévalence

estimée, respectivement, entre 0.4 et 1.8 pour 100 000 à travers le monde, à l'exception de la

péninsule japonaise de Kii et de l'Île de Guam, où la prévalence est nettement plus élevée (Mulder,

Kurland et al. 1986). Bien que certaines études tendent à montrer un lien entre l'exposition aux

métaux lourds, tels que le plomb et le mercure, l'exposition aux pesticides ou à certains composés

chimiques nocifs, et les maladies neurodégénératives, il n’y a pas encore de causes dites

environnementales clairement établies (Johnson and Atchison 2009). Cependant, de nombreuses

évidences pointent en ce sens, en raison de la prévalence de la maladie plus élevée non seulement

4

chez les habitants de la péninsule de Kii mais aussi chez les joueurs de soccer et les militaires (Chio,

Calvo et al. 2009; Beghi 2013; Trojsi, Monsurro et al. 2013).

Figure 1.1 Le système moteur humain et son implication dans la SLA

La dégénérescence sélective des neurones moteurs supérieurs du cortex moteur conduit à

l'apparition de symptômes tels que les difficultés d'élocution et les problèmes de déglutition. Quant à

elle, la dégénérescence des neurones moteurs du tronc cérébral et de la moelle épinière conduit à

une faiblesse musculaire et éventuellement, à l'atrophie des muscles (Adapté de (Shaw, 2001).

1.1.2 La SLA familiale

La SLA familiale représente près de 10% des cas totaux de SLA. La découverte, en 1993, de

mutations dans le gène SOD1 chez certains patients atteints de SLAF a orienté la recherche dans le

domaine depuis de nombreuses années (Rosen, Siddique et al. 1993; Gurney, Pu et al. 1994). Plus

récemment, des mutations dans trois autres gènes, soit TARDBP, FUS/TLS et C9ORF72, ont

également été identifiées chez des patients atteints de la SLA (Kabashi, Valdmanis et al. 2008;

5

Sreedharan, Blair et al. 2008; Vance, Rogelj et al. 2009; DeJesus-Hernandez, Mackenzie et al. 2011;

Renton, Majounie et al. 2011). De rares mutations dans certains gènes ont également été

répertoriées, mais elles ne représentent qu'un faible pourcentage des causes de la SLAF (Gros-

Louis, Gaspar et al. 2006). À ce jour, plus d'une vingtaine de gènes sont associés à cette pathologie

(Tableau 1.1) (Millecamps, Salachas et al. 2010).

1.1.2.1 La superoxyde dismutase 1

La Cu/Zn superoxyde dismutase 1 (SOD1) est une enzyme antioxydante ubiquitaire de la famille des

superoxydes dismutases (SOD) qui comporte trois membres : la Cu/Zn SOD cytosolique (SOD1), la

SOD à manganèse se trouvant dans les mitochondries (SOD2) et la Cu/Zn SOD extracellulaire

(SOD3). La SOD1 catalyse la dismutation du superoxyde (O2-) en peroxyde (H2O2), en oxygène

diatomique (O2) et en eau (H2O) (Valentine, Doucette et al. 2005). Elle se présente sous la forme

d'un homodimère incorporant un ion de cuivre et un ion de zinc par monomère (Figure 1.2).

Figure 1.2 Représentation tridimensionnelle de la SOD1

L'homodimère SOD1 est formé de deux monomères liés via des ponts disulfures (en vert). Chaque

sous-unité lie un ion de cuivre (en orange) et un ion de zinc (en bleu). Une sous-unité est composée

de huit feuillets béta qui permettent ainsi la formation d'un baril béta. Le site de liaison au zinc (en

violet) et la boucle électrostatique (en jaune), sont les deux principaux éléments fonctionnels de la

protéines (Adapté de (Rotunno and Bosco 2013).

6

Tableau 1.1 Principaux loci et gènes mutés identifiés chez les patients atteints de SLAF

Locus Gène(Référence) Protéine/Fonction Caractéristiques

ALS1 SOD11 Superoxyde dismutase 1 (SOD1)/ Enzyme de détoxification

AD/AR, forme adulte

ALS2 ALS22 Alsin/ facteur d'échange de nucléotide guanylique sur rho

AR, forme juvénile

ALS4 SETX3 Senataxine/ Hélicase ADN/ARN AD, forme juvénile

ALS5 SPG114 Spatacsine/ Protéine transmembranaire AR, forme juvénile

ALS6 FUS5 Fused in sarcoma (FUS)/ Liaison à l'ARN, épissage des exons et réparation de l'ADN

AD, forme adulte

ALS7 Inconnu6 Inconnu AD, forme adulte

ALS8 VAPB7 Vesicule-associated membrane protein-associated protein B/ Trafic vésiculaire

AD, forme adulte

ALS10 TARDBP8 TDP-43/ Répresseur de la transcription et régulation de l'épissage

AD, forme adulte

ALS12 OPTN9 Optineurine/ Tension oculaire, trafic vésiculaire

AD/AR, forme adulte

ALS14 VCP10 Valosin-containing protein/ Liaison à l'ATP, vésicules de transport et de fusion

AD, forme adulte

ALS15 UBQLN211 Ubiquiline 2/ Ubiquitination et dégradation Lié au chromosome X, formes juvénile et adulte

ALS16 SIGMAR112

DAO13

PFN114

hnRNPA2B1/A115

Sigma non-opioid intracellular receptor/ Chaperonne du RE

D-amino acid oxidase/inconnu

Profiline 1/ Polymérisation de l'actine,

liaison de l'actine

Ribonucléoprotéines nucléaires/maturation des ARNm, métabolisme et transport

AR, forme juvénile

AD, forme adulte

AD, forme adulte

AD, forme adulte

ALS-FTD1 Inconnu16 Inconnu AD, forme adulte ALS-FTD2 C9orf7217 Chromosome 9 cadre de lecture ouvert

72/inconnu AD/sporadique, forme

adulte AD: autosomal dominant, AR: autosomal récessif. 1(Rosen, Siddique et al. 1993), 2(Hadano, Hand et al. 2001; Yang, Hentati et al.

2001), 3(Chen, Bennett et al. 2004), 4(Hentati, Ouahchi et al. 1998; Orlacchio, Babalini et al. 2010), 5(Kwiatkowski, Bosco et al. 2009;

Vance, Rogelj et al. 2009), 6(Sapp, Hosler et al. 2003), 7(Nishimura, Mitne-Neto et al. 2004; Nishimura, Mitne-Neto et al. 2004),

8(Kabashi, Valdmanis et al. 2008; Sreedharan, Blair et al. 2008), 9(Murayama, Inoue et al. 1991), 10(Johnson, Mandrioli et al. 2010),

11(Deng, Chen et al. 2011), 12(Al-Saif, Al-Mohanna et al. 2011), 13(Mitchell, Paul et al. 2010), 14(Wu, Fallini et al. 2012), 15(Kim, Kim et

al. 2013), 16(Hosler, Siddique et al. 2000), 17(DeJesus-Hernandez, Mackenzie et al. 2011; Renton, Majounie et al. 2011). Adapté de

(Leblond, Kaneb et al. 2014).

7

Le gène SOD1 est situé sur le chromosome 21q22.1 et s'étend sur près de 9.3 kilobases (kb) d'ADN

génomique comprenant cinq exons codant pour une protéine de 153 acides aminés. La SOD1

humaine est d'un poids moléculaire de 32 kiloDalton (kDa), sous sa forme d'homodimère (Valentine,

Doucette et al. 2005).

Il y a plus de vingt ans, le premier lien génétique entre la SLA et les formes mutées de la protéine

SOD1 a été établi. Cette découverte constitue la première identification d'une cause de la SLAF

(Rosen, Siddique et al. 1993). À ce jour, plus de 150 mutations faux-sens causatives de la SLA dans

le gène SOD1 ont été identifiées et ce, dans tous les exons (Figure 1.3) (Saccon, Bunton-Stasyshyn

et al. 2013). Ces mutations sont impliquées dans 15%-20% des cas de SLAF et dans environ 5% des

cas de SLAS (Forsberg, Andersen et al. 2011).

Figure 1.3 Mutations de la SOD1 en lien avec la SLAF

En bleu, la séquence protéique des 153 acides aminés de la SOD1 sauvage, c'est-à-dire non mutée.

Des mutations dans des segments clés de la protéine ont été identifiées en vert (interface du

dimère), en mauve (cystéines impliquées dans la formation des ponts disulfures entre les sous-

unités), en orange (acides aminés impliqués dans la liaison du cuivre) et en gris (acides aminés

impliqués dans la liaison du zinc). Chaque mutation est indiquée au dessus de l'acide aminé

correspondant (Adapté de (Saccon, Bunton-Stasyshyn et al. 2013)).

8

1.1.2.2 C9ORF72

La découverte du gène C9ORF72, se trouvant à la phase ouverte de lecture 72 (open reading frame

72) sur le chromosome 9, a été identifié comme étant responsable de près de 50% des cas de SLAF

(DeJesus-Hernandez, Mackenzie et al. 2011; Renton, Majounie et al. 2011). Une expansion répétée

d'hexanucléotide GGGGCC dans le premier intron, soit l'intron entre les exons 1a et 1b non-codant,

est à l'origine de la mutation. Un individu normal peut comporter jusqu'à 23 répétitions de cette

séquence dans le gène C9ORF72 tandis que les patients atteints de SLAF porteurs de la mutation

peuvent avoir jusqu'à 1600 répétitions de l'hexanucléotide dans le gène (Murray, DeJesus-

Hernandez et al. 2011). À ce jour, la fonction de la protéine codée par le gène C9ORF72 n'est pas

encore clairement identifiée.

1.1.2.3 TDP-43

Le gène TARDBP code pour la Tar-DNA binding protein 43 (TDP-43), une protéine nucléaire de

liaison à l'ADN et à l'ARN de 414 acides aminés et d'un poids moléculaire de 43 kDa (Buratti and

Baralle 2001; Buratti, Dork et al. 2001; Daoud, Valdmanis et al. 2009). Elle est principalement

impliquée dans la répression de la transcription et l'épissage alternatif (Ou, Wu et al. 1995; Wang,

Wang et al. 2004). Sa découverte, en 1995, est en lien avec son implication dans la modulation de

l'expression génique du VIH-1 (Ou, Wu et al. 1995). TDP-43 possède deux motifs de reconnaissance

à l'ARN, lui permettant ainsi de se lier tant à l'ADN qu'à l'ARN. De plus, elle possède un domaine C-

terminal riche en glycine, permettant la liaison aux protéines (Wang, Wu et al. 2008; Chen-Plotkin,

Lee et al. 2010). Cette région comporte l'essentiel des mutations non-sens associées avec la SLA.

Une seule mutation se trouve dans le premier motif de reconnaissance à l'ARN (Figure 1.4)

(Williams, Floate et al. 1988; Daoud, Valdmanis et al. 2009; Chio, Borghero et al. 2011). Chez les

patients atteints de SLA, TDP-43 a été identifiée comme l'une des protéines majeures faisant partie

des inclusions cytoplasmiques de protéines ubiquitinées dans les neurones. C’est pourquoi cette

protéine sert à la confirmation post-mortem du diagnostic SLA par les pathologistes (Arai, Hasegawa

et al. 2006; Neumann, Sampathu et al. 2006).

9

Figure 1.4 Mutations de la TDP-43 en lien avec la SLA

Les mutations dans le gène TARDBP affectent essentiellement des acides aminés se trouvant dans

la région riche en glycine de la protéine TDP-43, en C-terminal de cette dernière. En haut, une

version schématique de la structure du gène TARDBP et de la protéine TDP-43 présentant les

régions conversées. En bas, une portion de l'alignement de séquence en acides aminés de la

protéine TDP-43 pour différentes espèces démontre la grande conservation en C-terminal. Les

mutations associées à la SLAF sont indiquées en rouge et celles associées à la SLAS, en orange.

(Mackenzie and Rademakers 2008).

1.1.2.4. FUS/TLS

Fused in sarcoma/translated in liposarcoma (FUS/TLS) est une protéine nucléaire de liaison à l'ADN

et à l'ARN de 546 acides aminés encodée par 15 exons. Son extrémité C-terminale est impliquée

dans la liaison aux protéines et à l'ARN, tandis que sa portion N-terminale, riche en glycine, est

impliquée dans l'activation de la transcription (Aman, Panagopoulos et al. 1996). Sa découverte en

lien avec la SLA a permis, à ce jour, d'identifier une cinquantaine de mutations, toutes situées dans la

région riche en glycine et en C-terminale de la protéine (Kwiatkowski, Bosco et al. 2009; Vance,

Rogelj et al. 2009; Deng, Gao et al. 2014). La structure tridimensionnelle et la fonction de FUS/TLS

très similaires à celles de TDP-43 suggèrent l'implication d'un mécanisme pathogénique similaire

(Ling, Polymenidou et al. 2013). De plus, FUS/TLS a été identifiée dans des inclusions protéiques

cytoplasmiques présentes dans la moelle épinière et le cerveau de patients atteints de SLA

(Kwiatkowski, Bosco et al. 2009; Vance, Rogelj et al. 2009; Tateishi, Hokonohara et al. 2010)

10

1.1.3 La SLA sporadique

Malgré tous les efforts de recherche, près de 90% des cas de SLA demeurent pour la vaste majorité

sans cause connue. Cependant, une composante génétique serait tout de même impliquée dans

plusieurs cas de SLAS. Bien que quelques gènes semblent être en lien avec la SLAS, tel que SOD1

et TARDBP, ces liens comptent pour un faible pourcentage des cas sporadiques totaux, ce qui sous-

entend une maladie beaucoup plus complexe et multifactorielle que précédemment anticipée (Gros-

Louis, Gaspar et al. 2006). À l'exception de quelques cas familiaux impliquant une co-morbidité avec

une autre maladie neurodégénérative, les symptômes de la SLAF et de la SLAS sont pratiquement

identiques. Cependant, quelques différences subtiles, mais des plus intéressantes, subsistent, telles

que l'âge d'apparition plus précoce chez les cas de SLAF et le ratio homme/femme plus élevé pour

les cas de SLAS (Haverkamp, Appel et al. 1995; Camu, Khoris et al. 1999).

1.2 L’étiologie de la SLA

1.2.1 La toxicité de la SOD1

De nombreuses hypothèses ont été soulevées dans le but d'expliquer la toxicité impliquant la SOD1.

Alors que certaines équipes soutiennent que la SOD1 aurait une activité enzymatique aberrante

(Beckman, Carson et al. 1993; Wiedau-Pazos, Goto et al. 1996; Cafe, Testa et al. 2000), d'autres

soutiennent qu'elle se propagerait à la manière d'un prion (Munch, O'Brien et al. 2011; Grad and

Cashman 2013) ou qu'elle induirait un dysfonctionnement au niveau des mitochondries (Pizzuti and

Petrucci 2011; Pickles, Destroismaisons et al. 2013). Cependant, l'une des hypothèses les plus

probables implique très certainement le stress associé au réticulum endoplasmique, l'agrégation

protéique et la cytotoxicité de ces agrégats cytoplasmiques (Figure 1.5) (Urushitani, Ezzi et al. 2008;

Gowing 2009; Saxena, Cabuy et al. 2009; Labarre, Paré et al. 2013). Malgré la formulation de près

d'une dizaine d'hypothèses toutes soutenues par des évidences scientifiques, aucun consensus n'a

été établi à ce jour par la communauté scientifique quant au mécanisme d'action de la SOD1 mutée

et sa toxicité (Ilieva, Polymenidou et al. 2009). Cependant, de nombreuses études effectuées chez le

modèle murin permettent d'appuyer le fait qu'il s'agit bel et bien d'un gain de fonction toxique et non

d'une perte de fonction. En effet, la majorité des mutations associées à la SOD1 lui permettent tout

de même de conserver son activité dismutase (Borchelt, Lee et al. 1994) et la souris transgénique

knock out (KO) pour le gène SOD1 ne développe pas des symptômes associés à la SLA (Reaume,

11

Elliott et al. 1996), contrairement aux souris transgéniques surexprimant les différentes formes de la

SOD1 mutée (Bruijn, Becher et al. 1997).

De plus, bien que diverses mutations génétiques soient causatives de la toxicité de la protéine SOD1

dans certains cas de SLAF, de récentes études démontrent clairement la présence de formes de

SOD1 mal repliées dans certains cas de SLAS (Bosco, Morfini et al. 2010). D'autres études

suggèrent également que des modifications post-traductionnelles pourraient conférer des propriétés

toxiques à la SOD1, mimant ainsi l'effet des mutations chez des patients SLAS (Ezzi, Urushitani et al.

2007; Gruzman, Wood et al. 2007; Labarre, Paré et al. 2013). Ces mutations entraineraient le

mauvais repliement de la SOD1, causant son accumulation et son agrégation au sein de la cellule et

conduisant ainsi à la dégénération des neurones moteurs (Bruijn, Houseweart et al. 1998;

Chattopadhyay and Valentine 2009).

12

Figure 1.5 Modèle de toxicité de la SOD1 impliquant son mauvais repliement et l'agrégation protéique

Dans des conditions normales, le monomère réduit (sans ion métallique) de SOD1 se dimérise avec

lui-même avant l'incorporation des ions métalliques de cuivre (Cu) et de zinc (Zn). La formation de

ponts disulfures intramoléculaires permet par la suite la stabilisation de l’enzyme. Le mauvais

repliement de la protéine SOD1 par différents éléments favorisant la conversion des monomères

réduits vers sa forme mal repliée mène à la formation de petits et de gros agrégats protéiques avec

des propriétés toxiques (Tirée de (Labarre, Paré et al. 2013).

13

De manière intéressante, de nouvelles évidences semblent soutenir l'hypothèse d'une sécrétion de

protéines SOD1 promues par les chromogranines, protéines chaperonnes abondantes dans les

neurones moteurs, les interneurones et les astrocytes activés (Urushitani, Sik et al. 2006; Urushitani,

Ezzi et al. 2008). La protéine mutante ainsi sécrétée pourrait alors induire la mort des neurones

moteurs et une microgliose par la même occasion (Urushitani, Sik et al. 2006). L'hypothèse d'un tel

mécanisme pathogénique, où la SOD1 mutante serait sécrétée, vient appuyer l'hypothèse selon

laquelle la maladie n'est pas exclusivement inhérente aux neurones moteurs et qu'il y a bel et bien

propagation de la toxicité d'une cellule à une autre (Clement, Nguyen et al. 2003; Grad, Guest et al.

2011; Munch, O'Brien et al. 2011; Labarre, Paré et al. 2013). Malgré ces évidences, suggérant

qu'une SOD1 mutée pourrait induire le mauvais repliement d'une SOD1 wild-type (WT), le

phénomène de dégénérescence spécifique aux neurones moteurs demeure un mystère.

Le mécanisme par lequel la SOD1 mutante provoque une dégénérescence sélective des neurones

moteurs, sans causer la pathologie au sein de d'autres tissus ou organes, reste aussi inexpliqué.

Cependant, l'idée selon laquelle la maladie ne serait pas intrinsèque aux neurones moteurs et

impliquerait l'influence des autres cellules du système nerveux, telles que les microglies et les

astrocytes, a récemment été davantage étudiée. En effet, des études réalisées sur des souris

chimériques ont permis de démontrer qu'en présence de cellules gliales portant une mutation de la

SOD1 associée à la SLA, les neurones moteurs ne portant pas de mutations développent une

dégénérescence axonale importante (Clement, Nguyen et al. 2003). Ce même phénomène peut être

observé lorsque des neurones moteurs sont cultivés en présence de milieu conditionné d'astrocytes

et de microglies mutantes SOD1 (Di Giorgio, Carrasco et al. 2007; Marchetto, Muotri et al. 2008;

Haidet-Phillips, Hester et al. 2011). Ainsi, des facteurs sécrétés par les cellules gliales contribueraient

au déclenchement et au maintien de la pathologie au sein des neurones moteurs (Nagai, Re et al.

2007; Ilieva, Polymenidou et al. 2009). Par conséquent, la contribution des autres types cellulaires au

développement et au maintien de la maladie semble être un élément important de la SLA (Figure

1.6) (Ilieva, Polymenidou et al. 2009).

14

Figure 1.6 Contribution des différents types cellulaires au développement de la SLA

Les différents types cellulaires portant une mutation dans le gène SOD1 influencent de diverses

façons l'évolution de la maladie. Les neurones moteurs accélèrent l'apparition des symptômes, les

microglies et les astrocytes accélèrent la progression de la maladie, tandis que les cellules

musculaires et les cellules endothéliales ne semblent pas avoir d'effet notable (Ilieva, Polymenidou et

al. 2009).

1.2.2 Protéinopathie TDP-43 et FUS

Des inclusions cytoplasmiques, formées par une accumulation anormale de protéines à l’intérieure

du cytoplasme des cellules, sont présentes dans de nombreuses maladies neurodégénératives,

telles que les maladies d'Alzheimer, d'Huntingdon et la SLA (Ross and Poirier 2004; Davidson, Raby

et al. 2011). Chez un sujet sain, la protéine TDP-43 se retrouve habituellement abondamment dans

le noyau et en proportion beaucoup plus faible dans le cytoplasme. Cependant, en condition

pathologique, il y a délocalisation de la protéine du noyau vers le cytoplasme, causant ainsi une

accumulation de TDP-43 et la formation d’inclusions cytoplasmiques (Figure 1.7) (Buratti and Baralle

2008). La présence de protéines TDP-43 dans les inclusions cytoplasmiques des tissus du système

nerveux des patients, tant chez les cas familiaux que les cas sporadiques, a amené un nouvel

éclairage sur les mécanismes sous-jacents de cette maladie (Neumann, Sampathu et al. 2006; Van

15

Deerlin, Leverenz et al. 2008; Mackenzie, Rademakers et al. 2010). De plus, ces inclusions

cytoplasmiques TDP-43 positives ont été mises en évidence par immunohistochimie dans des

biopsies de peau de patients atteints de l'une ou l'autre forme de SLA (Suzuki, Mikami et al. 2010).

Autre fait intéressant, des inclusions de TDP-43 cytoplasmiques sont également présentes chez les

patients atteints de dégénérescence lobaire frontrotemporale (DLFT), maladie neurodégénérative

entraînant une démence qui peut se développer en co-morbidité avec la SLA (Wang, Wu et al. 2008).

TDP-43 agit donc comme marqueur pathologique pour ces deux maladies.

Le rôle de la protéine TDP-43 anormale n'est pas très bien caractérisé à ce jour. Cependant, de

nombreuses études mettent en évidence l'implication de la protéine de type sauvage dans la

stabilisation des transcrits de neurofilaments, plus particulièrement le neurofilament light chain (NFL)

(Moisse, Mepham et al. 2009; Volkening, Leystra-Lantz et al. 2009). Ainsi, il serait possible que la

protéine anormale entrave cette régulation, essentielle au bon fonctionnement de la cellule. Les

efforts de recherche portés sur la compréhension des mécanismes impliquant la délocalisation de

TDP-43 ont permis la découverte d'une autre protéine ayant des fonctions similaires : Fused in

sarcoma (FUS). Également une protéine de liaison à l'ARN, FUS possède un mécanisme de

délocalisation dégénératif très similaire à celui de TDP-43 (Mackenzie, Rademakers et al. 2010;

Colombrita, Onesto et al. 2011; Pokrishevsky, Grad et al. 2012). Malgré leurs similitudes importantes,

leur agrégation semble mutuellement exclusive : les cellules positives aux agrégats de TDP-43 sont

négatives aux agrégats de FUS et vice versa (Kwiatkowski, Bosco et al. 2009).

16

Figure 1.7 Modèle de protéinopathie de TDP-43

En condition normale, la protéine TDP-43 se trouve en quantité importante dans le noyau et en

quantité très faible dans le cytoplasme. En condition pathologique, il est possible d'observer une

délocalisation de TDP-43 du noyau vers le cytoplasme et la présence d'inclusions ubiquitinées de

protéines (Buratti and Baralle 2008).

1.2.3 Facteurs environnementaux

Le lien entre de nombreuses maladies neurodégénératives, telles que le Parkinson et l'Alzheimer, et

divers facteurs environnementaux a bien été établi au courant des dernières années (Jadiya and

Nazir 2012; Allen and Levy 2013; Lee and Freeman 2014; Richardson, Roy et al. 2014). Plusieurs

hypothèses tendent à attribuer aux facteurs environnementaux une place de plus en plus importante

dans l'identification de causes probables de la SLA. L'exposition aux pesticides est considérée

comme un facteur de risque potentiel au développement de la maladie, tout comme l'exposition aux

métaux lourds, aux nettoyants et dégraisseurs commerciaux, au sélénium et aux cétones (McGuire,

Longstreth et al. 1997; Kamel, Umbach et al. 2005; Kamel, Umbach et al. 2008; Johnson and

Atchison 2009; Kamel, Umbach et al. 2012; Beghi 2013). De plus, certains métiers sembleraient plus

17

à risque, comme coiffeur, militaire, fermier et joueur de soccer en raison de leur exposition prolongée

aux solvants et aux pesticides (Haley 2003; Armon 2004; Park, Schulte et al. 2005). Cependant, le

fait d'être fumeur ou d'être exposé de façon prolongée au gaz naturel ou aux radiations ne semble

pas constituer un facteur de risque environnemental de la SLA (Yu, Su et al. 2014).

1.3 Le stress associé au réticulum endoplasmique

Le réticulum endoplasmique (RE) est une organelle liée à la membrane nucléaire des cellules

eucaryotes. Il reçoit de nombreux signaux cellulaires dans le but de maintenir l'homéostasie de la

cellule. Chez les neurones, le RE est présent dans le corps cellulaire et est appelé corps de Nissl.

Assurant des rôles multiples au sein de la cellule, le RE joue un rôle particulièrement essentiel dans

la synthèse protéique, le repliement des protéines, la régulation et la réalisation des modifications

post-traductionnelles (Ellgaard and Helenius 2003). Le RE possède un système de protéines

chaperonnes efficace visant à prévenir l'accumulation de protéines mal repliées ou l'agrégation

protéique (Horwich 2002). Différentes conditions physiologiques ou pathologiques peuvent venir

perturber le processus de repliement des protéines s'effectuant dans la lumière (lumen) du RE,

contribuant à l'accumulation de protéines mal repliées. Cette condition cellulaire constitue le stress

du RE (Hetz, Martinon et al. 2011). Le RE comprend trois protéines membranaires jouant le rôle de

senseur du stress et étant impliquées dans la réponse aux protéines mal repliées : l'inositol-requiring

enzyme 1 (Ire1), l'activating transcription factor 6 (ATF6) et la protein kinase RNA-activated (PKR)-

like ER kinase (PERK) (Kraskiewicz and FitzGerald 2012)

1.3.1 La réponse aux protéines mal repliées

La réponse aux protéines mal repliées ou unfolded protein response (UPR) est un mécanisme

associé au RE lorsque ce dernier est en condition de stress. Ce mécanisme est très conservé dans

les différentes espèces, allant des levures aux mammifères. En condition normale, chaque senseur

est lié à la glucose-regulated protein 78/B-cell immunoglobulin binding protein (GRP-78/Bip), une

protéine chaperonne jouant un rôle essentiel au sein du RE (Kraskiewicz and FitzGerald 2012). En

condition de stress, GRP-78/Bip ne lie plus les senseurs et la cascade de signalisation commence

(Figure 1.8) (Healy, Gorman et al. 2009).

18

L'effet combiné observé par l'activation des trois branches de l'UPR, Ire1, ATF6 et PERK, résulte en

une régulation à la hausse de plusieurs gènes codant pour des chaperonnes et une régulation à la

baisse de la synthèse protéique (Roth and Koshland 1981; Turano, Coppari et al. 2002; Atkin, Farg

et al. 2006). Les protéines chaperonnes du RE catalysent la formation et le réarrangement des ponts

disulfures intra et intermoléculaires, permettant ainsi de diminuer la quantité de protéines mal

repliées et par le fait même, le stress associé au RE (Roth and Koshland 1981; Turano, Coppari et

al. 2002).

Ire1 est une protéine possédant une activité kinase intrinsèque et endoribonucléase. Elle est

encodée chez l'humain par le gène ERN1 (Tirasophon, Welihinda et al. 1998). En condition de

stress, GRP-78/Bip ne lie plus Ire1, qui s'oligomérise et active son domaine ribonucléase via

l'autophosphorylation. Par la suite, Ire1 est en mesure de cliver l'ARNm de la X-box binding protein 1

(XBP1), enlevant ainsi 26 nucléotides d'un intron non conventionnel et provoquant le déplacement du

cadre de lecture (Kober, Zehe et al. 2012). Cette modification à l'ARNm permet la traduction en une

protéine fonctionnelle, le facteur de transcription sXBP1 (Calfon, Zeng et al. 2002; Healy, Gorman et

al. 2009). La protéine sXBP1 est impliquée dans plusieurs voies de signalisation, telles que la

régulation des gènes codant pour certains complexes d'histocompatibilité de classe II et la

différenciation des cellules plasmatiques (Ono, Liou et al. 1991; Iwakoshi, Lee et al. 2003). En

condition de stress cellulaire, sXBP1 régule à la hausse des gènes codant pour des protéines

chaperonnes et des protéines impliquées dans l'endoplasmic-reticulum-associated protein

degradation (ERAD) (Atkin, Farg et al. 2006).

19

Figure 1.8 Représentation schématique des voies de signalisation initiées par les trois branches de l'UPR

(Healy, Gorman et al. 2009)

20

Quant à lui, ATF6 est un facteur de transcription qui, une fois libéré de GRP-78/Bip, subit un clivage

protéolytique dans l'appareil de Golgi. La portion cytosolique nouvellement créée est transloquée

vers le noyau, où le fragment agira à titre de facteur de transcription pour des gènes associés à des

chaperonnes, tels que GRP-78/Bip et GRP-94, et des gènes associés directement à l'UPR, comme

XBP1 (Li, Baumeister et al. 2000; Healy, Gorman et al. 2009).

Finalement, lorsque GRP-78/Bip ne lie plus PERK, cette dernière se dimérise et s'autophosporyle,

provoquant ainsi son activation (Healy, Gorman et al. 2009). Par la suite, la PERK active peut

phosphoryler la sérine 51 du facteur eIF2α, le rendant ainsi inactif (Schroder and Kaufman 2005).

L'inactivation de eIF2α entraîne l'inhibition de la traduction majoritaire au sein de la cellule, soit la

traduction cap-dépendante. Cependant, les ARNm n'impliquant pas ce processus de traduction,

comme les ARNm contenant des Internal ribosome entry site (IRES), peuvent tout de même être

traduits (Hetz, Martinon et al. 2011).

Au cours des dernières années, des études ont été réalisées dans le but d'établir un lien entre les

trois branches de l'UPR et la SLA. Ces études ont démontré que des souris exprimant certaines

mutations associées à la SOD1, combinées à une activation de l'UPR, développent plus rapidement

les symptômes de la maladie (Wang, Popko et al. 2011). De plus, il a été démontré qu'en réduisant le

stress du RE, il est possible de diminuer in vivo, dans un modèle transgénique de

Caenorhabditis elegans, la toxicité causée par les agrégats de TDP-43 (Vaccaro, Patten et al. 2013).

Une autre étude a également démontré que suite à l'administration de salubrinal, un inhibiteur du

stress du RE, la survie des souris mutantes SOD1G93A est augmentée (Saxena, Cabuy et al. 2009).

Ces résultats indiquent donc le lien entre l'UPR et la SLAF, ouvrant ainsi une porte à la recherche

d'un traitement agissant directement sur les facteurs du stress associé au RE.

21

1.3.2 Composés connus pour induire un stress au réticulum endoplasmique

1.3.2.1 Curcuma

Le curcumin, composante majeure responsable du pigment jaune du curcuma (Curcuma longa) est

couramment utilisé comme épice dans la cuisine indienne et a retenu l'attention de plusieurs

spécialistes en raison de ses propriétés bénéfiques. Malgré la mise en évidence de ses propriétés

antioxydantes, anti-carcinogéniques, anti-angiogéniques et anti-inflammatoires par l'intermédiaire de

nombreuses études, plusieurs équipes de recherche ont également démontré que le curcuma peut

induire une augmentation du stress au niveau du RE (Aggarwal, Sundaram et al. 2007; Pae, Jeong

et al. 2007; Bakhshi, Weinstein et al. 2008; Cao, Li et al. 2013). En effet, une augmentation

significative de GRP-78/Bip est présente suite à un traitement au curcuma de cellules pulmonaires et

immunitaires cancéreuses (Pae, Jeong et al. 2007; Lin, Huang et al. 2008). Le curcuma semblerait

augmenter le stress au niveau du RE en stimulant la production d'espèces réactives d'oxygène

(ROS) (Minamino, Komuro et al. 2010; Pal, Cristan et al. 2010).

1.3.2.2 Paraquat

Le paraquat est un pesticide à effet herbicide largement utilisé à travers le monde, malgré son

utilisation de plus en plus restreinte voire interdite dans certains pays (Wunnapuk, Mohammed et al.

2014). Son ingestion cause des lésions dégénératives aigües du système nerveux. Le paraquat

possède des effets neurotoxiques similaires à ceux du plomb et du mercure (Dinis-Oliveira, Duarte et

al. 2008; Gawarammana and Buckley 2011). Plusieurs équipes de recherche ont démontré que le

paraquat reproduit plusieurs symptômes associés à des maladies neurodégénératives, comme la

perte des neurones dopaminergiques, une déficience en dopamine, une augmentation du stress

oxydatif, un mauvais fonctionnement du protéasome et des dysfonctions motrices (Liou, Chen et al.

1996; Brooks, Chadwick et al. 1999; McCormack, Atienza et al. 2005; Kuter, Smialowska et al. 2007;

Yang, Tiffany-Castiglioni et al. 2009). De récentes évidences démontrent également que le paraquat

activerait la voie Ire1 de l'UPR, déclenchant ainsi une cascade de signalisation menant très souvent

à l'apoptose de la cellule (Yang, Tiffany-Castiglioni et al. 2009). De plus, il est possible d'observer

une augmentation significative de GRP-78/Bip suite à un traitement au paraquat chez des lignées de

neurones moteurs et de neuroblastomes humains et murins (Yang and Tiffany-Castiglioni 2007).

22

1.3.2.3 Tunicamycine

La tunicamycine est un antibiotique inhibant la N-acétylglucosamine phototransférase (GTP) via

l'inhibition de la N-glycolysation, ce qui a pour effet de bloquer la synthèse des oligosaccharides liés

aux lipides dans le RE (Banerjee, Lang et al. 2011). Ainsi, la formation des glycoprotéines n'est pas

possible, ce qui cause une accumulation de glycoprotéines non repliées et par le fait même un stress

au niveau du RE (Kornfeld and Kornfeld 1985; Banerjee, Lang et al. 2011). De plus, un traitement à

la tunicamycine induit l'arrêt du cycle cellulaire en G1, en plus d'entraîner éventuellement l'apoptose

des cellules (Banerjee, Lang et al. 2011; Schonthal 2012).

1.3.2.4 Rapamycine

La rapamycine, ou sirolimus, est un immunosupresseur inhibant l'activation des cellules T et qui est

essentiellement utilisé dans les cas de transplantation rénale (Sehgal, Baker et al. 1975; Thomson,

Turnquist et al. 2009; Staats, Hernandez et al. 2013). Ce composé est très utilisé en recherche

fondamentale dans le but d'augmenter l'autophagie via la phosphorylation du récepteur mammalian

target of rapamycin (mTOR) (Heitman, Movva et al. 1991; Staats, Hernandez et al. 2013). Bien que

plusieurs études indiquent que la rapamycine a un effet bénéfique sur plusieurs maladies

neurodégénératives, telles que l'Alzheimer et le Parkinson, en raison de son effet pro-autophagique,

plusieurs études ont également été menées en lien avec la SLA (Spencer, Potkar et al. 2009). De

manière intéressante, les souris traitées à la rapamycine ont vu leur survie diminuée ou inchangée

(Bhattacharya, Bokov et al. 2012; Staats, Hernandez et al. 2013). Malgré ses effets bénéfiques sur le

stress du RE en raison de l'autophagie, un traitement prolongé et intensif à la rapamycine induirait ce

dernier de façon importante (Ching and Weihl 2013).

1.4 Les modèles animaux de la SLA

Les efforts de recherche afin de comprendre les mécanismes sous-jacents à la SLA, tant familiale

que sporadique, sont très importants en raison de la gravité de la maladie et de l'incapacité de la

médecine moderne à traiter de manière efficace et permanente les patients. Afin d'étudier les

différents gènes impliqués dans la SLAF et l'implication des différentes mutations qui les affectent, de

nombreux modèles animaux ont été développés. En effet, des modèles transgéniques chez la

drosophile (Drosophila melanogaster), le nématode (Caenorhabditis elegans), le poisson zèbre

23

(Danio rerio) et la souris (Mus musculus) sont fréquemment utilisés en laboratoire (Julien and Kriz

2006; Harvey, Richie et al. 2011; Berthod and Gros-Louis 2012).

Plusieurs modèles murins transgéniques, surexprimant certaines des mutations géniques associées

à la SLAF, ont déjà été générés et sont disponibles sur le marché pour l'étude de la SLA. Les deux

types de souris transgéniques les plus fréquemment utilisés sont les souris SOD1 mutantes et TDP-

43 mutantes. Les souris transgéniques SOD1 présentent, de façon analogue à la pathologie

humaine, des symptômes très caractéristiques : dégénérescence sélective des neurones moteurs du

cerveau et de la moelle épinière, astrocytose et microgliose des tissus atteints et pertes d'axones

myélinisées se situant dans la corne ventrale de la moelle épinière, provoquant ainsi un important

déficit moteur et une atrophie des muscles (Gurney, Pu et al. 1994; Wong, Pardo et al. 1995;

Reaume, Elliott et al. 1996; Bruijn, Becher et al. 1997; Bruijn, Houseweart et al. 1998; Alexander,

Erwin et al. 2004). Malgré ces similitudes au niveau des symptômes, plusieurs facteurs diffèrent de

manière draconienne, tels que le moment d’apparition des premiers symptômes, la progression et la

sévérité de la maladie pour les souris surexprimant des mutations différentes (Tableau 1.2). À ce

jour, aucun lien entre ces différences et la stabilité des formes de la SOD1 ou son activité

enzymatique, très certainement influencée par la nature de la mutation, n'a été établi. Près d'une

quinzaine de souris portant des mutations différentes ont été générées depuis la découverte du lien

entre la SLA et la SOD1, mais certains mutants restent plus utilisés que d'autres en raison de

l'accumulation importante de protéines et/ou d'apparition des symptômes plus rapide (Tableau

1.2)(Turner and Talbot 2008; Labarre, Paré et al. 2013).

24

Tableau 1.2 Souris transgéniques SOD1 couramment utilisées pour l’étude de la SLAF

(Labarre, Paré et al. 2013)

Plusieurs modèles de souris transgéniques TDP-43 ont été développés mais avec plus de difficulté.

En effet, les premières souris TDP-43 ont été générées à partir de l'ADN complémentaire (ADNc) du

gène TARDBP humain. Ces souris surexpriment de manière très importante le transgène et présente

une apparition précoce des symptômes (Wegorzewska, Bell et al. 2009; Wijesekera and Leigh 2009;

Stallings, Puttaparthi et al. 2010; Wils, Kleinberger et al. 2010). Malgré le phénotype sévère de la

maladie, ces souris transgéniques ne possèdent que quelques-unes des caractéristiques retrouvées

chez les patients, excluant la présence d'agrégats protéiques de TDP-43, remettant en cause la

pertinence du modèle (Janssens, Kleinberger et al. 2011; Swarup and Julien 2011). Cependant, les

efforts de recherche déployés ont permis de générer un modèle transgénique beaucoup plus

représentatif pour l'étude de la SLA. En effet, un modèle murin a été développé en microinjectant la

séquence génomique du gène incluant un domaine d'autorégulation dans la partie 3' non transduite

du gène. Ce domaine d'autorégulation permet une expression plus modérée du transgène, soit 3 à 4

fois, permettant ainsi un phénotype moins sévère (Swarup, Phaneuf et al. 2011). De plus, des souris

TDP-43 knockout (KO) ont également été générées, mais la mutation s'avère létale pour l'embryon

(Wu, Cheng et al. 2010). Plus récemment, des souris transgéniques FUS ont été générées,

permettant ainsi l'étude des FUSopathies (Shelkovnikova, Peters et al. 2013).

Lors d'analyse post-mortem, les tissus des souris transgéniques SOD1, TDP-43 et même FUS

présentent une augmentation des marqueurs liés au stress du RE et à UPR, corrélant ainsi avec ce

25

qui est trouvé chez les patients et indiquant le lien important entre les inclusions cytoplasmiques de

protéines et le stress associé au RE (Walker and Atkin 2011; Walker, Soo et al. 2013).

Le modèle du nématode, des plus intéressants en raison de la simplicité de son système neuronal et

de son temps de reproduction très court, montre plusieurs avantages pour étudier l'effet d'un gène

sur le système nerveux et pour identifier des composés potentiellement intéressants dans la

recherche d'un traitement à la maladie (Vaccaro, Patten et al. 2012; Vaccaro, Patten et al. 2013). Le

modèle de poisson zèbre est tout indiqué dans l'étude des déficits moteurs associés à la SLA. Il

s'agit d'un modèle très intéressant en raison de sa transparence, permettant ainsi de visualiser les

neurones moteurs et leur dégénérescence si ces derniers sont fluorescents. De nombreux variants

génétiques associés aux différents mutants retrouvés dans les cas de SLAF ont été générés pour

ces deux modèles (Gros-Louis, Kriz et al. 2008; Li and Le 2013; Patten, Armstrong et al. 2014;

Therrien and Parker 2014). Bien que ces modèles soient moins complexes que le modèle murin et

plus loin de l'humain, ils demeurent essentiels dans la recherche fondamentale.

1.5 Immunothérapie

Considérant que la SLA ne soit pas une maladie auto-immune, comme la sclérose en plaques,

plusieurs études réalisées avec des modèles murins mettent en évidence le rôle du système

immunitaire dans la pathogénèse de la maladie et le processus de dégénération (Hall, Oostveen et

al. 1998; Alexianu, Kozovska et al. 2001; Beers, Henkel et al. 2006; Boillee, Yamanaka et al. 2006).

Le système immunitaire pourrait être modulé dans le but d'avoir une réponse bénéfique à certains

évènements. Ainsi, l'activation du système immunitaire via des approches d’immunisation semble

des plus intéressantes comme avenues thérapeutiques dans la SLA. En effet, les formes de la SOD1

pourraient être une cible de choix dans l'immunothérapie. De récentes études démontrent qu'il est

possible de détecter ces formes mal repliées via l'utilisation d'anticorps spécifiques au sein

d'agrégats protéiques, tant chez les cas de SLAF que SLAS (Bosco, Morfini et al. 2010). Cette

découverte majeure constitue un élément important dans la recherche sur la SLA et permet de faire

un lien entre les cas familiaux et sporadiques, supportant ainsi l'hypothèse d'un mécanisme

pathogénique commun.

26

La découverte du mécanisme pathogénique de la SOD1 impliquant la toxicité de la SOD1 mal repliée

sécrétée a permis le développement de stratégies immunologiques visant à réduire le formation

d'agrégats protéiques néfastes pour la cellule (Urushitani, Sik et al. 2006). Des protocoles utilisant

l'une ou l'autre des approches d'immunisation, soit l'immunisation active, se caractérisant par

l'injection d'antigènes, et l'immunisation passive, se caractérisant par l'injection de sérum contenant

des anticorps spécifiques, ont été testés et ont obtenu des résultats bénéfiques sur l'accumulation de

la SOD1 mal repliée chez le modèle murin, prolongeant ainsi la survie des souris et retardant

l'apparition des symptômes (Urushitani, Ezzi et al. 2007; Gros-Louis, Soucy et al. 2010; Takeuchi,

Fujiwara et al. 2010; Liu, Tjostheim et al. 2012; Labarre, Paré et al. 2013). Ces résultats positifs

confèrent donc aux anticorps spécifiques aux formes mal repliées de la SOD1 le statut d'outil

moléculaire unique permettant l'étude des mécanismes pathogéniques associés à la SOD1 et

ouvrent la porte à l'immunothérapie comme traitement de la maladie. Pour des informations plus

détaillées sur l'immunothérapie, se référer au chapitre 3, qui est composé d'un article de revue sur le

sujet.

1.6 Problématique et hypothèses de travail

Bien que de nombreux modèles animaux et cellulaires soient fréquemment utilisés dans le but

d'étudier les mécanismes sous-jacents de la SLA, ces modèles permettent uniquement l'étude de la

forme familiale de la SLA. C'est pourquoi le développement de nouveaux modèles d'étude, tant

animaux que cellulaires, pour étudier la SLAS est urgent, puisque les patients atteints de SLAS

représentent la vaste majorité des cas.

À ce jour et malgré tous les efforts de recherche déployés dans l'étude de la SLA, il n'existe aucun

médicament ou biomarqueur de la progression de la maladie efficace et reconnu par la communauté

scientifique et les autorités médicales. À la lumière des plus récentes avancées dans le domaine,

l'hypothèse la plus plausible est que la toxicité de la protéine SOD1 mutante serait en lien avec son

mauvais repliement tertiaire (Gros-Louis 2009; Labarre, Paré et al. 2013). Cette hypothèse est

entièrement compatible avec les mutations dans le gène SOD1 et le gain de fonction toxique qui y

est associé suggérant ainsi que le mauvais repliement de la protéine, causé par des mutations

génétiques ou des modifications post-traductionnelles, pourrait être à l'origine d'une toxicité associée

27

à cette protéine changée. Cette hypothèse soutient donc qu'il y aurait un lien plausible entre les

formes de SLAF et SLAS et que ces formes pourraient partager une voie pathogénique commune

impliquant le mauvais repliement de la SOD1. De plus, les inclusions cytoplasmiques de protéines

TDP-43 sont retrouvées tant chez les patients atteints de SLAF que de SLAS, essentiellement au

niveau des cellules neuronales du cerveau et de la moelle épinière. De manière similaire au lien

plausible entre le mauvais repliement de la protéine SOD1 et les différents cas de SLA, nous croyons

qu'une voie pathogénique commune pourrait être partagée et qu'il serait possible d'induire la

formation de telles inclusions dans des cellules non pathologiques.

De plus, de nombreuses études récentes suggèrent que des perturbations au niveau du RE

pourraient contribuer à l'agrégation et l'accumulation de protéines mal repliées, en raison de son rôle

fondamental dans le processus de repliement des protéines. Ainsi, le stress associé au RE pourrait

être impliqué dans la cascade pathogénique de la SLA. Dans cette optique, l'hypothèse principale du

projet présenté au chapitre 2 est que les cas sporadiques pourraient partager avec les cas familiaux

une voie pathogénique commune impliquant le mauvais repliement de la protéine SOD1, la

délocalisation de TDP-43 et le stress associé au RE.

Les chapitres 3 et 4 traitent plus en profondeur du développement d'une immunothérapie comme

traitement de la SLA, en lien avec les formes mal repliées de la protéine SOD1. Depuis les dernières

années, de nombreux anticorps ont été développés chez le modèle murin dans le but de moduler la

conformation de la SOD1 et de nombreux effets bénéfiques ou neutres sur la progression de la

maladie y ont été associés. Notre hypothèse de recherche est qu'il est possible de développer une

immunothérapie optimale chez le modèle murin en développant des anticorps ciblant un acide aminé

clé dans la conformation de la protéine SOD1. Ainsi, le développement d'un anticorps anti-SOD1

ciblant la cystéine 111, acide aminé crucial dans la stabilité des ponts disulfures de la SOD1,

semblait le choix tout indiqué pour développer cet anticorps optimal.

28

29

Chapitre 2 : Des inclusions cytoplasmiques de

TDP-43 sont détectés dans les neurones moteurs

murins NSC-34 traités au curcuma

TDP-43 cytoplasmic inclusions detected in curcumin-treated NSC-34

motor neurons like cells

Audrey Labarre, Lydia Touzel Deschênes et François Gros-Louis

Article à soumettre dans Canadian Journal of Neurological Sciences

en décembre 2014

31

2.1 Résumé

Contexte : La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative incurable

caractérisée par la dégénérescence sélective des neurones moteurs du cerveau et de la moelle

épinière. À l'heure actuelle, plusieurs gènes ont été identifiés comme étant impliqués dans la forme

familiale de SLA, soit SOD1, TARDBP (TDP-43), FUS/TLS, et C9ORF72. Cependant, pour la grande

majorité des cas, les causes demeurent inconnues. Plusieurs hypothèses soutiennent que le stress

associé au réticulum endoplasmique (RE) pourrait jouer un rôle clé dans la pathogénèse de la

maladie. Objectifs : Déterminer l'effet du stress du RE sur l'accumulation cytoplasmique de la SOD1

mal repliée et de TDP-43. Méthode : Des neurones moteurs NSC-34 ont été traités au curcuma,

connu pour induire un stress au RE. Des immunobuvardages de type Western et des

immunofluorescence indirectes ont été réalisés pour visualiser, localiser et quantifier les marqueurs

de stress du RE, TDP-43 et SOD1. Résultats : Les cellules traitées au curcuma ont un taux de

mortalité plus élevé que les contrôles et ce même à très faible concentration. Le traitement au

curcuma induit une augmentation de l'expression de la chaperonne du RE GRP78/BiP. De plus, suite

au traitement, une accumulation cytoplasmique de TDP-43 est observée par immunobuvardage et

immunofluorescence. Conclusions : Le développement d'un modèle in vitro pour l'étude du lien

entre le stress du RE et l'accumulation cytoplasmique de TDP-43 nous permettra d'avoir de

nouvelles connaissances sur la pathogénèse de la SLA et pourrait mener à l'identification de causes

encore inconnues.

32

2.2 Abstract

Background: Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is an adult onset neurodegenerative disease

characterized by the loss of motor neurons in the brain and in the spinal cord. To date, a number of

genes have been discovered as causative for the classical adult onset form of familial ALS with

typical symptoms, namely SOD1, TARDBP (TDP-43), FUS/TLS, and C9ORF72. For the vast majority

of cases, the causes remain unknown. It has been repeatedly proposed, but never fully understood,

that endoplasmic reticulum (ER) stress response might exert a critical role in the disease

pathogenesis. Objectives: The aim of this study is to determine the effect of ER stress on the

cytoplasmic accumulation of misfolded SOD1 and TDP-43. Methods: We treated NSC-34

motorneuron-like cells with curcumin known to induce ER stress. Western blotting and indirect

immunofluorescence analysis were used to visualize and quantify ER stress markers, TDP-43 and

SOD1 protein expression and localisation. Results: Cells treated with curcumin had inexorably a

higher mortality rate than the controls even at low concentration. Curcumin treatment induced an

increase the ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP expression. Furthermore, an increase

of cytoplasmic TDP-43 accumulation was observed, following treatment with curcumin, by Western

blot and immunofluorescence. Conclusions: The development of an in vitro cellular model to study

this the link between ER stress and TDP-43 cytoplasmic deposits will bring new insights into the

disease pathogenesis and may lead to the identification of yet unknown underlying mechanisms in

SALS.

33

2.3 Introduction

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), also known as Lou Gehrig's disease, is an adult onset

neurodegenerative disease characterized by the loss of upper and lower motor neurons in the brain

and in the spinal cord. It is the most common motor neuron disorder and symptoms include muscle

weakness leading to atrophy, dysphagia and dysarthria (Tandan and Bradley 1985). The death

occurs generally within 3 to 5 years after the initial diagnosis. The only approved therapeutic agent,

proven to modestly prolongs median survival by about 2 to 3 months in a fraction of ALS patients, is

Riluzole (Mulder, Kurland et al. 1986; Lacomblez, Bensimon et al. 1996; Gordon 2013). About 10%

of ALS patients are associated with a genetic cause and are classified as familial ALS (FALS).

Though most cases of ALS are sporadic, 10% of cases have affected relatives, some with clear

Mendelian inheritance and high penetrance (Gros-Louis, Gaspar et al. 2006). To date, a number of

genes have been discovered as causative for the classical adult onset form of familial ALS with

typical symptoms, namely SOD1, TARDBP (TDP-43), FUS/TLS, and C9ORF72 (Rosen, Siddique et

al. 1993; Kabashi, Valdmanis et al. 2008; Sreedharan, Blair et al. 2008; Kwiatkowski, Bosco et al.

2009; Vance, Rogelj et al. 2009; Millecamps, Salachas et al. 2010; DeJesus-Hernandez, Mackenzie

et al. 2011; Renton, Majounie et al. 2011). Due to the complexity of ALS, the underlying mechanisms

of the disease are not yet fully understand. Several research groups around the world are now trying

to elucidate the physiological and pathophysiological functions of the proteins encoded by these

genes and its relevance to ALS.

Many neurodegenerative disorders, including ALS, are characterized by aberrant folding of proteins

leading to the intracellular and extracellular accumulation of insoluble misfolded proteins. The

mechanism whereby mutant SOD1 causes specific degeneration of motor neurons remains unclear.

The favoured hypothesis at this time is that toxicity of SOD1 mutants is related to the misfolding and

aggregation of SOD1 species (Gros-Louis, Soucy et al. 2010). Researchers have also identified

ubiquitinated TDP-43 inclusions in the cytoplasm of motor neurons within the central nervous system

in post-mortem tissues, a pathological hallmark now commonly found in the majority of FALS cases

with or without TARDBP mutations, and in SALS cases (Neumann, Sampathu et al. 2006; Van

Deerlin, Leverenz et al. 2008; Mackenzie, Rademakers et al. 2010). In healthy motor neurons, TDP-

43 is typically localized to the nucleus.

34

It has been also proposed that endoplasmic reticulum (ER) stress response might exert a critical role

in the disease pathogenesis (Saxena, Cabuy et al. 2009; Wang, Popko et al. 2011). The ER is the

site of synthesis and folding of secretory and membrane bound proteins. The capacity of the ER to

process proteins is limited and the accumulation of misfolded proteins may activate different ER

stress pathways. This phenomenon can be observed in ALS, where an increase of ER stress factors,

like GRP-78, is correlated with an aggregation of SOD1 (Urushitani, Ezzi et al. 2008; Saxena, Cabuy

et al. 2009; Saxena, Roselli et al. 2013). The mechanisms that determine cell fate during ER stress in

ALS are also not well understood. However, extensive or chronic ER stress may result in irreversible

neuronal damage and apoptosis. It has been shown that ER stress can be induced in vitro by a

variety of different drugs and chemical compounds (Kraskiewicz and FitzGerald 2012). Recent

studies show that in addition to its beneficial pharmacological effects, such as antioxidant,

anticarcinogenic, antiangiogenic, antiproliferative, and anti-inflammatory activities, curcumin,

compound responsible for the yellow color of the Indian spice turmeric, can induce an augmentation

of ER stress (Aggarwal, Sundaram et al. 2007; Pae, Jeong et al. 2007; Bakhshi, Weinstein et al.

2008; Cao, Li et al. 2013). In this study, we treated NSC-34 motorneurone-like cultured cells with

curcumin to induce ER stress and to determine its effect on the cytoplasmic accumulation of

misfolded SOD1 and TDP-43. Our data suggest that curcumin-induced ER stress did not affect

SOD1 misfolding but rather led to cytoplasmic TDP-43 accumulation.

2.4 Experimental procedures

Cell Culture and treatment

NSC-34 cells were stored at −160 °C in cryovial. Before using the cells, they were pre-cultured for 7

days in 75-cm² flasks at 37 °C in humidified 8% CO2 atmosphere. Cells were harvested using 0.05 %

trypsin/ 0.01% EDTA (Intergen/ J.T. Baker), centrifuged for 10 min at 300g, resuspended in DMEc:

DMEM (Gibco® Invitrogen) with 10% bovine growth serum (BGS; HyClone - Thermo Fisher

Scientific) and antibiotics [100 U/mL penicillin G (Sigma-Aldrich) and 25 μg/mL gentamicin (Shering)].

Cells were plated and cultured to about 85% of confluency before treatment. Curcumin (Sigma-

Aldrich) was diluted in DMSO at a concentration of 0.1 mg/ml and cells were treated at different

concentrations.

35

Cell counting

The number of viable cells of the different treatments after 24h of culture was counted in a 25-square

of the hemocytometer (Hausser Scientific Improved Bright Line at depth 0.1 mm, 0.00025 mm3).

Trypan blue was used as the dye to stain the cells. 50 μl of homogeneous cell suspension, in DMEc

(DMEM (Gibco® Invitrogen) with 10% bovine growth serum (BGS; HyClone - Thermo Fisher

Scientific) and antibiotics [100 U/mL penicillin G (Sigma-Aldrich) and 25 μg/mL gentamicin (Shering)])

was added to 50 μl of 0.4% trypan blue (Sigma Aldrich, Ltd).

Western blotting

Cells were harvest using 0.05 % trypsin/ 0.01% EDTA and centrifuged for 10 min at 1080 rpm at 4°C.

Whole protein lysates from treated cells were extracted by homogenization of the pellets in TNG-T

lysis buffer (50 mM Tris–HCl pH : 7.4; 100 mM NaCl; 10% Glycerol; 1% Triton X), and centrifugation

for 20 min at 13 000 rpm at 4°C. Supernatants (cytoplasmic fraction) were collected and the pellets

(nuclear fraction) were homogenized in SUB lysis buffer (0.5% SDS, 8 M Urea, 2% β-mercapto-

ethanol in water). The proteins were quantified by the Bradford method and diluted in loading buffer

(15% glycerol, 5% SDS, 80 mM Tris–HCl, pH 6.8, 5% β-mercapto-ethanol and 0.01% bromophenol

blue). Each sample (15 µg) was run on a 14% SDS/glycine polyacrylamide gel and then transfered

electrophoreatically to a nitrocellulose membrane (Amersham Biosciences). The blots were blocked

in 5% non-fat milk in TBST (50 mM Tris.HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20) and probed with

different antibodies : rabbit anti-TDP-43 (Protein Tech Group) diluted 1: 3000, rabbit anti-GRP-78

(Abcam) diluted 1:1000, rabbit anti-Cu/Zn SOD (Stressgen) diluted 1:2000, rabbit anti-XBP-1

(Abcam) diluted 1:1000 and mouse anti-actin clone c4 (Millipore Chemicon) diluted 1:15000.

Immunodetection was performed with a goat anti-rabbit-HRP-labelled or anti-mouse-HRP-labelled

secondary antibody (Thermo Scientific™ Pierce™) and the detection was performed with ClarityTM

Western ECL Substrate peroxide solution and luminol/enhancer solution mixed 1:1 (BioRad).

Immunofluoresence

NSC-34 cells plated on square glass cover slips were fixed with paraformaldehyde (4%) for 20 min at

RT according to standard protocols. Briefly, a permeabilization step was first performed with KPBS

(0.02 M potassium phosphate-buffered saline, pH 7.4) containing 0.5% (v/v) Triton X-100 (BioRad).

The primary antibodies used were rabbit polyclonal anti-TDP-43 (Protein Tech Group). The

36

secondary antibodies used were goat anti-rabbit IgG Alexa 488 (Thermo Fisher Scientific). Cell nuclei

were counterstained with DAPI Fluoromount-G™ mounting medium (Electron Microscopy Sciences).

Statistical analysis

Data were analyzed using Prism 6.0 software (Graphpad software, LaJolla, CA). Cell mortality data

were computed by performing one-way ANOVA followed by Dunnett post-tests. Data are expressed

as mean ± SEM; p < 0.001 was considered statistically significant.

2.5 Results

Curcumin treatment did affect cell viability

We first performed a dose-response curve and analyzed the cell viability after a 24h treatment using

increasing concentrations of curcumin (Figure 2.1). As oppose to the curcumin-treated cells, the cells

with no treatment (control) and the cells treated with DMSO (DMSO control) have a similar mortality

rate (respectively 4.67% and 6.39%). As DMSO is the solvent use to disolve curcumin, this control

was needed to sort-out the effect of DMSO from the effect of the treatment. A one-way ANOVA

analysis revealed no significant statistical differences between the two control conditions (no

treatment vs and DMSO-treated cells) (p=0,8809). In contrast, cells treated with a low concentration

of curcumin had a higher mortality rate than the controls (p

37

Con

trol

DM

SO c

ontrol

0.00

1 m

g/wel

l

0.01

mg/

wel

l

0.05

mg/

wel

l

0.1

mg/

wel

l0

10

20

30

40

50

Curcuma treatment

Mo

rta

lity

ra

te (

%) ********

********

n.s.

Figure 2.1 Curcumin treatment causes a increase of the mortality rate

A one-way ANOVA, followed by a Dunnett test, showed a significant increase of cell death after a

24h treatment with different curcumin concentrations (n = 6 for each condition).

Curcumin treatment induces ER stress and accumulation of cytoplasmic TDP-43 deposits

Western blots analysis, made after a 24h treatment using increasing doses of curcumin, were

undertook in order to confirm the induction of ER stress pathways following treatment with curcumin

(Figure 2.2). This analysis revealed an increase of GRP-78/BiP after treatment with curcumin when

compared to the controls. An augmentation of ubiquitin expression can also be noted (Figure 2.). No

significant augmentation of misfolded SOD1 expression was detected in the cytoplasm by

immunoprecipitation using anti-misfolded SOD1 specific antibodies (Gros-Louis, Soucy et al. 2010)

(data not shown). However, an increase of cytoplasmic TDP-43 accumulation was observed,

following treatment with curcumin, by Western blot (Figure 2.2A).

38

To confirm the abnormal accumulation of TDP-43 within the cytoplasm, we did an indirect

immunofluorescence analysis on curcumin-treated cells (Figure 2.3). Our data showed the absence

of cytoplasmic TDP-43 inclusions in control and in DMSO-treated cells, while cytoplasmic TDP-43

accumulation can be detected in curcumin-treated cells.

39

Figure 2.2 Curcumin-treated cells induced GRP-78 expression and cytoplasmic TDP-43 accumulation

A) Western blots analysis revealed an augmentation of ER stress chaperonne, GRP-78, and

cytoplasmic TDP-43, matching a diminution of nuclear TDP-43 (n = 3). B) Quantification analysis of

Western blots relative intensity using ImageJ revealed an increase of GRP-78 , ubiquitin and

cytoplasmic TDP-43 after a 24h treatment using increasing doses of curcumin.

40

Figure 2.3 Cytoplasmic TDP-43 accumulation detected in curcumin-treated cells

Indirect immunofluorescence analysis using anti-TDP43 antibody (green) counterstained with DAPI

(blue) revealed cytoplasmic TDP-43 accumulation in curcumin-treated NSC-34 cells. Each picture

was taken using the same microscope, camera and exposure settings. Magnification : 40x, scale bar

: 50 μm.

2.6 Discussion

In this study, we demonstrated that a 24h curcumin treatment induced the accumulation of TDP-43 in

the cytoplasm of NSC-34 motor neuron like cells. Our analysis also demonstrated that curcumin

enhanced ER stress and had an negative effect on cell viability