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Ressources GIPSA – 11/10/2007 ssUC8 Assistance aux soins et examens sur 14 8.3. Laboratoire Cours

UC8 – ASSISTANCE AUX SOINS ET EXAMENS

MODULE 8.3.

LABORATOIRE

COURS A – Correction de l’autoformation B – analyses biologiques 1 C – analyses biologiques 2

A – CORRECTION DE L’AUTOFORMATION

COMPOSITION DU SANG 1. Replacez les cellules suivantes dans la catégorie à laquelle elles appartiennent : Globules rouges Globules blancs Autre cellule sanguine hématies érythrocytes

lymphocytes, monocytes éosinophiles, basophiles polynucléaires, neutrophiles granulocytes

plaquettes ou thrombocytes

2. Quel est le rôle principal :

- des globules rouges ? le transport d’oxygène et de gaz carbonique - des globules blancs ? la défense immunitaire

- des plaquettes ? la coagulation sanguine

3. Complétez le texte suivant : « La grande circulation part du CŒUR pour aller irriguer les ORGANES (ou tissus)-. Puis le sang, enrichi en –GAZ CARBONIQUE -et appauvri en OXYGENE revient vers le----COEUR-----. La petite circulation se fait entre le---COEURet les --POUMONS» 4. Une solution qui a une pression osmotique supérieure à celle du plasma est qualifiée de :

hypotonique saline isotonique hyperplasmique ■■■■ hypertonique

5. Dans le plasma sanguin d’un animal en bonne santé, on trouve : des hormones sexuelles du cholestérol de l’amidon du glucose du collagène des ions calcium des enzymes digestives

6. Donnez votre avis à propos des affirmations suivantes sur la coagulation : VRAI FAUX Dans un tube sur anticoagulant, les cellules finissent par se déposer au fond du tube x Dans un tube sec, le sang coagule en 2 minutes à température ambiante x Pour obtenir du sérum, on doit utiliser un tube sec x Le plasma est constitué du sérum moins le fibrinogène x


7. Donnez votre avis à propos des affirmations suivantes sur la multiplication des globules : VRAI FAUX Les globules blancs se multiplient dans le sang x Les globules rouges sont fabriqués par la rate x Toutes les cellules sanguines sont fabriquées dans la moelle épinière x Tous les globules sont fabriqués par la moelle osseuse x Des cellules sanguines sont stockées dans la rate x 8. Retrouvez le terme correspondant à chaque définition : Décompte du nombre de globules rouges et blancs dans un volume de sang donné : Numération sanguine Dosage des différents constituants présents dans le plasma : Biochimie sanguine Exprime en pourcentage le volume occupé par les hématies par rapport au volume total du sang : Hématocrite Exprime en pourcentage le nombre de chaque catégorie différente de globules blancs dans le sang : Formule sanguine 9. Essayez de trouver le terme médical désignant le taux sanguin des substances suivantes :

Chlolestérol ➯ Cholestérolémie glucose ➯➯➯➯ glycémie acide urique ➯➯➯➯ uricémie (ne pas confondre avec urémie) protéines ➯➯➯➯ protéinémie amylase ➯➯➯➯ amylasémie sodium ➯➯➯➯ natrémie (vient du symbole du sodium : Na)

B - ANALYSES BIOLOGIQUES 1 1. LA CENTRIFUGATION 1.1. Définition de la force centrifuge « C’est la force créée par la rotation d’une masse à grande vitesse; la force centrifuge s’applique sur cette masse et tend à l’éloigner de l’axe de rotation »

Exemples : panier à salade, machine à laver. 1.2. La centrifugation d’un mélange Les particules les plus denses sont entraînées plus rapidement vers l’extérieur de l’axe de rotation. Pour un mélange placé dans un tube: (voir annexe 1) � Les particules denses sont entraînées vers le fond du tube = le culot � Les particules peu denses demeurent dans le haut du tube = le surnageant Application 1: SANG DANS UN TUBE SEC La force centrifuge s’applique sur le caillot. A la fin de la centrifugation :

- le culot = caillot rétracté (globules rouges, globules blancs, plaquettes, fibrine) - le surnageant = sérum (eau +glucose, urée, hormones…)

Application 2: SANG DANS UN TUBE AVEC ANTICOAGULANT La force centrifuge s’applique sur les cellules sanguines en suspension. A la fin de la centrifugation :

- le culot = cellules sanguines (globules rouges, globules blancs, plaquettes) - le surnageant = plasma (eau + glucose, urée, hormones, fibrinogène…)

Application 3: URINE La force centrifuge s’applique sur les éléments en suspension A la fin de la centrifugation :

- le culot = sédiments urinaires (cellules, cristaux, bactéries,...) - le surnageant = partie liquide de l’urine (eau + urée, bilirubine,…)


1.3. Règles de la centrifugation

* Equilibrer la centrifugeuse (répartir de façon égale le poids autour de l’axe de rotation)

* Verrouiller le couvercle et ne jamais l’ouvrir en marche (sécurité)

*Régler la force : variable en fonction de la nature (sang, urine…) et de la masse de l’échantillon à centrifuger. La plupart des centrifugeuses sont maintenant préréglées en fonction de l’échantillon. En moyenne : Vitesse ⊗ 4000 à 5000 tours/minute

Temps ⊗ 4 à 5 minutes


1.4. Correction des exercices Exercice 1 Un prélèvement d’urine (U) et deux prélèvements de sang (S1 et S2) ont été réalisés sur le même animal. 1- Disposez les tubes dans la centrifugeuse en remplissant le(s) tube(s) nécessaire(s) pour l’équilibrer ; indiquez par un trait le niveau d’eau choisi dans les tubes a, b, c.

1- Disposez les tubes dans la centrifugeuse en remplissant le(s) tube(s) nécessaire(s) pour l’équilibrer ; indiquez par un trait le niveau d’eau choisi dans les tubes a, b, c. 2- Complétez les schémas ci-dessous en identifiant les fractions obtenues à l’issue de la centrifugation.

Exercice 2 : Devenir du prélèvement de sang Légendez les schémas suivants:

Tube hépariné� Après 5 min Après 1/2 h Après centrifugation

Tube sec� Après 5 min Après ½ h Après centrifugation Lequel de ces deux tubes permet de reconstituer du sang total même après centrifugation ?


Le tube hépariné. 1.5. Séparation des constituants du mélange Afin de faire réaliser certaines analyses sanguines dans des laboratoires extérieurs, il est souvent utile de séparer le plasma ou le sérum de l’échantillon prélevé. Le prélèvement du surnageant s’effectue au moyen d’une aiguille (gros calibre) et d’une seringue stériles. La séparation du plasma est plus délicate car tout mouvement intempestif du tube provoque la reconstitution du sang total. Il faut aspirer le liquide en tenant le tube droit et en évitant de toucher le point de jonction entre le caillot et le surnageant, sous peine de contaminer le prélèvement. Le liquide est ensuite conditionné dans un tube sec stérile identifié et envoyé avec les précautions d’usage. 2. LES TESTS DE DIAGNOSTIC DES MALADIES INFECTIEUSE S

2.1. Principe de ces tests : analyses immunologiques

• Le but de ces analyses est de mettre en évidence dans le sang (ou d'autres prélèvements tels que les selles par exemple) la présence :

- soit d'un antigène (ex: virus ou une partie de son enveloppe) - soit d'un anticorps dirigé contre un antigène, dont la présence prouve qu’il y a eu

contact avec celui-ci. Ces test sont rapides (quelques minutes) fiables, et simples à utiliser ce qui favorise leur développement en clientèle vétérinaire. • Le principe de ces analyses fait appel à deux phénomènes : La réaction antigène-anticorps (voir UC1 protocoles de vaccination) Les anticorps sont des protéines produites dans le corps en réponse à la présence d'une substance étrangère qui n'est pas un constituant normal de ce corps : l’antigène. Les anticorps formés se combinent avec les antigènes de façon spécifique ce qui permet ou facilite l’élimination des substances étrangères. Une réaction de chromatographie : réaction colorée quantitative. Exemple du test FeLV Dans ce cas, on met en évidence l’antigène : donc le virus FeLV. On met en contact du sérum ou du sang du chat testé avec un anticorps anti-FeLV marqué en bleu afin de repérer si la réaction antigène/anticorps a eu lieu.

● chat positif au FeLV : spot test _ _ _ _ _ ● chat négatif au FeLV : spot test _ _ _ _ _

Exemple du test FIV Dans ce cas, on dose les anticorps du virus FIV; on met en contact du sérum ou du sang du chat testé avec l'antigène FIV marqué en bleu.

● chat positif au FIV : spot test _ _ _ _ _ ● chat négatif au FIV : spot test _ _ _ _ _

2.2. Maladies diagnostiquées par ces tests

Chat : - FIV (détection Anticorps) - FeLV (détection Antigène) - PIF (détection Anticorps) - Giardia (parasite intestinal, détection des oeufs) - Chlamydiose (détection Antigène)


Chien : - Leishmaniose (détection Anticorps) - Dirofilariose (détection Antigène) - Parvovirose (détection Antigène) - Ehrlichiose (détection Anticorps) - Maladie de Lyme - Giardia (parasite intestinal, détection des oeufs)

2.3. Echantillons utilisés

Pour la plupart des maladies testées, on utilise indifféremment du sang total frais ou une partie du sang (plasma ou sérum), frais ou congelés pour certains des tests (à vérifier sur la notice). La détection de Giardia, parasite intestinal ou du parvovirus, on utilise des selles. La détection de la chlamydiose utilise des larmes chez le chat (prélèvement conjonctival). La détection de la PIF peut être faite dans le sang ou dans un liquide d’ascite abdominal. Dans tous les cas, l’analyse doit être faite le plus tôt possible après le prélèvement.

2.4. Différents types de tests

Plusieurs laboratoires en proposent. D’une façon générale, il est important de repérer : � le mode de conservation (température ambiante ou réfrigérateur) � l’échantillon à utiliser � les étapes de la manipulation � les erreurs à ne pas commettre pendant la manipulation � le temps de la réaction (variant entre 6 à 10 min) � le témoin positif qui montre que le test a correctement fonctionné.

Tests simples à flux unilatéral : Exemple du test WITNESS FeLV

1. Mode de conservation : Au réfrigérateur, laisser revenir à température ambiante avant utilisation.

2. Afin de ne pas commettre d’erreurs de manipulation Respecter le nombre de gouttes de l’échantillon et du conjugué. Laisser le dispositif horizontal.

3. Résultat obtenu en 5 min

4. Validité du test et lecture du résultat La bande contrôle du repère 3 doit être colorée.


On en déduit les règles de lecture suivantes : � La bande du repère 3 doit être obligatoirement colorée sinon le test est non valide. � Pour un test FeLV, si la bande du repère 2 est rose, le chat est positif au FeLV. Tests SNAP : Exemple du Snap combo plus FeLV, FIV

Ce type de test a une technologie plus poussée qui permet d’améliorer sa sensibilité. Son prix est donc plus élevé.

1. Mode de conservation : Au réfrigérateur, laisser revenir à température ambiante avant utilisation.

2. Afin de ne pas commettre d’erreurs de manipulation Respecter le nombre de gouttes de l’échantillon et du conjugué. Homogénéiser délicatement Bien enfoncer l’activateur Laisser le dispositif horizontal.

3. Résultat obtenu en 10 min

4. Validité du test et lecture du résultat

Le spot contrôle positif doit être coloré en bleu. Test valide Test valide Test non valide Test valide Test non valide FIV – et Felv + FIV + et Felv + FIV – et Felv - On en déduit les règles de lecture suivantes : • Le spot positif doit obligatoirement être de couleur bleu, sinon le test est non valide. • Si le spot test FeLV est plus foncé que le contrôle négatif, le chat est positif au FeLV. • Si le spot test FIV est plus foncé que le contrôle négatif, le chat est positif au FIV. • Si le spot test FeLV est plus clair que le contrôle négatif, le test est non valide.(élimination

des faux positifs FeLV) • Si le spot test FIV et plus clair que le contrôle négatif, le test est non valide.(élimination

des faux positifs FIV) 2.5. Validité des tests

Le spot contrôle positif ou la bande contrôle n’a pas réagi :

CAUSES VERIFICATIONS Mauvaise qualité du test ⊗

- Mode de conservation - Date de péremption - Emballage individuel abîmé, ouvert


Mauvaises manipulations du test ⊗ - Echantillon utilisé - Mode d’emploi : étapes de préparation du test - temps de réaction

2.6. Exercice Voici un test de diagnostic FIV, FeLV fonctionnant sur le même principe que les tests Witness. Sachant que le résultat suivant est : Test FeLV valide et négatif, test FIV valide et négatif.

Interprétez les tests suivants :

3. LA METHODE OVASSAY

Intérêt de la méthode Ovassay : Déceler la présence d’œufs de vers (nématodes et cestodes) dans des selles, et les identifier afin de délivrer le traitement adapté. Mode de conservation de ce test : A température ambiante Type d’échantillon utilisé pour effectuer cette méthode : Selles fraîchement émises dans un pot propre. Conseils à donner au propriétaire pour la récolte du prélèvement : - Utiliser des gants

Test FeLV valide négatif Test FIV valide, Positif

Test FeLV valide, Positif Test FIV valide, Positif

Test FeLV valide Positif Test FIV valide, négatif

Test FeLV valide, Positif, Test FIV non valide


- Les selles doivent être fraîches, donc ne pas tarder à les amener à la clinique. Pas plus de 2 heures).

Points délicats de la manipulation : - Ne pas mettre trop de selles dans le pot échantillon. - Formation du ménisque convexe. - Retrait de la lame couvre – objet sans la racler sur le pot échantillon. Résultat : ��Utilisation de la lame de verre ainsi préparée - dépôt sur une lame porte – objet. - observation au microscope au faible grossissement.

C - LES ANALYSES BIOLOGIQUES 2 1. BANDELETTES REACTIVES

Il existe des tests simples de mesure biochimique dans le sang ou dans l’urine. Le principe repose sur une réaction colorimétrique.

Sur le sang total (capillaire ou veineux), 2 types de mesures sont possible : dosage de l’urée et du glucose. Sur l’urine , une dizaine de mesures sont possibles : globules blancs, hématies, glucose, corps cétoniques, protéines, pH… Mode d’emploi : - On fait passer une goutte d’échantillon sur un spot réactif placé sur la bandelette. - On attend le temps préconisé par le mode d’emploi (60 secondes par exemple pour une

glycémie). - Pour les bandelettes sanguines : on rince rapidement sous le jet d’eau, on sèche. - On compare la couleur obtenue sur le spot à une échelle colorimétrique imprimée sur le

tube ou le mode d’emploi. On en déduit la valeur approximative du taux de substance recherchée.

Résultats : Exemple

Glycémie 0,9 g/l

Ces tests sont rapides, simples et peu onéreux. Mais ils sont moins fiables quantitativement que ceux obtenus grâce aux automates de biochimie. Le nombre de paramètres est limité : urée, glucose. 2. BIOCHIMIE SANGUINE

On souhaite évaluer le taux de certaines substances toujours présentes dans le sang (nutriments : glucose, déchets : urée, … ; constituants du plasma : protéines..), et dont les variations traduisent des états pathologiques. Plusieurs types d’analyseurs biochimiques spécifiques à la clientèle vétérinaire sont disponibles sur le marché. Ils présentent beaucoup d’avantages.


Présence d’un

appareil d’analyses au cabinet

AVANTAGES CONSEQUENCES

Pour le praticien

Précision du diagnostic Intérêt médical Résultats rapides lors des gardes

Gain de temps + délivrance du traitement immédiatement Connaissances nouvelles Confort dans le travail et meilleure efficacité

Pour l’ASV

Motivation et participation Supprime les courses au laboratoire et la prise de note des résultats

Intérêt accru pour les malades Gain de temps

Pour le client

Résultats et traitement immédiats Image sophistiquée de la clinique Supprime la course au laboratoire

Gain de temps et apaisement psychologique Confiance Gain de temps

2.1. Réflotron

2.1.1. Caractéristiques techniques Echantillons utilisés : Sang total, sérum , plasma Paramètres analysables : 17 paramètres Urée, créatinine , GPT …. = analyses biochimiques Conservation des réactifs : Au sec A l'abri de la lumière Température ambiante (sauf triglycérides au réfrigérateur) Nombre de paramètres/analyse : 1 paramètre à la fois / durée 2min en moyenne 2.1.2. Etalonnage

Check (Vérification du système de mesure) : Modalités :

- Nettoyer la chambre de mesure avec une lingette spéciale Réflotron - Glisser une bandelette spéciale dans l’appareil - Vérifier que le résultat soit conforme aux données du flacon

Fréquence :

- En fonction du nombre d’analyses réalisées - Le nouveau Réflotron indique le moment de réalisation du check

Sérum de référence : Fréquence variable (6 mois à 1 an) 2.1.3. Plan de la manipulation


Description de la manipulation : - Sortir la bandelette correspondante - Disposer l'embout sur le pipeteur - Enlever la cupule de protection qui protège la plage réactive - Dépôt de l'échantillon sur la plage réactive - Insertion de la bandelette - Résultat en moyenne 2 minutes après

Erreurs à éviter :

- Poser les doigts sur la plage réactive + code magnétique - Racler la plage réactive en déposant le sang - Mal appuyer sur le bouton du pipeteur - Utiliser des bandelettes périmées ou mal conservées - Utiliser un sang trop vieux ou mal conservé - Utiliser un appareil mal étalonné

2.1.4. Relevé de résultats

Unité : 1mg/dl. = 10 mg/l. = 0,01 g/l.

Exemple : 35,2 mg/dl = 0,0352 g/dl = 0,352 g/l

g dg cg mg 0, 0 3 5

l dl cl ml 1 0

Réflectrométrie : Bandelette système REFLOTRON 2.2. Vettest

2.2.1.Caractéristiques techniques

Echantillon utilisé : Sérum, plasma. Il nécessite donc une centrifugeuse.

Paramètres analysables : 21 paramètres (plaquettes)

Conservation des réactifs :


Boîtes vertes au réfrigérateur, boîtes violettes au congélateur

Durée de l’analyse : Environ 6 minutes quel que soit le nombre de paramètres.

Nombre de paramètres/analyse : De 1 à 12

Calibration automatique par système de disquettes 2.2.2. Plan de la manipulation

Description de la manipulation : - Saisir les informations générales demandées (nom, espèce,…) - Introduire les plaquettes une par une - Placer un embout sur le pipeteur - Pipeter le sérum (action automatique : l’appareil prélève lui-même le volume

nécessaire) - Une fois l’analyse terminée, jeter le pipeteur - Imprimer les résultats

Erreurs de manipulation à éviter :

- Toucher le spot test de la plaquette - Insertion incorrecte de la plaquette (encoche) - Pipeter à la limite plasma/cellules sanguines - Utiliser des bandelettes périmées ou mal conservées - Utiliser un sang trop vieux ou mal conservé - Utiliser un appareil non recalibré

2.2.3. Relevé du résultat

Informations portées sur le compte rendu (imprimante): Date + nom du patient + résultat + normes des paramètres

Unités : Unité de la norme usuelle 2.3. Contrôle qualité des appareils d’analyses

Le principe d’un contrôle qualité est de vérifier que les résultats de l’analyseur soient toujours fiables, car des problèmes techniques (de source lumineuse, de capteur, de transport) peuvent entraîner des modifications des analyses et donc des résultats inexacts.

Chaque appareil a donc son système propre de contrôle qualité qui doit impérativement être fait régulièrement. On utilise en principe un système de sérum de contrôle ou de référence dont on connaît déjà les taux de certains paramètres ; le dosage par l’appareil du paramètre en question doit donc correspondre à la valeur déjà connue. Si ce n’est pas le cas, il est nécessaire de contacter le distributeur de l’appareil.

Attention aux négligences qui peuvent nuire à la qualité des résultats : - Erreurs de manipulation - Plaquettes ou sang périmés ou mal conservés - Appareil "déréglé"

2.4. Entretien des appareils d’analyse

Il est impératif de suivre quelques règles élémentaires et de se conformer strictement aux instructions du distributeur. Dans tous les cas :

� éviter de déplacer les appareils.


�� les protéger du soleil et de la poussière. �� éviter les manipulations brusques. �� n’utiliser que les produits de nettoyage recommandés par le fabricant.

3. HEMATOLOGIE

Le but est d’apprécier le nombre des différentes catégories de cellules sanguines : hématies, plaquettes, globules blancs, en réalisant une numération et/ou une formule sanguine. 3.1. Réalisation

Le sang doit être recueilli sur anticoagulant, ex : EDTA, Citrate… Il doit être conservé au réfrigérateur si l’analyse n’est pas faite immédiatement.

Des appareils permettent de réaliser ces analyses en clientèle vétérinaire : MS 9, QBC Autoreader. Rq : il existe des méthodes de comptage manuel des éléments sanguins : la cellule de Malassez, les Unopettes. 3.2. Mesure de l’hématocrite

Rappel L’hématocrite exprime en pourcentage le volume occupé par les hématies par rapport au volume total du sang. L’hématocrite est un paramètre révélateur de l’état de déshydratation ou d’anémie de l’animal. On estime le taux normal d’hématocrite à 45% pour le chien et à 40% pour le chat. Plus l’hématocrite est élevé, plus l’animal est déshydraté; chaque augmentation de 1% de l’hématocrite correspond à une perte approximative de liquide égale à 10 ml/kg. Plus l’hématocrite est faible, plus la quantité de globules rouges présents dans le sang est faible. Mesure de l’hématocrite Pour la mesure de l’hématocrite, on utilise un tube capillaire appelé tube à micro-hématocrite, qui contient de l’héparine afin d’éviter la coagulation. Il faut également disposer d’un plateau de centrifugeuse spécifique pouvant recevoir les tubes capillaires. Rotor à hématocrite

Principe de la manipulation Placer le tube capillaire dans le tube contenant le prélèvement sanguin et aspirer le sang jusqu’au niveau indiqué ; boucher avec le doigt l’extrémité supérieure du capillaire et le placer sur la gomme afin de former un petit bouchon . Placer ensuite correctement le tube sur le plateau et mettre la centrifugeuse en route :


Lecture du résultat Après centrifugation on observe trois couches distinctes:

� une première formée par les hématies � au dessus se trouve la couche leucocytaire (leucocytes + plaquettes) � la couche supérieure est constituée de plasma.

La lecture du résultat se fait à l’aide d’une échelle graduée qui permet de convertir la hauteur des globules rouges dans le tube en valeur de l’hématocrite. 4. RESULTATS D’ANALYSES : Corrections exercices

LABORATOIRE D’ANALYSES MEDICALES 22 RUE PIVOT - 13100 AIX EN PROVENCE

Chien POLLUX Madame VELLEDA mardi 15 avril 07 8 cours BLANCHER 13100 AIX EN PROVENCE

RESULTATS D’HEMATOLOGIE ERYTHROCYTES : 6 530 000 HEMATOCRITE : 45 %, HEMOGLOBINE : 20 LEUCOCYTES : 11 500 Neutrophiles : 65%, Eosinophiles : 1%, Basophiles : 2%, Lymphocytes : 26% Monocytes : 6% THROMBOCYTES : 360 000

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