hydrolyse de l'amidon de manioc par un lactobacille
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OFF 1~ ,- D[ LA RE CH [ ;~ CHE
SCI[;t"rIFI')UE [T TECHI~lt)UE
OUTI"\[ [1[1'.
La l.o r a t o i r e cie ~'icrobiologie
i • r. 1")H6 .. DAKAR
HYDROLYSE DE L'AMIDON DE MANIOC PAR UN LACTOUACILLE
ENRICHI~)SEr1EIH D'UN DISILAGE EN PROTEINES
13. I.)r~[YruJ
RAPPORT D'ELCVE
~Jovembre 1S77
1 N T R 0 DUC T ION
1. ~1 A TER 1 r: L ET nET H ODE S.
A. ENR1C11 1SSU1l NT SET 1SOL DH~ NT S DES 8f\ CT[R 1r. S LAC T1r;J UES
1/ Enrichissements
2/ 1so 1ements
B. COMPOSITION DES MI LIEUX DE CULTURE
C. L'ENSILAGE DE MANIOC
D. MATERIEL DE FERMENTATION
E. PREPARATION DES ECHANTILLONS
1/ Culture 1 iquide
2/ Ensi lage et Substrat sol ide
F. METHODES DE DOSAGES
1/ Dosage des protéines
2/ Dosage des sucres totaux
3/ Dosage des sucres réducteurs
4/ Dosage des sucres résiduels
5/ Dosage du glucose
6/ Dosage de l'ùcllvlt6 iJIIlY 1 ù"i i qlln
7/ Dosage par la chromatographie en phaze gazeuse
a ) Analyse des sucres
b) Analyse de l'acide lactique et d'autres acides
organiques.
8/ Détermination de l'acide lactique L(+)
Il. RES U L T A T S ET DI SCUSS IONS
Rappels sur les Bactéries Lactiques
C. ETUDE DE LA FER~1ENTATION ANAEROBIE DE L'AMIDON DE MANI_ .. __ . -_.~AF_~J__~~C}_OJ3_AC 1 LLUS AMYLOLYT 1 QUE
1/ Croissance comparée sur glucose et amidon
a) Croissance sur glucose
b) Croissance sur amidon
c) Production d'acide lactique après Inhibition dA
la croissance par le chloramphénicol
2/ Etude cinétique de l 'actlvitê amylaslque
3/ Propriété de l'amylase
4/ Application et Discussions
a) Application.1 ln production d'acide lactique
dans des mi 1ieux amylacés ne permettant aucune
cro i ssance des Lactohac il 1es.
b) Discussion.
D. INOCULATION D'UN ENSILAGE DE MANIOC
E. Er~ f~ 1CHI SSEM ENT D' LI N ENS 1LA GEDE 11 ANI 0C EN PROTEl NES
PAR FERMENTATION-----~-- - ~~- ~. ---
1/ r'1 é t h0 cl e s
a) Obtention de farine d'ensi lage
b ) Dispositif d'incubation
c ) Analyses
2/ Résultats et Discussions
CON C LUS ION.
2
contraitement aux diff~runts travaux CR. BERGKVIST, 1957; F. DESCHAMPS,
F. [1[ '( ER, 1')75, G t IÎ. r . PEfI [) E, K. r. GPEGO RY, 19 75) sur 11 U t i 1 i s a t ion
do l'Amidon pour la production de rrotêTnes, qui portaient jusqu'alor~
e s s e nt l e l Ierna n f sur la culture en mi 1 leu liquida di lu6 do d l f f é r e n t e s
souches de microoroanismes. Le procédé mis au point fait appel ~
une t e c hno log i e sim pie e t d0 i t Pe r met t r e à des 1ns 'r ail a t ion s d\)
formentation de se situer à proximité dos cultures et de 1iélevagc.
Mais, dans cette opti~u8 est apparu le probl~mc do la conservation
du man i oc : Lo tuhercu 1e de man i oc se con serve bien et 1ongtemp s
dans le sol, mais après son arrachage, il se détériore rapidement
par hydrolyse de l'amidon et début de fermentation par des lAvures.
Les moisissures com p l l q ue nt rapidement ce processus et en trois
jours, sous le climat chaud où il est cultivé, le tubercule arraché
devient inutilisable. Comme la conservation en place entraine une
immobil isation importante des surfaces cultivées et n'est donc pas
souhaitable, il se pose ainsi un problème de conservation de ce
pro du i t a my 1a c ô • Unl' sol u t ion 9 é né rai Cl men tut i 1 i sée est 1e s é cha 9e
au soleil des racines coupées en rondelles ou en cossettes. ~"lélls ln
dessiccation dure huit ~ quinze jours et exige pour obtenir un bon
produi 1- un cl l ma f sec. Or les zones de culture du manioc ont souvent
un cl lmol hum i do , 1 (> sÉlcha'le au fue 1 .3 d' autre part l' i nconvén ient
de faire munter le prix dG rov;ent du manioc sec.
Pour ces différentes raisons, il nous a paru Intéressant d'étudier
1a con s e r vat ion d u man i 0 c par e nsil age e t son ut i 1 i sa t ion é v,)ntue Ile
dans le procédé d'enrichissement par une moisissure.Par ai 1leurs,
une bonne c r o l s s an c o du mycel ium demande dès le départ que le
produit soit acidifié. L'ensilage, riche en acide lactique, pouvait
donc répondre aussi ~ co besoin d'acidification.
Oes essais emririqu0s ont montré qu' il est possible d'obtenir
un bon e ns l J a qe de manioc (S[lir(l~ ut' TILLON, l CJ7?), ma i s aucune
étude microbiologique nia été réal isée sur ce moyen do conservation
du manioc.
3
::utr'.' étude a donc porté, dans un premier temps,sur la
r e c ho r c ho dos :Jach0ri(;s lactiques rosponsables du processus d'ensi·-
lage du manioc et plus pn r t l c u l l è r erne n t sur les t ac t o bac i l l c s amylo
lytiques capables de donner une grando quantité d'acide lactique
à partir du l'amidon.
Afin de mieux déterminer les souches sélectionnées, une étud
de luurs caract6risti~u8~ ~hysiologique5 de croissancu a 6tG onsuit
réalisée. L'hydrolysc> anaérobie de l'amidon a été ê tu d i é e sur un c
sou che doL a ct 0 L' a cille h0 m0 be tt i que c ho i sie pou r son pou v0 iramy 10
lytique élevé. La nature de l'enzyme amylolytique et les rendements
de l 'hydrolyse ont ~té déterminés. La cinétique do production de
l'enzyme par cette souche a ét6 suIvie, ses propriétés physiques
caractérisées.
Nous avons) par la suite,étudié les possibilités d'utilisa
t Ion d\3 C 8 t 0 r 9 a Il l sm(-~ Po url '01) ton j Ion cl' un () n s l l (j Cl 0 cl () môn i 0 r. •
Enfin, l'étude a porté sur la transformation de l'cnsi lage
dn mRnioc en un produit enrichi en protéTnes par la croissance
d'un champignon.
1. ~1 AT ERIE LET 1'1 ET1-100 ES
4
Les bactér i os 1 act i ClLJes ont été i 50 1ées par enr i ch j ssements
obtenus suivant ln mè t ho do préconisée par R. \,lhittenlJury (lq64) et
F. Gassor (1975) n partir do matériel végétal. nu manioc fra1che
ment récolté est broyé puis tassé dans des flacons serum de 250 ml,
remp 1 i s au deux tiers, dans 1 esque 1 s 1 i air restant a été romp 1 acé
par de l'azote. Un flacon de l 'ensi lage ainsi obtenu est prélevé
toutes les 24 heures pour les isolements.
Un ensi lage de jeunes tiges de riz susceptible de contenir
des bactéries lactiques am v l o l v t l qu e s a été obtenu suivant la même
méthode.
2/ 1so 1ements
On p r n1p v n m1 do J u'~ rie 1i 8c h a n t i 1Ion; arr p s ri i 1LJ t i o n d c
10. 1 à 10-6,0,1 ml est é t a l ô t'Tl boîtes de Pét .... j sur milieu H.R.S.
modifié (voir paragraphe suivant).
Pour chaque di lution, trois boîtes sont placées à 35°C on
étuve et trois boîtes en anaérobiose en jarre gaspac à 35°C.
Après 48 ~ 72 h, les bactêries lactiques sont caractérisées par la
méthode de Whittenbury (1964).
Les souches possédant une exoamylase sont mises 'In 0vid0nre
e n exp 0 san t 1e s b 0 j t (3 s d e Pé tri , con te n a n t u n mil jeu ~1. R • ~. ami don ,
quelques instants aux vapeurs d' iode pour colorer l'amidon et
repérer ainsi les zones d'hydrolyse.
Ap r è s pur l t I c o t t o n , i o s ua c lô r l o s i ac t l quo a S0111" COI1':",orvnc'')
en tubes de gelose inclinée en atmosphère d'azote o l u s 5 % do CO2
.
1 N T R 0 Due T ION
Cette étude su ries La c t ob a c il 1 es amy 1 0 1yt i ques se si tU0
dans 10 cadre des rocherches portant sur l'enrichissement direct
du manioc en protéines d'origine unicellulaire.
La pénurie d'al iments protéiques dans l'al imentation humaine
touche directement les pays les plus d6favorisés et les plus pauvres
du tiers-Monde, ceux-là mêmes on la croissance démographique est
la plus forte. Le développement de l'élevage apportera sans doute
une première solution;) la carence en protéines al l me n t a l r e s .
Cependant, si aujourd' hu i l'a 1 i mentat i on protéique des
animaux est pratiquement assurée en total ité par des protéines
d'origine végétale (Céréales, Soja, Arachide etc), on s'accorde à
pen s e r '1 ue celle s _. ci, mal gré u n a c c r 0 Î s sem e nt pré vis i b 1e dei eu r
production, ne suffiront pas à couvrir les besoins nécessaires à
une intensification de l'élevage. Il est donc nôcessaire d'envisager
l 'uti 1 isation d'autres sources de protéines dans l'al imentation
animale.
C ' est pou r quo j,le 1ab 0 rat 0 ire J o l' 0 . ~ . "l • T • 0 • 1·~. Da ka r a
mené des études dans le but de rechercher de nouvelles sources de
protéines en ut! 1 isant dos microorganismes croissant sur des
substrats glucidi1ues agricoles. La choix du laboratoire s'est
porté sur un substrat amylacé facilement disponible dans les zones
géographiques on les carences protéTniques sont importantes: le
Ma n l o c •
Capable en offet de donner dans de bonnes conditions de
culture, plus do 40 tonnas da racines à l'hectare (15 tonnes de
matière sécha), peu exigeant en ce qui concerne les s o I s , If) ~~ûnioc
se pr0sente comme un cxceptionnBI fournisseur d'énergie.
Lee; tr av aux mon é s au laboratoire de Dakar (RAIMBAULT; GERMON;
ALAZARO. 1976) oni ainsi permis la mise au point d'un p r o cé d é,original portant sur l'enrichissement du manioc en prot6Tnes par
la croissance aérobie des moisissures amylolytiques. Dans ce pro
cédé, la c r o i s s an c o du champignon se fait sur un milieu sol ide
5
U. COrWOSITIOl1 DES HILIEUX DE CULTüRE.
L ~' mi \ i (~u rj c C \ 1 \ -~ ure Il i s Clu ~'C' i n t Ç' a r 'D(' '\ an, R0 Cl0 S êl et
Sharpe (1960) ou mi 1 i e u ~1.r(.s. a donc été uti 1 isé pour l'isolement
rie s ~. a c 1- é rio s i) c t i Cl u 0 s. Fou rie 5 sou c h e s amy 10 1Yt i Cl ues, 1e glu cos e
a été remplacé par de l'amidon solublo.
~1 i 1 jeu ~J, RSen g / _1_
Tryptone 10 g; Extrait de levure ~ g; P04HK 2
2,5 g; Na
acétate 5 g; Citrate di NH4
2 g; S04Mg 0,2 g; S04Mn 0,05 g; Tween
80 1 ml; 81 ucose 20 g; Agar 20 g; pH ajusté à 5,5 avec l'acide
acétique.
Nous avons uti 1 Isé, pour la consorvatlon des souches et
los cul t ~I ,- e 5 e n f 8 r :':-: nt: ' urs, 1Gr" i 1 i 0 u sui v uni' :
farine de manioc (ou glucose) 10 g, extrait
de levure 2,5 Trypt l c a s e 2 r: g; (N114
) 2 S04 3 0; K2
1-J P0 4 7 , ~ :Jg; , :J
NaCI 2,5 9 pH ajusté à 5,5.
C. L'ENSILAGt DE ~lMJIOC.
Po u rob te n i r urie n sil êl 9 o de rn a n 10 c , 1a mô t h 0 d G f) 5 t 1a ml~ me
quo celle utilisée pour les onrichissements de bactéries lactiques.
Nous avons cuip l o y ô des flacons serum de 1000 cc. Pour les essais
d'inoculation de l'ensilage de manioc par une souche sélectionnée
de bactérie lactique, nous avons utilisé des doses de 5 ml de cul
ture par kilo de pUlpe humide de manioc.
La pression des gaz à l' Intérieur du flacon est contr61ée
tout au long du processus de fermontation.
D. MATERIEl DE FERMENTATION.
Uno première étude des caractéristiques p h v s l o l o q i q u e s de
cro i s s an c o des souches a été réa 1 i :""ée DrnC(J iJ un b l o p no t omè t r o f1onet
Maury--Jouan. Deux fermenteurs de 2 litres Blolaffitte ont permis
l'étude cinétique des paramètres de fermentation d'une souche
sélectionnée. Sur ce type de fermenteur, les paramètres suivants
sont régulés:
6
.. température
.. eo l t a t l o n et réqulation d'antimousse
-- pH
arpor+ d'ôzotG ot de CO 2.
De rlus, un enrogistruur permet do suivre en fonction du
tump~ la consommatinn d'acide ou do base nécessaire à la r6gulation
du pH.
Les col Iules sont récoltées sur une contrifugeuse de type
réf r i 9 ô r ÉJ ~1 SEl 8, 0 u sur u n 0 pet i teS 0 r V o IlsSI.
Les mesures de dcnsit~ optique pour les croissances et les
dosages sont lues au spcctrophotomètre Zeiss.
L(3s ana 1 yscs par c h r orna t o q r a p h i e en phase gazeuse ont été
réalisées sur chromatographo Varian 1400.
Enf in, I,~ matériel uti 1 l s é pour les fermentations un mi 1 l o u
solide ost celui mis au point par Raimbault et Coll. (1976).
E. PREPARATION DES ECHANTILLONS.
Avant d'&tre nnalysés, les échanti 1 Ions subissent un trai
tfllnont pr ô p a r a t o i r o s o l o n Cj'I'il s'ilQit d'unn culture l l q u l d o ou
de l'ensilagE!.
La densité optique est lue à 620nm. Par ailleurs, pour
l'activité amylasique, la culture est centrifu9ée, puis le surnageant
est e n sui tep a s s é 5 U r fil t r 0 s i'~ i Iii po r e s d e 0, 4 5 u pou r é vit e r
toute contamination susceptible de modifier la concentration finale
des suc r es. Ilenos t de ln Ôme [' 0 url 0 s é cha n t i 1 Ion san a 1y s é son
chromatographie en phase gazeuse.
L'humidité est d é t o r ml né o sur o n v l r o n 5 g d'onsflJgu I1OmO
genéisé. Pour les analyses, 5 g d'ensilage mélangés à 30 ml d'eau
sont homogénéisés par un broyage de quelques secondes ~ l'Ultra
Tunax, puis 10 volume est ajusté à 50 ml. Après détermination du pH,
cette suspension convenablement diluée sert à la détermination
des dlfférontes onalyses,prot6Tnos ct sucras.
ffiÇ
Pour 1es ana 1ys o s au c h r orn a to j r o p he en ph o s o CJ;Jz~u·,L. 1 :.:l
d'en·~i lage r- s f di lu?' d a n s 10 ml d'c"lu.l ml de la solution est alors
filtrée sur Hi Il i po r o <0,-15 u ) puis traité.
La p r é pa r a t l o n dos é ch a n t l lions du (ni 1l c u sol l do dr) crois'
san c e duc h e mpiC! n (.n est ide n t i Q,1I G à celle u t i 1 i 5 é e pou r Ile nsil age .
F. 1\1 ETH ODES ri E DO S1\GES •
Nous avons uti 1 is6 la méthode de LO'!RY basée sur la formation
d'un complexe color~ entre le réactif de FOLIN-CIOCALTEU et certains
aminoacides <O. LO\<!RY, lQ51).
Réactifs: Soude N
Solution A
Solution li
Solution C
Na/C03
anhydre 0 2 % dans la soude O,lN
Cu SOi à 1 %tartrato double de Na et K à 2 %
Réactif de FOLIN-CIOCALTEU 2N.
Protocole: A 1 ml de solution c o n v e nab l emen t diluée <entre 50 et
150 mg/I du p r o t è l ne s ) on ajoute 1 m l de so u d o no rma l o don r, un t ub o
~ essais qui est placé au bain-marie boui liant pendant 5 mn afin
de libérer les protéines intracellulaires. Après un refroidissement
rapido, on ajoute 5 ml du mélanoe préparé à partir des solutions
A, l3 et C dans les proportions de 50/1/1. Ap r è s 30 mn à l'obscurité,
on ajoute 1 ml de réactif de FOLIN CIOCALTEU dilué de moitié. On
laisse 0 nouveau 30 mn à l'obscurité pour permettre à la coloration
de se développer. L'intensité de ce-rte coloration est alors mesurée
au colorimètre à 750 nm ct c omp a r é e ~ celle d'une gamme étalon de
"s é r um n l b um l n bovin(;" dont 10 concentration en protéines si(~téJle
entre ~o et 300 mg/I .
2/ Dosage des sucres totaux
Les glucides totaux sont dosés colorlmêtrlquemen1 par la
méthode à l'anthrone qui réugit avec tous les sucres sImples, mals
également avec les polysaccharides comme la cellulose et l'amidon
(G. ASHWELL, 1957).
Réactif Sol ut i on d' a n th r 0 n e à ~ :~ 0 d'1 n ~ 1 t c c i d~" J U 1 of url (,' '...:
c on c o n t r ô •
flans les f ub o s ~ e s s a i s o l a c ô s diJIIS U/I bo l n cJi()011 CJI,lCi~(-;,
on iJ j 0 u t u 2, 5 ri! 1 de 1a sol ut i on () dos -:: r; d i 1u (~ o d 'J f (l ç 0 ni é) v 0 i r
rn 0 i n s cl e 'J0 \-1 9 des ucre / mi, p u i s 5 m 1 d o réa c tif ?l l' an t :1 r 0 n <3
p r é a t ab l eme n t r-é f r l n é r é • Ap r è s homog6néisrdion, les tubes sont
placés dans un bain 'marie boui liant p o n d an t ox a c t orne n t 10 mn.
LQ réaction est alors stopp~o on plaçant les tubes dans 1 ie~u glacée
pendant 5 rnn. L'intonsitô de la coloration est mesurée au colori
mètre ô 625 nm et comparé à une gamme étalon de glucoso.
3/ Dosage des sucres réducteurs.
Les sucres réducteurs ont été déterminés par la méthode
de ::O~'1OGYI-NELSON, basée sur 10 formation d'un complexe coloré
entre l "ac l d s o r s é n omo l yh d i q ue ot les ions cuivreux formés par la
réduction avec les 5UCrGS (N. NELSON, 1944).
Réact ifs So l ut l o n A l~n2C03 anhydre 25 9
tartrate double de Na et K 25 9
NaHC03
20 (J
Né:'2 S04 200 9
eau permutée q . s . p . 1 1 i t re
Solution 0 CuS0 4 , 5H2O
15 g
eflU permutée q. 5 • P • 100 ml
H2
S04
concentré 2 gouttes
Solution C eau permutée
molybdate d'ammonium
H2S0 4
concentré
~rséniate disodfque anhydre
den s 25 m 1 d' e a u
450 ml
25 g
21 9
1 ,8 9
Co réactif est Incubé 24 heures ê 37°C
a v a n t la p r ern i è r e utilisation.
A 1 ml do 501 ut i on ô doser convenab 1ement di 1uée, on ajoute 1 ml
du mé 1ange des s o 1ut i ons A et ~' (25/1). Le tube est placé dans un
bain-marie boui liant pendant 20 mn; après refroidissement, on
9
ajoute 1 ml de solution C et le volume est ZJjusté iJ 25 ml. La c o l o
r Cit ion est mes u ré c' à "7 2 ~) nmet co mPéJ r é (~ ;) une 9 amme é t a Ion de
glucose ou do, ma 1f o s o ill l a n t dp 0 ,~ 75 ~j9/m 1.
r ô s l d u o l s .o _,
[) ;'1 n s ce dos i'l CJ 0, 0 n d (,termin e 1 o 5 suc r 0 s pro \1 e ri ;=1 n t dol' ami -
don e t qui n' 0 n t f1 ô s é t 0 a s sim i 1ô s p Z1 r 18 S mi c r 0 0 r 9 ~1 n 1s m(J ~;. Uli (;' f _.
fectue une hydrolyse enzymatique avec une amyloslucosidase du
commerce pour s'assurer 4ue tout l'amidon ost transformé en sucr0
réducteur. Les sucres réducteurs obtenus sont alors dosés p~r la
méthode précédente.
Réactifs Amigase 200 AGN (Société Rapidase, 59 - SECLIN France)
Tamp0 n pli Il, 5 : dei d() (; i 1- r i rIII () rrJ () n()1J Yri r 111- ,1
I--J a 2 HPO4' 12 H2 0
e~u permutée q.s.p.
fi 71, f)
16,31 9
1 i tro
L'hydrolyse est r é a l l s é e 1"1 partir d'un échantillon de 10 ml, conte
nant l'amidon sous forme d'empois, auquel on ajoute 15 ml do
tampon pl-I ,. 01,5 et environ 30 mg d'amigase, le tout placé dans un
erlen do 150 ml. On l n c u' 'J po n d o nt 1 h e u r o dans un b a l n vmn r i c
agité ~ GODe. La r6action est arr8tée par chauffage au bain-marie
bou i Il ant pendant 10 mn. Les sucres réducteurs sont a lors dosés
sur cet hydrolysat c-~nv'c,", bl';ï.)u:r di lu6. On pout égaloment employer
la mét h o d : d u r;Il!CCD',t:':t ;OL'i C':, do s ao e , l '<.:n~:'lo(.'lucosï;:.iZ'-::: 1 i~:'r"nt
d l r o c tame n t du glucose à po r t l r de l'amidon.
L() glu cos e p r ClS 8 nid an S 1U nl i 1 1u u cl o cul t Il r o 0 u n r r () '1
hydrolyso à l'amyloglucosid,,se, a été dosé on utilisant le
"Glucostat". 11 s'agit d'un réactif EJnzyrnéltique prép"ré pé'1rWorthington suivnnt le schéma suivant:
1 0 1I r. c 1lJ co'; c" 0 x '/ ': :: 3 k- 1 r- • .... 1 .- 9 ucoso + 2 + 2\" , -',' .. , .. ? hi)2 + ae: IIJe Cl lJcon 1 que
11 0 h - ' .... °t nel-oxydase - d' 0-- " 2 2 + c i rom 0 g 8 n e r e lJ u 1 .l-___ - _., . , > C h rom 0 9 e n e 0 x y 0 + H2
Dosago 2 ml dA solution à doser, di luée c o n v e n e b l erne nr r « 2 ml
de réactif glucostat.
10
L' 1nc ube t Ion d lJr 0 10 ln 1n LI ·t 0 5 fj l a 'i' 0 III P() r \1t ~ r o ': l l "1~" (, :- ::' -~ Ci T :-- '';
'1 se développe alors une coloration rouge ·orangée. La réaction est
arrêtée par 1 à Z gouttes d'HCI 4N et la coloration devenue jaune
est 1U8 a U 5 PGC t r 0 phot 0 f11 è t r r.;! fJ ·1 20 rn Il. L' é t r:J Ion na98 est r (., ail s é
avec une solution de glucose d o IJ:) 1')0 lJ~/ml. La s o l ut l o n vrnè r e
de glucose doit être prér~rée au minimum 4 heures avant son ut! 1 i
sation.
L'amylose 1 ibère des sucras r6ductours è partir de l'amidon.
Le principe du dosage porte donc sur l'étude de la cinétique d'appa
rition des sucres réducteurs en fonction de la concentration d'enzyme
produite. Au cours de la culture, on effectue donc,à intervalles
réguliers,des prélèvements qui sont fi Itrés sur ~~III ipore. Chaque
solution obtenue est alors répartie dans plusieurs tubes qui
serviront au dosage de l'activité amylaslque en fonction du temps.
Réactifs :-Solutlon d'amidon soluble MERCK à 0,5 %en tampon
phosphate 0,05 ~ pH 6
-acide sulfurique à 5 %··réactlfs du dosage des sucres réducteurs.
Ln solution ~ doser peut aussi contenir de l'amidon et des
sucres réducteurs; il faut donc faire un témoin pour chaque échan
ti lion, avant la réaction d'hydrolyse.
Pour les essais, on apporte dans un tube:
.~ 1 m1 dei a sol ut ion d' ami don è.l 0, 5 % e n ta mpo n ph0 s pha t e
0,05 ~1.
- 1 ml de solution à doser.
Pour les témoins, on apporte dans l'ordre:
ml de solution d'amidon è 0,5 % en tampon phosphate 0,05 M~
ml d'acide sulfurique à 5 %puis 1 mi de la solution à doser.
Les tubes sorit placés au bain-marIe à 40°C. Les premiers
prélèvements ont 1 ieu au bout de 15 mn, la réaction est alors
stoppée par addition de 1 ml d'HZ
S04
à 5 %. Le mélange r6actlonnel
est en su i te di 1ué c on vo nab 1erne nt et 1es sucres réducteurs 1 i bérés
par l'hydrolyse de l'amidon sont dosés par la méthode de SOMOGYINELSON.
7/ Dosages par la chromatographie en
a) Analyse des sucres
Qf.lZc?'U5C.h
1 1
Après filtration de la culture sur r'lIlllpore de 0,45 11 et
desséchement pour cryotlB'S"S"I"t:aYn:>n, II~ ,"-t~~I~n:-;IIIII,Qlli::, son t r:El~rls
pour 1 ml de Pyrldlne anhydre et ·triméthylsylilés avec 0,2 ml( .
d'hexamethyldlsyléJzane et 0',1 ml de Lr l met hy l ch l o ro s l l a ne - 1 à 2 ~I
de la solution sont injectés dans un chromatographe VARIAN 1400 à
Ionisation de flamme contenant une colonne 5E52 à 4 % sur chromosorb
W. DMCS 80/100 mesh de 200 cm x 0,3 cm. Programmation de tempéra·
ture de 140° à 260 0e à 4°e/mn. Injecteur 200 à 210°C, Détecteur 280 0 q.
b) Analyse de l'acide lactigue et d'autres acides organiques.
Après filtration de la culture sur Hill ipore de 0,45 II et
alcallnisatlon avec de la souche 2N, les échanti lions sont dessé
chés par cryodessicatlon puis m~thylés par la méthode de ~IARMON.M.A
et DOELLE.H.W. (1969) 2 â 3 111 de la solution chloroformlque sont
Injectés dans une colonne de REOPLEX 400 à 10 % de 60 x 0,3 cm sur
chromosorb W 60/80 mesh. Température isotherme à 70 0e, injecteur
l50oe, Détecteur l700e en Ionisation de flamme.
La méthode qui a été employéeest la méthode SIGMA (Sigma Tech.
Bulletin 826··UV. 10.68).
Pr r n_cJ~ : Lai a ct i co J 6 5 hYd r 0 g é n i:, :;'3 ca t a Il sel a réa ct Ion ré ver S 1b 1e
suivante
L (+) a cid e Lac t i que + 13 .. 0PN <=-. -_, =...... Ac 1de Py r uv 1que +
BDPNH.
En présence d'un excès de B-DPN la réaction se déplace vers
la droite; l'hydrazine est utilisée pour fournir un complexe avec
l'acide pyruvique formé. Dans ce cas, en présenco d'un excès de
~-DPN, la réaction est totalement déplacée vers la droite.
La quantité de B ·DPNH formé est mesurée au spectrophotomètre à 340ml1
et donne ainsi la quantité d'acide'Lactique L (+) présente au début
de la réaction. La solution à analyser doit être déprotéinisée à
l'acIde perchlorique avant d'ajouter l'exès de B 'DPN.
Il. RESULTATS ET DISCUSSIONS
> Il
Rappels sur les L>actr-Srios l.c ct Lquo s ,
On rassemble sous le terme de bnctérie lactique des b~tonnets
(Lac r o bac l 1lus) et des co c c l (streptococcus et l o uco no s t o c ) tous
Gram - positifs, asporogènes se distinguant par des traits physlo
loslques communs. Ce sont des hôtes des milieux naturels riches en
produits organiques: materlel végétal, tubes d l ç e s tl f s .
- L(~ur métahol 1sme é n ë r qô t i que est e x c 1us 1vement fermenta ire
- Ils ne possèdent pas de cytochromes donc n'ont pas de
système respIratoire product~ur d'énergJe. Les bactéries lactiques
ne synthétisent pas non plus de catalase. Pourtant, les bûctéries
lactiques ne sont pas anaérobies strictes gr~ce è un système d'él i
minatlon des péroxydes où la NADH péroxydnse joue le rôle protecteur
habituellement tenu par la catalase (GASSER, 1975). Ces caractéris
tiques font que l' ldentl flcatlon des uactérles I~ctlque~ ost assezrapide plr la méthode de Whittenbury.
LëS bàel~rl{Hl t act l quos sont Ijlvl§éeG en dGUX group€l§ au l vantla nature des produits de catabolisme du glucose:
- les Bôctéries Lactigues homofermentalres ou homolactlgues
1 glucose --------> Z acide lactique
- les Bactéries Lactiques hétérofermentalres ou hétérolactigues:
1 glucose > 1 COZ + 1 acide lactique + 1 (
acide acétique ou éthenol).
l 3
La méthode des enrichIssements ê base d'ensi lage de manioc
ou de Jeunes tiges de riz a permis d'isoler 15 souches de bactéries
lactiques. Parmi celles-ci, 2 appartiennent au genre Leuconostoc,
5 au genre Streptococcus et 8 au genre Lactobaci Il us.
Nous ri~)US sommes 1nt ê r e s s ô s essent 1e Il omont aux s o uch os apparte
na ntau ge nreL a ct 0 bac i 1 1us. Les L~c t 0 bac i 1 1 us toi ère nt en e f f et
les pH les plus bas et ne présentent par ai lieurs aucun risque
pathogène. Parmi les 8 souches isolées, 5 étaient capables de
croître sur amidon, mais deux seulement permettaient de mettre
en évidence une zone d'hydrolyse de l'amidon autour des colonies
sur boite de Pétri, grâce au test à l'iode.
B. SELECTION D'UNE SOUCHE DE LACTOBACILLUS AMYLOLYTIQUE.
Une des de ux sou che s de Lac ~~b-9_cJ....U_~~. a my 10 1yt 1que, qui ré vè
lait une zone d'hydrolyse particulièrement nette, a été sélectionnée
pour l'étude de l 'hydrolyse de l'amidon da manioc en anaérobiose.
Nous avons tout d'abord cherché à caractériser de façon plus
précise la souche ainsi sélectionnée grâce à des études au Biopho
tomètre, en faisant varier le plt , la température et la nature de
la source carbonnée.
La température optimum de croissance est de 40°C et le pH
optimum est de 5,5. La souche ne produit pas de gaz à partir du!
glucose, et ne pousse pas sur ribose. L'acide lactique, déterminé
par chromatographie en phase gazeuse,est le principal métabol ite
produit à partir du glucose. La souche est donc de type homoformen
taire et le glucose est dégradé par la voie d'Embden-Meyerhof.
1 glucose ----------> 2 acide Lactique.
14
La croissance de cette souche sur différents substrats
carbon\és a donné les résultats suivants
+ croissance positive
absence de croissance.
,( .\
Arabinose
Celloblose +
Fructose +
Galactose +
Glucose (acide) +
Glucose (gaz)
Gluconate
Lactose +
Maltose +
~~ann 1to 1
~~annose
Raffinose +
Rhamnose
Ribose
Sorbitol
Sucrose +
Tréhalose +
Xylose
Amidon +
l'~mploi simultané de la chromatographie en phase gazeuse et de la
méthode SIGMA de détermination de l'acide lactique L (+), a montré
que l'acide Lactique produit par cette souche est un mélange des
formes D et L. La souche étudiée poss8de donc à la fois une D et
une L lactate déshydrogênase transformant le pyruvate en D(-)
lactate ou en L(+) t ac t a f-e , . ,
D'après ces différents caractères, la
souche que nous avons 1so 1ée se rapproche de l' espèce ~!.~..!.,?!.acIl 1u~.
ac~~u~. Elle s'en différencie cependant par son absence de
croissance sur mannose et par sa capacité d'hydrolyser l 'amidon. C'e~t
cette souche de ~actobaci 1lus homolactique amylolytique que nous
avons utll isée pour la suite de notre étude .. Elle figure dans notre
collection sous la désignation LA41.
15
C. ETUDE DE LA FER~1Ej\JTATION ANAERO[)IE DE L'A~'iID()N [je: ~':.r\Nil'C r·.;,~1
UN _L~ÇI.oi1.~_C.I_,=-L!JS M1YLOLYT 1 QUE.
L'hydrolyse de l'amidon par les bactéries lactiques ne semble
a vol r été é t ud i ée jus qu'à pré sen t que che z 1e 9 e n r e 2..t T~_t~c~c~ et
essentiellement chez 2.!!,_eptococcus _bovl_$., hôte du RUmen. Quelques
Lactobaci 1(,.1 es amylolytiques ?nt é'té observés dans le tube dlge'stif\
des petits mammifères rongeurs, (Gasser c ommun I c e t l o n po r so nne ll e ) ,
mais aucune é t u do ne semble avoir été faite sur l'hydrolyse de
l'am1don par des Lac t 0 II acilie s. A pro p0 s dace s bac t é rie s ,le,"BERGEYS Manuel" (1975) Indique que "l'hydrolyse de l'amidon est
très rare lf •
1/ ~!~~s~~ce comparée sur glucose et amidon.
Une première série d'exrériences nous a permis de comparer
la croissance de la souche de .L.9_c_!_~bacillus LA41, sur glucose et
sur amidon de manioc.
Ces études ont été réal isées dans des fermenteurs de 2 litres
8iolaffitte dans les conditions suivantes: température 40°C; pH 5,5
régulé par un apport de soude enregistré; agitation 300 t/mn; atmos
phère non renouvelée 95 %d'azote 5 %de CO2•
Rappelons que le mi 1 iou a la composition suivante en g/I
farine de manioc ou glucose, 10 g; Extrait de levure, 2,59;
tryptlcase, 2,5 g; (NH 4)2 s04' 3 g; K2H P0 4, 2,5 g; j\JaCI, 2,5 9
pH aJusté à 5,5.
Les figures 1 (glucose) et Il (farine de manioc) et les
tableaux 1 et Il corrospondants, donnent les résultats des mesures
e ft e ct ué e s a u cou r s dei a c roi s san ce d u ~_a5:..! 0 ~~~ i 11us. Les a n a 1y ses
ont porté sur la production d'acide lactique, les sucres totaux
(Anthrone), les sucres réducteurs et la densité optique.
- ~em~quG : Les analyses de l'acide Lactique ont été faites au
chromatographe en phase gazeuse. Cependant, la. souche étant homofer
mentaire, seule la production d'acide Lactique fait baisser le pH
du milieu. La courbe de consommation de soude nécessaire à la
ré gui a t Ion du pH, au cou r s dei a cul t ure, est don c d ire c t emen t lié e
à la production d'acide Lactique par la bactérl8.
16
Sur la figure 1, l'étudE.: comparée des courbes de densité
optique et de la production d'acide lactique fait apparaftre
plusieurs phases au cours de la croissance du ~~_o_tJ-9.cillu~
- A~rès l'inoculation, la densité optique et la quantité
d'acide lactique produIt s'accroIssent exponontlel lamant jusqu'5
T = 4 h.
- Entre T 4 h et T = 5 h, on observe une phase de transition
correspondant à la phase de ralentissement de la croissance.
La production d'acide lactique fléchit légèrement.
- A partir de T = 5, la densité o pt Lqu e i e t t e l nt son maximum,
alors que la production d'acide lactique continue à un taux constant
jusqu'au moment où tout le glucose a été consommé.
Alnsi,durant la phase stationnaire de la croissance, la
production d'acide lactique continue et le parallélisme des courbes
de consommation du glucose et de production d'acide lactique montre
que tout le glucose consommé est transformé en lactate.
Le temps de doublement de notre organisme pendant la phase
exponentielle est d'environ 1 heure. En coordonnées Logarithmiques,
croissance, consommation de glucose et production de lactate ont,
entre 0 et 4 h, la même pente. Le taux de transformation du glucose
en acide lactique est, comme le montre le Tableau 1, de 93 %.
b) Croissance sur amidon.
Lac i né t i que dei a c roi s san ce dei a sou che de Lac t o_~.a~ iLI~:>.LA41 sur amidon est pour l'ossentlel semblable n celle obtenue sur
glucose. On observe de même une production d'acide ,1 actique pendant
la phase stationnaire de la croissance.
Cependant on obtient deux phases exponentiel [es comme le
montre la figure 2. On observe donc sur amidon un phénomène de
"Diauxie"; en effet, les mi 1 ieux à base de farIne de manioc
contiennent toujours une faible quantité de glucose. Ce dernier
est utilisé en pr eml e r , et l'amidon ne l'est qu'après une phase
d'adaptation. Nous confirmerons dans le chapitre suivant que
01
02
09
03
os
05
04
06
07
0.0.
. , .,....'
FIG.l
_--.6.--'
CROISSANCE SUR GLUCOSE 10 g/l
consommé
lactate
glllcos.
densité .optiqueA A
...
8
7
3
1
5
CIlIIIo(J
::J
Cl
- 8
CIl...IV...(J
ID
18
Tableau 1. Croissance sur Glucose 10 g/I
0,045
0,06
Densité 1
°rtique ,... --- .... ~
11i
oo
Te~-p~ -- . T G 1uc~'s'~' -" 1 G 1~c;s: . - _. l --L:c~ate
,h (Glucostat)g/I: 'Consommé 9/1 9/1r--- .. ~-- ... .. .. .... . .. .. .. . .. 1 - _.. .••. ...... •• -.
!o 10,13 ir--- .- ._---- .. - -- _...._. - -"r .- ....- -- .... .. ..--.-" - . .. ....-1 10,03 1 0,1 0,05
2
3
6
7
8
9,8
9,33
4,03
2,53
1 , 13
0,33
0,8
3,4
4,5
5,3
6, 1
7,6
9
0,31
0,7
1 ,81
3,6
4,2
5
6,6
8 , 1
9, ,
9,3
9,3
9,3
0,13
0,29
0,68
0,75
0,85
0,89
0,9
0,9
0,87
0,85
• ot
0.0 .
09
OS
07
OS
05
04
03
Temps
12 heure.11
•~.-
.. -. ·109B.7654321
A • 1actat a (\ O-S 08 0-0 sucra. consommés •
·A ...-. .ucres ré du ct.urs
7 07 l).-D. densité opt ique
1 01
6 06
5 o~......
....... 0)
Cl
t#)
4 04 ..~
" •t#)
".... ()
u ~~ ~t#) ."..CI
3 03.. t#)
ID ID.. ..u UID ~
III
202
20
Tableau Il. Croissance sur Amidon 10 9/1
0,380,420,389,570,31
r·-------,-------·---7 -- - - ..-.- -- -l··- ... _.- -- ..- - ..- _. i
,Lactate Sucres' Sucres Densité '1 Sucres
[Tomps g/I lotaux 0/1 Consomm65 Optl~UG Rêductour~1 g/I. g/I
1--~-- ---~----- -----~~~;--- -------~---------~~;;--I-----~~:,~----
1""'" -1--" -- '''O~1-' -- ..- --"-9 ~R5' --- "--"-"-'·0, 1 0,37; 0,5
r 2
3 0,73 9,25 0,70 0,5 0, 1
4
5
1 ,05
1, 4
8,90
8,42
1 ,05
1 ,53
0,58
0,66
!1
1
0,8
0, 11
0,18
0,08
0,82
0,81
0,94
5,37
2,24
3,65
7,71
4,58
6,3
1 ,9
2,63
4,2
~--+-----l-----+--+---.----------t1_._7_ +-- +-- +-- ...........+-- .;-- -1
8
9 6 2,98 6,97 1 1 , 1 0,27
10
11
7,37
7,7
1 ,78
1,55
18,17 1
8,41 ,
0,99 0,12
0,09
12 7,7 1 ,55 8,4 \
21
l'amylase est inductlble et soumise, en présence de glucosu, ~ la
répression c a t ab o l l q ue .
Le temps de doublement de la souche LA41 sur amidon est de
1 h 10 - 1 h 15,donc très semblable au temps do doublemont obtenu
sur glucose. On observe un pic d'accumulation des ·sucres réducteurs
(0,9 g(l) au d é b ut de la phase stationnaire de la croissance, ce
qui semble Indiquer Clue ce n'est pas l'hydrolyse de l'amidon qui
limite la c r o l s s a nc e , mais plutôt la disparition d'un facteur de
croissance essentiel.
Le Tableau 2 montre que 91 % des sucres consommés sont
transformés en acide lactique. L'hydrolyse de l'amidon est réalisée'
~ 84 %. Le rendement global de la transformation de l'amidon de
manioc en acide Lactique se situe donc entre 75 et 77 %.
c ) !:..ro~ uct !~n_d~9_c:L9_e__L2.<;:.!..L..9..u_~ !?.p!_~ ..!.!1_h_i_b__i.!..~d~ lE.croissance par le chloramphénicol.
La cro i ssance de 1a souche du Lactobac i II us montre sur 1es
mi 1ieux que nous avons employés, un découplage très rapide de la
production d'acide I.actique par rapport ô la croissance. TURNER
(1975) et BREHENY (1975) ont observ6 un tel découplage chez des
St r e pt 0~o c cl qui pro d u i sen t dei' a cid e 1a ct i que dan s 1a ph a se
stationnaire de la croissance.
Pour vérifier que le découplage est total, nous avons ajouté:
du chloramphénicol, inhibiteur de la synthèse des protéines, à
la culture, pendant la phase exponentielle de la croissanceOn observe un arrêt Immédiat de la croissance de la souche, alors
que la production d'ûcldc Idctlque,aprv5 un faible ralentlss8men'l',
continue 5 un taux constant dépendant de la concentration bacté
rienne au moment de l 'ôpport de chloramphénicol. Production d'acide
lactique et croissance sont donc parfaitement découplés, 1 i inhibi
tion de la croissance n'arrête pas la production de lactate.
Les études d'hydrolyse enzymati0;ue de l'amidon ont été
monées au cours de la culture représentûe par la fig Il.
22
Les résultats sont donnés par la figure III CT le Tabl~au III. L8Z
dosages ont porté sur l'apparition des sucres réducteurs dans les
é cha nt i 1 Ion s pré 1c vé s-. a u cou r s dei a cul t ure (v 0 i r Î'1 a t é rie 1 et
Méthode ).
On voit que la concentration de sucres réducteurs, ramenée
ici 0 n i ~~ d' hYd roi Yse, a u9me nt e de T4h à T1ah lia ppal ra Î t a i n 5 i
que la synthèse de l'amylase se poursuIt non s~ulem8nt pendant la
phase de croissance, mais également pendant toute la durée de la
phase stationnaire.
On retrouve pour T = la h, un pourcentage d'hydrolyse de 80 %.La figure IV, qui représente la c o u r be de la concentration d'enzymei
(ramenée en pourcentage d'hydrolyse) en fonction du temps de cultur~,
fait apparaître une diminution de la synthèse d'amylase pendant la
phase de raluntisserncnt de la culture, puis une production linéaire
d'amylase pondant la phase stationnaire de la croissance.
Cl1/1
~o..~
>s:~.
50
FIG.3 ACTIVITE AM1LASIQUE
TBT7
T6
TS
T4
Table8U Il r. Actlvit~ amylolytlque en %d'hydrolyse.
31%
9% "
25%
• 1------
40% j 50%; 1 1%
-,------------·---~--,...----_,_--r__--r
:~!:.~J....~~e_r:..t : T4 : T5 ; T6 : T7 1 T8r - - - ,- ...• - - •. - - - ,.. - - .• - .- _. - - - - ., - - ., - -'- - - - - - -. - - - -
, • • ; 1 1
15 ' mn 3 % :4, 51. i 5 % : 5, 5% 1 7%, . 1 1
•._.- .__.__.•-;- '1 1
45 mn 16,51, '1',5%! 14% 16,5%119%1--- -----;--1- - __1. - --j.I----+------I---+----i
1 h : 7,5% 113,5%: 19% 25%1
1 2 hL ~_ __L_._~"______.;.
Prélèvement en fin de culture <Tl(
% d'hydrolys~
15 mn 16 %
30 mn 26 %
1 h 45 %1h 15 50 %2 h 64 %
3 h 70 %
4 h 82 %
5 h 80 %
6 h 82 %
-
1s1
11
1
/t~-'--_Â---
GLUCOSE
al5..
:::Jes:~
...-fvcD
DClt>-0..
'l:J>-.r...
"0:
~
.,A
FIG.4
9 1n 1fh -
26
Si on ajoute du glucose ~I la c u l t u r o , la synthèse d'amylase
est immédiatement stoppée (fig IV). La synthèse d l emv l a se est donc
soumise, en présence GO glucose, à la répression c a t ab o l l qu e , ce
qui confirme le phénomène de "Diauxie" o b s e r vé sà la fig Il
l'amylase n'est produite qu'après épuisement du gluc~se contenu
dans le mi 1 leu.
La 'souche de Lactobacl Il us LA41 est donc t r è s intéressante
par sa ca~aclté de synthétiser activement son amylase même en phase
de non prol ifération.
L'analyse en chromatographie en phase gazeuse a révèlé que
le maltose représente dès le début de l'hydrolyse 95 % des sucres
produits. Ceci semble l n d l q ue r que l'amylase produite par la souche
LA41 est une G-amylase (a - 1, 4- Glucan maltohydrolase). Les'-
figuras V ot V bis représentent les propriétés de cette enzyme en
fonction de la température et du pH.
On voit que l'enzyme présente un pH optimum .' r' r- et ?05s;'::de". .J , .,.;
en co re 40 % de son activité fJ pit = 4 correspondant aux conditions
d'un ensi lage. L'optimum de température est de GOoC et à 40°C
l 'act i v i té est encore de no %
La B arny 1ase du .!::.?..E-tobac il 1us LA41 est donc essent 1e Il ement
différente des 8-amylases d'autres bactéries (R. SHINKE) par son,
activité aux pH bas.
4 / ~~P..P.'. 1c at Ion S 6 tOI s cu s s ion s •
a) [\.p..p.Li ~a!J5: n__à_..1~ J~.ro9~_c!."i ~n __ d_'_~ i 9..e..1_~c! I.q u El_ da.'].s. d.~_s
~JJ leux amylacés ne permettant aucune croissance des
Lactobac 111 B5.
Les bactéries lactiques sont exigeantes en facteurs de crois
sance et on n'observe aucune multiplication du Lactobacillus LA41
si le mi 1 ieu à base de manioc ne contient pas extrait de levure
et trypticase. Pour éviter l'emploi systématique de mil ieux riches
Q)tn~
o...'"0~
.s:.."'C
2
~HYDROLYSE
3 4 5 6
Â
\
7
77
FIG.5
8
Â
./,,/'
20 40 50 60 70
FIG. 5 BIS
80 température c
au prix de revient élevé, nous avons envisagé,dans l'expérience VI
d'introduire des col Iules de la souche LA41 dans des mi 1 ieux
amylacés si~ples ne perm0ttant 0ucune croissance de la bactérie.
Le découplage entre l at c r-o i s s ance et la production d'acide lactique
et d'amylase permet, dans un tel mi 1ieu, une production d'acldo
lactique à partir de l'amidon.
A partir d l u ne c u I t u r o , les cellules sont centrifugées, lavées,
centrifugées ~ nouveau et rlac~es dans doux fermenteurs 1 et 2.
La c on c e n t r a t I on en cellules (donnée par la densité optique) est
plus forte en 1 qu'en 2. Le mi 1ieu a la concentration suivante:
farine de manioc, 20 g/l; (NH4)2
5°4,3
s : K2H
P04
, 2,5 gj NaCl,
2,5 Qj pH régulé à 5,5. Dans CG mi 1 ieu dépourvu d'extrait do levure
et de t r y pt i c n se, 0 n n' 0 b s e r v eau c une c roi 5 san ce d u La ct 0 E.a_c_ i L1~ •
La figVI mnntre que la production d'acide lactique s'est
poursuivie 1 inéairement, pondant plusieurs jours. De même, les cel
lules non proliférantes du L(Jctobùcillus ont produit de l'amylôse.---_._._-Un apport d'amyloglucosidase ne modifie pas le taux de production
d'a cid El 1a c t i que. La pro duc t ion d' amy 1a sep a r 1~ ::; 0 lJ C :W L. A4 1
n'est donc pns Ilmitante.
La fIg VI montre en outre que la vitesse de productIon
d'acide lactique du fermenteur 1 est supérieure Zl celle du fermen
teur 2. La production d'acide lactique pour do s c e l l u l e s en phase
stationnaire do Lactobacillus dépend donc de la concentration en
cellules. De plus, cette production d'acide peut se prolonger
Rendant plusieurs jours. Enfin, l'expérience de la fig VI montre
que la production d'acide lactique s'arrête lorsque la concentration
en lactato a t t o l n-j 13 9/1. Si les cellules sont à nouveau centri
fugées, lavées puis replacées dans un ml l l e u neuf, la production
d'acIde lactique reprend. Il semble donc que CG soIt IQ concentra
tion en lactate (Dans ce cas 139/1) qui inhibe· la production
d'acide lactique.
L'expérIence VI montre qu'i 1 est possIble de transformer
de l'amidon en acide lactique à partir de cellules de ~2.c.!_~_~.aE.i.!_I.~s
non prol I f é r a n t e s dans un mi 1 ieu ne permettant aucune croissance.
Il est possible d'envisager, pour la transformation de tels mi 1 ieux
amylacés, d'utiliser des cellules de _L~ct?~u_c_i.I_I~~ fixées on inclus
lactate fil'
t._amyloglucosidase
flG.fi
•
•
•
1
7
4
5
2
3
8
10
1· _2 3 4
'...;n vue CiE, la p r o d uc t l r.n (j'éjcjd~ ln c t l qu e et d'ai"ylëJsCoJ.
b )j i sc us'; ion.
Production d'ATP
L 'l r r~ t p r (-c 0 c « d l,", 1il C roi s s il nc o d lJ Lac.t ,c.u ~_cil .1 ys, prob :') b 18"
ment dû à une c a r e nc o on ac 1tics am 1n é s ou on PW!" 1d~ a l o r s quo 1n
productIon d l ec l d o l o c t l qu e se poursuit, rose un ~robl0mo d'utili
sation de l'énergie. En affet, la dégradation du glucose par [a
voie homoformentairc procura doux moles d'adonosinu tri~hos0hate
(ATf') par mo l o do qluco:;e c o n s omrné • Après l'arrôt de i a croissance,
la poursuite du métabolisme do production d'acide lactique procure
la même c.uantité d'ATr par mole de 91ucose consommô. lien résulte
donc un ac c r-o l s s omcn t do 1ë1 concentration intracellulaire en ATP,
les besoins en énergie de la croissance étant nuls. Ce surplus
d'~norgl0 pourr~lt êtr0 abaissé par une enzyme ATP'ase comme l'ont
observé Lazdunski et Relaich (1972) chez ~y~omo~a~_ mo~~~.
Nous ~vons vu que I~ production d'acIde lactique s'arrôte
lorsque 'a concentrat i on en 1acta te de Sod i urn d a n s 1e mil 1üu est
trop forte. Divers auteurs ont observé une t811e inhibition lors
dei a cul t ure doL~_c t 0 b ~ c i 1 1u s b ~-'.~p.!J.~u .~. sur p~ t i t 1ait (K EL LERet
GERHARDT, 1975; REDDY, HENDERSON et ERDr1AN, 1976). Pour nos études,'
le pH a été régulé avec de la soude et non de l'ammoniaque car des
e s s a ls préliminaires nous ont montré que l'inhibition de la produc
tlon d'ôcide lactique est plus forte avec le lactate d'ammonium
qu'avec le lactate de sodium. Pour un pH donné, KELLER et GERHARDT
ont observé le même ph ê nomè no . Pour 10 souche de Lac r cb ac l Ilus LA41
7 9 de lactate d'ammonium inhibent la production d'acide lactique
contre 139/1 de lactate de sodium. La nature du sol de l'acide
lactIque semble déterminer la concentration en acide lactique non
dis soc 1é dan sie mil i e u (R 0 GERSet ~.I H 1TT 1ER, 19 2 8 ). Cet t e der n i ère
concentration serait responsable do l'inhibition de la production
d' ac 1de 1act i que chez 1es Lactob_~~!J.!_~s...
31
L'obtention de lactate d'ammonium semble cependant piUS
intéressante pour une utll isation dans l'al imentation animale.
La concentration o n lactate dans le mi 1iou devra donc être 1 imité(::J.
L'emploi de fermentations continues ou l 'él l ml n a t l o n du lactate par dia'
lyse pourront SAns doute résoudre ce p r ob l ème d'inhibition de la
production d'3cid8 lactique.
D. INOCULATIOt'-1 D'Ur'J EI'JSILAGE DE :1ANIOC.
Nous avons vu que 1a souche de .L~c_t_o_b.-9~JI_~~ étud i ée est
capable, en mi 1 ieu 1 iquide, de transformer l'amidon en acide
lactique avec un rendement global supérieur à 75 %. Il était donc
1ntéressant d' i nocu 1er un ens il age de man i oc avec une te l l e souche
productrice d'acide lactique à pJrtir de l'amidon. Bien que de
nombreuses expériences d'inoculation aient été menées sur divers
ensi lages, aucune n'a porté sur des e n s l lages de produits amylacés.
Les é t u des 5 url e 5 s n 5 lia9 e s de mi'l n i 0 c (S ERRESot TIL L0 I~, 197 2) et
de bananes (LE DIVIDICH, SEVE et GEOFFROY,1976) ont montré qu'on
obt i ent des ens il ages natu re 1s de bonne qua 1 i té <J part i r de ces
produits. Nous avons donc comparé un ensilage naturel de manioc
avec un ensi lage inoculé à l'aide de la souche LA41. La figure VII
et 1es Tab 1eaux 1V et V donnent 1es résu 1tats obtenus au cours de
cette étude.
L'ensi lage de manioc a été obtenu suivant les méthodes ~
décritos dans le chapitre 1. Les analyses ont porté sur la mesure
du pH, les dosages de l'acide lactique et des sucres réducteurs.
Les 'échanti lions ont ôté prélevés tous les 2 jours pendant 12 jours
puis à 1 et 2 mois.
La fIgure VII montre que l "e be l s s omerrt du pH ot la produc"
tlon d'aclde lactique sont très rapides dans l'enstlage inoculé,
le pH atteint 4,3 en deux jours et demi, date à laquelle 75 % de
l'acide lactique a été synthétisé. En revanché,1 'abaissement du pH
de l'ensilage na t u r e l , rapide dans les premières heures, continue
à ba i sser régu 1 i èrement pe nd an t 1 mo i s. L'ana 1yse des sucres réduc
teurs fait apparaître une 1 ibération de ceux··ci au cours des
premières 24 heures. L'onsi lage Inoculé contient alors 3 g/kg de
sucres réducteurs de plus que l'ensi lage témoin. La présence d'une
'amylase chez la souche LA41 peut expliquer la concentration impor-
C'
fi)c:(').,CDen
, ., -
iDCt:<')-CDC.,(1)
_0 _
INOCULATION DE l'ENSILAGE
.---------~-0 :--_0_
A-À ::s~ri~~c. FIG.1l-l Sucres red. Rat.
Â~ ~ Iae t. inoe.
l:::.._ 6 IBct. net.
.-- pHinoc.0-0 pH nat.
..
5
04
5 -- ••
=t· •Co)N
10
15
31
Tab l e au IV. Ensllago Analysa dA l'Acide Lactiquo
1 1
1 T1/ 4
f, 2,57 1 0, P.5 %1 1 !
1!-~ ._...1 ~_ ..-
l: ·T 1/2 1 1 r Z3 0,38 %1
;, 11
! 1
1
% 1 %1. T,
13,52 ,, , 1 , ,92 3,97
111 1 1
TZ 5 1 7,75 2,42 %1
, 6,51 %t1
i 5,5 .,1
j
1 1 ,0 %! %T7
, 3,4 20,65 6,9 !1
,--- 1
T12 5i 12,37 3,86 % 21 ,42 7 , , 4 %, 11 11 1
r -- .... -'.' --'1 .... _. .- - ,-_. •.. ... . _.. ..... -' ,- . . .-- - _.. -- - - ... .. _. ... -, -,Tem ps IEnsilage Témoin _ : Ensilôge Inoculé 1
( j 0u'r s ) 9 / k. 9 %. ~'1 a t j è r 8! 9 / k 9 pro - % ~1 a t i ère 11 ! Sè c h e ! du i t Sùche 1
~··_-------t---------~----------t---------l~----------1
TO 0,51 1 0,15 % 1
Tabloau V. Ensilago Analyse dos Sucres Réducteurs
34
-T, /4 4,7 , ,6
---T, 8,2 2,6 , , , 3 3,8
T 2 , 5 5,5 , , 7 4,4 , , 5
T7 3,0 0,9 2,0 0,7
T 12 5 , ,6 0,5 2,2 0,75,
-
35
tante d~) sucres réducteurs présents dans l'ensilage inoculé. Par
contre, au 12ème jours la co~ccntration en sucres réducteurs est
la môme dans les deux TypPS d'ensilage.
La production d'acide lactique atteint 21,4 g/kg dans
l 'ensi lage Inoculé alors qu'elle n'est que de 12,4 9 dans l 'onsi lage- ,
n ot u r o l . ~~,tt\; ~iff6rencü semble avoir deux causes
- L'amylase de ,13 s o uc he LA41 a 1ibéré ~ 'partlr de l'amidon
des sucres disponibles pour la production d'acide lactique.
- L'inoculation par une souche homolactlque transforme 90 %des sucres €n acide lactique,alors que de nombreuses bactéries
lactiques de l'ensilage naturel sont hétérofermentaires et produi
sent en plus de l'acide lactiquo, de l'acide acétique et du CO2•
Les analyses effectuées au ihromatographe donnent en effet les
résultats suivants pour l 'acide acétique :
Ensilago Témoin 1,5 g/kg
En s l l e ç o Inoculé 0,5 g!kg.
L'inoculation avec la souche de Lactobaci Ilus LA41 a pour
effet d'inhiber la croissance des a u t r o s bactéries lactiques. Ainsi
le dégagement gazeux est nul dans l'ensilage inoculé,alors qu "l I
est Important dans l'ensilage TémoIn.
L'inoculation par la souche de ~_a~tob~..<?_i_I_~u..s_ étudiée
p rodu 1t donc un ens il age de très bonne qua 1 i té où 1a p roduct ion
d'acide lactique est presque le double de celle de l'ensilage naturel.
E. ENRICI~ISSEMENT D'UN E,NSILAGE DE ~1ANIOC EN PROTEINES PAR
FEr\~lENTAT 1ON.
L'Inoculation de l'ensilage de manioc êl montré qu'II est
po s s l b l e d'obtenir un ensilage riche en acide lactique. flous avons
alors étudié li) possibilité d'enrichir cet ensIlage en protéines
par fermentation, en employant la m6thode mise au point au labora
tolro de Dak a r par RAI~WAULT, GERMON et ALAZARD. L'enrichissemont
en protéines par croissance d'un champignon a été étudié parallèlo"
ment, à partir d'un ensilage inoculé par la souche LA41 et d'un
ens 1 r age nature 1.
36
11 ~'éthodes.
L'ensi l a ç e est séchê à l'étuve, la farine ainsi obtenue
est réhydratée & 50 % puis cult~ à 85°C p~ndant 3~ minutes.
La f a r l ne est alors uti Iisable suivant la méthode RAIMI-lAULT et peut-,être condltlonnéo en de petits agrégats de diamètre inférieur? 4mm
après avoir ajouté les sels. Pour 100 g de farine d'ensilage 310 %
d'eau, on a apporté 9 9 (NH 4)2 504 2,7 g Urée, 5 g KH 2P0 4• Nous
n'avons rajouté aucun acide.
Nous avons utilisé le d l s po s l t l f d'incubation pour analyses
de laboratoire mis au point par RAIMQAULT et coll. La souche de
ch amp l qnon utl 1 l s é o est la souche n? la .!'Asperglilus NIger.
Les analyses ont été effectuées sur les protéines, les
sucres résiduels et l'acide Lactique. L'humidité du produit et le
pH ont été mesurés au cours de la croissance du champignon.
21 Résultats et discussions.
La figure VIII donne les résultats de la croissance de la
souche d~~perg_i.!.l~s_N.i.g,~r: sur farine d'ensilage naturel,la figure
IX sur farine d'ensilage inoculé par la souche LA41.
- Sur farine d'ensilage naturel, le pH de départ (pH 6)
est trop élevé pour permettre une bonne croissance du champignon.
La production de protéines reste falblG (8 %).,- Sur farine d'ensi lage inoculé, le pH de départ, bas,
(pH 4),a permis une bonne croissance du champignon et la production
de protéines est forte (12 ~ en %de farine au départ), On note
'que tou~ l'acide lactique ust consommé par le champignon. L'acide
lactique est donc un substrat utll isable par le champignon. Les
sucres résiduels passent dû 77 %à 40 %de farine au départ. La'
c r o l s s once du champignon sur de la f a r i ne d'ensilage inoculé est
donc tout à f a l t semblable à celle obtenue sur de la farine de manioc:
37
Il est donc possible de transformer l 'ensi lage de manioc
en un produit enrIchi en protêTnes avec des rendements comparables
à ceux obtenus pour l'enrichissement direct du manioc.
su cr~si
1 ?-
1
i
1
1
4!
lactate%
#
CROISSANCE SUR ENSILAGE INOCULEFIG.8
•
6.- 6. humidite
0- 0 sucres residuels'
Â_ Â lactate
• -. p"otelnol
Â- Â pH
7
e
pH
:,]'----1---------- -,-_~
3
:2
9
1
1
l3 '
7"
Iso 5 \Â 50 ','
61
~bl·2
5
~
4
12
oo
10 20 30 40
TAB. 6 - Croissance du champignon sur ensilage inoculé
39
• Acide Lact , Sucres .rési- Protéines HumiditéTlmp. % de farine due18 el. de el. de fari ne pH
%h au départ farine au au r1épartdépart
° 4,2 77,2 1,9 4,0 47,0
15 4,2 77,5 2,2 4,3 47,5
22 75,6 4,7 5,7 48,0
27 1,7 69,8 6,3 6,0 51,S
30 1,0 57,9 8,7 6,0
35 44,1 11,0 4,9 58,0
41 0,2 39,8 12,1 4,6 60,0
40
IJ,.-D humidite
o - 0 sucres residuela
ens::o
100 5 ""t(1)en
12
11
7
CI
H FIG.9
 _ lactate
• -. Proteines
A-1 pH
CROIS SANCE SUR ENSILAGE NATUREL
>o-fl>-fm
4
~ :
(1).t/) .-.0c:(1)-en.
o 10 20 30 40heures
TAB. 7 - Croissance du champignon sur ensi lage nature l
41
Acide Lact; , Sucres rési- Protei nesHumiditéTemps % de farine due 15 i'. de % de farine pH
%h au départ farine au au départdépart
0 1,6 77 ,0 1,9 4,7 46,0
15 1,6 78,2 2,2 4,8 46,5
22 78,2 3,2 4,8 49,5
27 1,0 70,0 3,8 4,9
30 0,8 74,6 5,0 4,8
41 0,4 57,3 8,1 4,8 55,5
1
C 0 N C LUS ION,
42
L'étude que nous avons réal isée nous a permis d'Isoler une
souche de ~~_c!o~_ac_r_"ys amylolytique intéressante aussi bIen sur
le plan physiologique q ue sur celui des applications possibles.
La phys 101 og i e d'une te Ile souche présente en effet un
intérêt-dans la mesure où l'hydrolyse de l'amidon est rare chez
les !:-a...f-t.Q...b.ê.c.LU_u.§. et qu!aucune référence bibliographique ne porte
sur ce sujet. Sur le plan des ap p l l ca t l on sj t t t nt é r ê t do cette
souche est important aussi bien pour une uti Iisation en fermentation
liquide que pour "obtention d'ensilage de produits amylacés comme
le menloc. En fermentation liquide, cette souche est capable de
transformer l'amidon en acide lactique avec un rendement global
supérieur à 75 % et cette transformùtion s'accompagne d'une impor
tante production d'amylase. L'étude a montré ~u' i 1 Y a un découp.lag e
,,"tr. ICl cro l s s anco At la production d'acide lactique, on peut
donc envlsGger une transformat!on de substrats amylacés par des
Le c t ob o c l Ll e s fIxés ou inclus en vue de la production d'acide lac
tique ot d'amylase. Cette application permettrait de valoriser les
effluents amylacés rejetés par les industries agricoles. Un produit
amylacé enrichi en lactate d'ammonium pourrait aussi être uti 1isé
dans l'alimentation du bétail.
L'inoculation do l 'ensi lage de manioc donna un ensi lage
dEI bonne qu a l i t é , utilisable pa r les animaux et permet de résoudre
le problème de stockage du manioc, problème Important dans les pays
du tIers -monde . Enfin, l 'ensi lage inoculé est transformé en un
produIt enrichi en prot6ines contenant 40 %de sucres et 12 %de
protéTnes, ceci o r â c e à la croissance aé r o b l e du mycelium d'une
souche d'A. Niger. L8 produit ainsi obtenu contient suffisamment
de protéines pour servir de base à une alimentation animale.
Alnsl)cette nouvelle possibilité de fournir des protéines
alimentaires à partir d'ensilage de manioc semb l e très intéressante,
pour le développement de l'élevage dans le Tiers-Monde.
43
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