Rm& -mentaire ORSTOB Q#!@:s* I V l o I *-.I

Dans les ci~2quau2teproc~a~?aes années, YO%% hp5uhtion mondiale vivra dans les pays du Sud. Par conséquent, i l importe de se donner les m o y e m d’accrottre hproduction hs cultures vivrières tropicales et subtropicales. La recherche dispose dès àprésent de nouvelles technologies, ?ao tain in en t le génie génétique, dont l‘application cotatribuera à relever ce défi. Une équipe de I‘Qrstoin, basée à I’Iltab (Laboratoire International de biotechnologie Agricole Tropicale, San Diego, Californie) s’emploie à amélioreP; par génie génétique, les performances du naarzioc. Après le riz et le mai’s, le manioc, aussi connu sous le nona de cassava, tapioca ou yuca est la culture vivrière la plus importante des régions tropicales de la planète.

Tubercules de manioc r6colt6s et pr6ts à l’emploi. Photo : Claude Fauquet

Manioc et génie génétique :

De nouveaux gènes pour une culture - . .\ ... I . vivriëre millënaire

Feuille de manioc adulte transformée , génétiquement. Toutes les cellules de la feuille expriment le gène gus (coloration artificielle). Photo : Christian Schöpke

...................... RBgBnhtion in vitro d'embryons somatiques BU stade cotylédonaire, A partir de cal de manioc embPlJogénique. Photo : Migel Taylor

Le manioc, Manihot esculenta, proba- blement originaire du nord du Brésil on il a été cultivé pendant des milliers d'années, a été introduit en Afrique et en Asie par les Européens au cours des XVIP et XVIIIe siècles. Cette plante convertit avec une grande efficacité l'énergie solaire en sucres qu'elle stocke sous forme d'amidon dans son système racinaire à tubercules. Dans des régions marquées par une faible pluviométrie ou un climat capricieux qui limitent la production d'autres cul- tures, le manioc constitue une source de calories essentielle pour de nom- breuses communautés.

500 MILLIONS DE CONSOMMATEURS

On estime à 500 millions le nombre de personnes qui chaque jour consomment du manioc tel quel, ou transformé sous de multiples formes. Bien qu'essentiel pour la survie d'une large proportion de la population mon- diale, cette plante n'a reçu que peu d'at- tention de la part de la communauté scientifique. Cette réalité s'explique par le fait qu'il est cultivé et consommé en grande majorité localement dans le cadre d'une agriculture de subsistance et qu'il n'a donc que peu d'impact sur le com-

merce régional ou international. Le manioc recèle des potentiels énormes de développement, autant dans une pers- pective d'utilisation alimentaire que d'uti- lisation industrielle. Les capacités d'amé- lioration du rendement quantitatif comme qualitatif sont très importantes. Si des efforts de recherche et de développement adéquats étaient mis en oeuvre pour son amélioration, le manioc aurait un rôle de premier ordre àjouer pour I'augmenta- tion de la production alimentaire dans les pays tropicaux du monde entier. Le manioc est une plante robuste, pous- sant sur des sols pauvres et tolérant des périodes de sécheresse importantes.

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Cependant, sa culture est soumiseà plu- sieurs contraintes qui limitent non seu- lement les rendements mais aussi la valeur commerciale des tubercules. D’importance variable selon les régions, on compte parmi les plus sévères, les pertes dues aux maladies àvirus ou bac- téries et aux insectes ravageurs ainsi qu’a une détérioration rapide des tubercules après la récolte. En outre, alors que de nouvelles souches du virus de la mosaïque africaine du manioc (ACMV) constituent aujourd’hui une grande menace pour la culture en Afrique de l’Est et en Afrique Centrale, la bactériose vasculaire du manioc’ peut dans certains

cas réduire la récolte à néant. La détérioration rapide des tubercules de manioc est un problème omniprésent qui se manifeste dans les 72 heures après la récolte. Elle peut être critique pour la commercialisation du manioc dans des régions où les moyens de transports sont rares et les lieux des consommation éloignés des zones de production. Même si les programmes de sélections et d’amélioration conventionnels sont parvenusà produire des cultivars* offrant une résistance accrue aux maladies et une meilleure aptitude à la transforma- tion des tubercules, ils sont toutefois

limités par le caractère hautement hété- rozygote du manioc. En effet, le manioc étant allogame, lorsqu’on introduit un trait agronomique d’intérêt dans un cul- tivar, il existe une forte probabilité que ce dernier ne soit pas exprimé phénoty- piquement à la génération suivante en raison de la ségrégation aléatoire des caractères de génotypes parentaux. Ceci signifie que les caractéristiques varié- tales appréciées par les fermiers ont de fortes chances d’être perdues lors de la mise en ceuvre,des procédures de sélec- tion classiques. .

Une comparaison entre des feuilles de

manioc infectées et saines, montrant l’impact du virus de

la mosaique du manioc sur la morphologie

des feuilles.

...................... i ORSTOM Actualit& no 52

mall to medium-sca

traits, cassava could even be concerned; local scientists can

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Q@rsPPiaation de plan- tules ti3nSg&liqM@% & partir d'embryons somatiques de manioc. ..................... Un manioc dans un champ en Ouganda présentant des symp- tômes sévères typiques du virus de la mosaïque africaine du manioc.

Le r6cob du manioc par les f@rmiers en CBte d'Ivoire.

Mettre en oeuvre les techniques du génie génétique en améliora- tion des plantes nécessite la réunion de techniques de biolo- gie moléculaire et de culture de tissu végétal. Le rôle du biolo- giste moléculaire consiste à identifier, localiser et isoler dans le génome d'un organisme donné une séquence d'ADN qui code pour une caractéristique recherchée. C'est ce que l'on appelle le "gène d'intérêt". Une fois isolé et multiplié, plusieurs millions de fois, le gène est contenu dans quelques dizaines de microlitres de liquide dans un microtube. Pour être utilisé, il doit être inséré dans la plante, de telle manière qu'il soit partie intégrante du matériel géné- tique de la plante. Les diffé- rentes méthodes de transfert de gènes incluent, le bombarde- ment de microparticules d'or recouvertes avec l'ADN de ces gènes ou, l'inoculation d'Agrobacterium tumefaciens qui contient ces gènes. De plus, le tissu végétal doit être manipulé de manière à ce qu'il soit sous une forme apte à rece- voir et intégrer l'ADN étranger.

Pour le manioc, cela implique de prélever des parties de très jeunes feuilles et de les traiter avec des hormones végétales qui vont re-initier une division cellulaire rapide et conduire les cellules à revenir sous une forme juvénile. Elles sont alors dites totipotentes* et sont comparables à des embryons zygotiques. Mais, comme ces cellules proviennent de tissu foliaire, ce processus est appelé embryogenèse somatique*. Ces cellules somatiques embryo- gènes sont des cibles idéales pour les techniques de trans- fert de gène, car, mises dans un milieu de culture adéquat, elles sont capables de se déve- lopper selon le même schéma que l'embryon zygotique et permettent donc de produire un grand nombre d'embryons matures qui deviendront des plantes normales et en bonne santé. Donc, quand un nouveau maté- riel génétique est transféré à des cellules embryogéniques, la totalité des cellules des plantes régénérées contiendra le gène désiré.

QUINTUPLER LES RENDEMENTS

Le génie génétique permet de s'affran- chir de la forte variabilité du manioc et d'introduire un caractère monogénique sans changer les qualités agrono- miques ou organoleptiques intrin- sèques du cultivar transformé. Il auto- rise en outre le transfert de gènes provenant d'espèces végétales très éloi- gnées et même d'autres organismes (virus, bactéries, animaux...). Cette technique offre donc de nombreuses possibilités d'amélioration de rende- ment au travers d'une résistance accrue

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MANIOC ET GÉNIE GÉNÉTIQUE : DE NOUVEAUX GENES POUR UNE CULTURE VlVRlERE MILLÉNAIRE

aux stress biotiques et abiotiques. Elle ouvre des perspectives pour la qua- lité de l’amidon produit, et pour I’adap- tation des tubercules à la production de plastiques biodégradables. On a estimé qu’en combinant le génie géné- tique et les techniques classiques d’amélioration des plantes, on pourrait multiplier par cinq le niveau de rende- ment actuel qui est de 7 à 20 tonnes par hectare. La modification d’une espèce végétale à l’aide du génie génétique, s’effectue en deux étapes essentielles : I’isolemant du matériel génétique désiré, et son

insertion dans le génome* de la plante. Des travaux récents menésà I’lltab ont permis des progrès significatifs dans ces deux domaines et ont conduità la production des premières plantes de manioc transgénique* en 1995. Cette avancée déterminante exploite une pro- priété particulière des tissus végétaux qui, dans des conditions in vitro adap- tées, peuvent produire certaines cel- lules qui se divisent rapidement et en grand nombre pour donner naissance à des structures comparables à celles d’un embryon, sans pour autant prove- nir de cellules germinales.

La yuca es un cultivo originario cas de cultivo de c61ulas y de de America tropical, el cual pro- transformación genética. Los vee alimento para cerca de 500 científicos ya han logrado millones de personas en el producir más de treinta gene- mundo. Se trata de una planta raciones de plantas conte- robusta que tolera la sequía niendo un gene resistente al estacional y los suelos pobres, virus del mosaico comdn de sin embargo, está sujeta a pla- la yuca, CsCMV, que consti- gas y enfermedades que redu- tuye un serio problema en cen su rendimiento; además, Brasil. los tubérculos de la yuca se Ya se han regenerado plantas deterioran rápidamente Iras la que se cree resisten al ACMV, cosecha, por lo que su comer- el virus del mosaico más cializací6n se ve limitada. devastador, y que esdan Los científicos del Orstom y siendo estudiadas.

diferentes tipos de

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Plante de manioc génétiquement transformbe avec le gène de la protéine de capside du virus de la mosaïque commune du manioc, supposé induire une résistance à ce pathogène.

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De la même manière, il est possible de multiplier à l'identique des cellules embryogéniques si elles sont soumises àdes hormones végétales appropriées. Selon une procédure qui reconstitue les premières étapes du développement des graines, ces cellules peuvent former des embryons matures, à partir desquels il est possible de régénérer des jeunes plants qui formeront ultérieurement des plantes adultes. Si, àun stade de déve- loppement très précoce on introduit dans l'une de ces cellules E!mbryOg6- niques du matériel génétique étranger, celle-ci ainsi que toutes celles qui en sont issues contiendront ce nouveau matériel génétique.

Les chercheurs de I'Orstom ont adapté deux techniques de transfert de gènes pour des cultures embryogéniques. L'une ut i I ise la bactér ie Agrobacterium tumefaciens, l'autre I e bom bard em en t de microparticules. Dans cette der- nière, plus communément appelée biolistique, des particules d'or de taille de l'ordre du micron sont enrobées d'ADN et propulsées àgrande vitesse dans les tissus à l'aide de gaz sous pression. Les particules pénètrent alors la paroi cellulosique des cellules végétales et le matériel génétique étranger est ainsi libéré dans le cyto- plasme, puis incorporé au patrimoine génétique de la cellule.

DÉVELOPPER UNE RklSTANCE AUX MALADIES

L'ut i I isat ion d ' Agrobacterium ex p lo i te une propriété naturelle de la bactérie, àtransférer une partie de son génome dans les tissus de son hôte. Cet ADN bactérien peut être remplacé par un ou plusieurs gènes d'intérêt que le microbe utilise donc dans son système naturel de transgénèse. Un des objectifs majeurs de I'lltab est d'employer les techniques du génie génétique pour produire des cultivars de manioc pos- sédant une résistance accrue contre les principales maladies virales et bacté- riennes du manioc. Les biologistes

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moléculaires de ce laboratoire ont concentré leur efforts sur I’identifi- cation de gènes conférant de la résis- tance à I’ACMV et au virus de la mosaïque commune du manioc (CsCMV). On sait, depuis plusieurs années, que si on parvientà isoler et transférer dans la plante certaines séquences génétiques virales et si, en outre, le tramgène* est exprimé à des niveaux appropriés, la plante ainsi modifiée présentera une résistance à ce virus età d’autres virus proches de celui-ci. Au cours des trois dernières années, les chercheurs ont identifié et isolé plusieurs de ces gènes putatifs de résistance à I’AGMV et au CsCMV.

Cultures en milieu liquide de cellules

em bryogéniques de manioc, cibles

utilisées pour le transfert de gènes.

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~~~~~~ .................................................. Embtyagenise somatique : pro- duction d’embryons à parkir de tissu végktatif. Ce procédé de clo- nage permet de produire un grand nombre d‘individus sans passer par un cycle sexuel. Embryons somatiques : embryons produits par embryo- genèse somatique. Totipotent : décrit la propriété d’une cellule ou d’un tissu capable de se diviser et de se développer de manière h pro- duire une plante adulte entiere (l’embryon somatique de même que l’embryon zygotique est totipotent). Genome : information gén6- tique totale d’une cellule ou d’un organisme donné. fransgenique : qualifie une cellule ou un organisme dont le

génome a été modifié par l’introduction de matériel géné- tique étranger. TranegGne : matériel génétique (ADN) codant pour un produit spécifique qui a été inséré dans le génome d’une cellule don- née. Culture de tissus :technologie qui permet la manipulation in vitro du développement de cel- lules QU de tissus vég6taux ; pour le transfert de genes cela - implique la production de tissu capable de recevoir le trans- gène et de permettre la r6g6nk- ration ultérieure de plantes contenant le nouveau matériel

Examen de vitroplants

transgéniques de manioc.

génétique. .Cultivar : varieté d’une espèce vég6tale obtenue artificielle- ment et cultivée.

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MANIOC ET GÉNIE GÉNÉTIQUE : DE NOUVEAUX GENES POUR UNE CULTURE VlVRlERE MILLÉNAIRE

Plantes de manioc transgéniques

en culture in vitro à I'ILTAB

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Après une période axée sur la recherche de base dans les années 90, la bio- technologie du manioc est entrée dans une nouvelle ère. Les techniques de cul- ture de tissus* et de transgènèse ont atteint une efficacité telle qu'elles sont àprésent quasiment appliquées en rou- tine pour l'introduction de caractères agronomiques majeurs dans des culti- vars de manioc. A ce jour, on a régé- néré plus de trente lignées de plantes contenant un gène de résistance au CsCMV, un virus qui fait peser une menace grandissante sur la production de manioc au Brésil. Ce sont les pre- mières plantes de manioc jamais pro- duites contenant un gène de résistance àune infection virale. Des tests de résis- tance au pathogène se déroulent actuel- lement à I'lltab et il est prévu d'envoyer très prochainement les meilleures plantes au ClAT en Colombie et au Brésil pour des essais de plein champ. Par ailleurs, pour ce qui est de I'ACMV, la maladie du manioc la plus sévère en Afrique, Ià aussi des progrès significa- tifs ont été réalisés. L'lltab travaille en collaboration avec l'Institut de Recherche John lnnes en Angleterre et des chercheurs de Côte d'Ivoire et du Zimbabwe pour introduire des gènes de résistanceà cette infection. Une étape importante a été franchie dans ce sens puisque, à l'heure actuelle, des plantes contenant un gène putatif de résistance à I'ACMV ont été régénérées et sont en cours d'analyse. Parallèlement, un gène, Xa21, prove- nant d'une espèce sauvage de riz et qui confère de la résistance contre la bac- tériose vasculaire de cette culture a été introduit et intégré dans un cultivar de manioc. I I est possible que des plantes transgéniques exprimant Xa21 possè- dent un niveau de résistance supérieur contre cette maladie dévastatrice du manioc qui sévit en Afrique et en Amérique du Sud. Cette hypothèse devrait être testée en 1998.

DES CENTAINES DE CULTIVARS DANS LE MONDE

A I'lltab, le transfert technologique tient une place de premier ordre. On estime qu'il existe plusieurs centaines de CUI- tivars de manioc cultivés sous les tro- piques, chaque communauté ayant des conditions climatiques, pédologiques et culturales spécifiques. Par consé- quent, il existe des cultivars adaptés à chaque région pour faire face à des contraintes particulières dans la pro- duction et l'utilisation du manioc. Pour que les techniques de transfert de gènes développées dans ce laboratoire aient un impact à I'échelle de la petite agri- culture, il est essentiel de mettre en place un programme de transfert tech- nologique avec les pays les moins avancés. Ainsi, les chercheurs de chaque pays serontà même d'appliquer ces technologiesà un cultivar particu- lier pour résoudre un problème régio- nal. Le premier pas dans ce sens sera de transférer les biotechnologies du génie génétique du manioc aux Programmes de Recherche Agrono- mique Nationaux (NARs) et aux Centres de Recherche Agronomique Interna- tionaux (IARC) tels que le ClAT et I'IITA. Ce processus est déjà en application à I'lltab et des chercheurs du Zimbabwe, de Côte d'Ivoire, du Cameroun et de Thaïlande sont actuellement en for- mation et appliquent ces technologies à leurs propres cultivars de manioc. I I faut espérer que ce soit le début

d'une longue série de coopération avec les pays concernés. Le manioc a été jusqu'à nos jours une plante largement ignorée par la recherche et le développement. Cependant, le génie génétique pourrait valoriser l'énorme potentiel de production du manioc dans des conditions limites de cultures. Cela permettrait de hisser, dès le début du XXI" siècle, cette culture au rang des plus importantes au monde.

Claude Fauquet, Nigel J. T et Christian Schöpke, Orstom/lltab, département "Ressources, environnement, d loppement " UR '' Bases de la v sation agronomique et agro-in( trielle de la biodiversité", Sébastien Cunnac et Munyar V. Masona, lltab 'I lnternation Laboratory for Tropical Agriculi Biotechnology "

........................................................... Quelle que soit la technique de transfert de gène utilisée, une tres faible proportion des cellules visées recevra et int& grera de maniere stable le nou- veau matériel génétique. Une fois lea séquences d'ADN transférées, il est impératif de pouvoir isoler les cellules effectivement transformées de la masse des cellules non transformées. Pour cela, en même temps que l e gene d' intérêt agronomique, on transfère un gene que l'on appelle un "marqueur de sélec- tion". Ce dernier code pour une résistance å une toxine, le plus souvent un antibiotique ou un herbicide. Ainsi, en appliquant cette toxine au milieu nutritif où est cultivé le tissu, on exerce une tres forte pression de sélection qui

n'affectera en rien les cellu transformées mais tuera 01

inhibera le développement autres cellules non tran: mées. II est alors possibl d'isoler, de cultiver et de ri nérer les premieres pour d naissance å des plantes ac transgéniques. En outre, i troisième gène désigné so nom de "marqueur visuel" souvent employé. Le plus ramment utilisé, le gène C code pour une enzyme qi lorsque les cellules exprim ce gene sont mises en pré d'un certain produit, induif coloration bleue dans c mQmes cellules. Le.chercl peut donc étudier et optim processus de transformati suivre le développement rieur des tissus et des plar transgéniques.

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