chmi 2227f biochimie i

CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 1

CHMI 2227FBiochimie I

Acides nucléiques:- structure- propriétés physico-chimiques


Acides nucléiques

Découverts en 1869 par Friedrich Meischer: Composé acide présent dans le noyau cellulaire; Donne le nom de nucléine à ce composé;

Plus tard, d’autres scientifiques déterminent que les acides nucléiques sont composés de: Phosphore Azote Carbone Oxygène

Deux types d’acides nucléiques: Acide déoxyribonucléique (ADN) Acide ribonucléique (ARN)

Et pis après? Kossé ça donne tout ça????


Hershey et ChaseL’expérience du Waring blender…32P seulement dans les acides nucléiques

35S dans les protéines seulement (Met/Cys)


Nature des acides nucléiques1. bases azotées Il existe 5 bases

azotées: Purines:

Adénine Guanine

Pyrimidines Cytosine Thymine Uracile


Nature des acides nucléiques 2. sucres

Deux types de sucres à 5 carbones sont retrouvés dans les acides nucléiques:

Ribose (ARN) 2’Désoxyribose (ADN)

Configuration des sucres: 2’ endo: C2’ au-dessus du

cycle 3’ endo: C3’ au dessus du

cycle


Nature des acides nucléiques 3. nucléosides

La formation d’une liaison covalente (lien glycosidique) entre le sucre et la base azotée forme un nucléoside

H

Deoxyadenosine

Lienglycosidique

1’

91

1’

Cytidine

H


Purines

Base DNA RNA

Adénine Déoxyadénosine Adénosine

Guanine Déoxyguanosine Guanosine


Pyrimidines

Base DNA RNA

CytosineDéoxycytidine Cytidine

Thymine Déoxythymidine -

Uracile - Uridine


Nature des acides nucléiques 4. nucléotides Les nucléotides sont des nucléosides portant un

ou plusieurs groupes phosphates, généralement à la position 5’ du sucre;

Guanosine 5’monophosphateDéoxythymidine 5’triphosphate

Alpha

Beta

Gamma


Nombre de groupes

phosphatesDéoxynucléotide/Nucléotide

1 Déoxyadenosine-5’-monophosphate

2 Déoxyguanosine-5’-diphosphate

3 Adénosine-5’-triphosphate

Nature des acides nucléiques 4. nucléotides


Nature des acides nucléiques 5. les polynucléotides

Les nucléotides et les déoxynucléotides forment des polymères appelés polynucléotides

Les nucléotides sont liés ensemble via une liaison phosphodiester;

Implique le 3’OH d’un nucléotide et le phosphate en positon 5’ d’un autre nucléotide;

L’ordre des bases dans un polynucléotide est la structure primaire ou la séquence de l’acide nucléique;

Les polynucléotides ont une polarité: Extrémité 5’ : le phosphate 5’ n’est pas impliqué

dans une liaison phosphodiester

Extrémité 3’ : le 3’OH n’est pas impliqué dans une liaison phosphodiester;


Nature des acides nucléiques 5. les polynucléotides

http://www.mbi.ufl.edu/facilities/msg/bch4024m/lecture45.pdf


Nature des acides nucléiques 6. Les règles de Chargaff


Structure des acides nucléiques1. ADN

L’ADN est formé de deux chaînes de polynucléotides antiparallèles (vont dans des directions opposées);

Les bases sont presque perpendiculaires à l’axe (inclinaison de 6o);

Les bases sont enfouies à l’intérieur de la structure, avec le squelette sucre-phosphate à l’extérieur;

Les deux chaînes sont maintenues ensemble via la formation de ponts H entre bases azotées:

A forme 2 ponts H avec T (paire de base AT)

G forme 3 ponts H avec C (paire de base GC)

Cette relation A:T et G:C dicte la complémentarité des deux chaînes:

La nature de la base sur un brin donne immédiatement la nature de la base sur le brin opposé;

bases

Squelette sucre-phosphate


Les deux chaînes polynucléotidiques forment une hélice droite: Environ 10 paires de bases par tour

d’hélice; 3.4 Å par 34 Å par tour 20 Å de diamètre Sucre: 2’ endo Lien glycosidique: anti

Présence de deux crevasses à la surface de l’hélice:

Petite crevasse: faible distance entre les deux chaînes;

Grande crevasse: plus grand espace entre les deux chaînes;

1 Å (Ångstrom) = 0.1 nm = 1 x 10-10 m




Stabilité de l’hélice:

Plusieurs ponts H entre les deux chaînes;

2 ponts H pour AT 3 ponts H pour GC

Empilement des bases (p.ex. pile de pièces de monnaie):

L’empilement de paires de bases GC est plus stable;

Donc, une molécule d’ADN riche en GC sera plus stable qu’une molécule d’ADN contenant plus de AT;


Structure des acides nucléiques2. Duplex ARN/ARN et ADN/ARN

Les molécules hybrides ADN/ARN ainsi que les duplexes d’ARN suivent les mêmes règles de base que l’ADN: Complémentarité Antiparallélisme

Cependant, le 2’OH de l’ARN affecte la structure de l’hélice:

Plus large: 26 Å Plus courte: 11 bp/turn Distance par paire de base: 2.6 Å Les bases sont plus inclinées (20o) Configuration des sucres: 3’endo


Structure des acides nucléiques2. Duplex ARN/ARN et ADN/ARN


Structure des acides nucléiques

Java applets:

http://www.moleculesinmotion.com/


ADN: Absorbance

Les acides nucléiques absorbent à ~260 nm (à cause des bases puriques/pyrimidiques);

Généralement: les préparations d’acides nucléiques pures donnent un rapport A260/A280 d’environ1.8;

Des valeurs de A260/A280 inférieures à 1.8 sont généralement indicatives de la contamination des acides nucléiques par des protéines. Pourquoi???

Petit truc: une absorbance de 1 à 260 nm donne: 50 µg / ml d’ADN 40 µg / ml d’ARN


Dénaturation de l’ADN Les acides nucléiques double brins (db)

(ds) peuvent être convertis en acides nucléiques simple brins (sb) (i.e. dénaturés) de plusieurs façons:

Augmentation de la température Diminution de la concentration de sel Produits chimiques:

NaOH/formamide/formaldéhyde (brisent les ponts H)

Inversement, l’ADN sb peut être renaturé de la façon suivante: :

Diminution de la température Augmentation de la concentration en sel

Ce phénomène peut être suivi par spectrophotométrie:

Les acides nucléiques sb absorbent davantage à 260 nm que les acides nucléiques db: hyperchromicité;


Dénaturation de l’ADN La température à laquelle 50% de l’acide

nucléique db s’est dénaturé est appelée la température de fusion (Tm);

Le Tm est affecté par plusieurs facteurs:

Concentration en sels: Tm augmente avec la [NaCl];

Longueur des molécules: Tm augmente avec la longueur (pour ADN <

150 pb)

Contenu en G+C: Plus le contenu en GC est élevé, plus le Tm

sera aussi élevé; Tm = 4 (G + C) + 2 (A+T)

Quel est le Tm de la molécule d’ADN suivante:5’GACTAGATCGATGGCTTCGATACC3’

3’CTGATCTAGCTACCGAAGCTATGG5’

Hyp

erc

hro

mic

ité DNA#1

DNA#2


Dénaturation de l’ADN

A+T-rich

G+C-rich


Hybridation Les acides nucléiques sb ayant des

séquences complémentaires vont se renaturer lorsqu’elles seront mélangées ensemble (hybridation);

ADN-ADN ADN-ARN ARN-ARN

La renaturation se produira même si les deux brins ne sont pas parfaitement complémentaires;

Cependant, le Tm diminuera avec le nombre de différences dans la complémentarité;

Ce phénomène est très utilisé lors de l’étude des acides nucléiques:

Séquençage PCR Analyse Southern Analyse Northern Analyse FISH Puces à ADN


Électrophorèse en gel d’agarose

+-

Power

Microscopie électronique à balayage d’un gel d’agarose

(1×1 µm)

• L’agarose est un polymère poreux qui permet le mouvement des molécules d’ADN

ADN


Électrophorèse en gel d’agaroseMolécules d’ADNDe longueur connue

Courbe standard: Log longueurvs distance migrée

Staining with ethidium bromide

Le bromure d’éthidium fluoresce rougeseulement lorsqu’il s’intercale entre les paires de bases.


Analyse Southern et Northern

Analyse Southern: des molécules d’ADN sont séparées sur le gel et hybridées; Utilisé fréquemment pour étudier la structure des gènes;

Analyse Northern: des molécules d’ARN sont séparées sur le gel et hybridées: Très utilisé pour déterminer le lieu et l’intensité de l’expression d’un gène

d’intérêt.

Une sonde d’acide nucléique marquée au 32P n’est complé-mentaire qu’à une seule des molécules d’ADN présentes sur le gel

Hybridation


Analyse Southern

ADN génomique coupé avecune enzyme de restriction

Allèle différente des autres?


FISHFluorescent in-situ hybridization

Le FISH est utilisé pour déterminer la position d’un gène sur un chromosome;

Une sonde d’acide nucléique fluorescente et complémentaire au gène d’intérêt est hybridée à des chromosomes;

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