caractérisation fonctionnelle de crb3 dans l'homéostasie
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TARIK YADADEN
CARACTÉRISATION FONCTIONNELLE DE CRB3 DANS
L’HOMÉOSTASIE ÉPITHÉLIALE ET LES CANCERS
ÉPITHÉLIAUX
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l’Université Laval dans le cadre du programme de maîtrise en biologie cellulaire et moléculaire
pour l’obtention du grade de Maître ès Sciences (M.Sc.)
BIOLOGIE MOLÉCULAIRE, BIOCHIMIE MÉDICALE ET PATHOLOGIE
FACULTÉ DE MÉDECINE UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2012
© Tarik Yadaden, 2012
Résumé
La polykystose rénale et le cancer colorectal sont caractérisés par la perte de la
polarité apico-basale des cellules épithéliales. La polarité épithéliale est régulée, entre
autres, par un complexe protéique articulé autour de la protéine CRB3. Cette dernière est
également essentielle pour la ciliogenèse et la croissance du domaine apical. La taille du
domaine apical définie les dimensions des tubules épithéliaux qui constituent l’unité
fonctionnelle des reins. La dimension des tubules épithéliaux définit la mécanique des
fluides corporels. Finalement, CRB3 réprime des voies de signalisation soutenant la
croissance tumorale. Ce travail visait à définir le rôle de CRB3 dans la morphogenèse des
tubules rénaux, étant donné que le contrôle de la taille du domaine apical, la formation du
cil et la répression de la voie Hippo sont des fonctions essentielles de CRB3, et que leurs
altérations mènent à des pathologies rénales. D’un autre coté, CRB3 agit comme
suppresseur de tumeurs chez la souris et que CRB3 réprime la prolifération de lignées
épithéliales cancéreuses humaines, nous pensons que CRB3 soit un suppresseur de tumeurs
chez l’humain. Afin de valider ces hypothèses, nous avons généré des souris surexprimant
CRB3 ou exprimant une forme tronquée de CRB3 dans les reins pour répondre au premier
objectif. En ce qui concerne le deuxième objectif, nous avons analysé l’expression de
CRB3 par immunohistochimie dans des échantillons de cancer du côlon. La surexpression
de CRB3 résulte en une accumulation lipidique dans les cellules proximales du rein. Cette
fonction n’est pas spécifique aux cellules rénales, puisque une surabondance de CRB3
provoque un phénotype similaire dans des cellules épithéliales de différentes origines en
culture. L’expression de la forme tronquée amène une diminution du nombre de cils.
Finalement, la perte de CRB3 est tardive dans le processus tumoral et coïncide avec la
transition épithélio-mésenchymateuse. En conclusion, ce travail montre un nouveau rôle de
CRB3 dans le métabolisme lipidique. De plus, nos travaux montrent que la perte de CRB3
corrèle avec un phénotype agressif dans le cancer du côlon.
Avant-propos
Avant tout, je tiens à remercier mon directeur de recherche le Dr Patrick Laprise de
m’avoir permit de réaliser ce projet de recherche, et également pour la confiance qui m’a
accordé tout au long de ces deux années.
Je remercie Dr François Chartier avec qui j’ai partagé des moments de complicité. Dr
Bernard Têtu qui a mis à ma disposition la bio-banque ainsi que Michel Orain qui m’a
initié au travail technique et fournie les échantillons. J’aimerais également remercier
Marcel Carter qui a fait les microinjections, sans oublier les membres des laboratoires du
Dr Jean Charron et du Dre Lucie Jeannotte pour leur aide sur le plan technique. Un grand
merci pour Andrée Roberge qui a pris soins des animaux. Je tiens aussi à remercier Carl St-
Pierre de l’imagerie et tous le personnel scientifique et administratif du centre de recherche
Hôtel-Dieu de Québec.
Je dédie ce travail à Lise ma femme, Inès ma fille, Wardia, Ahmed mes parents et Odile,
Hervé mes beaux-parents.
Table des matières
Résumé..................................................................................................................................... i
Avant-propos........................................................................................................................... ii Table des matières.................................................................................................................. iv Liste des tableaux................................................................................................................... vi
Liste des figures .................................................................................................................... vii Abréviations ............................................................................................................................8
1 Introduction .....................................................................................................................9 1.1 Les épithéliums .......................................................................................................9 1.2 Les jonctions serrées .............................................................................................11
1.3 La polarité épithéliale............................................................................................11 1.4 Complexes protéiques de polarité .........................................................................12
1.4.1 Protéines d’identité basolatérale .......................................................................12 1.4.2 Déterminants du domaine apical.......................................................................13
1.5 Fonction de Crb/CRB ...........................................................................................18
1.5.1 Jonctions serrées ...............................................................................................18 1.5.2 CRB3 et polarité épithéliale ..............................................................................19
1.5.3 Ciliogenèse et cytokinèse..................................................................................19 1.5.4 Déterminant de la taille du domaine apical.......................................................19 1.5.5 Trafic intracellulaire, formation de lumière et régulation de la taille des tubules
épithéliaux. ....................................................................................................................20 1.6 Polarité et cancer ...................................................................................................21
1.6.1 Transition épithéliomésenchymateuse (EMT) et cancer...................................22
1.6.2 CRB3 et cancer .................................................................................................23 1.6.3 CRB3 contrôle les voies Hippo, TGFβ et Notch ..............................................24
1.7 Le rein : rappels.....................................................................................................26 1.7.1 Structure du rein adulte ....................................................................................26 1.7.2 Le cil primaire du rein.......................................................................................28
1.7.3 La fonction rénale .............................................................................................29 1.8 Le côlon : rappels ..................................................................................................30
1.8.1 L’épithélium colique .........................................................................................30 1.8.2 Le cancer du côlon ............................................................................................32
1.2 Problématiques......................................................................................................34
1.9 Hypothèses ............................................................................................................34 1.10 Objectifs ................................................................................................................35
2 Matériels et méthodes ...................................................................................................36 2.1 Construction plasmidique (Clonage: digestion, ligation et trasformation) ..........36
2.1.1 Génération de CRB3ERLI..............................................................................36
2.1.2 Éléments régulateurs rein spécifique ................................................................38 2.2 Purification de l’ADN sur Chlorure Césium ........................................................39
2.3 Modèle murin ........................................................................................................40 2.4 Extraction de l'ADN..............................................................................................40
2.4.1 Digestion de l'ADN ...........................................................................................40 2.4.2 Extraction de l'ADN au phénol/chloroforme ....................................................41
2.5 Southern blot .........................................................................................................41
v
2.6 Biochimie urinaire.................................................................................................44 2.7 Western-Blot (WB) ...............................................................................................44 2.8 Histologie: Fixation, inclusion et coupe ...............................................................45
2.9 Coloration Hématoxyline-Éosine..........................................................................45 2.10 Coloration PAS/BA ..............................................................................................46
2.11 Coloration Oil Red O des tissus ............................................................................46 2.12 Coloration trichrome de MASSON ......................................................................46 2.13 Immunohistochimie ..............................................................................................47
2.14 Culture cellulaire...................................................................................................48 2.15 Coloration Oil Red O des cellules ........................................................................48
2.16 Échantillons...........................................................................................................49 3 CRB3 et homéostasie des tubules rénaux .....................................................................50
3.1 Résultats ................................................................................................................50
3.1.1 Établissement des lignées de souris transgéniques ...........................................50 3.1.2 Validation des lignées transgéniques ................................................................51
3.1.3 Effet de la modulation de CRB3 sur la physiologie rénale ...............................52 3.1.4 Le phénotype rénal............................................................................................55 3.1.5 Effet de la modulation de CRB3 sur le stockage lipidique dans d’autres
modèles .........................................................................................................................60 3.1.6 Effets de la modulation de CRB3 sur la polarité des tubules in vivo ...............61
3.1.7 Effets de la modulation de CRB3 sur le cil des cellules in vivo .......................62 3.2 Discussion .............................................................................................................65 3.3 Perspectives...........................................................................................................68
3.4 Conclusion ............................................................................................................69 4 CRB3 et cancer .............................................................................................................70
4.1 Résultats ................................................................................................................70
4.1.1 Étude en immunohistochimie du côlon normal ................................................70 4.1.2 Marquage des adénomes ...................................................................................71
4.1.3 Marquages des adénocarcinomes......................................................................71 4.1.4 Marquage EMT .................................................................................................72
4.2 Discussion .............................................................................................................74
4.3 Perspectives...........................................................................................................76 4.4 Conclusion ............................................................................................................77
5 Bibliographie.................................................................................................................78
vi
Liste des tableaux
Tableau 1 : Programme PCR pour génération de la sonde pour l’hybridation .....................42 Tableau 2 : Les anticorps utilisés en immunohistochimie ....................................................48
Tableau 3 : Répartition des échantillons tissulaires. .............................................................49 Tableau 4 : Colorations histochimiques spéciales ................................................................56
Liste des figures
Figure 1 : Représentation schématique des différents types d'épithéliums.............................9
Figure 2 : Représentation schématique d’un épithélium monocouche polarisé ...................10 Figure 3 : Représentation schématique des diverses protéines des jonctions serrées ...........11 Figure 4 : Représentation schématique des complexes protéiques de polarité .....................12
Figure 5 : Représentation schématique des domaines des protéines CRB humaines ...........16 Figure 6 : Séquence cytoplasmique des deux isoformes de CRB3 chez l'humain................16
Figure 7 : Représentation schématique d’une coupe de rein passant par le hile ...................26 Figure 8 : Représentation schématique d’un néphron. ..........................................................27 Figure 9 : Coupe histologie du rein.......................................................................................28
Figure 10 : Représentation schématique de l’anatomie du côlon .........................................30 Figure 11 : Coupe histologique de côlon ..............................................................................31
Figure 12 : Les différentes étapes moléculaires de la séquence adénome-cancer ................33 Figure 13 : Mutation du codon acide glutamique en codon stop ..........................................37 Figure 14 : Plasmide contenant les différentes parties du transgène. ...................................38
Figure 15 : Technique southern blot-DIG.............................................................................43 Figure 16 : Analyse en southern blot-DIG............................................................................50
Figure 17 : Analyse en western blot de l’expression de CRB3. ...........................................51 Figure 18 : Immunomarquage anti-CRB3 des tissus rénaux. ...............................................52 Figure 19 : Taux de glucose urinaire ....................................................................................53
Figure 20 : Analyse du taux urinaire de l’urée, sodium et potassium...................................54 Figure 21 : Ratio poids du rein /poids total...........................................................................55 Figure 22 : Analyse histologique du rein des lignées pSBCRB3 .........................................57
Figure 23 : Analyse histologique du rein des lignées pSB-CRB3ΔERLI.............................58 Figure 24 : Lésions histologiques des reins de lignées pSB-CRB3ΔERLI ..........................59
Figure 25 : Accumulation de lipides dans les cellules humaines d’origines variées. ...........61 Figure 26 : Immunomarquage de la polarité par anti Na+/K +ATPase ................................62 Figure 27 : Immunohistochimie anti-tubuline acétylé : immunomarquage des cils .............63
Figure 28 : Évaluation quantitative du nombre de cils .........................................................64 Figure 29 : Immunomarquage anti-CRB3 de la muqueuse colique normale.......................70
Figure 30 : Immunomarquage anti-CRB3 des adénomes coliques.......................................71 Figure 31 : Immunomarquage anti-CRB3 des adénocarcinomes du côlon et métastase. .....72 Figure 32 : Zone de transition épithéliale mésenchymateux ................................................73
Abréviations
AMPK Adenosine monophosphate-activated protein kinase
Cora/Yrt Coracle/Yurt Dlg Discs large ECM Extra-cellular matrix
EGF Epidermal growth factor EMT Epithelial-mesenchymal transition
FBD FERM binding domain FERM Band 4.1, Ezrin, Radixin, Moesin GUK Guanylate kinase
HEK293 Humain Embryonic Kidney 293 iBMK Immortal baby mouse kidney
Lgl Lethal giant larvae MAGUK Membrane associated guanylate kinase MDCK Madin Darby Canine Kidney
Nrx-IV Neurexin-IV MSI Microsatellite instabilité
PAF Polypose familiale adenomateuse PATJ Pals1-associated tight junction protein Pals1 Protein associated with Lin-7 1
PDZ PSD-95/Discs large/Zonula Occludens 1 Scrib Scribble Sdt Stardust
TJ Tight junction TDLC Tumor-derived cell line ZO Zonula occludens
9
1 Introduction
1.1 Les épithéliums
Les tissus sont des constituants importants des organes, leurs caractéristiques
morphologiques et fonctionnelles permettent d’individualiser quatre grandes familles : le
tissu conjonctif, le tissu nerveux, le tissu musculaire et enfin le tissu épithélial.
L’agencement des épithéliums leur permet de former des revêtements, des tubules et
des acini. Les épithéliums peuvent être simples, pluristratifiés ou pseudo stratifiés. Les
épithéliums simples sont composés d’une seule couche de cellules, les épithéliums stratifiés
comptent plus d’une couche cellulaire, tandis que les épithéliums pseudo stratifiés sont
composés d’une seule couche de cellule, mais la hauteur des cellules et la disposition
nucléaire leurs confèrent un aspect multicouche (Figure1).
Figure 1 : Représentation schématique des différents types d'épithéliums
Les cellules des épithéliums simples sont pavimenteuses (A), cubiques (B) ou cylindrique (C). Celles des
épithéliums stratifiés sont cubiques, cylindriques ou pavimenteuses (D). Les épithéliums pseudo stratifiés sont
constitués d'une couche unique de cellules de diverses hauteurs n'atteignant pas toute la surface libre et les
noyaux de ces cellules sont situés à différentes hauteurs (E) (http://histoblog.viabloga.com)
10
Les cellules des épithéliums sont cylindriques, cubiques, pavimenteuses. Les
épithéliums tapissent la surface du corps et bordent les cavités des organes creux et des
tubules. Ainsi, ils séparent le milieu externe du milieu interne et assurent de multiples
fonctions comme la protection, l’absorption et la sécrétion.
L’épithélium simple est formé par des cellules polarisées cohésives entre elles et
repose sur une membrane basale (Figure 2). L’adhésion et l’intégrité cellulaire et tissulaire
sont préservées grâce aux complexes jonctionnels apicaux. Ainsi, chez les vertébrés, les
cellules épithéliales voisines adhèrent entres elles par des jonctions adhérentes localisées
sous les jonctions serrées (Wang and Margolis 2007).
Figure 2 : Représentation schématique d’un épithélium monocouche polarisé
Les cellules polarisées de l’épithélium simple sont constituées d’un domaine apical (rouge) et d’un domaine
basolatéral (jaune). Ces deux domaines sont séparés par une frontière appelée jonctions serrées (en bleu). Les
cellules, cohésives entre elles, reposent sur une membrane basale.
11
1.2 Les jonctions serrées
Les jonctions serrées sont constituées de multiples protéines transmembranaires
comme l’occludine et les claudines, de protéines cytoplasmiques comme les zonula
occludens (ZO) 1 et 2. Ces dernières permettent de créer un lien avec l’actine filamenteuse
(Figure3) (Knust and Bossinger 2002). Les jonctions serrées scellent l’espace intercellulaire
et empêchent la diffusion des ions et des molécules de grandes tailles. De plus, ces
jonctions déterminent une frontière entre les deux domaines de la membrane plasmique,
limitant ainsi le passage de protéines localisées au domaine apical vers le domaine
basolatéral et vice-versa pour maintenir la polarité apico-basale (Wilson 2011).
Figure 3 : Représentation schématique des diverses protéines des jonctions serrées
Les jonctions serrées se composent de multiples protéines transmembranaires (l’occludine et les claudines),
des protéines cytoplasmiques (comme zonula ocludens 1 et 2) et de l’actine filamenteuse.
(http://www.facbio.com)
1.3 La polarité épithéliale
La polarité épithéliale se caractérise par une distribution asymétrique des protéines et
des lipides membranaire entre le domaine apical et le domaine basolatéral. Le domaine
apical fait face à l’environnement externe comme la lumière des cavités et l’air ambiant de
manière à lui permettre d’accomplir des fonctions d’absorption de sécrétion et de
12
protection. En revanche, le domaine basolatéral est en contact avec les cellules adjacentes
et la matrice extracellulaire (MEC). Il remplit des fonctions de transduction des signaux et
d’adhésion entre cellules voisines et cellule-matrice extracellulaire.
1.4 Complexes protéiques de polarité
La formation des jonctions serrées et la différenciation apico-basale des cellules
épithéliales sont régulées par plusieurs protéines qui se regroupent en complexes protéiques
apicaux et basolatéraux (Figure 4).
Figure 4 : Représentation schématique des complexes protéiques de polarité
Deux complexes protéiques apicaux (complexe Crumbs et Par) et deux modules protéiques basolatéraux
(Scribble (Scrib) et Coracle/Yurt (Cora/Yrt)) participent à la régulation dynamique de la polarité.
1.4.1 Protéines d’identité basolatérale
La formation et la stabilité du domaine basolatéral sont assurées par deux groupes de
protéines: le module Scribble (Scrib) et le module Coracle/Yurt (Cora/Yrt). Le premier
module est formé de trois protéines : Lethal giant larvae (Lgl), Discs large (Dlg) et Scrib
(Bilder 2004). Les gènes qui codent pour ces protéines présentent une interaction
fonctionnelle. Les protéines appartenant à ce groupe sont conservées chez les métazoaires.
13
La protéine cytoplasmique d’échafaudage Scrib appartient à la famille des protéines
contenant des répétitions riches en leucine (LLR) et à domaines PDZ (LAP) (Bilder and
Perrimon 2000). La protéine Dlg est un membre de la famille de MAGUK (Membrane
associated guanylate kinase) (Woods and Bryant 1991). Quant à Lgl, elle est caractérisée
par une série de répétition WD-40 (Jacob, Opper et al. 1987). Chez la drosophile comme
chez les mammifères, ce groupe de protéine joue un rôle important dans le maintien de
l’intégrité apicobasal à travers la définition non seulement du domaine basolatéral, mais
également l’exclusion d’éléments appartenant au domaine apical. Toutes mutations qui
touchent un de ces gènes conduit à une localisation défectueuse des protéines apicales et de
ce fait une altération de la polarité cellulaire (Pieczynski and Margolis ; Bilder and
Perrimon 2000; Laprise, Viel et al. 2004).
Le module Cora/Yrt (Laprise, Lau et al. 2009) est subdivisé en deux sous-groupes de
protéines fonctionnellement reliées: d’un côté la protéine Yrt et de l’autre le sous-groupe
Cora constitué de Cora, Neurexine–IV (Nrx-IV) et Na+/K+ATPase. Le groupe Cora/Yrt
maintien l’intégrité du domaine basolatéral (Hoover and Bryant 2002; Laprise, Lau et al.
2009). Le domaine FERM de Yrt sert de site de liaison à la protéine Crb pour permettre de
réguler négativement l’action de Crb et déterminer ainsi la taille de domaine apical des
cellules épithéliales et des photorécepteurs (voir ci-bas) (Laprise, Beronja et al. 2006).
1.4.2 Déterminants du domaine apical
1.4.2.1 Le complexe Crumbs (Crb)
1.4.2.1.1 Le gène crb chez la drosophile
La dénomination Crumbs vient du caractère émietté de la cuticule, sécrétée par
l’épiderme, dans les embryons porteurs de mutations dans le gène crb. crb encode une
protéine transmembranaire de 2139 acides aminés de poids moléculaire de 234 kDa. Sa
partie extracellulaire est constituée d’une séquence répétitive de 30 EGF-like et quatre
14
domaines globulaires laminin A-like. La portion cytoplasmique est composée de 37 acides
aminés (Tepass, Theres et al. 1990). Elle renferme deux motifs de liaison aux protéines, le
premier est le domaine ERLI constitué des quatre derniers acides aminés (acide
glutamique-arginine-leucine-isoleucine). Grâce à ce motif, la protéine Crb effectue ses
principales fonctions de par sa liaison au domaine PDZ de Stardust (Sdt) (Bachmann,
Schneider et al. 2001). Le deuxième motif sert de site de liaison à des protéines à domaine
FERM (4.1 protein, ezrin, radixin, moesin; FBD), comme la protéine basolatéral Yrt qui est
recrutée au domaine apical lors de la différenciation terminale des cellules épithéliales
(Laprise, Beronja et al. 2006). Crb est exprimée dans les épithéliums dérivés de l’ectoderme
et se localise au domaine apical. Dans les cellules photoréceptrices, Crb siège à la
membrane apicale nommée «stalk membrane» (Tepass, Theres et al. 1990) (Pellikka et all).
Crb forme un complexe avec Sdt et dPatj (Bachmann, Schneider et al. 2001) (Knust,
Tepass et al. 1993; Roh, Makarova et al. 2002). Ce complexe régule la polarité apico-
basale, la croissance du domaine apical et la formation des jonctions adhérentes au cours de
l’embryogenèse. La fonction de Crb au niveau de la croissance du domaine apicale et de la
stabilité des jonctions adhérentes est conservée dans les photorécepteurs (Richard, Grawe et
al. 2006). La fonction de Crb est essentiellement assurée par la portion intra cytoplasmique
dans les tissus épithéliaux. En effet, une version de Crb dépourvue du domaine
extracellulaire est capable de renverser le phénotype du mutant crb dans l’embryon de
drosophile comme la protéine pleine longueur (Wodarz, Hinz et al. 1995). Dans les
photorécepteurs, la perte de Crb conduit à une dégénérescence des photorécepteurs
(Pellikka, Tanentzapf et al. 2002).
1.4.2.1.2 CRB1
En 1999, den Hollander et al mettaient en évidence le gène CRB1 chez l’humain. Ce
gène comporte 11 exons et encode une protéine transmembranaire de 1376 acides aminés
organisée de façon similaire à Crb (Figure 5). En effet, CRB1 contient dix-neuf répétitions
EGF-like et trois domaines globulaires laminine A-like (den Hollander, ten Brink et al.
1999). Son domaine cytoplasmique présente une forte similitude avec le domaine
intracytoplasmique de Crb (den Hollander, Johnson et al. 2001). CRB1 est exprimée dans
la rétine et le cerveau (den Hollander, ten Brink et al. 1999). Les mutations de CRB1
15
causent chez l’humain plusieurs maladies dystrophiques de la rétine comme la rétinite
pigmentosae de type 12 (RP12), le syndrome congénital amaurose de Leber et l’atrophie
choriorétinienne paraveineuse pigmentée (den Hollander, ten Brink et al. 1999) (Lotery,
Jacobson et al. 2001) (McKay, Clarke et al. 2005). Les mêmes altérations rétiniennes sont
observées dans les souris déficientes en Crb1 (Mehalow, Kameya et al. 2003)
1.4.2.1.3 CRB2
Le gène CRB2 comporte 13 exons et encode une protéine transmembranaire de 1285
acide aminés (Katoh 2004; van den Hurk, Rashbass et al. 2005) (Figure 5). La protéine
CRB2 est fortement exprimée dans la rétine, le cerveau, le rein et faiblement dans le
poumon, le placenta et le cœur (van den Hurk, Rashbass et al. 2005). Le rôle de CRB2
commence à émerger tout d’abord dans la survie et la différenciation des cellules souches
embryonnaires neuronales (Boroviak and Rashbass 2010; Boroviak and Rashbass 2011) et
récemment, des données rapportées chez la souris montrent que l’inactivation du gène
CRB2 par Knock out constitutif amène de sévères anomalies lors de la gastrulation et
aboutit à une résorption des embryons à 12,5 jours de gestation (Xiao, Patrakka et al.)
1.1.1.1.1 CRB3
CRB3 renferme quatre exons. Contrairement aux gènes CRB1 et CRB2 et crb, il
encode pour une courte protéine transmembranaire de 120 acides aminés. Ainsi, son court
domaine extracellulaire est constitué de seulement 56 acides aminés (Figure 5). Par contre,
le domaine cytoplasmique de CRB3 présente une forte similitude avec Crb, CRB1 et CRB2
(Makarova, Roh et al. 2003). L’épissage alternatif de l’ARNm à l’exon 4 produit un variant
nommé CRB3b (Fan, Fogg et al. 2007).
16
Figure 5 : Représentation schématique des domaines des protéines CRB humaines
Les trois protéines CRB1, 2 et 3 ont un domaine cytoplasmique et un domaine transmembranaire conservés
(bleu clair et trait fin à droite). La différence existe dans le domaine extracellulaire, contrairement à CRB3,
CRB1 et 2 ont des domaines EGF (en vert) et Globulaire laminine A-like (orange). Le peptide signal est en
bleu foncé est commun aux trois protéines (Céline Lemmers, 2004)
Il existe une différence de séquence en C-terminal des deux isoformes conduisant à
une modification du motif de liaison PDZ (Fan, Fogg et al. 2007). En effet, CRB3a se
termine par la séquence ERLI (acide glutamique-arginine-leucine-isoleucine) (Roh,
Makarova et al. 2002). Cette séquence permet de lier les domaines PDZ de PALS1
(homologue à Sdt) et Par-6 (Roh, Fan et al. 2003) (Lemmers, Michel et al. 2004). Pour sa
part, CRB3b contient à son extrémité C-terminale le motif CLPI (cystéine-leucine-proline-
isoleucine) (Fan, Fogg et al. 2007). Il reste à déterminer si ces acides aminés servent à des
interactions protéine-protéine (Figure 6).
Figure 6 : Séquence cytoplasmique des deux isoformes de CRB3 chez l'humain
CRB3-ERLI (CRB3a) et CRB3–CLPI (CRB3b) diffèrent par les 23 derniers acides aminés (en gras). Cette
différence a des implications fonctionnelles (Shulter et Margolis 2007).
17
La fonction du domaine extracellulaire de CRB3 demeure méconnue, tandis que la
partie cytoplasmique concentre l’essentielle des fonctions décrites à ce jour. CRB3a est
fortement exprimée dans les poumons, les reins, le côlon, la glande mammaire et plus
faiblement dans le foie, la rate et le pancréas. CRB3 est également exprimée dans les tissus
non épithéliaux comme la rétine (Makarova, Roh et al. 2003) (Lemmers, Medina et al.
2004). CRB3a est essentielle pour l’établissement de la polarité apicobasale et la formation
des jonctions serrées (Lemmers, Michel et al. 2004), (Roh and Margolis 2003; Fan, Fogg et
al. 2007). L’expression de CRB3b est rapportée seulement dans les lignées cellulaires
MDCK, Cos -7 et Hela (Fan, Fogg et al. 2007). CRB3b joue un rôle dans la ciliogenèse et
la cytokinèse (Fan, Hurd et al. 2004) (Fan, Fogg et al. 2007).
1.4.2.1.4 PALS1 (Proteine-Associated with Lin Seven 1)
PALS1 appartient à la famille des protéines MAGUK, car elle renferme un domaine
GUK et cinq autres domaines de liaison différents: deux domaines L27 (L27N, L27C), un
domaine PDZ et un domaine SH3 (Src homology 3 domain) et un domaine Hook. PALS1
se lie par son domaine PDZ à CRB3 et au complexe Par (Roh, Makarova et al. 2002)
(Lemmers, Michel et al. 2004) et également à PATJ et MALS3 par le biais des domaines
L27N et L27C respectivement (Olsen, Funke et al. 2007). Ces domaines servent d’une part
à créer un lien indirect entre CRB3 et PATJ pour permettre la polarité cellulaire et la
formation de jonctions serrées (Straight, Shin et al. 2004) D’autre part, ils participent à la
formation des lumières des tubes (Roh, Fan et al. 2003; Schluter, Pfarr et al. 2009).
1.4.2.1.5 PATJ (PALS1 Associated Tight junction protein)
PATJ est une protéine qui possède dix domaines PDZ. Les domaines 6 et 8 se lient aux
protéines de jonctions serrées ZO-3 et claudines (Michel, Arsanto et al. 2005), et les
domaines 2 et 3 se lient à la partie C-terminal de TSC2 permettant ainsi une connexion
entre le complexe CRB3/PALS1/PATJ et la voie de signalisation mTOR (Massey-
Harroche, Delgrossi et al. 2007). Parmi les fonctions de PATJ identifiées figurent
essentiellement la régulation de la formation des jonctions serrées et de la polarité des
cellules épithéliales (Shin, Straight et al. 2005).
18
1.5 Fonction de Crb/CRB
1.5.1 Jonctions serrées
La formation des jonctions est essentielle pour préserver l’intégrité et la fonction des
épithéliums. La corrélation entre le niveau d’expression de CRB3 et la capacité de certaines
lignées à former des jonctions serrées a permit de mettre en évidence le rôle de CRB3 dans
cette fonction. En effet, les MCF10A sont caractérisées par un faible niveau d’expression
de CRB3 et une incapacité des cellules à former des jonctions serrées entre elles
lorsqu’elles sont cultivées en monocouches. Par contre, dans les MCF7 l’expression de
CRB3 est plus élevée et les jonctions serrées sont présentes permettant l’adhésion des
cellules entre elles. Ce résultat est supporté par d’autres données. Premièrement,
l’introduction exogène de CRB3 dans les MCF10A conduit à l’apparition de jonctions
serrées fonctionnelles et deuxièmement la nécessité de conservation des motifs de liaison
ERLI (Figure 6). Toutes mutations de ce motif conduit à une incapacité de CRB3 d’induire
la formation de jonctions serrées (Fogg, Liu et al. 2005).
CRB3 fait partie d’un complexe apical incluant PATJ qui se lie indirectement à
CRB3 via le motif ERLI. En accord avec la nécessité du motif ERLI pour la formation des
jonctions serrées, des travaux ont montrés que la réduction de l’expression de PATJ dans
les MDCK retarde la formation des jonctions serrées et affecte la polarité cellulaire. Le
phénotype normal est réinstauré lorsqu’on réintroduit PATJ, ce qui démontre son rôle dans
la polarité et la régulation de la formation des jonctions (Shin, Straight et al. 2005). La
protéine PALS1 sert d’adaptateur entre CRB3 et PATJ, lorsque l’expression de PALS1 est
diminuée, il en résulte un retard de formation de jonctions serrées. Il est intéressant de
signaler que PATJ dans cette situation est également délocalisé des jonctions serrées
(Straight, Shin et al. 2004). En somme, ces travaux montrent l’importance du complexe
CRB3 dans la formation des jonctions serrées.
19
1.5.2 CRB3 et polarité épithéliale
Chez les mammifères, les cellules MDCK cultivées en monocouche qui surexpriment
CRB3 affichent un retard de formation de jonctions serrées, mais malgré cela, la polarité
apicobasal n’est pas très affectée car la distribution des divers protéines apicales et latérales
est correcte (Roh, Fan et al. 2003).
Cependant, une autre méthode de culture considérée plus sensible pour la détection
des modifications de la polarité (O'Brien, Zegers et al. 2002) a été utilisé par les mêmes
auteurs. Elle consiste en une culture cellulaire dans un gel de collagène qui permet la
formation de sphéroïde avec une lumière centrale. Grâce à cette technique, ils ont détecté
des altérations dans la polarité, la formation de la lumière et la distribution de diverses
protéines de jonctions lorsque CRB3 est surexprimée. En revanche, lorsque CRB3ΔERLI
est exprimée, ces anomalies disparaissent. Ceci démontre que la liaison avec PALS1 par le
biais du motif ERLI est importante pour permettre à CRB3 d’avoir ses effets sur la polarité
apicobasale (Roh and Margolis 2003).
1.5.3 Ciliogenèse et cytokinèse
Dans les cellules MDCK, lorsque l’expression de CRB3b est diminuée par
knockdown, une altération de la longueur du cil est décelée (Fan, Hurd et al. 2004). De
plus, cette perte d’expression de CRB3b est associée non seulement à une perte du cil, mais
également à un phénotype multi-nucléaire associé à des anomalies du centrosome. Ces
données suggèrent un rôle fondamental de l’isoforme CRB3b dans la formation du cil et la
cytokinèse (Fan, Fogg et al. 2007).
1.5.4 Déterminant de la taille du domaine apical
Chez la drosophile, lorsque Crb est surexprimés dans les tissus épithéliaux (Wodarz,
Hinz et al. 1995) et les cellules neuroépithéliales de la rétine (Izaddoost, Nam et al. 2002),
le domaine apical de ces cellules exhibe une taille accrue par rapport aux cellules normales.
La même observation a été constatée lorsqu’on surexprime CRB3 dans les cellules MDCK
20
(Roh, Fan et al. 2003). C’est pourquoi Crb/CRB3 sont considérées comme des déterminants
de la taille du domaine apical.
1.5.5 Trafic intracellulaire, formation de lumière et
régulation de la taille des tubules épithéliaux.
Chez la drosophile, la trachée est constituée d’un réseau ramifié de tubules
épithéliaux. Le domaine apical des cellules épithéliales fait face à la lumière de la trachée.
La surexpression de Crb dans l’épithélium de la trachée augmente la longueur et le
diamètre des tubules. Ce phénotype est strictement dû à l’élargissement du domaine apical,
puisqu’il n’y a pas d’augmentation du nombre de cellules dans la trachée lors de la
surexpression de Crb, donc Crb possède un rôle fondamental dans la morphogenèse des
tubules épithéliaux in vivo chez la drosophile (Laprise, Paul et al. 2010). Ce rôle pourrait
être conservé chez les mammifères. En effet, quand CRB3 est surexprimée dans la lignée
MDCK (dérivé de l’épithélium rénal canin), les cellules manifestent une expansion de la
membrane apicale. De plus, lorsque CRB3 est surexprimée dans des cellules MDCK
cultivées en kyste dans le collagène (un modèle de tubules épithéliaux in vitro), la lumière
formée est caractérisée par une augmentation de son diamètre conséquemment à une
expansion du domaine apical de chaque cellule. À l’inverse, le knockdown de CRB3 révèle
des altérations dans la formation des lumières. En fait, la formation de la lumière des
tubules formés par les MDCK nécessite un recyclage et un trafic de CRB3 dépendant de la
protéine Rab11 (Schluter, Pfarr et al. 2009). En somme, ces études suggèrent que CRB3
pourrait participer à la morphogenèse et l’homéostasie des tubules épithéliaux, en
particulier dans le rein, chez les mammifères in vivo. Par contre, la démonstration formelle
de cette hypothèse reste à faire.
21
1.6 Polarité et cancer
Dans la maladie cancéreuse, les cellules sont immortalisées et prolifèrent
indéfiniment. Ces cellules échappent aux divers mécanismes biologiques complexes qui
sont étroitement régulés et qui permettent de préserver l’homéostasie tissulaire. Tout
dysfonctionnement de ces processus conduit à une prolifération cellulaire excessive, d’où
formation de tumeurs. Les cellules tumorales vont acquérir, non seulement des capacités de
proliférer de façon anarchiques et échapper à la mort programmée, mais aussi elles vont
induire la formation de nouveaux réseaux vasculaire (angiogenèse), acquérir des capacités
d’invasion loco-régionale et métastaser à distance (Hanahan and Weinberg 2011).
Chez l’humain, plus de 80% des cancers sont d’origines épithéliales. Au cours de la
tumorogenèse de ces cancers, il se développe progressivement une accumulation de lésions
génétiques et épigénétiques, qui causent des modifications majeures des cellules, celles-ci
peuvent perdre ou conserver des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles des
cellules originelles ou en acquérir de nouvelles.
La dérégulation de la polarité épithéliale entraine une perturbation de l’architecture
tissulaire similaire à celle observée lors de la tumorogenèse et la progression des cancers
épithéliaux. La perte de la polarité des cellules épithéliales est observée aussi au cours de la
transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) qui se caractérise par un phénotype agressif
des cellules tumorales.
L’importance des protéines régulatrices de la polarité dans l’homéostasie tissulaire est
avérée, mais leurs rôles durant la carcinogenèse commencent à peine à émerger, surtout
depuis la publication des travaux fait chez la drosophile impliquant les membres du module
Scrib. Ainsi, la perte de l’expression de ces protéines conduit à une croissance cellulaire
excessive (Bilder 2004). Chez les mammifères, l’expression génique des protéines de ce
module est soit diminuée ou absent dans de nombreux cancers. En effet, dans les lésions
bénignes de la prostate de souris, l’expression de la protéine Scrib est diminuée. Par contre,
sa perte totale favorise la progression vers la malignité (Pearson, Perez-Mancera et al.
2011). De même, l’expression de Lgl est diminuée dans plusieurs cancers humains comme
22
celui du sein, de la prostate, du poumon, de l’ovaire et du cerveau (Lisovsky, Dresser et al.
2010) . Parmi les protéines des complexes apicaux impliquées dans le cancer, on retrouve
Par3 qui est mutée dans 15% des carcinomes œsophagiens. Enfin, la protéine LKB1, une
protéine clé de la polarité épithéliale et du métabolisme, est mutée dans le syndrome Peutz-
Jegher et présente un haut risque de dégénérescence maligne (Williams and Brenman 2008;
Feigin and Muthuswamy 2009). D’autre part, il existe des virus qui ciblent spécifiquement
l’expression des protéines de polarité en diminuant leurs niveaux d’expression, parmi ces
virus on retrouve ceux qui ont un potentiel oncogénique, comme les adénovirus de type E4-
ORF1, humaines type de virus T-lymphotrope 1 Tax, et les papillomavirus humains
(HPV)16, 18 (Javier and Rice 2011).
1.6.1 Transition épithéliomésenchymateuse (EMT) et
cancer
L’EMT est conservée dans de nombreuses espèces tout au long de l’évolution. C’est
un processus au cours duquel une cellule épithéliale subit une évolution rapide et réversible
de son phénotype épithélial vers un phénotype mésenchymateux. Ce mécanisme est
fondamental pour le contrôle de multiples événements durant le développement
embryonnaire et la régénération tissulaire. Cependant, l’EMT est activée de façon
inappropriée lors du processus de carcinogenèse, surtout durant les stades précoces de
l’invasion des vaisseaux sanguins ou des lymphatiques par les cellules malignes (Ansieau,
Caron de Fromentel et al. 2010).
À l’échelle cellulaire et moléculaire, l’EMT se caractérise par l’activation de
multiples voies de signalisations en réponse à divers signaux provenant de l’environnement
externe. Ces signaux sont les cytokines, les facteurs de croissances (ex :PDGF, HGF et
TGFβ) (Kalluri and Weinberg 2009), et les divers stress intrinsèques et extrinsèques. Alors
un programme spécifique est activé et engage la cellule dans un ensemble de modifications
portant sur l’expression protéique. Ainsi, des protéines normalement absentes dans ce type
de cellules sont exprimées comme la vimentine et les métalloprotéases. En revanche,
l’expression des protéines d’identité épithéliale est réprimée comme les cytokératines et
23
l’E-cadherine (Zlobec and Lugli 2010). Cette régulation est soit génétique par l’expression
des facteurs de transcription des familles Snail et Zeb1/2 ou épigénétique par la méthylation
des séquences promotrices de ces gènes (Peinado, Olmeda et al. 2007). Snail et Zeb sont
exprimées dans de nombreux cancers humains, cette expression coïncide avec un
phénotype dédifférencié et une très grande capacité invasive et métastatique des cellules
tumorales (Kalluri and Weinberg 2009).
1.6.2 CRB3 et cancer
Le lien potentiel entre CRB3 et le cancer a été apporté par une étude faite sur des
cellules embryonnaires du rein de souris immortalisées iBMK (immortal baby mouse
kidney) et cancérisées de façon artificielle par une sélection de lignées TDCL (Tumor-
derived cell line). Comparativement aux cellules parentales, le profil d’expression génique
des TDLC révèle une répression d’un ensemble de gènes. Parmi ces gènes, CRB3 est le
plus fortement réprimé. Sur le plan phénotypique, les cellules cancérisées affichent une
altération de la polarité, une perte des jonctions, une inhibition de contact et une capacité
invasive et métastatique élevée. De plus, ces cellules perdent l'expression de la protéine
d’adhérence E-cadhérine. La réintroduction de CRB3 exogène dans ces TDLC se traduit
par la formation des jonctions serrées et la diminution de la capacité proliférative, de plus le
pouvoir invasif et métastatique est diminué. Ceci suggère que la perte de CRB3 est
importante pour la capacité tumorogénique des TDLC et que CRB3 est un suppresseur de
tumeur potentiel. Toutefois, les mécanismes moléculaires par lesquels CRB3 influence la
progression tumorale demeurent inconnus (Karp, Tan et al. 2008).
De la même façon dans le laboratoire, des lignées stables de cellules cancéreuses de
diverses origines ont été établies. D’un côté, les lignées qui surexpriment CRB3 montrent
un effet négatif sur la prolifération cellulaire et positif sur l’apoptose et lorsqu’elles sont
injectées en sous cutanée à des souris nues, ces cellules forment des tumeurs de petite taille.
De l’autre côté, l’expression de CRB3∆ERLI permet une prolifération cellulaire accrue et
une sensibilité moindre à l’apoptose quand celle-ci sont privées de sérum. Finalement,
lorsqu’elles sont injectées en sous cutanée à des souris nues elles forment de tumeurs de
grande taille (données du laboratoire non publiées).
24
Comme rapporté ci-dessus, lors du processus cancéreux les cellules épithéliales
subissent une EMT. Le rôle des régulateurs de polarité en particulier de CRB3 dans ce
processus est démontré dans des travaux in vitro. En effet, lors de l’EMT, les MDCK
expriment des facteurs de transcription tels que Snail et ZEB1. Ces derniers ciblent non
seulement l’E-cadherine, mais aussi et de façon spécifique les protéines des complexes de
polarité comme CRB3, PATJ et Lgl (répression du promoteur) (Whiteman, Liu et al. 2008),
(Spaderna, Schmalhofer et al. 2008), (Aigner, Dampier et al. 2007). La réexpression de
CRB3 exogènes dans les cellules qui expriment Snail permet une amélioration du
phénotype par la restauration des jonctions intercellulaires et la diminution de leur pouvoir
invasif. Ceci démontre que la répression de CRB3 représente une étape active et nécessaire
pour le processus de l’EMT (Whiteman, Liu et al. 2008).
1.6.3 CRB3 contrôle les voies Hippo, TGFβ et Notch
La voie Hippo est bien étudiée chez la drosophile. Elle contrôle la prolifération
cellulaire, l’apoptose et régule la taille des tissus et des organes. Lorsque cette voie est
altérée, elle aboutit à une hyperplasie non néoplasique caractérisée par une croissance
cellulaire accrue sans perte de l’architecture tissulaire et de la différenciation cellulaire,
contrairement à l’hyperplasie néoplasique. Des travaux in vivo ont montré l’implication de
cette voie dans la formation des kystes dans les reins dans un modèle de souris de
polykystose et aussi dans la polykystose héréditaire humaine autosomique dominante ou
récessive (Happe, van der Wal et al. 2011).
L’activation de la voie Hippo déclenche une multitude de cascade de phosphorylation
qui aboutit à la rétention d’un co-facteur de transcription Yorkie (Yki) dans le cytoplasme.
En conséquence, la transcription des gènes cibles est bloquée comme la cycline E et E2F1
et également des gènes anti-apoptotiques comme drosophila inhibitor of apoptosis (diap1)
(Grzeschik, Parsons et al. 2010). Toutes les protéines de la voie Hippo sont conservées chez
les mammifères (ex Yap l’orthologue de Yki). La protéine FERM Expanded (Ex) intervient
aussi dans la séquestration de ces deux co-facteurs de transcription dans le cytoplasme
(Badouel, Gardano et al. 2009), (Grzeschik, Parsons et al. 2010). Lorsque crb est muté dans
les disques épithéliaux des ailes, cette mutation conduit à une hyperplasie épithéliale en
25
conséquence de l’accumulation d’Yki dans le noyau et de la diminution de l’expression
d’Ex. Ainsi, cette perte de Crb aboutit à une augmentation de l’expression des gènes cible
de Yki (Chen, Gajewski et al. 2010; Ling, Zheng et al. 2010).
Chez les mammifères la densité cellulaire est régulée grâce à des récepteurs qui
relayent l’information via la voie de signalisation TGFβ. Devant une faible densité
cellulaire, les protéines SMAD2/3 se retrouvent dans le noyau et activent ainsi les gènes
pro-prolifératifs, par contre elles sont cytoplasmiques lorsque la densité cellulaire est forte.
La phosphorylation de YAP permet la rétention cytoplasmique de SMAD2/3, de ce fait,
empêche la transcription de gènes cible de la voie TGFβ et l’EMT. Comme la perte de
CRB3 conduit à la diminution de la phosphorylation de YAP, celui-ci se retrouve dans le
noyau et active ainsi les gènes pro-prolifératifs, de même SMAD2/3 se retrouve également
dans le noyau et déclenche la transcription de facteur d’EMT (Varelas, Samavarchi-Tehrani
et al. 2010). Enfin, chez la drosophile et les mammifères, le sentier essentielle Notch est
impliqué dans de nombreux processus comme la prolifération, l’apoptose et la
différenciation, cette voie est réprimé par Crb et de CRB1, CRB2, CRB3. (Laprise 2011)
26
1.7 Le rein : rappels
1.7.1 Structure du rein adulte
Les reins sont composés de tubules épithéliaux qui sont nécessaires à sa physiologie.
Ils constituent donc un modèle intéressant pour étudier la fonction de CRB3 dans la
morphogenèse et la régulation de la taille des tubules épithéliaux. Les reins sont localisés
dans la loge rénale retro péritonéale entre la troisième vertèbre lombaire et la onzième
dorsale. Chez l’adulte, ils mesurent en moyenne 11 cm de longueur et pèsent 150 grammes.
Les reins reçoivent le sang par les artères rénales pour effectuer leurs fonctions de filtration
et le retour du sang débarrassé des différents déchets est assuré par les veines rénales. Le
rein adulte est formé de deux régions, le cortex en périphérie et la médullaire au centre
(Figure 7). Ces deux régions renferment les différents segments des néphrons; les unités
structurelles et fonctionnelles du rein
Figure 7 : Représentation schématique d’une coupe de rein passant par le hile
Sur ce schéma on distingue une division du rein en deux régions : le cortex en périphérie et la médullaire au
centre. Le cortex situé immédiatement sous la capsule rénale a une épaisseur de 1 cm environ et pénètre dans
la médullaire pour former des colonnes rénale. La médullaire se compose de pyramides rénales. Vers le hile
par lequel entre et sorte les vaisseaux artériel et veineux on remarque un espace de collection, le bassinet.
C’est par ce dernier que l’urine est expulsée en empruntant l’uretère (http://www.journaldugeek.com).
27
Chaque rein possède environ un million de néphrons. Le néphron comporte deux
sections nommées le corpuscule rénal et les tubules rénaux. Le corpuscule rénal comprend
un glomérule et une capsule de Bowman. Les tubules rénaux comportent quatre segments
différents; le tubule proximal, l’anse de Henlé, le tubule distal et le tubule collecteur
(Figure 8).
Figure 8 : Représentation schématique d’un néphron.
Le corpuscule rénal (glomérule) filtre le sang et les tubules rénaux drainent l’urine. Près des glomérules se
trouvent les tubules proximaux et distaux reliés entre eux par une branche de Henlé. L’urine subit des
phénomènes de sécrétion et de réabsorption lors de son trajet et se jette dans les tubules collecteurs. Une
vascularisation très riche accompagne les tubules, ici représenté par la vascularisation artérielle
(vzajic.tripod.com).
28
Le tubule proximal est le site majeur de réabsorption des ions comme le sodium, le
potassium et le chlore. C’est le seul épithélium à posséder une bordure en brosse dans le
rein. L’anse de Henlé et le tubule distal assurent respectivement la deuxième vague
d’absorption des ions et le dernier contrôle de l’urine primaire. La réabsorption de grande
quantité d’eau se fait dans les canaux collecteurs qui délivrent l’urine à la vessie par le biais
des uretères (Figure 9).
Figure 9 : Coupe histologie du rein
Le rein est composé de glomérules et de système tubulaire. (A) Coupe du cortex : Les glomérules rénaux ont
deux pôles, l’un vasculaire et l’autre urinaire. Les tubules proximaux sont tapissés par un épithélium simple
avec un cytoplasme très éosinophile et se caractérise à son pôle apical par la présence d’une bordure en
brosse, par contre les tubes distaux ont un cytoplasme clair et sont dépourvus de bordure en brosse. (B)
Coupe de la médullaire où siège les tubes collecteurs et les tubes de Henlé (intermédiaires). Coloration : HE ;
(A) GX100; (B) GX200 (Sobotta 2002).
1.7.2 Le cil primaire du rein
Il existe deux types de cils : le flagelle et le cil primaire qui est non motile. Le cil
primaire rénal se projette dans la lumière des tubules à partir de la membrane apicale. Le cil
comprend deux parties principales qui sont l’axonème formé de 9 doublets de microtubules
circulaires (conformation 9+0) et une membrane plasmique. En effet, sa situation intra-
tubulaire qui l’expose aux variations de flot créé par le passage de l’urine et permet sa
29
flexion et l’activation de voies de signalisations intracellulaires impliquées dans la
morphogenèse des tissus comme l’établissement du diamètre des tubules rénaux (Rodat-
Despoix and Delmas 2009). De plus, le cil intervient dans la morphogenèse des tubules et
sa perte aboutit à un élargissement des lumières qui deviennent kystiques entre autre dans
le rein. CRB3 est non seulement localisé au cil dans les cellules pourvues de cet organelle,
mais il est impliqué dans sa formation. Ensuite, presque la totalité des protéines impliquées
dans la pathologie kystique du rein sont localisée au cil (Deane and Ricardo 2007) (Fan,
Fogg et al. 2007). Donc, le cil est fondamental pour maintenir l’intégrité rénale.
1.7.3 La fonction rénale
Le rein assure l’hémostasie des milieux extracellulaires de l’organisme, l’excrétion
des métabolites et la régulation de la pression artérielle systémique. Les produits de
dégradation du métabolisme, les électrolytes (sodium, potassium et chlore) et les molécules
de petites tailles sont filtrées par le glomérule et ainsi évacués par l’organisme. Le rein
permet également l’élimination de produit de dégradation comme l’urée qui provient de la
dégradation des protéines et des pyrimidines, l’acide urique du métabolisme des purines, la
créatinine venant des muscles, la bilirubine du catabolisme de l’hémoglobine et les
métabolites hormonaux comme les stéroïdes. Ces molécules circulent ensuite dans les
tubules rénaux où s’établit la concentration finale de l’urine par des mécanismes de
réabsorption sélective ou d’excrétion. Le dosage des déchets azotés, de la créatinine et de
l’osmolalité urinaire est un paramètre clinique important pour déterminer l’état de la
fonction rénale.
30
1.8 Le côlon : rappels
1.8.1 L’épithélium colique
Le gros intestin est constitué successivement par le côlon ascendant, le côlon
transverse, le côlon descendant et du côlon sigmoïde prolongé par le rectum. Sa longueur
est d’environ 1,5 m (Figure 10).
Figure 10 : Représentation schématique de l’anatomie du côlon
Le côlon mesure environ 1.5 m de long. Dans la cavité abdominale, il forme un cadre autour des anses grêles
et se divise en quatre parties : le caecum, le côlon ascendant, le côlon transverse et le côlon sigmoïde. Les
couches pariétales forment des plis appelés pli semi-lunaire du côlon, entre deux plis apparaissent en à
l’extérieur des haustrations. Des épaississements de la couche musculaire longitudinale de 1cm de large sont
caractéristiques du côlon dénommée ténias. On remarque la présence d’appendice graisseux tout le long du
cadre colique (futura-sciences.com).
Histologiquement, il est formé de quatre couches concentriques. En effet, on
retrouve, de l’extérieur vers l’intérieur, la séreuse, la musculeuse, une sous-muqueuse et
enfin la couche muqueuse (Figure 11). La muqueuse est composée d’un épithélium de
surface plat qui s’invagine dans le chorion en cryptes Lieberkhüniennes. L’épithélium de
31
surface et cryptique ont en commun deux types de cellules : les cellules caliciformes
mucosécrétantes et les cellules absorbantes. Les cellules souches sont situées à la base des
cryptes. Elles assurent le renouvellement rapide de l’épithélium (de l'ordre de 5 jours).
Le côlon assure diverses fonctions : la récupération d’eau et de sels à partir de résidus
de l’intestin grêle, la digestion terminale de la cellulose (faite par la flore intestinale) et la
propulsion des fèces vers le rectum (Wheater, Young et al. 2001).
Figure 11 : Coupe histologique de côlon
Dans la muqueuse du côlon, les villosités sont absentes. La couche muqueuse (1) est formée de glandes
tubuleuses simples (5) constituées de cellules caliciformes mucosécrétantes et des cellules entérocytaires. La
couche sous muqueuse (2) est riche en vaisseaux sanguin et filets nerveux. La couche musculaire (3)
composée d’une couche circulaire interne et d’une couche longitudinale externe permet des mouvements de
contraction. La couche séreuse (4) est une couche de tissu conjonctif limitée à l’extérieur par un épithélium
péritonéale. Coloration HE; GX10 (http://histol.narod.ru).
32
1.8.2 Le cancer du côlon
Le cancer colorectal était le troisième cancer le plus fréquent au Canada en 2011.
Malgré les avancées considérables dans les domaines diagnostiques et thérapeutiques, la
mortalité liée à ce cancer reste élevée. Il se développe suite à une accumulation d’un
ensemble de lésions génétiques et épigénétiques d’évolution lente et progressive touchant
les gènes qui contrôlent le cycle cellulaire, la différenciation, l’angiogenèse et d’autres
fonctions (Figure 12). Le cancer colorectal est précédé par des lésions bénignes désignées
sous le terme d’adénomes. Les adénomes sont des tumeurs épithéliales qui peuvent
correspondre à des polypes pédiculés ou sessiles, dans lesquels la prolifération cellulaire
s’accompagne d’une dysplasie qui peut aller de bas grade à haut grade selon la complexité
glandulaire et l'étendue des lésions cytologiques. Au plan histologique, les adénomes
conservent la capacité de former des structures glandulaires, ils sont bordés d’un épithélium
fait de cellules avec des noyaux hyperchromatiques de grande taille et irréguliers et leur
cytoplasme peut contenir des vacuoles de mucus ou non.
La plupart des cancers colorectaux sont des adénocarcinomes. Leur évolution dépend
de certains paramètres histo-pronostics qui regroupent le type histologique, le degré de
différenciation ou grade (fondé sur des critères tels que le degré de différenciation de la
tumeur et d’atypies nucléaires) et l’extension ou stade (prend en considération la taille de la
tumeur, le degré d’infiltration des tissus et organes avoisinants, la dissémination
ganglionnaire locorégionale et la métastase à distance) (Sobin, Wittekind et al. 2003).
33
85% des cas de cancer colorectal sont sporadiques ou acquis, c’est-à-dire que ce sont
des gènes des cellules somatiques qui sont atteints et, ainsi, ces cancers ne sont pas
transmissibles. Les 15% des cas restant dérivent d’une atteinte des lignées germinales, c’est
le cancer héréditaire transmissible. On identifie deux sentiers moléculaires majeurs dans le
cance
r colorectal. Le premier se voit lorsque des mutations progressives touchent les
oncogènes et des pertes de fonction des gènes suppresseurs de tumeurs. La forme
adénomateuse polyploïde familiale (PAF) est un exemple qui illustre cette voie.
Le deuxième sentier est l’instabilité microsatellite (MSI). Dans cette voie, il existe
une altération des gènes impliqués dans la réparation de mésappariement de l’ADN
(Mismatch Repair ex : MSH2 et MLH1), par conséquence, les erreurs de réplication des
séquences répétés des oncogènes et des gènes suppresseurs de tumeurs ne sont pas réparées,
ceci va causer l’accumulation de mutations, ces lésions sont souvent retrouvés dans le
syndrome de lynch ou heriditary non-polyposis coli (HNPC) (Saif and Chu 2010) (Figure
12).
Figure 12 : Les différentes étapes moléculaires de la séquence adénome-cancer
Les lésions moléculaires sont précoces, dans la première étape, elles associent une mutation d’APC et/ou
perte de gènes réparateurs de l’ADN ensuite elles sont suivies d’une seconde étape caractérisée par des
mutations de K-ras. D’autres mutations additionnelles associées ou non à la perte de caractère homozygote et
inactivation du gène suppresseur de tumeurs p53 conduisent à la formation du cancer (Saif 2010).
34
1.2 Problématiques
Le diamètre et la longueur des tubules épithéliaux sont importants pour la physiologie
des organes comme le rein. Toutefois, les mécanismes moléculaires sous-jacents à la
détermination de la taille des tubules demeurent méconnus. L’élucidation de ces
mécanismes permettrait d’envisager des thérapies pour la maladie polykystique rénale.
La progression des tumeurs d’origine épithéliale est associée à une perte de la polarité
apico-basale. CRB3 réprime la croissance tumorale et la formation de métastases par les
cellules épithéliales rénales chez la souris. Toutefois, il reste à être déterminé si cette
fonction de suppresseur de tumeur est conservée chez l’humain et dans d’autres tissus que
l’épithélium rénal. De plus, l’expression de CRB3 n’a jamais été étudiée dans les tumeurs
humaines.
1.9 Hypothèses
Étant donné que CRB3, i) contrôle la taille du domaine apical qui défini la taille des
tubules épithéliaux, ii) est essentielle pour la formation du cil dont l’altération est associée à
des maladies rénales telle la polykystose, iii) réprime la voie Hippo qui est suractivée dans
la polykystose rénale, nous émettons l’hypothèse que CRB3 contrôle la morphogenèse des
tubules rénaux et que la perte de fonction de CRB3 mène à des pathologies rénales.
Compte tenu que CRB3 agit comme suppresseur de tumeurs chez la souris et que
CRB3 réprime la prolifération de lignées épithéliales cancéreuses humaines (résultats non
publiés du laboratoire Laprise), nous proposons que CRB3 soit un suppresseur de tumeurs
chez l’humain.
35
1.10 Objectifs
Basés sur les hypothèses décrites ci-haut, nous avons défini deux objectifs :
1. Déterminer l’impact de la surexpression de CRB3 ou de l’expression de
CRB3ERLI sur la morphogenèse et la physiologie rénale chez la souris.
2. Analyser le lien entre l’expression de CRB3 et les facteurs histo-pronostiques
du cancer du côlon chez l’humain.
36
2 Matériels et méthodes
2.1 Construction plasmidique (Clonage: digestion,
ligation et trasformation)
Les plasmides ont été digérés à 37°C pendant 1 heure par les enzymes de restrictions
appropriées (New England Biolabs). À la fin de la digestion, les différents fragments ont
été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose pour être ensuite extrait du gel à l’aide du
gel extraction kit (Feldan). Dans chaque réaction de ligation, 100 ng et 10 ng de vecteur et
d'insert respectivement ont été incubés à température pièce pendant 1 heure en présence de
400 Unité international de ligase T4 selon les indications du fabricant (New England
Biolabs).
Pour isoler et amplifier les clones positifs, la totalité du volume de la réaction de
ligation a été transformée dans des bactéries DH5α compétentes (50 μl de bactéries
décongelées sur glace). Le mélange ADN-bactéries a ensuite été incubé sur glace pendant
20 minutes, soumis à choc thermique de 45 secondes à 42 °C et remis sur glace
immédiatement pour 3 minutes. 1 ml de milieu Luria-Bertani (LB) a été ajouté et les
bactéries ont été incubées pendant 1 heure à 37 °C avec agitation. La culture bactérienne a
ensuite été centrifugée et le culot a été resuspendu dans 100 μl de milieu LB, étalé sur un
pétri LB-agar contenant 100 µg/ml d’Ampicilline et incubé pour la nuit à 37 °C.
2.1.1 Génération de CRB3ERLI
Un gène CRB3 mutant permettant de tronquer les acides aminés ERLI a été généré
par mutagenèse dirigée (fait avant mon arrivée au laboratoire). Un codon stop a été créé en
amont de la séquence codant pour le motif ERLI (remplacement d’un G par un T; voir
figure 13).
37
Figure 13 : Mutation du codon acide glutamique en codon stop
En amont de la séquence codant pour le motif ERLI, on note la présence du codant GAG qui code pour un
acide arginine. La modification du nucléotide Guanine en Thymine permet de créer un codon stop TAG. Ce
codon empêche la traduction des quatre derniers acides aminés et la protéine CRB3 est tronquée 50 de ce
motif de liaison.
38
2.1.2 Éléments régulateurs rein spécifique
Pour permettre l’expression spécifique dans le rein, des éléments régulateurs ont été
clonés3 en amont des gènes CRB3 ET CRB3ΔERLI, ils sont constitués de l’enhancer de
virus simien SV40 et du promoteur de du gène β-globine (fournie gracieusement par Dr
Marie Trudel de l’institut de recherches cliniques de Montréal) (Figure 14). L’enhancer de
SV40 renferme seulement les deux séquences répétées de 72 paires de base sans la
séquence répété de 21 paires de base. Quant au promoteur de β-globine, la séquence
contient 687 paires de base et correspond au promoteur de la globine exprimé chez
l’humain adulte (Trudel, D'Agati et al. 1991).
Figure 14 : Plasmide contenant les différentes parties du transgène.
Le transgène a été obtenu par clonage de la séquence du promoteur de β globine humaine (EcoR I- EcoR I) et
de l’enhancer (BamHI-BamHI) de SV40. En aval, le gène CRB3 et la forme muté CRB3ΔERLI ont été
introduit dans le vecteur après digestion par EcoRV. L’ADN linaire pour micro injection a été obtenu apres
digestion par des enzymes de restrictions Xba I et Cla I.
39
2.2 Purification de l’ADN sur Chlorure Césium
250 ml de culture bactérienne ont été centrifugés (4000 RPM, 20 minutes température
pièce), le surnageant a été jeté et le culot a été resuspendu dans 20 ml de solution I
(Glucose 50 mM, Tris-HCl 25 mM pH 8.0, EDTA 10mM) à laquelle a été ajouté 2 ml de
lysozyme à 100µg/ml. 40 ml de solution II (NaOH 0.2 N, 1% SDS) ont été ensuite ajoutés
afin d’obtenir une lyse alcaline qui est favorisée par des mouvements de rotation. Après
cinq minutes d’incubation, 30 ml de solution III froide (Acétate de potassium 3M, Acide
acétique 2 M) on été ajoutés, le tout a été mélangés par inversion et placé sur glace. Après
10 minutes, le lysat bactérien a été centrifugé (4000 RPM, 30 minutes, 4°C). Le surnageant
a été filtré sur coton fromage dans une nouvelle bouteille de 250 ml. Ensuite, 90 ml
d’isopropanol ont été ajoutés, mélangés et incubés 10 minutes. L’ADN a été culoté par
centrifugation (4000 RPM, 30 minutes, température pièce). Il a été lavé avec 5 ml d’éthanol
70% et centrifugé (4000 RPM, 30 minutes, température pièce). Le surnageant a été jeté et le
culot a été séché et resuspendu dans 5 ml de TE (l0 mM Tris-HCl pH8, 0.l mM EDTA). La
qualité de cet ADN a été vérifiée par migration sur gel. Ensuite, le contenu a été transféré
dans un tube de 15 ml et 5.42 g de Césium Chloride (Bioshop) ont été ajoutés, après sa
dissolution complète, 417 µl de Bromure d’Éthidium 10 mg/ml (Sigma) ont été ajoutés au
tube à l’abri de la lumière. Afin d’éliminer les protéines précipitées, le tube a été centrifugé
(2000 RPM, 2 minutes, température pièce). Le surnageant a été transféré dans un tube à
ultracentrifugation et centrifugé dans un rotor TV1665 (45000 RPM, toute la nuit, 22°C).
La deuxième bande en partant du haut a été récoltée à l’aide d’une seringue de 5 ml et une
aiguille 18 gauge en ayant préalablement fait une entrée d’air avec une autre aiguille dans
le haut du tube. Pour éliminer le bromure éthidium, plusieurs extractions avec du butanol
saturé en H2O ont été effectuées, le butanol est séparé de la phase aqueuse par
centrifugation à 2000 RPM, 3 minutes, température pièce et la phase organique a été jetée.
Ensuite, plusieurs lavages ont été effectués jusqu’à élimination totale du butanol. Pour
précipiter l’ADN, 2 volumes d’eau et 6 volumes d’éthanol 100% ont été ajouté et
l’échantillon a été incubé pendant 30 minutes à - 20 °C. Après centrifugation (4000 RPM,
30 minutes, 4°C), le culot obtenu est lavé avec 1 ml d’éthanol 70%, ensuite une autre
centrifugation (4000 RPM, 10 minutes, 4 °C) a été effectuée et finalement le culot a été
40
séché à l’air libre, ensuite il a été dissout dans 400 µl de tampon TE. Les séquences d’ADN
ont été confirmées par séquençage (Plateforme de séquençage du centre de recherche du
CHUL, Québec, Canada).
2.3 Modèle murin
Afin de faciliter les expériences de micro injection, les souris B6CBAF1 (Jackson
Laboratories) âgées entre 21 et 25 jours ont été utilisées. Pour induire la production et la
maturation accélérée des follicules, les souris ont été injectées d’une dose de 5 unités de
PMS (pregnant mare’s serum) par voie intra péritonéale 72 h avant prélèvement des œufs
fertilisés. 48 heures plus tard, 5 unités d’hormone gonadotrophine chorionique humain
(hCG) ont été injectées. Cette dernière induit la production de la progestérone et provoque
la rupture du follicule mature. Ensuite, ces femelles ont été mises en accouplement. À 0.5 j,
les oocytes fertilisés ont été prélevés des oviductes de femelles donneuses et l’ADN linéaire
à une concentration de 5 ng/μl a été micro injecté dans le noyau (digéré par Cla I et Xba I;
voir figure 8). Des souris porteuses (pseudo gestantes) accouplées avec des mâles
vasectomisés ont été utilisées pour le transfert d’embryons dans leurs utérus.
Les souris ont été logées dans des cages en plastique dans une salle maintenue à des
conditions optimales avec une température constante de 22°C et une alternance des
périodes d’obscurité et de lumière de 12 h chacune. Les animaux ont été soumis à une diète
normale. L’ensemble des expériences ont été approuvé par le comité de protection des
animaux de l’Université Laval
2.4 Extraction de l'ADN
2.4.1 Digestion de l'ADN
L'ADN provient de la queue de souris. Un bout de 0,5 centimètres a été déposé dans
un tube contenant 500 µl du tampon de protéolyse (50mM Tris-HCl pH 7.5, 50mM EDTA
pH 8.0 et 0,5% de SDS) et 15 µl de protéinase K (10 mg/ml, Invitrogen). Les échantillons
ont été incubés à 55°C pendant une nuit complète.
41
2.4.2 Extraction de l'ADN au phénol/chloroforme
Les tubes contenant l'ADN ont été centrifugés (13000 RPM, 5 minutes, température
pièce). Le surnageant a été transvidé dans un autre tube auquel a été ajouté un volume de
phénol équilibré avec du Tris-HCl (50mM pH8.0, Bioshop). Le contenu des tubes a été
mélangé par inversion durant 3 minutes et a été centrifugé (13000 RPM, 5 minutes,
température pièce). La phase aqueuse du dessus a été récupérée et un volume de phénol :
chloroforme : alcool-isoamylique (25:24:1) (Bioshop) a été ajouté. Les tubes ont ensuite été
mélangés 3 minutes par inversion et la phase aqueuse a été récoltée à nouveau après une
centrifugation (13000 RPM, 5 minutes, température pièce). 1 volume de chloroforme a été
ajouté à la phase aqueuse et les tubes ont été mélangés par inversion pendant 3 minutes et
ont été centrifugé (13000 RPM, 5 minutes, température pièce). La phase aqueuse a été
récupérée et 50 µl d'acétate de sodium (3M à pH 5.3, Bioshop) et 890 µl d'éthanol 100%
ont été ajoutés. Les tubes ont été brièvement inversés et l’ADN précipité a été péché à l'aide
de capillaires en forme de canne à pêche. Le précipité a été lavé dans 500 µl d'éthanol 70%
en plongeant l’ADN péché. Il a été séché à l'air ambiant. Une fois l'éthanol évaporé, l'ADN
a été resuspendu dans 200 µl de tampon TE. Les tubes ont été incubés à 55°C durant toute
la nuit afin de permettre une bonne dissolution de l'ADN. Les échantillons sont conservés à
4 °C.
2.5 Southern blot
La sonde, correspondant à la région du nucléotide 1 à 670 du gène CRB3, a été
obtenue au cours d’une amplification par PCR incorporant dUTP Digoxigenine (Kit PCR-
DIG Roche).
Primer For 5’- ATCTGGAGCGACCGGGTGAAG - 3’
Primer Rev 5’- CCAAGCTCATTCCTCAGACC - 3’
42
Tableau 1 : Programme PCR pour génération de la sonde pour l’hybridation
Action Température Temps Nombre de cycle
Dénaturation initiale 95 °C 2 min 1 cycle
Dénaturation 95 °C 30 sec
30 cycles Hybridation 60 °C 30 sec
Élongation 72 ° C 40 sec
Élongation finale 72 °C 7 min 1 cycle
Digestion de l’ADN génomique : 10 μl d’ADN ont été digérés pendant 16 heures à
37°C dans un mélange de 20 UI d’enzyme (NEB), 3 μl du tampon de l’enzyme (NEB), 1
mM spermidine 1000X (Invitrogen), 0.1mg/ml de BSA 100X (Sigma) et 5,65 μl d’eau
distillée.. L’ADN a migré pendant 16 heures à travers un gel d’agarose à 1% (Bioshop)
dans une cuve à électrophorèse sous une tension de 20 Volts (Fischer scientific). Le gel a
été mis pendant 5 minutes sous UV (Spectroline), ensuite il a été déposé pendant 30
minutes dans un tampon de dénaturation (0.5 M NaOH, 1.5 NaCl, Bioshop) avec agitation.
Après rinçage à l’eau distillée, il a été déposé pendant 30 minutes dans une solution de
neutralisation (0.5 M Tris-HCl pH7.5, 1.5 NaCl)) sous agitation. Pour le transfert, le gel a
été retourné et déposé sur un papier Whatman (VWR) trempé dans du tampon 10X SSC (3
M NaCL, 0.3 Sodium Citrate) et déposé sur une éponge. Ensuite, une membrane de nylon
chargée positivement (Roche) (préalablement trempée pendant 10 minutes dans du tampon
10XSSC), deux papiers Whatman imbibés de tampon 10XSSC, une couche de papier et un
poids de 300 à 700 g ont été successivement placés sur le gel. Le transfert a duré 16 heures.
La membrane a été ensuite récupérée puis lavée dans du tampon 2XSSC pendant 2 minutes
et a été déposée dans un cross-linker a 2400 KJ (Höefer), afin de fixer l’ADN à la
membrane. La membrane enroulée a été placée dans un tube à hybridation (VWR)
contenant la solution de préhybridation (15ml/100cm2) (0.5 M tampon phosphate pH7.2,
7%SDS, 10mM EDTA) dans un four rotatif (UVP) pendant deux heures à 65°C. Entre 0.5 à
43
2 µl/ml de la sonde dénaturée (Chauffée pendant 5 minutes à 95°C) été rajoutée à la
solution d’hybridation. L’hybridation à 65°C a durée 16 heures. La membrane a été lavée
deux fois 15 minutes à température ambiante dans la solution de lavage Low stringency
buffer (2XSSC, 0.1% SDS), puis deux autres lavages dans la solution High stringency
buffer (0.5XSSC, 0.1% SDS) préalablement chauffée à 65°C. La membrane a été rincée
dans du tampon de rinçage (acide maléique 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 ajusté avec
NaOH). Elle a été ensuite mise dans le tampon de blocage (Roche) pendant 30 minutes
sous agitation et enfin une solution d’anticorps anti-DIG (Roche) dilué au 1/10000 dans du
tampon blocage à raison de 0,2 ml/cm2 a été rajoutée à la membrane. La membrane a été
équilibrée dans du tampon (Tris-HCl 100 mM, NaCl 100 mM, MgCl 250 mM, ajusté à pH
9,5 avec NaOH) pendant 3 minutes. La membrane a été égouttée ensuite une solution de
substrat CSPD (Roche) a été déposée (0,1 ml/ cm2) délicatement à sa surface. La membrane
a été séchée puis recouverte de plastique et incubée pendant 15 minutes à 37°C. Dans la
chambre noire, un film (Denville Scientific) a été déposé dans la cassette (Fisher Scientific)
contenant la membrane soigneusement fixée, après 15 minutes d’incubation, le film a été
développé dans un développeur (Xpmat M35-A, Kodak) (Figure 15).
Figure 15 : Technique southern blot-DIG
La digestion de l’ADN génomique a l’aide de l’enzyme de restriction BamHI, permet de détecter les souris
transgéniques de celle qui ne le sont pas. L’hybridation de la sonde avec le fragment sauvage présent chez
toutes le souris quelque soit leurs background et un fragment de transgène présent seulement chez les souris
transgéniques.
44
2.6 Biochimie urinaire
L’urine des souris a été récoltée grâce à des cages métaboliques individuelles. Les
échantillons urinaires ont été analysés dans le service de biochimie de l’Hôtel-Dieu de
Québec.
2.7 Western-Blot (WB)
Les tissus ont été homogénéisés dans un tampon de lyse (1% Triton X-100, 50mM
Tris-HCl pH7.5, 100 mM NaCl, 5mM EDTA, 1mM PMSF, 50mM NaF, 40Mm β-
glycerophophate, 200 µM sodium orthovanadate, glycérol 5%, aprotinine 0.5 µg/ml,
leupeptine 0.5µg/ml, pepstatine 0.7µg/ml et PMSF 1µM). Après centrifugation (13000
RPM, 10 min, 4°C), le surnageant a été récupéré. Une aliquot a été prélevée pour le dosage
des protéines à l’aide de la méthode BCA Pierce (Thermo scientific) par comparaison avec
une courbe standard d’albumine. Après migration sur gel acrylamide de 11%,
(Acrylamide 11% (Bioshop), Ammonium persulfate (Sigma) 10%, TEMED 0.1% Bioshop,
Stacking buffer 4X (Tris 0.5M, SDS 0.4%), resolving buffer 4X (Tris 1.5 M, SDS 0.4%), le
transfert des protéines a été effectué over-night à 250 mA sur une membrane de
nitrocellulose (Amersham Bioscience). La membrane a été colorée au rouge ponceau et
ensuite été saturée sous agitation en présence de tampon PBS1X (NaCL 137mM, KCL
2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, K2HPO4 1.4mM) contenant 5% de lait en poudre et 0.05% de
Tween-20. La membrane a ensuite été lavée à trois reprises pendant 10 minutes dans du
tampon PBS-Tween 20 0,05% (PBST). La membrane a alors été mise en présence de
l’anticorps primaire dilué (1/100) dans la solution de blocage pendant une nuit à 4°C. Elle a
ensuite été lavée trois fois au PBST pendant 10 minutes et a été mise en présence d’un
anticorps secondaire pendant 1 heure à température pièce sous agitation. La membrane a
été lavée à trois reprises dans du PBST et la membrane a été mise dans une solution de
révélation (Tris 0.1 M pH8.5, acide coumarique 225 µM, Luminol 0.25 mM et 0.018%
H2O2. La membrane a été révélée par exposition sur film dans une chambre noire.
45
2.8 Histologie: Fixation, inclusion et coupe
Les prélèvements ont été fixés dans du formol à 10%, tamponné à la neutralité
(Surgipath) pendant 24 heures à 4°C. L’inclusion a été faite en paraffine dans un circulateur
(Leica). Des coupes sériées de cinq micromètres d’épaisseur de chaque bloc ont été
réalisées à l’aide d’un microtome (Leica). Les coupes ont été étalées sur des lames
silanisées traitées électrostatiquement (Surgipath), et elles ont été séchées à température
pièce pendant 24 heures. Pour les différentes colorations et l’immunohistochimie, le
déparaffinage a été fait comme suit : Les lames ont été plongées dans deux bains de toluène
(laboratoire MAT) successivement 5 et 10 minutes, puis ont été réhydratées dans des bains
successifs d’éthanol de concentration décroissante (deux bains de 2 et 5 minutes dans de
l’éthanol absolu puis deux bains de 5 minutes dans de l’éthanol à 95%), ensuite les lames
ont été passé à l’eau courante pendant 5 minutes.
2.9 Coloration Hématoxyline-Éosine
Pour chaque prélèvement, les lames ont été colorées à l’Hématoxyline-Éosine pour
les examens histologiques standards. Après le déparaffinage, les lames ont été plongées
dans la solution d’hématoxyline de Harris (Fisher Scientific) pendant 5 minutes et ont été
rincées à l’eau courante pendant 5 minutes, ensuite elles ont été mises dans un bain d’eau
ammoniacale 0.2% (2 ml d’ammoniaque dans 1 litre d’eau distillée) (Bioshop) pendant 2
minutes et après elles ont été rincées à l’eau courante pendant 5 minutes. Les lames ont été
plongées dans une solution d’Éosine aqueuse à 1% (Sigma), pendant 1 minute, après elles
ont été déshydratées par des bains successifs d’éthanol de concentration croissante, 4
passages rapides dans de l’éthanol 95%, et 2 bains 2 minutes dans l’éthanol 100%, puis
placées dans de l’isopropanol pendant 2 minutes (Bioshop). Ensuite, les lames ont été mises
dans un bain de xylène pendant 2 minutes (deux fois) (laboratoire MAT). Le montage entre
lame et lamelle se fait à l’aide d’une solution de montage (Mounting Medium, Surgipath).
46
2.10 Coloration PAS/BA
Les coupes ont été incubées dans une solution contenant du Bleu Alcian PH 2.5
(Richard-Allan Scientific) pendant 30 minutes, puis ont été traitées à l’acide périodique à
0,5 % (Richard-Allan Scientific) pendant 5 minutes. Les lames ont été rincées à l’eau
déminéralisée entre chaque traitement. Elles sont placées dans une solution de Schiff
(Richard-Allan Scientific compagnie) pendant 15 minutes. Les lames ont ensuite été
rincées à l’eau tiède du robinet. Enfin, les noyaux ont été colorés par une solution
d’hématoxyline et ont été différenciés par l’eau ammoniacale pendant une minute. Les
coupes ont été déshydratées puis ont été montées sous lamelle.
2.11 Coloration Oil Red O des tissus
Le principe de cette technique repose sur les propriétés lipophiles du colorant Oil Red
O envers des lipides neutres, qui sont colorés en rouge. Des coupes de rein congelé en OCT
(Leica) de 5 µm ont été étalées sur des lames positivement chargées, elles ont été fixées
dans un mélange de solution de formol 10 % et de l’éthanol 95% pendant 15 minutes.
Après lavage à l’isopropanol, les lames ont été mises dans un bain de solution de travail de
coloration Oil Red O (40% de la solution stock (0.4 g dilué dans 100 ml de l’alcool
isopropylique 99%) et 60% d’eau distillée) et ensuite ont été incubées 15 min à température
ambiante. Après rinçage à l’isopropanol et à l’eau distillée, les noyaux ont été contre-
coloré à l’hématoxyline de Harris pendant 30 secondes. Les lames ont été rincées à l’eau
courante pendant 5 minutes et examinées au microscope optique après le montage avec du
glycérol.
2.12 Coloration trichrome de MASSON
La coloration au trichrome de MASSON (Sigma) colore le collagène en bleu pâle, les
noyaux en violet et le cytoplasme et les fibres musculaires en rose ou rouge. Les lames ont
été incubées pendant 1 heure dans la solution de Bouin chauffée à 60°C, puis sont rincées
pendant 10 minutes à l'eau courante. Une incubation de 10 minutes dans l'hématoxyline de
Weigert ferrique a été suivie d'un deuxième rinçage de 10 minutes à l'eau courante. Les
47
lames ont été par la suite incubées dans la solution Biebrich Scarlet - acide fuschine. Après
rinçage, les lames ont été montées et examinée.
2.13 Immunohistochimie
Après le déparaffinage, afin de procéder aux démasquages antigéniques, les lames ont
été placées dans un presto (Nordic Ware) remplis de 1200 ml de tampon citrate (0.01M à
pH 6, laboratoire MAT) et chauffées pendant 12 minutes dans un four à micro-ondes à
puissance maximale. Puis les lames ont été mise dans une solution peroxyde d’hydrogène 3
% (Bioshop) pendant 10 minutes et ensuite ont été lavées dans du PBS 1X (recette) pendant
2 minutes. Les coupes ont été cerclées à l’aide d’un stylo gras DakoPen (Dako). Pour le
blocage des sites de fixation non spécifique, la solution de blocage (kit IDetect Super Stain
Système HRP, Labs Biotechnology) a été appliqué sur les lames pendant 20 minutes et ont
été placées dans une chambre humide. Anticorps primaires: le volume appliqué est en
fonction de la taille de l’échantillon aux dilutions prédéterminé et laissé incuber dans une
chambre humide pendant 1 heure 30. Ensuite ont été effectue trois rinçages de 5 minutes
avec du PBS1X. L’anticorps secondaire (kit IDetect Super Stain Système HRP, Labs
Biotechnology) a été appliqué pendant 20 minutes. Puis les lames ont été rincées trois fois
5 minutes dans du PBS. Application du complexe streptavidine-biotine-peroxydase (kit
IDetect Super Stain Système HRP, Labs Biotechnology) pendant 20 minutes. Puis les
lames ont été rincées trois fois 5 minutes dans du PBS1X. La révélation de l’activité
peroxydase a été obtenu par application sur le lames du chromogène 3,3’-diaminobenzidine
tétrahydrochloride (DAB) pendant 2 à 5 minutes (Labs Biotechnology), puis ont été rincées
à l’eau distillé. La contre coloration à l’Hématoxyline de Harris (Fisher Scientific), pendant
30 secondes, suivi d’un rinçage à l’eau courante pendant 5 minutes, et déshydratation dans
différent bain d’alcool. Montage. Pour les contrôles négatifs les échantillons sont incubées
avec la solution PBS1X/BSA 1 % en remplacement de l’anticorps primaire.
48
Tableau 2 : Les anticorps utilisés en immunohistochimie
Clone Dilution intérêt Compagnie
Anti-CRB3 1/100 Marque CRB3 a et b Sigma Aldrich
Anti-CRB3b 1/1000 Marque l’isoforme CRB3b Dr Benjamin Margolis
Anti-NA+/K+ ATPas C464.6 1/100 Marque pompe sodium et potassium Millipore
Anti- vimentine 1/1000 Marque filament intermédiaire Santa- Cruz
Anti-E-cadhérine 36-E-cadhérine 1/1000 Marque molécule d’adhésion épithéliale BD Boisciences
Anti Tubuline acétylé 6-11B-1 1/1000 Marque la tubuline Abcam
2.14 Culture cellulaire
Les cellules rénales embryonnaires humaines exprimant l’antigène SV40 (HEK293T)
proviennent de l’ATCC (Américain type culture collection, Manassas, VA). Elles sont
cultivés dans du milieu DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) supplémenté avec
10% de sérum bovin fœtal (FBS), 20mM HEPES (acide 4-2-2 hydroxyethyl 1 piperazine
éthane sulfonique), 2 mM d’acide aminée glutamine et l’antibiotique (50UI/ml de
penicilline et 50ug/Ml de streptomycine). Les cellules sont gardées dans un incubateur à
37°C et 5% de CO2.
2.15 Coloration Oil Red O des cellules
Les cellules ont été lavées avec 2 ml de PBS. La fixation a été faite par l’ajout de 2
ml de formaline 10% à température pièce et incubées pendant 10 minutes, puis pendant 1
heure avec 2 ml de formaline fraîche. La formaline a été enlevée avec une pipete et les
cellules ont été lavées avec 2 ml d’eau, ensuite avec 2 ml d’isopropanol 60% pendant 5
minutes à température pièce. Les cellules ont été séchées et 1 ml de la solution de travail
d’Oil Red O a été ajouté et incubé pendant 10 minutes. La solution Oil Red O a été enlevée
avant d’ajouter de l’eau pour lavage 4 fois. Après contre coloration à l’hématoxyline et
montage les lames ont été observées au microscope optique.
49
2.16 Échantillons
Les échantillons coliques bénins et malins utilisés dans ce projet proviennent de
patients opérés à l’Hôtel-Dieu de Québec pour un adénocarcinome colorectal et choisis à
partir des données disponibles dans la banque des tissus du CRCHUQ-HDQ. Chaque coupe
a fait l’objet d’une coloration à l’hématoxyline éosine et une étude immunohistochimique.
Le projet respecte les règles d’éthique en matière de recherche sur les sujets humains et a
reçu l’aval du comité d’éthique de la recherche avec des êtres humains du CHUQ.
Tableau 3 : Répartition des échantillons tissulaires.
Type histologique Nombre
adénome 10
adénocarcinome 26
50
3 CRB3 et homéostasie des tubules rénaux
3.1 Résultats
3.1.1 Établissement des lignées de souris transgéniques
La micro injection du transgène dans l’oocytes fertilisés de souris B6CBAF1, un
hybride issue de croisement de C57BL/6 et de CBAF1/J, nous a permis de générer des
lignées de souris qui expriment spécifiquement le transgène dans le rein grâce à un
promoteur hybride composé des éléments régulateurs (figure 14).
Nous avons obtenu 2 «founders» pour pSB-CRB3 et 7 pour pSB-CRB3ΔERLI. Nous
avons utilisé ces founders pour établir des lignées indépendantes. Afin de limiter la
possibilité d’étudier un phénotype lié à l’insertion du transgène dans un gène important,
nous avons travaillé avec des souris hétérozygotes (croisées avec des souris C57BL/6). La
présence du transgène est détectée par Southern Blot. Dans les conditions utilisées (voir
Matériels et Méthodes), la sonde reconnaît un fragment de 4757 paires de base pour
l’endogène et de 2673 paires de base pour nos transgènes (Figure 16)
Figure 16 : Analyse en southern blot-DIG
La technique Southern blot sans radioactivité permet d’identifier les souris transgéniques issue du croisement
d’une souris hétérozygote pour le transgène avec une souris de type sauvage. L’ADN a été isolé de la queue
digéré par BamhI. Cette digestion révèle un fragment de 4757 paires de base correspondant à l’endogène qui
est présent chez toutes les souris et un autre fragment de 2673 paires de base qui correspond au transgène
correspondant à la sonde de la région codante 5’.
51
3.1.2 Validation des lignées transgéniques
Nous avons validé l’expression des transgènes dans les lignées pSB-CRB3 par
Western-blot. Une augmentation de l’expression protéique de CRB3 est observée dans le
tissu rénal des souris transgéniques comparativement à celui des contrôles non-
transgéniques. Cette surexpression est spécifique au rein compte tenu de l’absence de
surexpression dans l’intestin des souris transgéniques (Figure 17).
Figure 17 : Analyse en western blot de l’expression de CRB3.
L’extraction de protéines des échantillons de rein et d’intestin de souris transgénique pSB-CRB3 a permit de
mettre en évidence l’expression de CRB3. Les souris transgéniques sont caractérisées par une augmentation
de l’expression protéique de CRB3 comparativement à celui des contrôles non-transgéniques, elle est
également spécifique au tissu rénal des souris transgéniques comparativement a son expression dans l’intestin
des souris transgéniques, blot anti- Actine contrôle.
Nous avons effectué un immunomarquage avec l’anticorps CRB3 des tissus rénaux
des souris transgéniques des lignées pSB-CRB3 et pSB-CRB3ΔERLI qui ne montre pas
une différence de localisation de CRB3 entre les différentes lignés et les souris non
transgéniques (Figure 18).
52
Figure 18 : Immunomarquage anti-CRB3 des tissus rénaux.
A) Le marquage apical et membranaire (brun) de CRB3 des souris contrôles (IHC anti-CRB3; G X200). B)
Marquage apical et membranaire préservé chez les souris pSB-CRB3 (IHC anti-CRB3; G X200). C)
Marquage apical et membranaire préservé également chez les souris pSB-CRB3ΔERLI (IHC anti-CRB3; G
X200)
Lorsque nous avons obtenu les lignées pSB-CRB3ERLI, l’anti-CRB3 était
discontinué. Nous n’avons donc pas pu valider l’expression de CRB3ERLI (un anti-CRB3
est actuellement en production dans le laboratoire Laprise). Pour augmenter nos chances de
travailler avec des lignées exprimant réellement CRB3ERLI, nous avons analysé les sept
lignées pSB-CRB3ERLI qui présentent toutes le même phénotype (voir ci-bas). Donc,
nous avons généré de nouveaux modèles de souris qui surexpriment CRB3 ou expriment
(probablement) CRB3ERLI dans le rein spécifiquement.
3.1.3 Effet de la modulation de CRB3 sur la physiologie
rénale
Aucune morbidité ou mortalité ne sont signalées chez les individus transgéniques
(pSB-CRB3 et pSB-CRB3ΔERLI) et qui présentent le même phénotype. Afin d’évaluer
l’impact de la surexpression de CRB3 et de l’expression de CRB3ΔERLI sur la fonction
rénale, nous avons dosé la concentration urinaire de différents métabolites comme l’urée et
le glucose ainsi que les ions comme le sodium et le potassium. En premier lieu, chez les
souris qui surexpriment CRB3, le taux urinaire de glucose est augmenté par rapport aux
53
contrôles (Figure 19). De la même façon, on note que le taux de sodium et d’urée subissent
une élévation significative. Par contre, le taux urinaire de potassium reste inchangé (Figure
20).
Figure 19 : Taux de glucose urinaire
Les souris qui surexpriment CRB3 (20 souris) ont un niveau de glucose urinaire élevé par rapport au contrôle
(p<0.05). Celles qui expriment CRB3ΔERLI (7 souris) ont un niveau qui n’est pas statistiquement différent
du contrôle.
54
Figure 20 : Analyse du taux urinaire de l’urée, sodium et potassium
Les 20 souris pSB-CRB3 ont des urines concentrées en urée et sodium (p<0.05). Il n’y a pas de différence
significative de concentration urinaire en potassium entre les souris transgéniques pSB-CRB3 et le contrôle.
Les 7 souris pSB-CRB3ΔERLI ont également un niveau d’urée et sodium urinaire élevé (p<0.05), par contre
la concentration urinaire du potassium reste aussi normale.
Les souris qui expriment CRB3ERLI subissent elles aussi des modifications de la
concentration urinaire des différents ions et produits de dégradations. En particulier, le
sodium et l’urée sont augmentés de façon significative par rapport aux souris contrôles
(Figure 20). Par contre, les taux de glucose et de potassium sont normaux (Figure 19, 20).
En somme, ces résultats démontrent que la modulation de l’expression de CRB3 et du
mutant au motif ERLI peut avoir un impact sur la fonction physiologique du rein
probablement en rapport avec des anomalies des cellules épithéliales des tubules.
55
3.1.4 Le phénotype rénal
Aucune anomalie macroscopique n’est retrouvée et le ratio poids du rein sur le poids total
de la souris reste inchangé dans les souris pSB-CRB3 et pSB-CRB3ΔERLI (Figure 21).
Figure 21 : Ratio poids du rein /poids total
Les souris sacrifiées ont été pesées et, ensuite, les deux reins ont été pesés pour déterminer le ratio entre le
poids du rein et le poids total. L’analyse des résultats montre qu’aucune différence significative de ce ratio
n’est constatée entre les souris, ce qui signifie que le rein des souris transgéniques ne subit aucune
modification du poids.
Afin de caractériser le phénotype rénal, nous avons procédé à l’examen histologique
des reins des souris adultes. La coloration à l’hématoxyline-éosine (HE) ne met pas en
évidence d’anomalies dans l’architecture du rein (Figure 22B). Contrairement aux résultats
attendus, la lumière des tubules rénaux ne montrent pas de changement du diamètre que ce
soit lors de la surexpression de CRB3 ou l’expression de CRB3ΔERLI. Par contre, des
modifications cellulaires sont notées. En effet, lors de la surexpression de CRB3, les
cellules épithéliales des tubules proximaux montrent une accumulation de vésicules intra-
cytoplasmiques de grande taille qui refoulent le noyau en périphérie et laisse une empreinte
56
d’écrasement sur le noyau (Figure 22B). Cette surcharge apparait chez les individus
adultes, car elle est absente dans les reins de souris de moins de 60 jours.
Cet aspect histologique des vésicules coloré par HE oriente vers plusieurs natures
comme les lipides du mucus ou du glycogène, pour déterminer la nature exacte de ces
vésicules, nous avons effectué plusieurs colorations spéciales (Tableau 4). La première est
la combinaison Bleu Alcian (BA; qui colore le mucus en bleu) et le Périodique Acide Shift
(PAS; qui colore le glycogène en fuchsia). Les vésicules intracytoplasmiques sont
négatives suite aux colorations par le PAS et BA (Figure 22D). Par conséquent, elles ne
sont ni du glycogène ni du mucus. La deuxième coloration spéciale utilisée est l’Oil Red O
qui permet de mettre en évidence les lipides. Les vésicules associées à la surabondance de
CRB3 sont colorées par l’Oil Red O (Figure 22 G), ce qui démontre qu’elles sont de nature
lipidique. La surcharge lipidique est négligeable dans les reins des souris exprimant
CRB3ΔERLI (Figure 23B, E), ce qui démontre l’implication du motif ERLI dans
l’accumulation de gouttelettes lipidiques.
Tableau 4 : Colorations histochimiques spéciales
Technique de coloration Couleur Substance détectée
Bleu alcian Bleu Mucines acides
PAS (Periodic Acid Shiff) Rouge mucines, glycogène
Oil red O Rouge Lipide
57
Figure 22 : Analyse histologique du rein des lignées pSBCRB3
A) Coupe histologique de rein de souris contrôle. (HE; GX100). B) coupe histologique de rein de la lignée
pSBCRB3; Absence de modification de l’architecture du rein et présence de gouttelettes dans les cellules
proximale, des vésicules bien définies et écrasent les noyaux et laissent une empreinte optiquement vide
( ) (HE; GX400). C, D) coupe congelé de rein de souris transgeniques. Pas de marquage de ces
gouttelettes par l’acide Periodique de schifft (PAS) et le bleu alcian (BA) ce qui démontre que les gouttelettes
ne sont ni du mucus ni du glycogène. (PAS/BA; GX200). E) Contrôle positif de foie stéatosique humain par
marquage des gouttelettes lipidiques en rouge (Oil Red O GX100). F) coupe congelé de rein coloration
négative contrôle de souris non transgénique. (Oil Red O GX200). G) Les vésicules accumulées dans le rein
de souris pSB-CRB3 ont une affinité au colorant Oil Red démontrant leurs natures lipidiques (Oil Red O;
GX200).
58
Figure 23 : Analyse histologique du rein des lignées pSB-CRB3ΔERLI
A) Coupe rénal de souris contrôle. (Coloration HE; GX100). B) Absence de modification de l’architecture du
rein, et absence de dépôt anormale. (Coloration HE; GX100). C) Contrôle positif, marquage des gouttelettes
lipidiques d’un foie humain stéatosique (Coloration Oil Red O GX200). D) Absence de marquage par le Oil
Red O du rein de souris pSBCRBΔERLI (Coloration Oil Red O GX100). E) Absence de marquage par le Oil
Red O du rein de souris control (Coloration Oil Red O GX100)
Par contre, les reins des souris issues de 7 lignées CRB3ΔERLI présentent des lésions de dégénérescence intracellulaire accompagnées d’un infiltrat inflammatoire lymphocytaire sans dépôts fibreux (Figure 23, 24). Ces lésions touchent les cellules des tubes proximaux
sans atteinte des autres segments du néphron.
59
Figure 24 : Lésions histologiques des reins de lignées pSB-CRB3ΔERLI
A) Les cellules des épithéliums des tubules rénaux proximaux sont le siège de lésions de dégénére scences
hydropiques caractérisées par un cytoplasme clarifié et une limite apicale floue. (Coloration HE; GX200). B)
Présence d’un infiltrat inflammatoire constitué de lymphocytes et de macrophage au pourtour des vaisseaux
sanguins. (Coloration HE; GX200). C) Rein de souris contrôle. (Coloration Trichrome de MASSON;
GX100). D) Absence de dépôt de fibrose dans le rein (Coloration Trichrome de MASSON; GX100).
60
3.1.5 Effet de la modulation de CRB3 sur le stockage
lipidique dans d’autres modèles
Dans le but de vérifier si cette fonction de CRB3 d’induction de stockage lipidique
est générale ou spécifique aux reins, nous avons utilisés des cellules humaines d’origines
variées. D’abord, les HEK293T dérivent du rein fœtal humain, les MCF7 de la glande
mammaire et enfin les Hela proviennent du col de l’utérus. Ces différentes lignées ont été
transfectées avec le vecteur vide (contrôle), un plasmide encodant myc-CRB3 ou myc-
CRB3ΔERLI. En dépit de la diversité de l’origine de ces cellules, elles accumulent des
gouttelettes lipidiques lorsque CRB3 est surexprimée (Figure 25).
L’expression de CRB3ΔERLI résulte en peu ou pas d’accumulation de lipide
intracellulaire. Ces données corroborent les résultats obtenus in vivo et suggèrent que CRB3
possède un rôle important dans le métabolisme lipidique dans les cellules épithéliales.
61
Figure 25 : Accumulation de lipides dans les cellules humaines d’origines variées.
Les cellules HEK293T, MCF7 et les Hela sont transfectées par myc-CRB3, myc-CRB3ΔERLI (HEK293T,
MCF7) ou avec le vecteur vide (contrôle). 72 heures après la transfection, les cellules sont fixées puis
colorées à l’Oil Red.O. A, D, G) cellules contrôle HEK293T, Hela et MCF7 respectivement (Coloration Oil
Red; C, GX200, GX400). B, E, F, H) Les cellules HEK 293T, Hela et MCF7qui surexpriment CRB3 ont une
augmentation de lipides intracytoplasmique. (Coloration Oil Red; GX200, GX400). C, I) Élévation moindre
observée dans les HEK 293T et les MCF7 qui expriment myc-CRB3ΔERLI, (Coloration Oil Red; C, GX200,
GX400).
3.1.6 Effets de la modulation de CRB3 sur la polarité des
tubules in vivo
En culture cellulaire, la perte ou la surexpression de CRB3 modifie la polarité
épithéliale comme cela été rapporté dans des études antérieures et vu qu’aucunes données
n’est disponible de l’effet de cette modulation de l’expression dans le modèle in vivo, nous
avons examiné la polarité cellulaire des tubules rénales du néphron. À cet effet, nous avons
utilisé la méthode de marquage par immunohistochimie de la protéine basolatéral Na+/K+
ATPase. Le marquage basolatéral de la protéine est conservé dans toute les cellules rénales
62
et aucun marquage inhabituel n’a été constaté (Figure 18, 22 D, 26A). Pareillement,
l’expression de CRB3ERLI dans le rein ne présente pas de modification du marquage
basolateral de la pompe sodium potassium (Figure 26B).
Figure 26 : Immunomarquage de la polarité par anti Na+/K +ATPase
La pompe sodium potassium localisée à la membranaire basolatérale est un bon indicateur de la localisation
correcte des protéines. A) Le marquage basolatéral la protéine Na+/K +ATPase; est conservé dans toutes les
cellules rénales des souris pSB-CRB3 (IHC anti Na+/K +ATPase; GX400). B) le marquage basolatéral de la
proteine Na+/K +ATPase est également conservé dans toutes les cellules rénales des souris pSB-
CRB3ΔERLI; (IHC anti Na+/K +ATPase; GX400).
3.1.7 Effets de la modulation de CRB3 sur le cil des cellules
in vivo
Les cellules des tubes rénaux ont un cil au pôle apical qui baigne dans la lumière des
tubules (Rodat-Despoix and Delmas 2009). Cet organelle est présent dans toutes les
cellules sauf dans les cellules intercalaires des tubules collecteurs. Pour examiner les
modifications pouvant survenir lors de la surexpression de CRB3 ou CRB3ERLI, nous
avons opté pour la technique en immunohistochimie à l’aide d’un anticorps anti-tubuline
acétylé qui permet de marquer une des protéines constituant les cils. Malgré la
63
surexpression de CRB3, la taille et la forme des cils des cellules rénales restent inchangées
comparativement à ce qui est observé chez les souris contrôles (Figure 27A et B). En
revanche, lorsque CRB3ERLI est exprimée on constate que le nombre de cil est diminué
par rapport aux souris contrôles (Figure 27 C et D).
Figure 27 : Immunohistochimie anti-tubuline acétylé : immunomarquage des cils
A, C) les souris contrôles, les tailles et les formes des cils ( ) (IHC anti Tubuline acetylé; GX200).
B) taille et forme restent inchangées chez le souris pSB-CRB3 (IHC anti Tubuline acetylé; GX200). D) Les
cils sont peu nombreux dans les tubules de rein de souris pSB-CRB3ΔERLI (IHC anti Tubuline acetylé;
GX200)
En parallèle, nous avons fait une évaluation quantitative du nombre de cils des cellules
épithéliales rénales en comptant 10 champs contigus au grossissement 40X de trois
individus de chaque lignée. L’analyse des résultats confirme les constatations
64
histologiques, car aucune différence significative n’est observée entre le nombre de cils
chez les souris qui surexpriment CRB3 et les souris contrôles, alors que le nombre de cils
des cellules rénales chez les souris CRB3ΔERLI est significativement diminué (Figure 28).
Figure 28 : Évaluation quantitative du nombre de cils
Le nombre de cils des cellules rénales chez les souris pSB-CRB3ΔERLI est significativement diminué par
rapport au contrôle (P<0.05), mais aucune différence significative n’est observée entre le nombre de cil chez
les souris pSB-CRB3 et les souris contrôles. (Les cils ont été comptés sur 10 champs contigus au
grossissement 400X).
65
3.2 Discussion
Depuis la découverte de Crb et de ses orthologues chez les mammifères (Tepass,
Theres et al. 1990) (den Hollander, ten Brink et al. 1999; Makarova, Roh et al. 2003; Katoh
2004; van den Hurk, Rashbass et al. 2005), de nombreux travaux ont démontré divers rôles
des protéines CRB, soit au niveau de la polarité épithéliale, de la formation des jonctions
intercellulaires, de la ciliogenèse et la formation de lumière dans les tissus épithéliaux.
La détermination de la taille et du diamètre des tubules est cruciale pour la fonction
des organes. Toute altération de leur morphogenèse conduit à des altérations
morphologiques, ceci a été démontré dans le système respiratoire de drosophile (Laprise,
Paul et al. 2010). Ainsi des travaux réalisés chez la drosophile et dans les cellules in vitro
ont démontré que Crb/CRB3 sont impliquées dans la formation des lumières des tubules et
déterminent leurs tailles (Laprise, Paul et al. ; Schluter, Pfarr et al. 2009).
Mes travaux de maîtrise visaient à déterminer l’impact de la surexpression de CRB3
ou de l’expression de CRBΔERLI sur la morphogenèse et la physiologie rénale chez la
souris. Tout d’abord, nous avons généré dans le laboratoire des souris transgéniques qui
surexpriment CRB3 ou expriment CRB3ΔERLI grâce à des éléments régulateurs
spécifiques au rein (Trudel, D'Agati et al. 1991). Aucune mortalité et morbidité ne sont
constatées jusqu’à neuf mois de vie.
De façon inattendue, nous avons constaté l’apparition d’une stéatose rénale, c'est-à-
dire une surcharge des cellules en lipides, chez les souris qui surexpriment CRB3. Ce
phénotype n’a jamais été rapporté dans la littérature que ce soit dans un modèle in vitro ou
in vivo. Cette fonction de CRB3 est générale, car elle est reproductible dans des lignées
cellulaires d’origines variées. Il est également à noter que l’accumulation de gouttelettes
lipidiques est beaucoup moins marquée chez les individus exprimant CRB3ΔERLI. Donc,
l’accumulation de lipides amenée par CRB3 nécessite la présence du domaine ERLI. Ce
motif de liaison protéique permet une connexion avec les protéines comme PATJ par
l’intermédiaire de PALS1 et de Par 6. Ceci laisse penser que ces protéines ont un rôle à
jouer dans le métabolisme des lipides en aval de CRB3. Par ailleurs, les souris qui
66
expriment CRB3ΔERLI ont des lésions de dégénérescences hydropiques et montrent une
inflammation de type lymphocytaire péri-vasculaire sans fibrose.
La stéatose est une accumulation de lipides dans les cellules des tissus non-adipeux.
Cette accumulation est responsable de lésions cellulaires et d’un dysfonctionnement des
organes touchés (Bobulescu, Dubree et al. 2009). Les cellules proximales du rein ont de
grands besoins énergétiques. Cependant, les capacités de glycolyse pour la synthèse d’ATP
sont faibles, ce qui conduit ces cellules à utiliser d’autres substrats non glucidiques, comme
les acides gras libres (Bobulescu 2010). Quand l’équilibre énergétique est atteint, l’excès
est stocké sous forme de triglycérides dans les cellules proximales, mais celle-ci ne
possèdent pas la machinerie des cellules spécialisée dans le stockage (adipocytes). En
conséquence, une fois les capacités dépassées, ce stockage excessif devient un réservoir de
métabolites toxiques comme la diacyglycerol ou la céramide et a des effets délétères sur la
cellule (Bobulescu, Dubree et al. 2009).
Plusieurs maladies et conditions pathologique comme le diabète, l’obésité et le
syndrome métabolique sont caractérisés par une accumulation de lipide dans le foie, le
cœur, le muscle strié et le rein (Bobulescu, Dubree et al. 2009). Cette stéatose est
responsable de lésions cellulaires et de dysfonction de l’organe atteinte. Dans le rein, elle
perturbe l’excrétion de NH4+ ce qui mène à l’acidification de l’urine. Par conséquent, la
stéatose rénale favorise la lithiase dans le rein (Bobulescu, Dubree et al. 2009). Il serait
donc pertinent de mesurer le pH de l’urine dans nos modèles transgéniques et de d’observer
la possible formation de calculs dans les reins des souris âgées.
Dans notre modèle de souris pSB-CRB3, l’analyse des urines montre des troubles du
métabolisme urinaire du glucose, de l’urée et du sodium. Quant aux souris pSB-
CRB3ΔERLI, les altérations touchent l’absorption du sodium et de l’urée seulement, mais
les taux urinaires de glucose et de potassium demeurent inchangés. Les fonctions de
réabsorptions et de sécrétion se font tout le long des segments du néphron mais la plus
grande partie de ce métabolisme se déroulent dans la portion proximale des tubules. Une
altération de la polarité (non démontré jusqu’ici) pourrait être la cause d’une altération dans
la distribution de protéines impliquées dans les fonctions de réabsorption comme
GLUT 4. Et aussi l’atteinte spécifique des cellules proximales par la stéatose et que l’urée,
67
le sodium et le glucose sont les seuls atteints contrairement au potassium ou son transport
se fait par les cellules des tubules distales, ce qui pourrait expliquer son taux urinaire
normal. Ceci suggère que CRB3 a un rôle spécifique de métabolisme lipidique dans les
cellules proximales.
Il aurait été intéressant de vérifier la glycémie des souris pSB-CRB3, car une
glycosurie (taux élevé de glucose dans les urines) accompagne une glycémie au-dessus
d’un certain seuil (chez l’humain >1.8 g/L) et une accumulation de lipides dans le rein se
voit souvent dans le diabète.
Malgré une diminution drastique du nombre de cils dans les reins qui expriment
CRB3ΔERLI, aucun phénotype kystique n’a été constaté. Dans la littérature, il a été
rapporté qu’une perte de cils conduit à un phénotype kystique (D'Angelo and Franco 2009;
Rodat-Despoix and Delmas 2009; Tobin and Beales 2009). Cependant d’autres données
montrent que l’altération de la taille du cil n’est pas toujours accompagnée de kystes au
moment des lésions, mais le phénotype est plus tardif (Davenport, Watts et al. 2007). De
plus, la pathologie kystique du rein autosomique dominante se manifeste à l’âge adulte
(Deltas and Papagregoriou 2010). La manifestation de la pathologie pourrait dépendre de
différents impacts lésionnels infligés aux reins (Happe, Leonhard et al. 2009). Donc, il
serait intéressant de regarder le phénotype des souris pSB-CRB3ΔERLI très âgées ou de
leur faire subir des lésions rénales aigues pour voir si un phénotype kystique se manifeste.
L’examen histologique ne permettait pas de mettre en évidence une perte de polarité
ou une altération des jonctions, ceci ne signifie pas que ces lésions sont inexistantes. Des
moyens d’explorations plus performants, comme une étude en microscopie électroniques et
en immunohistochimie à l’aide d’un panel d’anticorps élargie (ex GLUT 4, Aquaporine)
permettra de mettre plus de lumière sur ce volet.
Des données publiées suggèrent que l’accumulation de lipide intra rénal est favorisée
par la modulation de l’AMPK (Hallows, Mount et al. 2010). Pareillement les résultats
préliminaires effectués en culture cellulaire montrent une modulation des voies AMPK et
MAPK/ERK lors de la surexpression de CRB3 (Laprise, résultat non publié).
68
3.3 Perspectives
Bien que l’objectif premier de ma maîtrise fût de déterminer le rôle de CRB3 dans la
morphogenèse des tubules rénaux, mais l’apparition d’un phénotype autre que celui attendu
rend ce travail intéressant car il a le mérite de mettre en évidence une nouvelle fonction
générale de CRB3 dans le métabolisme lipidique. Il est cependant intéressant de poursuivre
les investigations concernant l’étude des protéines de polarité et les jonctions par des
méthodes comme l’immunofluorescence et microscopie électronique.
La compréhension des voies moléculaires impliquant CRB3 dans la lipogenèse reste
également un challenge excitant à relever dans le futur proche d’autant plus que des
indications sérieuses supportent la relation d’une part entre la polarité épithéliale et le
métabolisme énergétique et d’autre part entre les protéines localisées au cil et le
métabolisme énergétique. Parmi les expériences intéressantes; une étude de l’expression
protéique en western blot des différents voies et une étude de l’expression génique dans les
différentes lignées par ARN microarray sur le plan biologie une exploration de la fonction
rénal et aussi une modification de la diète des souris et regarder si il y a un changement du
phénotype. Finalement, élucider le rôle de l’isoforme CRB3CLPI dans le métabolisme
lipidique.
69
3.4 Conclusion
Cette première partie de mon travail a permis de caractériser des souris transgéniques
qui surexpriment constitutivement et spécifiquement CRB3 dans le rein. Bien que le
phénotype fût inattendu, on a pu déterminer une nouvelle fonction générale de CRB3 dans
la lipogenèse. Ce modèle de souris pourrait servir pour comprendre les mécanismes
moléculaires impliqués dans la stéatose survenant dans des tissus lors des maladies comme
le syndrome métabolique, le diabète et l’obésité. Il pourrait être éventuellement une
solution dans le traitement de ces maladies, car l’accumulation de lipide favorisée par
l’augmentation de la phosphorylation de l’AMPK (une voie supposé être régulée par
CRB3) sera probablement inhibée lorsque l’expression de CRB3 est abaissé par des
agonistes exogènes qui agissent directement sur la protéine ou indirectement en stimulant
des protéines inhibitrices et de ce fait pourra permettra une diminution de l’effet
pathologique.
70
4 CRB3 et cancer
4.1 Résultats
4.1.1 Étude en immunohistochimie du côlon normal
CRB3 se retrouve dans une grande variété de tissus épithéliaux normaux, comme
dans le côlon, le foie, les poumons et les reins. Dans le côlon humain, l’immunohistochimie
par l’anticorps anti CRB3 (Sigma) montre un marquage membranaire apical d’intensité
modérée présent sur tous les échantillons analysés (Figure 29). Afin de caractériser
l’expression de CRB3 au cours de la carcinogénèse colique, nous avons d’une part étudié
l’expression de CRB3 dans les adénomes et d’autre part dans les échantillons
d’adénocarcinomes.
Figure 29 : Immunomarquage anti-CRB3 de la muqueuse colique normale
Région de muqueuse colique normale renfermant des glandes bordées par un épithélium simple constitué
d’entérocytes et de cellules mucosécrétantes, centrés par une lumières dont le bord apical est souligné par un
immunomarquage membranaire de forte intensité par l’anticorps anti CRB3 (Flèches ) (IHC, anti-CRB3;
GX400)
71
4.1.2 Marquage des adénomes
En premier lieu, les résultats de l’examen immunohistochimique par l’anticorps anti
CRB3 révèlent que le marquage membranaire apical ne subit ni de perte de localisation ni
d’intensité que ce soit dans les adenomes comparativement à ceux observés dans le côlon
normal (Figure 30).
Figure 30 : Immunomarquage anti-CRB3 des adénomes coliques.
A) Marquage membranaire apical de forte intensité des glandes coliques normales (IHC anti-CRB3 GX400)
B, C) Persistance du marquage membranaire et apical de forte intensité dans les adénomes (IHC anti-CRB3;
GX200 et GX400).
4.1.3 Marquages des adénocarcinomes
En deuxième lieu, l’analyse des échantillons d’adénocarcinomes permet de déceler
une certaine hétérogénéité dans la distribution du signal, mais le plus souvent il reste
localisé à la membrane apicale et son intensité est identique à l’épithélium normal contigu.
Ceci se voit quel que soit le degré de différenciation et le stade histologique. Par ailleurs,
nous avons constaté dans des tumeurs indifférenciées c’est-à-dire les tumeurs les plus
agressives un signal qui est cytoplasmique ou nucléaire. En somme, ces constatations
indiquent bien que cette perte de l’expression de CRB3 tardive dans des tumeurs
indifférenciées pourrait constituer une importante étape dans leurs évolutions (Figure 31)
72
Figure 31 : Immunomarquage anti-CRB3 des adénocarcinomes du côlon et métastase.
A) Marquage membranaire de forte intensité du pôle apical des glandes de côlon normal (IHC anti-CRB3
GX400. B) persistance du marquage membranaire de forte intensité dans les adénocarcinomes (IHC anti-
CRB3 GX400. C) persistance de marquage anti CRB3 dans un foyer de métastatique ganglionnaire d’un
adénocarcinome colique (IHC anti-CRB3 GX200).
Le phénotype agressif des tumeurs est caractérisé par l’invasion loco-régional et la
métastase. Afin de voir l’expression de CRB3 dans les tumeurs metastasées, nous avons
analysé deux métastases de cancer de côlon dans les ganglions lymphatiques. Nous avons
visualisé dans le parenchyme ganglionnaire, des glandes tapissées par un épithélium bien
différencié formé de cellules exhibant un marquage membranaire et apical lorsqu’elles sont
immunomarquées par l’anticorps anti CRB3. Ce marquage démontre que les tumeurs
secondaires peuvent retrouver des marqueurs perdus lors des étapes de colonisation de
l’hôte (Figure 31C).
4.1.4 Marquage EMT
L’EMT se voit dans 20 à 40 % des carcinomes coliques (Zlobec and Lugli 2010) et
siège généralement au front d’invasion des tumeurs composés de quelques cellules.
L’identification morphologique de ces sites sur des coupes colorées à hématoxyline et
éosine est difficile, mais néanmoins possible. Afin de faciliter la recherche de ces
territoires, le marquage de certains antigènes spécifiques de l’identité épithéliale et
mésenchymateuse est utilisé. Parmi les marqueurs utilisés, notons l’E-cadherine (marqueur
épithéliale) et la vimentine (typique du mésenchyme). Notre analyse des échantillons a
73
débouché sur l’identification de deux cas distincts des territoires tumoraux qui présentent
un phénotype immunohistochimique différent des zones contigües. Les deux zones sont
effectivement situées au niveau du front d’invasion. Les cellules tumorales sont denses et
peu différenciées et sont caractérisées par une perte totale de l’expression de CRB3 (Figure
32).
Figure 32 : Zone de transition épithéliale mésenchymateux
A, E). Zones tumorales au front d’invasion d’adénocarcinome du côlon peu différenciée (HE; A : GX100, E :
GX200). B, F) Perte de l’expression apicale de CRB3 (IHC anti-CRB; GX100). C, G) Perte de l’expression
de la molecule d’adhésion épithéliale l’E-cadhérine (IHC anti E-cadherine GX100. D,H) Apparition de
l’expression de marqueur mésenchymateux la vimentine (IHC anti-vimentine; GX200).
Sur le même territoire cellulaire, nous avons constaté une perte d’E-cadhérine et un
gain de la vimentine. Donc, il s’agit d’une transition du phénotype épithéliale vers le
phénotype mésenchymateux et qui de plus coïncide avec une perte de l’expression de
CRB3. En somme, ce résultat corrobore les données de la littérature qui démontrent la
répression de CRB3 lors de l’EMT dans le model in vitro.
74
4.2 Discussion
Le cancer colorectal est un cancer le fréquent, d’une part son incidence ne cesse
d’augmenter chaque année grâce aux moyens de diagnostics de plus en plus performant
d’autre part il reste un cancer de bon pronostic lorsqu’il est diagnostiqué à un stade précoce.
Ces 20 dernières années grâce notamment aux progrès réalisés en matière de prise en
charge (précocité du diagnostic et amélioration des modalités thérapeutiques), son taux de
mortalité a diminué.
Le cancer colorectal est caractérisé comme la plupart des carcinomes par des anomalies de
la régulation de plusieurs processus clés liés à sa division, la différenciation et le
métabolisme… etc, parmi, elle l’atteinte de la polarité épithéliale dans la progression de la
maladie cancéreuse. En effet la perte de cette polarité est associée avec un caractère
important dans la prolifération et dans l’invasion des cellules cancéreuses.
CRB3 est exprimée dans de nombreux épithéliums monocouches dont celui du côlon.
Cette expression est forte et localisée au domaine apical (Figure 27). Les résultats
préliminaires du laboratoire indiquent que la surexpression de CRB3 ou l’expression de
CRB3ΔERLI dans des lignées intestinales tumorales et non tumorales modulent la
prolifération et l’apoptose. De plus des résultats similaires ont été obtenus précédemment,
mais sur des lignées de cellules cancérisées artificiellement. Dans ce cas, les cellules ont un
profil tumoral plus agressif associé à une répression de l’expression génique de nombreux
gènes parmi lesquels CRB3 est le plus réprimé (Karp, Tan et al. 2008).
Le choix de ce type de cancer est motivé d’une part par la forte expression de CRB3 dans le
côlon et des résultats préliminaires obtenus dans le laboratoire sur des cellules intestinales
et d’autre part l’accès plus aisé à des échantillons de cancer du colon.
Pour voir l’évolution de l’expression de CRB3, notre étude a été faite sur des
échantillons de cancer colorectal et des adénomes
En effet, CRB3 est conservée dans les adénomes sans grande différence dans la
localisation et l’intensité du signal. La diminution de l’expression des protéines dans les
75
états pathologiques précédant la cancerisation sont souvent détectés seulement par l’étude
de l’expression de mRNA, ce qui serait une des pistes à explorer dans le futur.
Quant aux adénocarcinomes, quelque soit leurs grades et leurs stades, on ne constate
pas de perte du marquage de CRB3. Cette étude immunohistochimique ne reflète pas tous
les événements moléculaires qui sous-tendent, car on voit la persistance du signal même
dans les tumeurs indifférenciées (tumeurs agressives) qui ont accumulés des lésions
moléculaires importantes. Toutefois, il a été démontré, particulièrement dans des cancers
que même si l’expression des protéines est maintenue, elles restent sur le plan fonctionnel
inactif, ces protéines sont incapables d’accomplir leurs tâches comme par exemple l’E-
cadherine dans les cancers coliques. La fonctionnalité de la protéine CRB3 peut être
affectée dans ce cas, mais pas son expression, par conséquent, les interactions avec d’autres
partenaires de polarité pourraient être altérées.
De plus, au cours de la transformation tumorale l’acquisition des lésions génétiques
est séquentielle et plusieurs gènes suppresseurs sont atteints. CRB3 est potentiel un gène
suppresseur de tumeurs (Karp, Tan et al. 2008), son probable rôle de protecteur expliquerait
le maintien du marquage apical et de CRB3.
Les cellules embryonnaires sont caractérisées par le phénomène de plasticité
(changement de phénotype et mobilité apparenté à l’EMT). L’EMT peut être activée de
façon inappropriée lors d’une progression tumorale (Kalluri and Weinberg 2009). Les
études en immunohistochimie de tous les échantillons que ce soit dans les adénocarcinomes
bien, moyennement et peu différenciés, révèlent que CRB3 et l’E-cadherine sont présentes.
Par contre, la vimentine est absente. Lorsque la perte d’expression de CRB3 est constatée,
on remarque également la perte de l’E-cadherine et l’expression de la vimentine. Cette
perte d’un marqueur moléculaire épithélial coïncide avec le gain d’un marqueur
mésenchymateux sans réel incidence sur le phénotype histologique.
Le facteur de transcription SNAIL est activé dans 78% des cancers (Natalwala,
Spychal et al. 2008), il permet d’inhiber temporairement l’expression de la E-cadherine et
de CRB3 (Whiteman, Liu et al. 2008). Au cours du processus cancéreux, la croissance
tumorale s’arrête pour permettre aux cellules d’envahir localement et à distance et de se
76
déplacer dans leurs environnement. Toutefois lors des étapes suivantes, la transcription de
SNAIL est réprimée et ceci permet de lever l’inhibition de l’expression de l’E-cadherine et
de CRB3. Par la suite on assiste à une reprise de la croissance tumorale et la formation des
adhésions intercellulaire grâce à l’E-cadhérine et reconstitution du phénotype de la tumeur
(Natalwala, Spychal et al. 2008).
L’apparition du phénotype EMT est corrélée au type de lésions moléculaires, en effet,
lorsque le type moléculaire des tumeurs est MSI-H, le phénomène de transformation
mésenchymateux est fortement réduit et il est élevé dans les types moléculaires (MSI- L et
MSS) (Zlobec and Lugli 2010). Sur les 26 tumeurs de côlon étudiées aucune indication sur
le type de lésions moléculaire n’était disponible en notre possession. Ces donnés
moléculaires (si disponibles) permettront d’élargir la recherche des foyers d’EMT.
4.3 Perspectives
Dans le but de complémenter notre étude en immunohistochimie, qui permet
seulement un marquage de CRB3 sans indication quantitative du niveau d’expression
protéique, il faudra avoir recours à des méthodes comme la PCR quantitative et le Western
blot afin d’évaluer le niveau d’expression de CRB3 dans le cancer.
La recherche de mutation de CRB3 dans les cancers humains serait également
intéressante, de même une corrélation clinique et moléculaire pour observer l’impact de la
perte de CRB3 et le pronostic.
L’étude de l’homéostasie de CRB3 dans l’intestin en utilisant un modèle murin va
permettre dans le futur de mettre la lumière sur les mécanismes moléculaires impliqués
dans le maintien de la physiologie cellulaire intestinale. Ce modèle permettra également
d’étudier la cancérogenèse en croisant ces souris avec un modèle des souris de cancer du
côlon (ex ; souris ApcMin/+) et de ce fait observer l’impact de la surexpression de CRB3 et
de l’expression du dominant négatif sur l’évolution de la tumeur.
77
4.4 Conclusion
Ce premier travail effectué sur CRB3 sur des échantillons de cancers humains
particulièrement dans le côlon révèle que CRB3 reste exprimée tardivement dans le cancer
du colon. Son expression est réprimée dans des territoires d’EMT (front d’invasion) et
pourrait être une cible de facteurs inducteurs de l’EMT, ce qui suggère un rôle protecteur de
CRB3 contre l’agressivité des cancers.
Les résultats de la surexpression de CRB3 et l’expression de CRB3ΔERLI dans
l’homéostasie intestinale et la tumorogenèse nous permettront d’en savoir un peu plus sur le
rôle de CRB3 dans l’intestin. En parallèle, l’acquisition récente du laboratoire de la souris
CRB3 Knock-out (KO) conditionnelle, va certainement mettre davantage la lumière sur les
rôles de CRB3 dans l’intestin.
La prise en charge des patients atteints de cancer épithéliaux du côlon est un des défis
auquel la recherche est confrontée. La perte tardive de CRB3 pourrait servir de cible pour
contrôler la progression tumorale par la stimulation de son expression. D’un autre coté, la
localisation de CRB3 au domaine apical des cellules épithéliales intestinales qui font face à
la lumière lui confère un double avantage : d’une part elle est facilement accessible à des
molécules (ex agonistes) prise par voie orale et d’autre part elle permet d’éviter la
dégradation via le métabolisme hépatique et aussi les effets secondaires indésirables.
78
5 Bibliographie
Aigner, K., B. Dampier, et al. (2007). "The transcription factor ZEB1 ([delta]EF1) promotes tumour cell dedifferentiation by repressing
master regulators of epithelial polarity." Oncogene 26(49): 6979-6988. Ansieau, S., C. Caron de Fromentel, et al. (2010). "[Role of the epithelial-
mesenchymal transition during tumor progression]." Bull Cancer 97(1):
7-15. Bachmann, A., M. Schneider, et al. (2001). "Drosophila Stardust is a partner
of Crumbs in the control of epithelial cell polarity." Nature 414(6864): 638-43.
Badouel, C., L. Gardano, et al. (2009). "The FERM-Domain Protein Expanded Regulates Hippo Pathway Activity via Direct Interactions with the
Transcriptional Activator Yorkie." Developmental Cell 16(3): 411-420. Bilder, D. (2004). "Epithelial polarity and proliferation control: links from the
Drosophila neoplastic tumor suppressors." Genes Dev 18(16): 1909-25. Bilder, D. and N. Perrimon (2000). "Localization of apical epithelial
determinants by the basolateral PDZ protein Scribble." Nature 403(6770): 676-80.
Bobulescu, I. A. (2010). "Renal lipid metabolism and lipotoxicity." Curr Opin
Nephrol Hypertens 19(4): 393-402. Bobulescu, I. A., M. Dubree, et al. (2009). "Reduction of renal triglyceride
accumulation: effects on proximal tubule Na+/H+ exchange and urinary acidification." Am J Physiol Renal Physiol 297(5): F1419-26.
Boroviak, T. and P. Rashbass (2010). "The Apical Polarity Determinant Crumbs 2 is a Novel Regulator of Embryonic Stem Cell Derived Neural
Progenitors." Stem Cells. Boroviak, T. and P. Rashbass (2011). "The apical polarity determinant
Crumbs 2 is a novel regulator of ESC-derived neural progenitors." Stem Cells 29(2): 193-205.
Chen, C.-L., K. M. Gajewski, et al. (2010). "The apical-basal cell polarity determinant Crumbs regulates Hippo signaling in Drosophila."
Proceedings of the National Academy of Sciences 107(36): 15810-15815.
D'Angelo, A. and B. Franco (2009). "The dynamic cilium in human diseases."
PathoGenetics 2(1): 3. Davenport, J. R., A. J. Watts, et al. (2007). "Disruption of Intraflagellar
Transport in Adult Mice Leads to Obesity and Slow-Onset Cystic Kidney Disease." Current biology : CB 17(18): 1586-1594.
79
Deane, J. A. and S. D. Ricardo (2007). "Polycystic kidney disease and the renal cilium." Nephrology (Carlton) 12(6): 559-64.
Deltas, C. and G. Papagregoriou (2010). "Cystic Diseases of the Kidney:
Molecular Biology and Genetics." Archives of Pathology & Laboratory Medicine 134(4): 569-582.
den Hollander, A. I., K. Johnson, et al. (2001). "CRB1 has a cytoplasmic domain that is functionally conserved between human and Drosophila."
Hum Mol Genet 10(24): 2767-73. den Hollander, A. I., J. B. ten Brink, et al. (1999). "Mutations in a human
homologue of Drosophila crumbs cause retinitis pigmentosa (RP12)." Nat Genet 23(2): 217-21.
Fan, S., V. Fogg, et al. (2007). "A novel Crumbs3 isoform regulates cell division and ciliogenesis via importin beta interactions." J Cell Biol
178(3): 387-98. Fan, S., T. W. Hurd, et al. (2004). "Polarity proteins control ciliogenesis via
kinesin motor interactions." Curr Biol 14(16): 1451-61. Feigin, M. E. and S. K. Muthuswamy (2009). "Polarity proteins regulate
mammalian cell-cell junctions and cancer pathogenesis." Current
Opinion in Cell Biology 21(5): 694-700. Fogg, V. C., C. J. Liu, et al. (2005). "Multiple regions of Crumbs3 are
required for tight junction formation in MCF10A cells." J Cell Sci 118(Pt 13): 2859-69.
Grzeschik, N. A., L. M. Parsons, et al. (2010). "Lgl, aPKC, and Crumbs regulate the Salvador/Warts/Hippo pathway through two distinct
mechanisms." Curr Biol 20(7): 573-81. Hallows, K. R., P. F. Mount, et al. (2010). "Role of the energy sensor AMP-
activated protein kinase in renal physiology and disease." Am J Physiol Renal Physiol.
Hanahan, D. and Robert A. Weinberg (2011). "Hallmarks of Cancer: The Next Generation." Cell 144(5): 646-674.
Happe, H., W. N. Leonhard, et al. (2009). "Toxic tubular injury in kidneys
from Pkd1-deletion mice accelerates cystogenesis accompanied by dysregulated planar cell polarity and canonical Wnt signaling
pathways." Hum Mol Genet 18(14): 2532-42. Happe, H., A. M. van der Wal, et al. (2011). "Altered Hippo signalling in
polycystic kidney disease." J Pathol 224(1): 133-42. Hoover, K. B. and P. J. Bryant (2002). "Drosophila Yurt is a new protein-4.1-
like protein required for epithelial morphogenesis." Dev Genes Evol 212(5): 230-8.
80
Izaddoost, S., S. C. Nam, et al. (2002). "Drosophila Crumbs is a positional cue in photoreceptor adherens junctions and rhabdomeres." Nature 416(6877): 178-83.
Jacob, L., M. Opper, et al. (1987). "Structure of the l(2)gl gene of Drosophila and delimitation of its tumor suppressor domain." Cell 50(2): 215-25.
Javier, R. T. and A. P. Rice (2011). "Emerging Theme: Cellular PDZ Proteins as Common Targets of Pathogenic Viruses." Journal of Virology
85(22): 11544-11556. Kalluri, R. and R. A. Weinberg (2009). "The basics of epithelial-mesenchymal
transition." The Journal of Clinical Investigation 119(6): 1420-1428. Karp, C. M., T. T. Tan, et al. (2008). "Role of the Polarity Determinant
Crumbs in Suppressing Mammalian Epithelial Tumor Progression." Cancer Research 68(11): 4105-4115.
Karp, C. M., T. T. Tan, et al. (2008). "Role of the polarity determinant crumbs in suppressing mammalian epithelial tumor progression." Cancer Res
68(11): 4105-15. Katoh, M. (2004). "Identification and characterization of Crumbs homolog 2
gene at human chromosome 9q33.3." Int J Oncol 24(3): 743-9.
Knust, E. and O. Bossinger (2002). "Composition and formation of intercellular junctions in epithelial cells." Science 298(5600): 1955-9.
Knust, E., U. Tepass, et al. (1993). "crumbs and stardust, two genes of Drosophila required for the development of epithelial cell polarity."
Dev Suppl: 261-8. Laprise, P. (2011). "Emerging role for epithelial polarity proteins of the
crumbs family as potential tumor suppressors." J Biomed Biotechnol 2011: 868217.
Laprise, P., S. Beronja, et al. (2006). "The FERM protein Yurt is a negative regulatory component of the Crumbs complex that controls epithelial
polarity and apical membrane size." Dev Cell 11(3): 363-74. Laprise, P., K. M. Lau, et al. (2009). "Yurt, Coracle, Neurexin IV and the
Na(+),K(+)-ATPase form a novel group of epithelial polarity proteins."
Nature 459(7250): 1141-5. Laprise, P., S. M. Paul, et al. "Epithelial polarity proteins regulate Drosophila
tracheal tube size in parallel to the luminal matrix pathway." Curr Biol 20(1): 55-61.
Laprise, P., S. M. Paul, et al. (2010). "Epithelial Polarity Proteins Regulate Drosophila Tracheal Tube Size in Parallel to the Luminal Matrix
Pathway." Current Biology 20(1): 55-61.
81
Laprise, P., S. M. Paul, et al. (2010). "Epithelial polarity proteins regulate Drosophila tracheal tube size in parallel to the luminal matrix pathway." Curr Biol 20(1): 55-61.
Laprise, P., A. Viel, et al. (2004). "Human homolog of disc-large is required for adherens junction assembly and differentiation of human intestinal
epithelial cells." J Biol Chem 279(11): 10157-66. Lemmers, C., E. Medina, et al. (2004). "[Role of Crumbs proteins in the
control of epithelial cell and photoreceptor morphogenesis]." Med Sci (Paris) 20(6-7): 663-7.
Lemmers, C., D. Michel, et al. (2004). "CRB3 binds directly to Par6 and regulates the morphogenesis of the tight junctions in mammalian
epithelial cells." Mol Biol Cell 15(3): 1324-33. Ling, C., Y. Zheng, et al. (2010). "The apical transmembrane protein Crumbs
functions as a tumor suppressor that regulates Hippo signaling by binding to Expanded." Proceedings of the National Academy of
Sciences 107(23): 10532-10537. Lisovsky, M., K. Dresser, et al. (2010). "Immunohistochemistry for cell
polarity protein lethal giant larvae 2 differentiates pancreatic
intraepithelial neoplasia-3 and ductal adenocarcinoma of the pancreas from lower-grade pancreatic intraepithelial neoplasias." Human
Pathology 41(6): 902-909. Lotery, A. J., S. G. Jacobson, et al. (2001). "Mutations in the CRB1 gene
cause Leber congenital amaurosis." Arch Ophthalmol 119(3): 415-20. Makarova, O., M. H. Roh, et al. (2003). "Mammalian Crumbs3 is a small
transmembrane protein linked to protein associated with Lin-7 (Pals1)." Gene 302(1-2): 21-9.
Massey-Harroche, D., M. H. Delgrossi, et al. (2007). "Evidence for a molecular link between the tuberous sclerosis complex and the Crumbs
complex." Hum Mol Genet 16(5): 529-36. McKay, G. J., S. Clarke, et al. (2005). "Pigmented paravenous chorioretinal
atrophy is associated with a mutation within the crumbs homolog 1
(CRB1) gene." Invest Ophthalmol Vis Sci 46(1): 322-8. Mehalow, A. K., S. Kameya, et al. (2003). "CRB1 is essential for external
limiting membrane integrity and photoreceptor morphogenesis in the mammalian retina." Hum Mol Genet 12(17): 2179-89.
Michel, D., J. P. Arsanto, et al. (2005). "PATJ connects and stabilizes apical and lateral components of tight junctions in human intestinal cells." J
Cell Sci 118(Pt 17): 4049-57.
82
Natalwala, A., R. Spychal, et al. (2008). "Epithelial-mesenchymal transition mediated tumourigenesis in the gastrointestinal tract." World J Gastroenterol 14(24): 3792-7.
O'Brien, L. E., M. M. Zegers, et al. (2002). "Opinion: Building epithelial architecture: insights from three-dimensional culture models." Nat Rev
Mol Cell Biol 3(7): 531-7. Olsen, O., L. Funke, et al. (2007). "Renal defects associated with improper
polarization of the CRB and DLG polarity complexes in MALS-3 knockout mice." J Cell Biol 179(1): 151-64.
Pearson, H. B., P. A. Perez-Mancera, et al. (2011). "SCRIB expression is deregulated in human prostate cancer, and its deficiency in mice
promotes prostate neoplasia." The Journal of Clinical Investigation 121(11): 4257-4267.
Peinado, H., D. Olmeda, et al. (2007). "Snail, Zeb and bHLH factors in tumour progression: an alliance against the epithelial phenotype?" Nat
Rev Cancer 7(6): 415-428. Pellikka, M., G. Tanentzapf, et al. (2002). "Crumbs, the Drosophila
homologue of human CRB1/RP12, is essential for photoreceptor
morphogenesis." Nature 416(6877): 143-9. Pieczynski, J. and B. Margolis "Protein complexes that control renal epithelial
polarity." Am J Physiol Renal Physiol 300(3): F589-601. Richard, M., F. Grawe, et al. (2006). "DPATJ plays a role in retinal
morphogenesis and protects against light-dependent degeneration of photoreceptor cells in the Drosophila eye." Developmental Dynamics
235(4): 895-907. Rodat-Despoix, L. and P. Delmas (2009). "Ciliar functions in the nephron."
Pflugers Arch 458(1): 179-87. Roh, M. H., S. Fan, et al. (2003). "The Crumbs3-Pals1 complex participates in
the establishment of polarity in mammalian epithelial cells." J Cell Sci 116(Pt 14): 2895-906.
Roh, M. H., O. Makarova, et al. (2002). "The Maguk protein, Pals1, functions
as an adapter, linking mammalian homologues of Crumbs and Discs Lost." J Cell Biol 157(1): 161-72.
Roh, M. H. and B. Margolis (2003). "Composition and function of PDZ protein complexes during cell polarization." Am J Physiol Renal
Physiol 285(3): F377-87. Saif, M. W. and E. Chu (2010). "Biology of Colorectal Cancer." The Cancer
Journal 16(3): 196-201 10.1097/PPO.0b013e3181e076af.
83
Schluter, M. A., C. S. Pfarr, et al. (2009). "Trafficking of Crumbs3 during cytokinesis is crucial for lumen formation." Mol Biol Cell 20(22): 4652-63.
Shin, K., S. Straight, et al. (2005). "PATJ regulates tight junction formation and polarity in mammalian epithelial cells." The Journal of Cell Biology
168(5): 705-711. Sobin, L. H., C. Wittekind, et al. (2003). TNM classification des tumeurs
malignes. Paris, Cassini. Sobotta, J. (2002). Atlas d'Histologie : cytologie, histologie, anatomie
microscopique. Cachan [(Val-de-Marne)], Editions m©*dicales internationales.
Spaderna, S., O. Schmalhofer, et al. (2008). "The Transcriptional Repressor ZEB1 Promotes Metastasis and Loss of Cell Polarity in Cancer." Cancer
Research 68(2): 537-544. Straight, S. W., K. Shin, et al. (2004). "Loss of PALS1 Expression Leads to
Tight Junction and Polarity Defects." Molecular Biology of the Cell 15(4): 1981-1990.
Tepass, U., C. Theres, et al. (1990). "crumbs encodes an EGF-like protein
expressed on apical membranes of Drosophila epithelial cells and required for organization of epithelia." Cell 61(5): 787-99.
Tobin, J. L. and P. L. Beales (2009). "The nonmotile ciliopathies." Genetics in Medicine 11(6): 386-402 10.1097/GIM.0b013e3181a02882.
Trudel, M., V. D'Agati, et al. (1991). "C-myc as an inducer of polycystic kidney disease in transgenic mice." Kidney Int 39(4): 665-71.
van den Hurk, J. A., P. Rashbass, et al. (2005). "Characterization of the Crumbs homolog 2 (CRB2) gene and analysis of its role in retinitis
pigmentosa and Leber congenital amaurosis." Mol Vis 11: 263-73. Varelas, X., P. Samavarchi-Tehrani, et al. (2010). "The Crumbs complex
couples cell density sensing to Hippo-dependent control of the TGF-beta-SMAD pathway." Dev Cell 19(6): 831-44.
Wang, Q. and B. Margolis (2007). "Apical junctional complexes and cell
polarity." Kidney Int 72(12): 1448-58. Wheater, P. R., B. Young, et al. (2001). Histologie fonctionnelle. Paris, De
Boeck University. Whiteman, E. L., C. J. Liu, et al. (2008). "The transcription factor snail
represses Crumbs3 expression and disrupts apico-basal polarity complexes." Oncogene 27(27): 3875-9.
Williams, T. and J. E. Brenman (2008). "LKB1 and AMPK in cell polarity and division." Trends in Cell Biology 18(4): 193-198.
84
Wilson, P. D. (2011). "Apico-basal polarity in polycystic kidney disease epithelia." Biochim Biophys Acta 1812(10): 1239-48.
Wodarz, A., U. Hinz, et al. (1995). "Expression of crumbs confers apical
character on plasma membrane domains of ectodermal epithelia of Drosophila." Cell 82(1): 67-76.
Woods, D. F. and P. J. Bryant (1991). "The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate
junctions." Cell 66(3): 451-64. Xiao, Z., J. Patrakka, et al. "Deficiency in crumbs homolog 2 (Crb2) affects
gastrulation and results in embryonic lethality in mice." Developmental Dynamics 240(12): 2646-2656.
Zlobec, I. and A. Lugli (2010). Epithelial mesenchymal transition and tumor budding in aggressive colorectal cancer: Tumor budding as oncotarget.
Zlobec, I. and A. Lugli (2010). "Epithelial mesenchymal transition and tumor budding in aggressive colorectal cancer: tumor budding as oncotarget."
Oncotarget 1(7): 651-61.