8/7/2019 BOULIKAS, T. et al 1979

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P r o c . N a t i . A c a d . S c i . USAV o l . 7 7 , N o . 1 , p p . 1 2 7 - 1 3 1 , J a n u a r y 1 9 8 0B i o c h e m i s t r y

P o i n t s o f c o n t a c t b e t w e e n h i s t o n e H1 and t h e h i s t o n e octamer( n u c l e o s o m e s / c h r o m a t i n / p r o t e i n c r o s s l i n k i n g / t w o - d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s / p e p t i d e m a p p i n g )

T E N I B O U L I K A S , JOHN M . WISEMAN, AND WILLIAM T . GARRARD*D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , T h e U n i v e r s i t y o f T e x a s H e a l t h S c i e n c e C e n t e r , 5 3 2 3 H a r r y H i n e s B o u l e v a r d , D a l l a s , T e x a s 7 5 2 3 5C o m m u n i c a t e d b y J a m e s F . B o n n e r , S e p t e m b e r 2 4 , 1 9 7 9ABSTRACT T h e t o p o g r a p h y o f t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e nh i s t o n e HI a n d t h e h i s t o n e o c t a m e r h a s b e e n i n v e s t i g a t e d . B o -v i n e t h y m u s n u c l e i o r e n z y m a t i c a l l y f r a g m e n t e d c h r o m a t i nw e r e t r e a t e d w i t h 1 - e t h y l - 3 ( - d i m e t h y l a m i n o p r o p y l ) c a r b o d i -i m i d e , w h i c h c a t a l y z e s t h e f o r m a t i o n o f c o v a l e n t b o n d s b e t w e e nr e s i d u e s o f p r o t e i n s i n e l e c t r o s t a t i c c o n t a c t . H i s t o n e H I - c o r eh i s t o n e d i m e r s w e r e i d e n t i f i e d a n d t h e s e g m e n t s o f m o l e c u l e sp a r t i c i p a t i n g i n c r o s s l i n k i n g w e r e e l u c i d a t e d . T h e r e s u l t sd e m o n s t r a t e t h a t t h e m a j o r h i s t o n e H I - c o r e h i s t o n e d i m e rg e n e r a t e d u p o n c a r b o d i i m i d e c r o s s l i n k i n g o f i n t a c t n u c l e i ,c h r o m a t i n , o r m o n o n u c l e o s o m e s c o n s i s t s o f t h e s e g m e n t o fh i s t o n e H I c o n t a i n i n g a m i n o a c i d s 7 4 - 1 0 6 c r o s s l i n k e d t o t h es e g m e n t o f h i s t o n e H2A c o n t a i n i n g a m i n o a c i d s 5 8 - 1 2 9 . T h u s ,t h e c e n t r a l g l o b u l a r r e g i o n o f h i s t o n e HI i n t i m a t e l y c o n t a c t st h e h i s t o n e o c t a m e r . B e s i d e s h i s t o n e H i - H 2 A d i m e r s , t w o o t h e rh i s t o n e H I - c o n t a i n i n g c r o s s l i n k e d p r o d u c t s w e r e d e t e c t e d . I nt h e s e i n s t a n c e s , t h e s e g m e n t s o f h i s t o n e HI m o l e c u l e s c o n -t a i n i n g a m i n o a c i d s 1 - 7 2 w e r e s h o w n t o p a r t i c i p a t e i n c r o s s -l i n k i n g . T h e h i s t o n e H I c o n t a c t p o i n t s d e f i n e d h e r e a l l o c c u rw i t h i n m o n o n u c l e o s o m e s a n d n o t b e t w e e n n u c l e o s o m e s . T h e s er e s u l t s p e r m i t t h e f o r m u l a t i o n o f a t e s t a b l e m o d e l f o r t h e a r -r a n g e m e n t o f h i s t o n e H I a l o n g p o l y n u c l e o s o m e c h a i n s .H i s t o n e HI p l a y s a f u n d a m e n t a l r o l e i n c o m p a c t i n g p o l y n u -c l e o s o m e c h a i n s i n t o h i g h e r o r d e r s t r u c t u r e s t h a t c o n f o r m a -t i o n a l l y r e p r e s e n t p a r t i c u l a r i n v i v o s t a t e s o f c h r o m a t i n ( 1 - 4 ) .A l t h o u g h t h e m o l e c u l a r d e t a i l s o f h o w h i s t o n e H I i n t e r a c t s w i t hp o l y n u c l e o s o m e s a r e n o t k n o w n , i t h a s g e n e r a l l y b ee n a s s u m e dt h a t Hi i s a s s o c i a t e d w i t h t h e l i n k e r r e g i o n b e t w e e n n u c l e o s o m ec o r e p a r t i c l e s ( 5 ) . T h i s b e l i e f i s b a s e d p r i n c i p a l l y o n t h e f i n d i n gt h a t h i s t o n e Hi i s r e l e a s e d f r o m c h r o m a t i n d u r i n g n u c l e a s ed i g e s t i o n , c o n c o m i t a n t w i t h t h e p r o d u c t i o n o f c o r e p a r t i c l e s .B e s i d e s b i n d i n g t o t h e s p a c e r r e g i o n , w e s u g g e s t e d e a r l i e r t h a th i s t o n e HI may i n t e r a c t a l s o w i t h t h e n u c l e o s o m e s u r f a c e ,b e c a u s e H i s t i l l r e m a i n s b o u n d t o n u c l e o s o m e s c o n t a i n i n g a b o u t1 6 0 b a s e p a i r s o f DN A ( 6 ) [ a DN A l e n g t h n o w b e l i e v e d t o c o r -r e s p o n d t o t w o c o m p l e t e t u r n s o f D N A a b o u t t h e h i s t o n e o c -t a m e r ( 7 ) ] . I n d e e d , t h e i d e a t h a t r e g i o n s o f t h e H i m o l e c u l e m a yc o n t a c t t h e n u c l e o s o m e s u r f a c e h a s a l s o b e e n e n t e r t a i n e d b yo t h e r i n v e s t i g a t o r s ( 8 - 1 1 ) a n d h a s g a i n e d s u p p o r t f r o m t h e r e -s u l t s o f p r o t e i n c r o s s l i n k i n g e x p e r i m e n t s ( 1 2 , 1 3 ) . H o w e v e r , d u et o t h e s i z e o f t h e H i m o l e c u l e a n d t h e a r m l e n g t h s o f t h ec r o s s l i n k i n g r e a g e n t s u s e d i n t h e s e s t u d i e s , c o n c l u s i v e d e m o n -s t r a t i o n t h a t H i i n t i m a t e l y c o n t a c t s t h e h i s t o n e o c t a m e r r e -

q u i r e s a s o m e w h a t d i f f e r e n t e x p e r i m e n t a l a p p r o a c h .T h e p r e s e n t s t u d y w a s u n d e r t a k e n i n o r d e r t o r e s o l v e t h ep r o b l e m o f t h e p r e c i s e l o c a t i o n o f h i s t o n e H i w i t h r e s p e c t t ot h e h i s t o n e o c t a m e r . F o r t h i s p u r p o s e , w e h a v e p e r f o r m e dc r o s s l i n k i n g e x p e r i m e n t s w i t h a w a t e r - s o l u b l e c a r b o d l i m i d e t h a tf o r m s z e r o - l e n g t h c r o s s l i n k s b e t w e e n p r o t e i n s i n e l e c t r o s t a t i cc o n t a c t . B y u s i n g c a r b o d i i m i d e c r o s s l i n k i n g a n d p e p t i d em a p p i n g p r o c e d u r e s , w e d e m o n s t r a t e t h a t d i f f e r e n t s e g m e n t so f t h e N H r t e r m i n a l h a l v e s o f h i s t o n e H I m o l e c u l e s s p e c i f i c a l l yc o n t a c t o t h e r n u c l e o s o m a l p r o t e i n s . W e s h o w f u r t h e r t h a t t h e

m o s t p r e d o m i n a n t c o n t a c t o c c u r s b e t w e e n t h e c e n t r a l g l o b u l a rr e g i o n o f HI a n d t h e C O O H - t e r m i n a l h a l f o f H 2 A .

M A T E R I A L S AND M E T H O D SP r e p a r a t i o n o f N u c l e i a n d E n z y m a t i c a l l y F r a g m e n t e dC h r o m a t i n . N u c l e i w e r e i s o l a t e d f r o m f r e s h c a l f t h y m u s t i s s u ea n d c h r o m a t i n w a s p r e p a r e d b y d i g e s t i o n w i t h m i c r o c o c c a ln u c l e a s e a s d e s c r i b e d ( 6 ) . U n l e s s o t h e r w i s e s t a t e d , 6 - 1 0 % o f t h en u c l e a r DN A h a d b e e n c o n v e r t e d t o a c i d - s o l u b l e m a t e r i a l .C a r b o d i i m i d e C r o s s l i n k i n g . N u c l e i w e r e a d j u s t e d t o 0 . 5 m go f D N A p e r m l i n S o l u t i o n C ( r e f . 6 ) a n d f r e s h l y d i s s o l v e d 1 -

e t h y l - 3 ( 3 - d i m e t h y l a m i n o p r o p y l ) c a r b o d i i m i d e ( E D A C ) ( B i o -R a d ; 1 M i n S o l u t i o n C ) w a s a d d e d w i t h s t i r r i n g t o y i e l d a f i n a lE D A C c o n c e n t r a t i o n o f 3 0 m M . I n c u b a t i o n w a s c a r r i e d o u t a t2 2 0 C f o r 2 h r , w i t h c o n t i n u o u s s t i r r i n g . C r o s s l i n k i n g w a s t e r -m i n a t e d b y c o l l e c t i n g t h e n u c l e i a n d w a s h i n g t h r e e t i m e s b yc e n t r i f u g a t i o n a t 4 0 C w i t h S o l u t i o n C ( m i n u s EDAC) c o n -t a i n i n g 5 0 mM ammonium a c e t a t e . E n z y m a t i c a l l y f r a g m e n t e dc h r o m a t i n w a s p r e p a r e d f r o m c r o s s l i n k e d n u c l e i a s d e s c r i b e d( 6 ) , e x c e p t t h a t a f t e r d i g e s t i o n n u c l e i w e r e d i a l y z e d f o r 2 4 h ra t 4 0 C a g a i n s t 1 mM N a 2 E D T A ( p H 8 . 5 ) w i t h t h r e e c h a n g e s .P r o c e d u r e s f o r c r o s s l i n k i n g a n d c o n c e n t r a t i n g c h r o m a t i n , a n dp r e p a r a t i o n o f p r o t e i n s a r e d e s c r i b e d e l s e w h e r e ( 1 4 ) .G e l E l e c t r o p h o r e s i s . S e p a r a t i o n o f n u c l e o p r o t e i n c o m p l e x e sa n d s e c o n d - d i m e n s i o n D N A e l e c t r o p h o r e s i s w e r e p e r f o r m e da s d e s c r i b e d ( 6 , 1 5 ) . F o r s ec o n d - d i m en s i o n a c i d / u r e a g e l s ,p r e p a r a t i v e n u c l e o p r o t e i n s l a b g e l s ( 0 . 3 c m t h i c k ) w e r e l o a d e dw i t h e n z y m a t i c a l l y f r a g m e n t e d c h r o m a t i n s a m p l e s a t 0 . 8 m go f D N A p e r c m w i d t h o f g e l . A f t e r e l e c t r o p h o r e s i s , 1 . 5 - c m - w i d es t r i p s w e r e c u t a n d s o a k e d a s r e p o r t e d e l s e w h e r e ( 1 6 ) b u t i n t h ea b s e n c e o f p r o t a m i n e . S t r i p s w e r e p o s i t i o n e d a c r o s s t h e t o p s o f0 . 3 - c m - t h i c k s e c o n d - d i m e n s i o n s l a b g e l s , a n d w e r e o v e r l a y e dw i t h p r o t a m i n e s o l u t i o n ( 0 . 1 5 m l / c m o f g e l w i d t h ; r e f . 1 6 ) .A c i d / u r e a a n d s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e ( N a D o d S O 4 ) s l a b g e l sw e r e r u n a s d e s c r i b e d ( 1 7 , 1 8 ) . A f t e r e l e c t r o p h o r e s i s , d i f f u s i o no f p e p t i d e s w a s d e c r e a s e d b y s o a k i n g g e l s f o r 1 h r a t 2 2 0 C w i t ha g i t a t i o n i n 1 % g l u t a r a l d e h y d e / 5 0 mM s o d i u m p h o s p h a t eb u f f e r ( p H 7 . 0 ) p r i o r t o s t a i n i n g ( K . M . N e w r o c k a n d L . H .C o h e n , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) .P r o t e o l y t i c a n d C h e m i c a l C l e a v a g e o f P r o t e i n s i n P o l y -a c r y l a m i d e G e l s . A c i d - s o l u b l e p r o t e i n w a s s e p a r a t e d b y u s i n ga c i d / u r e a s l a b g e l s ( 1 8 X 1 4 X 0 . 1 5 c m ) , w h i c h w er e l o a d e dt r a n s v e r s e l y w i t h 3 - 8 m g o f p r o t e i n . S t r i p s c o n t a i n i n g 1 0 0 - 5 0 0M g o f p r o t e i n w e r e c u t a n d d e h y d r a t e d b y s o a k i n g s u c c e s s i v e l yi n s o l u t i o n s c o n t a i n i n g m e t h a n o l ( 5 0 % , 6 0 %, 7 5 %, a n d 9 5 % ) a n da c e t o n e ( 2 - 5 h r p e r s o l u t i o n a t 2 2 ' C ) . D e h y d r a t e d g e l s w e r es t o r e d i n v a c u o u n t i l r e a d y f o r u s e . T o a c c o m p l i s h p r o t e a s ed i g e s t i o n , a m o d i f i c a t i o n o f t h e m e t h o d o f C l e v e l a n d e t a l . ( 1 9 )w a s e m p l o y e d . D e h y d r a t e d g e l s t r i p s w e r e s o a k e d f o r 3 0 m i ni n a - c h y m o t r y p s i n ( W o r t h i n g t o n ) a t 2 m g / m l / 0 . 1 2 5 M T r i s .

A b b r e v i a t i o n s : E D A C , I - e t h y l - 3 ( 3 - d i m e t h y l a m i n o p r o p y l ) c a r b o d i -i m i d e ; N a D o d S O 4 , s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e ; N B S , N - b r o m o s u c c i n i m i d e ;X X - C O O H - t e r m i n a l s e g m e n t , h i s t o n e s e g m e n t c o n s i s t i n g o f a m i n oa c i d s f r o m a m i n o a c i d - X X t o t h e C O O H t e r m i n u s .* T o whom r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e d .1 2 7

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g ec h a r g e p a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r eb y m a r k e d " a d -v e r t i s e m e n t " i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t et h i s f a c t .

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1 2 8 B i o c h e m i s t r y : B o u l i k a s e t a l .H C I / 0 . 5 % N a D o d S O 4 / 0 . 5 mM N a 2 E D T A / 0 . 0 1 % b r o m o -p h e n o l b l u e a t pH 6 . 8 . H y d r a t e d g e l s t r i p s w e r e p o s i t i o n e da c r o s s t h e t o p s o f N a D o d S O 4 - s t a c k i n g g e l s ( 0 . 1 5 cm t h i c k ) a n de l e c t r o p h o r e s i s w a s p e r f o r m e d a t 2 2 0 C , b u t w i t h a 3 0 - m i n i n -t e r r u p t i o n a f t e r s a m p l e s h a d e n t e r e d s t a c k i n g g e l s . F o r c l e a v a g eb y N - b r o m o s u c c i n i m i d e ( N B S ) , d e h y d r a t e d g e l s t r i p s w e r es o a k e d w i t h a g i t a t i o n a t 2 2 0 C f o r 5 0 m i n i n 5 0 % a c e t i c a c i d /N B S ( P i e r c e ) a t 0 . 7 m g / m l a n d t h e n f o r 1 6 h r i n 5 0 % m e t h a n o l( s a t u r a t e d w i t h t y r o s i n e ) . A f t e r s o a k i n g f o r 1 5 m i n i n 0 . 1 2 5 MT r i s - H C I / 2 % N a D o d S O 4 / 2 . 5 % 2 - m e r c a p t o e t h a n o l / 1 5 %g l y c e r o l a t pH 6 . 8 , s t r i p s w e r e l a y e d a c r o s s t h e t o p s o f N a -D o d S O 4 s t a c k i n g g e l s ( 0 . 1 5 cm t h i c k ) , a n d 3 0 m i n l a t e r e l e c -t r o p h o r e s i s w a s i n i t i a t e d .P u r i f i c a t i o n o f ( 4 ' + w ) l b y P r e p a r a t i v e T w o - D i m e n s i o n a lE l e c t r o p h o r e s i s . A m i d o b l a c k - s t a i n e d ( 4 / + w ) , b a n d s w e r ee x c i s e d f r o m p r e p a r a t i v e a c i d / u r e a g e l s a n d s t r i p s w e r e s o a k e da t 2 2 0 C f o r 1 h r i n 1 0 % g l y c e r o l / 0 . 1 2 5 M T r i s - H C I , pH 6 . 8 a n df o r 0 . 5 h r i n t h e s a m e b u f f e r p l u s 2 % N a D o d S O 4 . S t r i p s t h e nw e r e p o s i t i o n e d a c r o s s N a D o d S O 4 s t a c k i n g g e l s a n d a f t e re l e c t r o p h o r e s i s s e c t i o n s w e r e s t a i n e d t o d e t e r m i n e R F v a l u e s .U n s t a i n e d r e g i o n s c o r r e s p o n d i n g t o i / a n d w 1 w e r e e x c i s e d a n dm i n c e d , a n d p r o t e i n w a s e l e c t r o e l u t e d a t 5 0 0 V f o r 1 8 h r a t 4 Cw i t h 0 . 0 5 M T r i s / 0 . 3 8 M g l y c i n e / 0 . 1 % N a D o d S O 4 a t pH 8 . 8( c h a m b e r b u f f e r ) i n a n a p p a r a t u s c o n t a i n i n g a n A m i c o n P M 1 0m e m b r a n e ( 2 0 ) . E l u t e d m a t e r i a l w a s d i a l y z e d a g a i n s t d i s t i l l e dw a t e r , a n d N a D o d S O 4 w a s r e m o v e d a f t e r l y o p h i l i z a t i o n( 2 1 ) .C l e a v a g e o f P r o t e i n s i n S o l u t i o n w i t h D i l u t e A c i d a n dN B S . P u r i f i e d h i s t o n e H i s p e c i e s ( 1 4 ) , p u r i f i e d c o r e h i s t o n e s( k i n d l y d o n a t e d b y P e t e r L e w i s ) , a n d p u r i f i e d ( 4 1 + w ) 1 w e r ed i s s o l v e d i n 3 0 mM H C 1 a t 1 - 2 m g / m l , a n d s a m p l e s w e r e i n -c u b a t e d e i t h e r a t 1 0 5 C f o r 2 - 3 h r ( 2 2 ) o r a t 2 7 C f o r 1 0 m i ni n t h e p r e s e n c e o f 1 0 m o l o f N B S p e r m o l o f t y r o s i n e . N B St r e a t m e n t w a s t e r m i n a t e d b y a d d i t i o n o f 1 0 m o l o f t r y p t o p h a np e r m o l o f N B S .

RESULTSI d e n t i f i c a t i o n o f H i s t o n e H I - C o n t a i n i n g C r o s s l i n k e dP r o d u c t s . O u r a p p r o a c h t o i n v e s t i g a t e t h e t o p o g r a p h y o f t h e

i n t e r a c t i o n b e t w e e n h i s t o n e Hi a n d t h e h i s t o n e o c t a m e r f i r s tr e s t e d o n i d e n t i f y i n g h i s t o n e H i - c o n t a i n i n g p r o d u c t s p r o d u c e db y c r o s s l i n k i n g o f n u c l e i w i t h a w a t e r - s o l u b l e c a r b o d i i m i d e( E D A G ) . F o r t h i s p u r p o s e , w e l o o k e d f o r c r o s s l i n k e d p r o d u c t st h a t w e r e u n i q u e t o e l e c t r o p h o r e t i c f o r m s o f n u c l e o s o m e sk n o w n t o c o n t a i n h i s t o n e H 1 . I n t a c t n u c l e i - t h a t h a d b e e nc r o s s l i n k e d w i t h EDA C w e r e t r e a t e d w i t h m i c r o c o c c a l n u c l e a s et o q u a n t i t a t i v e l y d i g e s t t h e s p a c e r r e g i o n s b e t w e e n 1 6 0 - b a s ep a i r c o r e p a r t i c l e s ( 6 ) . A f t e r p r e p a r a t i o n o f t h e f r a g m e n t e dc h r o m a t i n , m a t e r i a l w a s s e p a r a t e d b y n u c l e o p r o t e i n g e l e l e c -t r o p h o r e s i s i n o n e d i m e n s i o n , a n d t h e n t h e p r o t e i n a n d DNAc o m p o n e n t s w e r e d i s p l a y e d b y p e r f o r m i n g e l e c t r o p h o r e s i s i na s e c o n d d i m e n s i o n i n a c i d / u r e a a n d N a D o d S O 4 s l a b g e l s , r e -s p e c t i v e l y ( F i g . 1 ) . B y p e r f o r m i n g t w o - d i m e n s i o n a l e l e c t r o -p h o r e s i s o n u n c r o s s l i n k e d n u c l e o s o m e c o m p o n e n t s , we h a v es h o w n ( 6 , 1 5 ) t h a t m o n o n u c l e o s o m e s a r e f r a c t i o n e d i n t o t h r e em a i n c l a s s e s , t e r m e d M I , M I I , a n d M I I I , a n d t h a t c l a s s e s M I a n dM I I l a c k h i s t o n e H i . A s s h o w n i n F i g . 1 , t h r e e p r o t e i n b a n d s ,t e r m e d ( 4 + w h ) , ( 1 + W ) 2 , a n d ( 4 f + W ) 4 , a r e a b s e n t f r o m M I a n dM I I , b u t a r e p r e s e n t a m o n g t h e o t h e r n u c l e o p r o t e i n s p e c i e s .W e s h o w b e l o w t h a t b a n d s ( 4 1 + w ) 1 , ( 1 + W ) 2 , a n d ( 4 + W ) 4 a r eb o n a f i d e h i s t o n e H i - c o n t a i n i n g c r o s s l i n k e d p r o d u c t s . T h e s es p e c i e s c a n n o t b e h i s t o n e H i - H i d i m e r s b e c a u s e M I I I p o s s e s s e so n l y o n e H1 m o l e c u l e ( 1 4 , 2 3 ) . I t c a n b e c o n c l u d e d f u r t h e r t h a tt h e g e n e r a t i o n o f ( 4 ' + w ) b a n d s b y c r o s s l i n k i n g m u s t b e a c o n -s e q u e n c e o f h i s t o n e H1 i n t e r a c t i o n s w i t h i n n u c l e o s o m e s a n dn o t b e t w e e n n u c l e o s o m e s . A s s h o w n i n F i g . 1 B , c o m p o n e n t st h a t m i g r a t e a s " d i " - a n d " t r i n u c l e o s o m e s " i n t h e f i r s t d i m e n -

A S t d. . . . .. . S (t )- ( V j + ( ) 21- b-( V + ( A ) ) 4

C,~~H 1 I

HH 3E H2BU H2A_ n H4

-340 b p

l160 b p-1 4 0 b p

UL J 1 1 1 1 I I I 13N 2 N i NF I G . 1 . L o c a t i o n o f h i s t o n e H i - c o n t a i n i n g c r o s s l i n k e d p r o d u c t s .I n t a c t n u c l e i w e r e t r e a t e d w i t h EDAC, w a s h e d , a n d t h e n d i g e s t e d w i t hm i c r o c o c c a l n u c l e a s e . R e s u l t i n g n u c l e o p r o t e i n c o m p l e x e s w e r e s e p -a r a t e d e l e c t r o p h o r e t i c a l l y i n t h e f i r s t d i m e n s i o n ( h o r i z o n t a l ) , a n d t h e ne l e c t r o p h o r e s i s w a s p e r f o r m e d i n a s e c o n d d i m e n s i o n ( v e r t i c a l ) i ne i t h e r a c i d / u r e a ( A ) o r N a D o d S O 4 ( B ) s l a b g e l s . S t a n d a r d s a r e i n -c l u d e d a t t h e r i g h t s i d e s o f t h e t w o - d i m e n s i o n a l g e l s . Roman n u m e r a l sI - I I I d e p i c t d i f f e r e n t e l e c t r o p h o r e t i c f o r m s o f m o n o n u c l e o s o m e s ,w h e r e a s 1 N , 2 N , a n d 3N c o r r e s p o n d t o r e g i o n s w h e r e m o n o - , d i - , a n dt r i n u c l e o s o m e s m i g r a t e . R e g i o n s a , b , a n d c d e p i c t d i f f u s e c r o s s l i n k e dp r o d u c t s t h a t a r e u n i q u e t o " o l i g o n u c l e o s o m e s " . b p , B a s e p a i r s .

s i o n a r e c o m p o s e d o f m o n o m e r - l e n g t h DN A f r a g m e n t s , i n d i -c a t i n g t h a t i n t e r n u c l e o s o m a l p r o t e i n c r o s s l i n k i n g o c c u r r e d t oa s i g n i f i c a n t e x t e n t i n t h e a b o v e e x p e r i m e n t a l r e g i m e . H o w e v e r ,t h e s e n u c l e o s o m e c o m p o n e n t s a r e n o t e n r i c h e d i n a n y p a r t i c u l a r( 4 + w ) b a n d c o m p a r e d t o o t h e r m a j o r p r o t e i n c o m p o n e n t s .T h e i n t r a n u c l e o s o m a l n a t u r e o f t h e H 1 c o n t a c t p o i n t s d e f i n e dh e r e h a s b e e n v e r i f i e d b y p e r f o r m i n g c r o s s l i n k i n g o n e n z y -m a t i c a l l y f r a g m e n t e d c h r o m a t i n , f o l l o w e d b y n u c l e o p r o t e i ng e l e l e c t r o p h o r e s i s a n d a c i d / u r e a g e l e l e c t r o p h o r e s i s i n a s e c o n dd i m e n s i o n . M o n o n u c l e o s o m e c l a s s M I I I a n d p o l y n u c l e o s o m e sp o s s e s s b a n d s ( 4 ' + w U ) a n d ( 4 / + W ) 2 ( n o t s h o w n ) . F u r t h e r a n a l y s i si n d i c a t e s t h a t b a n d ( 4 1 + W ) 4 i s a l s o p r e s e n t ( s e e b e l o w ) .D i f f e r e n t S e g m e n t s o f t h e N H 2 - T e r m i n a l H a l v e s o f H i s -t o n e H I M o l e c u l e s S p e c i f i c a l l y C o n t a c t N u c l e o s o m e s . I no r d e r t o d e t e r m i n e t h e h o m o g e n e i t y a n d a p p a r e n t m o l e c u l a rw e i g h t s o f ( 4 1 + w ) b a n d s , p r o t e i n s w e r e s e p a r a t e d b y a c i d / u r e ag e l e l e c t r o p h o r e s i s i n o n e d i m e n s i o n , a n d t h e n e l e c t r o p h o r e s i si n a s e c o n d d i m e n s i o n w a s p e r f o r m e d i n t h e p r e s e n c e o f N a -D o d S O 4 . F i g . 2 A a n d D s h o w t h e r e s u l t i n g t w o - d i m e n s i o n a lp a t t e r n s o f a c i d - s o l u b l e p r o t e i n s p r e p a r e d f r o m E D A C - t r e a t e d ,e n z y m a t i c a l l y f r a g m e n t e d c h r o m a t i n a n d i n t a c t n u c l e i , r e -s p e c t i v e l y . B a n d ( 4 1 + w ) l , w h i c h i s a p r e d o m i n a n t p r o d u c t o fb o t h c h r o m a t i n a n d n u c l e i c r o s s l i n k i n g r e a c t i o n s , w a s f r a c -t i o n a t e d i n t o t w o b a n d s , t e r m e d i 1 1 a n d w i , a f t e r e l e c t r o p h o r e s i si n t h e p r e s e n c e o f N a D o d S O 4 ( F i g . 2 A a n d D ) . A s i m i l a r s e p -a r a t i o n o f o t h e r ( 4 ' + w ) b a n d s i n t o d o u b l e t s a l s o s e e m s t o o c c u ru p o n e l e c t r o p h o r e s i s i n t h e s e c o n d d i m e n s i o n ( h e n c e t h e n o -m e n c l a t u r e ) . I t i s n o t e w o r t h y t h a t d i f f e r e n t ( 4 1 + w ) b a n d s e a c h

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 7 ( 1 9 8 0 )

%.*W -d

8/7/2019 BOULIKAS, T. et al 1979

3/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 7 ( 1 9 8 0 ) 1 2 9_ . - A c i d u r e a

IAt 2 ? 3 40 my I I t0ooa 2 a

c o r e h i s x

A/ H i Aa ,PHI "

t o n e d i m e r s / H 3/ H 2 sH4-,

1 2 4

, H I A_f H i Bcore h i s t o n e d i m e r s H3

4 4 /H4/

B

D

A 2 s

E

F

--

F I G . 2 . N H 2 - t e r m i n a l h a l v e s o f h i s t o n e H1 m o l e c u l e s p a r t i c i p a t ei n c r o s s l i n k i n g . A c i d - s o l u b l e p r o t e i n p r e p a r e d f r o m E D A C - t r e a t e de n z y m a t i c a l l y f r a g m e n t e d c h r o m a t i n o r i n t a c t n u c l e i w a s s e p a r a t e db y a c i d / u r e a g e l e l e c t r o p h o r e s i s i n o n e d i m e n s i o n , a n d s o d i u m d o d e c y ls u l f a t e g e l e l e c t r o p h o r e s i s w a s p e r f o r m e d i n t h e s ec o n d d i m e n s i o ni n t h e p r e s en c e o r a b s e n c e o f a - c h y m o t r y p s i n . ( A a n d B ) P r o t e i n s o fE D A C - t r e a t e d e n z y m a t i c a l l y f r a g m e n t e d c h r o m a t i n i n t h e a b s e n c eo r p r e s e n c e , r e s p e c t i v e l y , o f a - c h y m o t r y p s i n . ( C ) S c h e m a t i c d i a g r a mo f B . ( D a n d E ) P r o t e i n s o f E D A C - t r e a t e d i n t a c t n u c l e i i n t h e a b s e n c eo r p r e s e n c e , r e s p e c t i v e l y , o f a - c h y m o t r y p s i n . ( F ) S c h e m a t i c d i a g r a mo f E . T h e d i a g r a m s d e p i c t a - c h y m o t r y p s i n a n d i t s a u t o l y s i s p r o d u c t sa s t r a n s v e r s e l i n e s a n d c r o s s - h a t c h e d a r e a s , r e s p e c t i v e l y . H i s t o n e H1p e p t i d e n o m e n c l a t u r e : 1 A - a C h y m ( l ) , s e g m e n t o f HiA c o n s i s t i n g o fa m i n o a c i d s f r o m a m i n o a c i d - 1 0 7 t o t h e C O O H t e r m i n u s ( 1 0 7 -C O O H - t e r m i n a l s e g m e n t ) ; 1 B - a C h y m ( l ) , t 0 7 - C O O H - t e r m i n a ls e g m e n t o f H 1 B ; 1 A , B - a C h y m ( 2 ) , s e g m e n t s o f Hi A a n d Hi B c o n -t a i n i n g a m i n o a c i d s 1 - 1 0 6 .p o s s e s s a p p a r e n t m o l e c u l a r w e i g h t s i n a c c o r d w i t h t h o s e p r e -d i c t e d f o r h i s t o n e H i - c o r e h i s t o n e d i m e r s . P e p t i d e m a p p i n ge x p e r i m e n t s d e m o n s t r a t e t h a t b a n d s I ' a n d w , c o n t a i n a s o n ec o m p o n e n t h i s t o n e s HiA a n d H 1 B , r e s p e c t i v e l y ( n o t s h o w n ) .T h u s , i t s e e m s l i k e l y t h a t , d u r i n g e l e c t r o p h o r e s i s i n a c i d / u r e ag e l s , H i - c o r e h i s t o n e d i m e r s a r e f r a c t i o n a t e d f r o m e a c h o t h e rb e c a u s e o f t h e i r c o m p o n e n t c o r e h i s t o n e a n d c o n f o r m a t i o n ,w h e r e a s , d u r i n g e l e c t r o p h o r e s i s i n t h e p r e s e n c e o f N a D o d S O 4 ,s u c h c o m p o n e n t s a r e s e p a r a t e d i n t o d o u b l e t s b e c a u s e o f m o -l e c u l a r w e i g h t d i f f e r e n c e s i n h i s t o n e H i s u b f r a c t i o n s .I n o r d e r t o d e t e r m i n e w i t h i n h i s t o n e H i p r i m a r y s t r u c t u r ew h i c h s e g m e n t s p a r t i c i p a t e i n c r o s s l i n k i n g , we h a v e t a k e na d v a n t a g e o f a u n i q u e i n i t i a l c l e a v a g e s i t e f o r a - c h y m o t r y p s i na t , o r n e a r , p h e n y l a l a n i n e - 1 0 6 i n b o v i n e t h y m u s h i s t o n e H is p e c i e s ( 2 4 , 2 5 ) . A f t e r c l e a v a g e w i t h a - c h y m o t r y p s i n , h i s t o n e sHI A a n d HIB y i e l d d i f f e r e n t - l e n g t h C O O H - t e r m i n a l h a l fm o l e c u l e s b u t c o m m o n - l e n g t h N H 2 - t e r m i n a l f r a g m e n t s ( 2 4 ) .A f t e r a c i d / u r e a g e l e l e c t r o p h o r e s i s , s a m p l e s w e r e d i g e s t e d w i t ha - c h y m o t r y p s i n i n s e c o n d - d i m e n s i o n N a D o d S O 4 s t a c k i n g g e l sp r i o r t o p e r f o r m i n g e l e c t r o p h o r e t i c s e p a r a t i o n . A s s h o w n i n F i g .2 B , C , E , a n d F , t h e c l e a v a g e p a t t e r n s g e n e r a t e d f o r b a n d s( V I + c W ) , ( ) t + w O ) 2 , a n d ( t + W ) 4 a r e s i m i l a r i n t h a t t h e d i f f e r e n t -l e n g t h , C O O H - t e r m i n a l h a l v e s o f h i s t o n e s H i A a n d HI B w e r er e l e a s e d [ F i g . 2 C a n d F ; i A a C h y m ( l ) a n d I B - a C h y m ( l ) ] .[ H i s t o n e H I p e p t i d e s h a v e n o t b e e n o b s e r v e d f o r b a n d ( i V + w ) 3 ,

a c o m p o n e n t g e n e r a t e d i n c h r o m a t i n , b u t n o t n u c l e i , c r o s s -l i n k i n g e x p e r i m e n t s . ] B e c a u s e c h y m o t r y p t i c d i g e s t i o n o f b a n d s( t ' + W ) 1 , ( 4 t + w ) 2 , a n d ( 1 t + C ) 4 r e l e a s e s i n t a c t C O O H - t e r m i n a lp e p t i d e s i d e n t i c a l t o t h o s e l i b e r a t e d f r o m HI A a n d H I B , w ec o n c l u d e t h a t t h e N H 2 - t e r m i n a l h a l v e s o f H1 s u b f r a c t i o n s a r ei n v o l v e d i n c o n t a c t s w i t h o t h e r p r o t e i n s .I n o r d e r t o o b t a i n m o r e d e t a i l e d i n f o r m a t i o n w i t h r e g a r d t ot h e s e g m e n t s w i t h i n t h e N H 2 - t e r m i n a l h a l v e s o f h i s t o n e H1m o l e c u l e s t h a t p a r t i c i p a t e i n c r o s s l i n k i n g , w e h a v e t a k e n a d -v a n t a g e o f a u n i q u e NBS c l e a v a g e s i t e a t , o r n e a r , t y r o s i n e - 7 2i n b o v i n e t h y m u s h i s t o n e H1 m o l e c u l e s ( 2 5 ) . A c i d - s o l u b l ep r o t e i n s p r e p a r e d f r o m E D A C - t r e a t e d i n t a c t n u c l e i w e r es e p a r a t e d i n o n e d i m e n s i o n b y u s i n g t h e a c i d / u r e a s y s t e m , t h eg e l w a s t r e a t e d w i t h N B S , a n d a s e c o n d d i m e n s i o n o f e l e c t r o -p h o r e s i s w a s e m p l o y e d i n t h e p r e s e n c e o f N a D o d S O 4 t o d i s p l a yt h e r e s u l t i n g c l e a v a g e p r o d u c t s . A s s h o w n i n F i g . 3 ( p a i r s o fa r r o w s ) , t h e d i f f e r e n t - l e n g t h C O O H - t e r m i n a l s e g m e n t s o fh i s t o n e s HiA a n d H1B w e r e r e l e a s e d f r o m b a n d s ( 4 I + C O ) 2 a n d( t + C O ) 4 . T h e r e f o r e , w e c o n c l u d e t h a t t h e s e s p e c i e s a r e c o m -p o s e d o f t h e N H 2 - t e r m i n a l s e c t i o n s ( a m i n o a c i d s 1 - 7 2 ) o f h i s -t o n e H1 c o m p o n e n t s c r o s s l i n k e d t o o t h e r p r o t e i n s . I n m a r k e dc o n t r a s t , u p o n NBS c l e a v a g e o f ( t + w ) j o n l y t r a c e s o f t h eC O O H - t e r m i n a l s e g m e n t s o f h i s t o n e s H1A a n a d H1B w e r el i b e r a t e d , b u t a p e p t i d e ( s ) w a s g e n e r a t e d t h a t p o s s e s s e d a ne l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t y s i m i l a r t o t h a t o f N H 2 - t e r m i n a l H1f r a g m e n t s ( F i g . 3 , a r r o w ) . R e s u l t s i d e n t i c a l t o t h e s e a r e o b t a i n e du p o n NBS t r e a t m e n t o f ( t + 4 c ) d e r i v e d f r o m E DA C - t r ea t e d ,e n z y m a t i c a l l y f r a g m e n t e d c h r o m a t i n ( n o t s h o w n ) . T h e r e f o r e ,f o r b a n d ( 4 t + w ) i we c o n c l u d e t h a t , a t a m i n i m u m , t h e 7 3 -C O O H - t e r m i n a l s e g m e n t s o f h i s t o n e H 1 s p e c i e s m u s t p a r t i c i -p a t e i n c r o s s l i n k i n g .F i n e S t r u c t u r e A n a l y s i s o f B a n d ( # P + w ) j . F r o m t h e f o l -

I ( 4

/

H l A

~ WIA.NBS(I )1B N B S ( t )H3r _, ~ H 2

I A , B * N B S ( 2 )

F I G . 3 . M a p p i n g s e g m e n t s w it h i n t h e N H 2 - t e r m i n a l h a l v e s o fh i s t o n e H1 m o l e c u l e s t h a t p a r t i c i p a t e i n c r o s s l i n k i n g . A c i d - s o l u b l ep r o t e i n s o f E D A C - t r e a t e d i n t a c t n u c l e i w e r e s e p a r a t e d b y a c i d / u r e ag e l e l e c t r o p h o r e s i s i n t h e f i r s t d i m e n s i o n a n d N a D o d S O 4 g e l e l e c -t r o p h o r e s i s w a s p e r f o r m e d i n t h e s e c o n d d i m e n s i o n a f t e r NB St r e a t m e n t . H i s t o n e H1 p e p t i d e n o m e n c l a t u r e : I A - N B S ( 1 ) , 7 3 -C O O H - t e r m i n a l s e g m e n t o f H 1 A ; 1 B - N B S ( l ) , 7 3 - C O O H - t e r m i n a ls e g m e n t o f H i B ; 1 A , B - N B S ( 2 ) , s e g m e n t s o f H1A a n d HlB c o n t a i n i n ga m i n o a c i d s 1 - 7 2 .

B i o c h e m i s t r y : B o u l i k a s e t a l .

, i i : 3 1 1 1 0MW I q R P - ' '- W-I Z - N W - . d i i m m u -

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1 3 0 B i o c h e m i s t r y : B o u l i k a s e t a l .l o w i n g l i n e s o f e v i d e n c e , we c o n c l u d e t h a t ( t + w ) l i s a d i m e rc o m p o s e d o f h i s t o n e s H i a n d H 2 A : ( i ) T h e r e s u l t s o f a m i n o a c i da n a l y s i s s u g g e s t t h a t H I - H 2 A i s t h e m o s t l i k e l y c o m p o s i t i o nf o r b a n d ( / + w ) I ( n o t s h o w n ) . ( i i ) H 1 a n d H 2 A . 1 a r e t h e o n l yh i s t o n e s p e c i e s t h a t l a c k m e t h i o n i n e , a n d f r o m 7 8 t o 9 0 % o fb a n d ( 4 1 + w ) , i s r e s i s t a n t t o a 2 4 - h r t r e a t m e n t w i t h a 2 0 0 0 - m o le x c e s s o f c y a n o g e n b r o m i d e ( n o t s h o w n ) . H i s t o n e H 2 A . 2 , w h i c hc o n t a i n s m e t h i o n i n e , c o m p r i s e s 1 8 % o f t h e t o t a l H2A o f b o v i n et h y m u s ( 2 6 ) . ( i i i a n d i v ) A f t e r c l e a v a g e o f ( 4 1 + w ) 1 a t t y r o s i n eo r a s p a r t i c a c i d r e s i d u e s , H 2 A - s p e c i f i c p e p t i d e s a r e r e l e a s e d( s e e b e l o w ) . ( v ) A f t e r t h i s w o r k w a s c o m p l e t e d , B o n n e r a n dS t e d m a n ( 2 7 ) d e m o n s t r a t e d b y f i n g e r p r i n t i n g a n a l y s i s t h a tE D A C t r e a t m e n t o f c u l t u r e d m o u s e c e l l n u c l e i g e n e r a t e sH1-H2A d i m e r s t h a t b e h a v e e l e c t r o p h o r e t i c a l l y i d e n t i c a l t ob a n d s i 6 , a n d w i . T h u s , b a n d s 1 ' i a n d w 1 a r e H1A-H2A a n dH 1 B - H 2 A d i m e r s , r e s p e c t i v e l y .I n o r d e r t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e s e g m e n t s o f h i s t o n e H Is p e c i e s c o n t a i n i n g a m i n o a c i d s 1 - 7 2 a l s o p a r t i c i p a t e i n c r o s s -l i n k i n g a n d t o a s c e r t a i n w h i c h s e g m e n t s o f H2A e n g a g e i nc r o s s l i n k i n g , b a n d ( t + w ) 1 w a s p u r i f i e d b y p r e p a r a t i v e t w o -d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s ( F i g . 4 A , l a n e b ) . I t s p r o d u c t s o fc h e m i c a l c l e a v a g e w e r e t h e n c o m p a r e d w i t h t h o s e o f e a c h o ft h e f i v e p u r i f i e d h i s t o n e s p e c i e s b y N a D o d S O 4 s l a b g e l e l e c -t r o p h o r e s i s . F o r p u r p o s e s o f s i m p l i c i t y , o n l y c l e a v a g e p r o d u c t so f H i , ( i t + w ) i , a n d H2A a r e d e p i c t e d h e r e ( F i g . 4 B - D ) .N H 2 - t e r m i n a l s e g m e n t s o f H i s p e c i e s w e r e r e l e a s e d f r o m( / + w ) 1 a f t e r t r e a t m e n t w i t h NBS a t 2 7 C o r w i t h 3 0 mM H O 1a t 1 0 5 0 C ( F i g . 4 B a n d C , a r r o w s ) . T h e s e p r o c e d u r e s c l e a v e dH i s p e c i e s a t t y r o s i n e - 7 2 ( 2 5 ) a n d p r e f e r e n t i a l l y a t a s p a r a t e - 7 3( F i g . 4 D ) , r e s p e c t i v e l y . T r a c e s o f t h e 7 3 - C O O H - t e r m i n a ls e g m e n t s o f H I m o l e c u l e s w e r e a l s o r e l e a s e d b y NBS t r e a t m e n t( F i g . 4 B ) , i n d i c a t i n g t h a t m i c r o h e t e r o g e n e i t y e x i s t s i n c r o s s -l i n k i n g s i t e s . N e v e r t h e l e s s , i t c a n b e c o n c l u d e d t h a t t h e 7 4 -C O O H - t e r m i n a l s e g m e n t s o f H I m o l e c u l e s p a r t i c i p a t e p r i n -c i p a l l y i n c r o s s l i n k i n g . B e c a u s e t h e 1 0 7 - C O O H - t e r m i n a l s e g -m e n t s o f H i m o l e c u l e s w e r e r e l e a s e d f r o m ( i + w ) 1 a f t e rt r e a t m e n t w i t h a - c h y m o t r y p s i n ( F i g . 2 ) , i t i s c o n c l u d e d f u r t h e rt h a t o n l y t h e s e g m e n t s o f HI s p e c i e s c o n t a i n i n g a m i n o a c i d s7 4 - 1 0 6 b e c o m e p r e d o m i n a n t l y c r o s s l i n k e d t o h i s t o n e H 2 A .N H 2 - t e r m i n a l s e g m e n t s o f t h e H2A m o l e c u l e w e r e a l s o r e -l e a s e d f r o m ( 4 ' + w ) , a f t e r t r e a t m e n t w i t h NBS ( F i g . 4 B , a s t e r -i s k s ) , w h i c h c l e a v e s H2A a t t y r o s i n e s 3 9 , 5 0 , a n d 5 7 ( 2 8 ) . H2Ap e p t i d e c o n t a i n i n g a m i n o a c i d s 5 8 - 1 2 9 w a s n o t l i b e r a t e d .T h e r e f o r e , i t i s c o n c l u d e d t h a t t h e C O O H - t e r m i n a l h a l f o f H2Ap a r t i c i p a t e s i n c r o s s l i n k i n g . B y a n a n a l y s i s o f t h e h i g h e r m o -l e c u l a r w e i g h t p r o d u c t s o f NBS c l e a v a g e o f ( 4 ' + o ) l , t h i s c o n -c l u s i o n i s p e r s u a s i v e l y r e i n f o r c e d . T h e l i m i t p r o d u c t s o f NBSc l e a v a g e o f ( i + c o ) 1 a r e t w o m a j o r b a n d s t h a t p o s s e s s a p p a r e n tm o l e c u l a r w e i g h t s c l o s e t o , b u t n o t i d e n t i c a l w i t h , i n t a c t h i s t o n eH i s p e c i e s ( F i g . 4 B ) . T h e s e l i m i t p r o d u c t s m u s t c o n s i s t o f h i s -t o n e H i m o l e c u l e s t h a t h a v e l o s t t h e i r 7 2 - a m i n o a c i d - l o n gN H 2 - t e r m i n a l s e g m e n t s b u t h a v e g a i n e d a p e p t i d e p r e c i s e l y7 2 a m i n o a c i d s l o n g b y v i r t u e o f p o s s e s s i n g t h e C O O H - t e r m i n a lh a l v e s o f H2A m o l e c u l e s . C l e a v a g e o f ( i , 6 + w ) , a t a s p a r t i c a c i d( o r a s p a r a g i n e ) r e s i d u e s ( 2 2 ) a l s o r e l e a s e d a H 2 A - s p e c i f i cp e p t i d e ( F i g . 4 C , a s t e r i s k ) .I n c o n c l u s i o n , b y t w o i n d e p e n d e n t c l e a v a g e t e c h n i q u e s w eh a v e s h o w n t h a t h i s t o n e H2A i s t h e c o r e h i s t o n e c o m p o n e n t o fb a n d ( 4 1 + w ) i a n d t h a t t h e N H 2 - t e r m i n a l s e g m e n t s o f h i s t o n eH i s p e c i e s d o n o t s i g n i f i c a n t l y p a r t i c i p a t e i n c r o s s l i n k i n g . I ts h o u l d b e n o t e d t h a t n e a r l y i d e n t i c a l NBS a n d a s p a r t a t ec l e a v a g e r e s u l t s a r e o b t a i n e d w h e t h e r ( 1 O + w h ) I i s p r e p a r e d f r o mc r o s s l i n k e d i n t a c t n u c l e i o r f r o m c h r o m a t i n t h a t i s c r o s s l i n k e da f t e r n u c l e a s e d i g e s t i o n . T h e r e f o r e , HI-H2A c o n t a c t s m a i n t a i nt h e m s e l v e s a t t h e s u b m o l e c u l a r l e v e l d u r i n g v a r i o u s i n v i t r om a n i p u l a t i o n s , i n d i c a t i n g t h a t s u c h i n t e r a c t i o n s a r e a h i g h l ys i g n i f i c a n t s t r u c t u r a l f e a t u r e o f c h r o m a t i n .

A a b

Hl A - - -

H 2 B aH2A -H4

H i ( 4 p + r , ) ) . H 2 )

A H C 1 (1)-1H 1 B -1 B - H C I (1)- w I1 A B ' H C I ( 2 ) -

,-, / 2 A-2Ae o - 2A2 /- 2 ,

H 2 A ( y l + ) . HiB

H 1 A'. ~ H 1 AHiB- 1 A N B S ( 1 )-1B-NBS ( 1 )58-129 1 A , B - N B S ( 2 )1-50.57- ,1-39-~

AD abc

\iHCI( 3 )V H C 0 ( 4 ) 4 - 1 B H C I ( 2 )A H C I ( 5 )F I G . 4 . A n a l y s i s o f t h e f i n e s t r u c t u r e o f b a n d ( w + w ) 1 . ( A ) L a n e s :a , h i s t o n e s t a n d a r d ; b , p u r i f i e d ( # + 0 ) 1 d e r i v e d f r o m E D A C - t r e a t e di n t a c t n u c l e i . ( B ) N B S - t r e a t e d H 2 A , n u c l e a r - d e r i v e d ( 4 1 + w ) 1 , a n d H I .( S e e F i g . 3 f o r H1 p e p t i d e n o m e n c l a t u r e . ) ( C ) A c i d c l e a v a g e o f H 2 A ,d i g e s t e d c h r o m a t i n - d e r i v e d ( 0 t + 0 ) 1 , a n d H 1 ; ( D ) L a n e s : a a n d c , a c i dc l e a v a g e o f t o t a l H1 o r H i B , r e s p e c t i v e l y ; b , N B S - t r e a t e d t o t a l H i .H i s t o n e H1 a c i d c l e a v a g e p e p t i d e n o m e n c l a t u r e : i A - H C l ( i ) , 7 4 -C O O H - t e r m i n a l s e g m e n t o f H i A ; I B - H C l ( l ) , 7 4 - C O O H - t e r m i n a ls e g m e n t o f H i B ; a n d 1 A , B - H C l ( 2 ) s e g m e n t s o f HiA a n d H i B c o n -t a i n i n g a m i n o a c i d s 1 - 7 2 . P e p t i d e s d e s i g n a t e d H 2 A ( 1 - 3 9 ) , 1 A , B .N B S ( 2 ) , a n d 2 A - H C 1 ( 3 ) a r e u n i q u e t o t h e s e h i s t o n e s ( n o t s h o w n ) .

DISCUSSIONA f t e r c o m p l e t i o n o f t h i s w o r k , B o n n e r a n d S t e d m a n ( 2 7 ) r e -p o r t e d t h a t EDAC t r e a t m e n t o f e i t h e r i n t a c t n u c l e i o r i s o l a t e dn u c l e o s o m e s o f c u l t u r e d m o u s e c e l l s g e n e r a t e s H I - H 2 A a n dH 1 - A 2 4 d i m e r s . B e c a u s e b o v i n e a n d mouse n u c l e o s o m e sc o n t a i n d i f f e r e n t p r o p o r t i o n s o f c o r e h i s t o n e v a r i a n t s ( 2 6 ) , i tc a n b e c o n c l u d e d t h a t c o n t a c t ( s ) b e t w e e n h i s t o n e s H 1 a n d H2Aa r e g e n e r a l s t r u c t u r a l f e a t u r e s o f m a m m a l i a n c h r o m o s o m eo r g a n i z a t i o n . A l t h o u g h w e h a v e n o t s t u d i e d H 1 c r o s s l i n k i n g t oA 2 4 , w e h a v e s h o w n e l s e w h e r e t h a t H 1 w i l l b i n d t o b o v i n en u c l e o s o m e s t h a t p o s s e s s t h i s p r o t e i n ( 1 4 ) .T h e m a j o r f i n d i n g s o f t h i s r e p o r t a r e t h e e l u c i d a t i o n o f t h es e g m e n t s w i t h i n t h e p r i m a r y s t r u c t u r e s o f h i s t o n e s H 1 a n d H2At h a t p a r t i c i p a t e i n c r o s s l i n k i n g . I n a d d i t i o n , w e h a v e i d e n t i f i e dt w o o t h e r h i s t o n e H 1 c o n t a c t p o i n t s w i t h n u c l e o s o m a l p r o t e i n s .O u r r e s u l t s d e m o n s t r a t e t h a t d i s c r e t e s e g m e n t s o f h i s t o n e H 1m o l e c u l e s p a r t i c i p a t e i n i n t r a n u c l e o s o m a l c a r b o d i i m i d e - c a t -a l y z e d c r o s s l i n k i n g r e a c t i o n s . T h e s e a n d o t h e r r e l a t e d f i n d i n g s ,t a k e n t o g e t h e r w i t h t h e d e t a i l e d s t r u c t u r a l i n f o r m a t i o n o n H 1s p e c i e s t h a t h a s b e e n a c c r u e d b y t h e l a b o r a t o r i e s o f B r a d b u r y( 2 9 ) a n d C o l e ( 3 0 ) , p e r m i t u s t o p r o p o s e a m o d e l f o r h o w HIm i g h t b e o r g a n i z e d a l o n g p o l y n u c l e o s o m e c h a i n s .P r i m a r y s t r u c t u r e a n d s o l u t i o n c o n f o r m a t i o n d a t a i n d i c a t et h a t H 1 m o l e c u l e s a r e c o m p o s e d o f t h r e e d i s c r e t e s t r u c t u r a l

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 7 ( 1 9 8 0 )

8/7/2019 BOULIKAS, T. et al 1979

5/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 7 ( 1 9 8 0 ) 1 3 1H 1 s t r u c t u r a l d o m a i n s

3 9116P o s s i b l e a r r a n g e m e n t o f H I a l o n g p o l y n u c l e o s o m e s

F I G . 5 . HI s t r u c t u r a l d o m a i n s a n d p o s s i b l e a r r a n g e m e n t o f HIa l o n g p o l y n u c l e o s o m e s . T h e m o d e l d e p i c t s t h r e e n u c l e o s o m e s , e a c ha s 1 1 0 - A - d i a m e t e r d i s c s ( 7 , 3 1 ) l y i n g f a c e d o w n , w i t h o n l y o n e o f t h et wo t u r n s o f DNA v i s i b l e p e r p a r t i c l e .d o m a i n s ( 2 9 , 3 0 ) . T h e s e d o m a i n s a r e d e p i c t e d s c h e m a t i c a l l yi n F i g . 5 a n d c o n s i s t o f t h e f o l l o w i n g : ( i ) A r a n d o m c o i l , b a s i cN H 2 - t e r m i n a l s e g m e n t t h a t e n c o m p a s s e s r e s i d u e s 1 - 3 9 ( + 4 ) .( i i ) A c e n t r a l g l o b u l a r r e g i o n t h a t e x t e n d s f r o m r e s i d u e s 3 9 ( 4 )t o 1 1 6 ( 4 ) . T h i s s e g m e n t i s r i c h i n a p o l a r r e s i d u e s a n d c o n t a i n smost o f t h e a c i d i c r e s i d u e s o f t h e e n t i r e m o l e c u l e . From i t sm o l e c u l a r w e i g h t a n d p a r t i a l s p e c i f i c v o l u m e ( 2 9 ) , wee s t i m a t et h a t t h i s r e g i o n w o u l d p o s s e s s a d i a m e t e r o f a b o u t 2 8 A i f i t w e r es p h e r i c a l . ( i i i ) A h i g h l y b a s i c , r a n d o m c o i l C O O H - t e r m i n a l h a l ft h a t c o n t a i n s a p p r o x i m a t e l y 4 0 m o l % o f l y s i n e . T h i s s e g m e n tb i n d s as s t r o n g l y t o p u r i f i e d D N A as d o e s i n t a c t HI ( 2 4 ) .O u r f i n d i n g s s h o w t h a t d i f f e r e n t s e g m e n t s o f t h e N H 2 - t e r -m i n a l h a l v e s o f h i s t o n e Hi s p e c i e s a r e i n e l e c t r o s t a t i c c o n t a c tw i t h n u c l e o s o m a l p r o t e i n s ( F i g s . 3 a n d 4 ) . A l t h o u g h t h i s mayr e f l e c t h e t e r o g e n e i t y i n t h e o r g a n i z a t i o n o f h i s t o n e Hi i nc h r o m a t i n , we f a v o r t h e n o t i o n t h a t Hi m o l e c u l e s a re o r g a n i z e dr e a s o n a b l y u n i f o r m l y a n d t h a t d i f f e r e n t r e g i o n s w i t h i n t h eN H 2 - t e r m i n a l h a l v e s o f Hi s p e c i e s h a v e d i f f e r e n t c r o s s l i n k i n ge f f i c i e n c i e s . T h e m a j o r p o i n t s o f Hi c o n t a c t w i t h t h e h i s t o n eo c t a m e r d e f i n e d h e r e e n c o m p a s s a m i n o a c i d r e s i d u e s 7 4 : 1 0 6( F i g s . 2 a n d 4 ) , a s e g m e n t t h a t r e s i d e s w i t h i n t h e 2 8 - A g l o b u l a rs t r u c t u r a l d o m a i n ( F i g . 5 ) , a n d a segment w h o s e a m i n o a c i ds e q u e n c e h a s b e e n c o n s e r v e d d u r i n g e v o l u t i o n ( 3 0 ) . T h e m i n o rp o i n t s o f h i s t o n e Hi c o n t a c t w i t h n u c l e o s o m a l p r o t e i n s , w h i c he n c o m p a s s r e s i d u e s 1 - 7 2 , may a l s o r e s i d e i n t h i s d o m a i n .X - r a y d i f f r a c t i o n a n d n e u t r o n s c a t t e r i n g d a t a i n d i c a t e t h a tn u c l e o s o m e c o r e p a r t i c l e s a r e d i s c l i k e s t r u c t u r e s w i t h a p p r o x-i m a t e d i m e n s i o n s o f 1 1 0 X 1 1 0 X 5 7 A ( 7 , 3 1 ) . When c h r o m a t i ni s s p r e a d on e l e c t r o n m i c r o s c o p e g r i d s , a " z i g - z a g " c o n f i g u r a t i o no f d i s c s i s o b s e r v e d , w i t h s u c c e s s i v e p a r t i c l e s a l o n g p o l y n u -c l e o s o m e c h a i n s l y i n g on a l t e r n a t e s i d e s o f s p a c e r DNA a n d w i t ht h e p o i n t s o f e n t r y a n d e x i t o f s p a c e r DNA f r o m p a r t i c l e s b e i n ga p p a r e n t l y c o i n c i d e n t ( 3 2 , 3 3 ) . T h e s c h e m a t i c m o d e l s h o w n i nF i g . 5 i n c l u d e s t h i s i n f o r m a t i o n , a l o n g w i t h a p o s s i b l e a r -r a n g e m e n t o f h i s t o n e H i .B e c a u s e we h a v e no e v i d e n c e f o r t h e h i g h l y b a s i c , C O O H -t e r m i n a l h a l v e s o f Hi s p e c i e s b e i n g p r o x i m a l t o t h e h i s t o n eo c t a m e r ( F i g . 2 ) , we p r o p o s e h e r e ( F i g . 5 ) t h a t t h e s e segmentsi n t e r a c t w i t h a b o u t 2 0 b a s e p a i r s o f s p a c e r DNA on t h e e x i t s i d eo f n u c l e o s o m e cores t h a t p o s s e s s two t u r n s o f D N A ( 7 ) a n d a b o u t1 6 0 b a s e p a i r s ( 6 ) . W e p r o p o s e f u r t h e r t h a t t h e l e s s b a s i cN H 2 - t e r m i n a l s e g m e n t s o f Hi s p e c i e s i n t e r a c t w i t h a b o u t 1 0b a s e p a i r s o f sp a c e r D N A n e a r i t s p o i n t o f e n t r y t o n u c l e o s o m e

c o r e s ( F i g . 5 ) . T h i s arrangement o f HI l o c a l i z e s t h e g l o b u l a rd o m a i n p r o x i m a l t o t h e h i s t o n e o c t a m e r i n a D N A r e g i o n o f

m a x i m a l s u p e r h e l i c a l d e n s i t y . I n t h i s r e g a r d , S i n g e r a n d S i n g e r( 2 5 ) h a v e s h o w n t h a t t h e g l o b u l a r r e g i o n o f H i i s n e c e s s a r y f o re i t h e r t h e N H 2 - o r C O O H - t e r m i n a l h a l v e s t o b i n d p r e f e r e n -t i a l l y t o s u p e r h e l i c a l D N A . I n a d d i t i o n , o u r m o d e l p o s i t i o n ss u c c e s s i v e h i s t o n e H I m o l e c u l e s i n a " h e a d - t o - t a i l " f a s h i o n .T h i s i n v e s t i g a t i o n w a s s u p p o r t e d b y a g r a n t ( G M 2 2 2 0 1 - 0 5 ) f r o m t h eN a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h a n d b y a g r a n t f r o m t h e N a t i o n a l F o u n -d a t i o n - M a r c h o f D i m e s .

1 . S m a r t , J . E . & B o n n e r , J . ( 1 9 7 1 ) J . M o l . B i o l . 5 8 , 6 7 5 - 6 8 4 .2 . B r a d b u r y , E . M . , C a r p e n t e r , B . G . & R a t t l e , H . W. E . ( 1 9 7 3 )N a t u r e ( L o n d o n ) 2 4 1 , 1 2 3 - 1 2 6 .3 . T h o m a , F . & K o l l e r , T . ( 1 9 7 7 ) C e l l 1 2 , 1 0 1 - 1 0 7 .4 . M u l l e r , V . , Z e n t g r a f , H . , E i c k e n I . & K e l l e r , W. ( 1 9 7 8 ) S c i e n c e2 0 1 , 4 0 6 - 4 1 5 .5 . K o r n b e r g , R . D . ( 1 9 7 7 ) A n n u . R e v . B i o c h e m . 4 6 , 9 3 1 - 9 5 4 .6 . T o d d , R . D . & G a r r a r d , W. T . ( 1 9 7 7 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 2 ,4 7 2 9 - 4 7 3 8 .7 . F i n c h , J . T . , L u t t e r , L . C . , R h o d e s , D . , B r o w n , R . S . , R u s h t o n , B . ,L e v i t t , M . & K l u g , A . ( 1 9 7 7 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 6 9 , 2 9 - 3 6 .8 . C h a p m a n , G . E . , H a r t m a n , P . G . & B r a d b u r y , E . M . ( 1 9 7 6 ) E u r .J . B i o c h e m . 6 1 , 4 5 - 5 1 .9 . B i n a - S t e i n , M . & S i n g e r , M . F . ( 1 9 7 7 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 4 ,1 1 7 - 1 2 7 .1 0 . W o r c e l , A . & B e n y a j a t i , C . ( 1 9 7 7 ) C e l l 1 2 , 8 3 - 1 0 0 .1 1 . F u l m e r , A . W . & F a s m a n , G . D . ( 1 9 7 9 ) B i o c h e m i s t r y 1 8 , 6 5 9 -6 6 8 .1 2 . H a r d i s o n , R . C . , Z e i t l e r , D . P . , M u r p h y , J . M . & C h a l k l e y , R .( 1 9 7 7 ) C e l l 1 2 , 4 1 7 - 4 2 7 .1 3 . B o n n e r , W. M . ( 1 9 7 8 ) N u c l ei c A c i d s R e s . 5 , 7 1 - 8 5 .1 4 . N e l s o n , P . P . , A l b r i g h t , S . C . & G a r r a r d , W. T . ( 1 9 7 9 ) J . B i o l .C h e m . 2 5 4 , 1 1 7 5 1 - 1 1 7 6 0 .1 5 . T o d d , R . D . & G a r r a r d , W. T . ( 1 9 7 9 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 4 ,3 0 7 4 - 3 0 8 3 .1 6 . R i c h a r d s , R . G . & S h a w , B . R . ( 1 9 7 8 ) F e d . P r o c . F e d . Am. S o c .E x p . B i o l . 3 7 , 2 8 3 6 ( a b s t r . ) .1 7 . T h o m a s , J . 0 . & K o r n b e r g , R . D . ( 1 9 7 5 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i .USA 7 2 , 2 6 2 6 - 2 6 3 0 .1 8 . Z w e i d l e r , A . ( 1 9 7 8 ) i n M e t h o d s i n C e l l B i o l o g y , e d . P r e s c o t t , D .M . ( A c a d e m i c , Ne w Y o r k ) , V o l . 1 7 , p p . 2 2 3 - 2 3 3 .1 9 . C l e v e l a n d , D . W . , F i s h e r , S . G . , K i r s c h n e r , M . W. & L a e m m l i ,U . K . ( 1 9 7 7 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 2 , 1 1 0 2 - 1 1 0 6 .2 0 . M a r d i a n , J . K . W. & I s e n b e r g , I . ( 1 9 7 8 ) A n a l . B i o c h e m . 9 1 ,1 - 1 2 .2 1 . H e n d e r s o n , L . E . , O r o s z l a n , S . & K o n i g s b e r g , W. ( 1 9 7 9 ) A n a l .B i o c h e m . 9 3 , 1 5 3 - 1 5 7 .2 2 . S c h u l t z , J . ( 1 9 6 7 ) M e t b o d s E n z y m o l . 1 1 , 2 5 5 - 2 6 3 .2 3 . A l b r i g h t , S . C . , N e l s o n , - P . P . & G a r r a r d , W . T . ( 1 9 7 9 ) J . B i o l .C h e m . 2 5 4 , 1 0 6 5 - 1 0 7 3 .2 4 . B r a d b u r y , E . M . , C h a p m a n , G . E . , D a n b y , S . E . , H a r t m a n , P . G .& R i c h e s , P . L . ( 1 9 7 5 ) E p r . J . B i o c h e m . 5 7 , 5 2 1 - 5 2 8 .2 5 . S i n g e r , D . S . & S i n g e r , M . F . ( 1 9 7 6 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 3 ,2 5 3 1 - 2 5 4 7 .2 6 . F r a n k l i n , S . G . & Z w e i d l e r , A . ( 1 9 7 7 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 6 6 ,2 7 3 - 2 7 5 .2 7 . B o n n e r , W. M . & S t e d m a n , J . D . ( 1 9 7 9 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i .USA 7 6 , 2 1 9 0 - 2 1 9 4 .2 8 . E l g i n , S . C . R . & W e i n t r a u b , H . ( 1 9 7 5 ) A n n u . R e v . B i o c h e m . 4 4 ,7 2 5 - 7 7 4 .2 9 . H a r t m a n , P . G . , C h a p m a n , G . E . , M o s s , T . & B r a d b u r y , E . M .( 1 9 7 7 ) E u r . J . B i o c h e m . 7 7 , 4 5 - 5 1 .3 0 . C o l e , R . D . ( 1 9 7 5 ) i n T h e M o l e c u l a r B i o l o g y o f t h e M a m m a l i a nG e n e t i c A p p a r a t u s , e d . T s ' o , P . 0 . ( N o r t h - H o l l a n d , A m s t e r d a m ) ,V o l . 1 , p p . 9 3 - 1 0 4 .3 1 . P a r d o n , J . F . , W o r c e s t e r , D . L . , W o o l e y , J . C . , C o t t e r , R . I . , L i l l e y ,D . M . J . & R i c h a r d s , B . M . ( 1 9 7 7 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 4 , 3 1 9 9 -3 2 1 4 .3 2 . L a n g m o r e , J . P . & W o o l e y , J . C . ( 1 9 7 5 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA7 2 , 2 6 9 1 - 2 6 9 5 .3 3 . O l i n s , A . L . , B r e i l l a t t , J . P . , C a r l s o n , R . D . , S e n i o r , M . B . , W r i g h t ,E . B . & O l i n s , D . E . ( 1 9 7 5 ) i n T h e M o l e c u l a r B i o l o g y o f t h eM a m n w l i a n G e n e t i c A p p a r a t u s , e d . T s ' o , P . O . ( N o r t h - H o l l a n d ,

A m s t e r d a m ) , V o l . 1 , p p . 2 1 1 - 2 3 7 .

B i o c h e m i s t r y : B o u l i k a s e t a l .