bioinformatique la bioinformatique : stocker, analyser et visualiser pour découvrir lexemple du...

BIOINFORMATIQUE

La bioinformatique : stocker, analyser et visualiser pour découvrir

L’exemple du séquençage d’un génome

Les banques de donnéesLes banques de séquences nucléiques et protéiques

Les banques d’alignements, de motifs et de sites

La recherche dans les banques de données

Analyser l’information

La comparaison de séquences

l’alignement multiple

la phylogénie

I La bioinformatique : stocker, analyser et visualiser pour découvrir

• Les progrès de la biotechnologie permettent aux chercheurs d’accéder à la séquence de plus en plus de gènes ou même de génomes complets.

• Chaque année, le nombre de nouvelles séquences double.

• Des systèmes efficaces de stockage de l’information doivent être mis en œuvre.

I La bioinformatique : stocker et analyser pour découvrir

I La bioinformatique : stocker et analyser pour découvrir• La production de ces séquences se fait de plus en plus

dans le cadre de séquençages de génomes complets ou de banques d’EST (Expressed Sequence Tag)– L’Homme (Homo sapiens)

– La mouche du vinaigre (Drosophila melanogaster)

– Un ver (Coenorhabditis elegans)

– Une plante (Arabidopsis thaliana)

– La levure (Saccharomyces cerevisiae)

– Une bactérie lactique (Bacillus subtilis)

– …

I La bioinformatique : stocker et analyser pour découvrir• Le séquençage des génomes est une tache complexe et

gigantesque qui réclame la mise au point de logiciels capables d’automatiser la plupart des étapes

– Exemple du séquençage d’un génome complet• I Production d’une banque BAC (Bacterial Artificial Chromosome)

• II Ordonnancement des BAC

• III Séquençage des BAC en « shot gun »

• IV Assemblage des séquences de BAC en chromosome

• V Annotation de la séquence du génome

chromosome

Fragments chromosomiques

BAC

BACBAC

BAC

BAC

BAC

Banque BACInserts : ~100-150 kpb

Construction d’une banque BAC

BAC

BACBAC

BAC

BAC

BAC

Ordonnancement de la banque BAC

1

24

6

5

3

Plusieurs méthodes - séquençage des extrémités - « fingerprinting »

BAC 1

BAC 2

Logiciels (Sanger Centre):-IMAGE : lecture des gels-FCP : assemblage

Technique du « fingerprinting »

Analyse du profil de restriction des BAC

BAC

BACBAC

BAC

BAC

BAC

1

24

6

5

3

Ordonnancement de la banque BAC

Plusieurs méthodes - séquençage des extrémités - « fingerprinting »

1

Amorces PCR aléatoires

Séquençage « shot gun »

Visualisation et édition des chromatogrammes« base calling »

Lecture et nettoyage des séquences : PHRED

lecture des chromatogrammesélimination des bases de mauvaise qualité

élimination des séquences contaminantes (BAC)

assemblage des séquences : PHRAP, CAP3recherche des séquences chevauchantesproduction d’une séquence consensus

séquence consensus (contig)

Les difficultés de l’assemblage

Présence de séquences répétées

Assemblage erroné

CAP3 : règles et contraintes Intervention humaine

annotationsprédiction de gènes : intelligence artificielle (Eugène,…)

prédiction de la fonction des gènes : comparaison de séquences (BLAST)

Annotation structurale

invertase I inconnu

Annotation fonctionnelle

Banques et bases de données


La bioinformatique a pour objet de mettre en œuvre les moyens informatiques (bases de données, algorithmes) utiles au stockage et à l’analyse des données biologiques


………………gaaa gaaactcgaa aacgagaaaa aaccatggcg aagtctgacg ctctcttgccaatctccgcc agagaagaag atcctctatt atccgacggg tcaagatccg acccaaatgccgaaacccat ggccgtagaa gacccgtgaa aggtctcctc gccgtctcat ttgggcttttctttatcgcc ttctacgtcg ctctcatcgc cacacacgac ggatctagat ccaacgacgttaagatcgaa agcgatggaa cagcgaccaa agcgtcacgt gcccatctcg ccggcgtctcggagaaaagc aatgatcagt tgtggaagct ttccggtgac aggaatacgg tggcgttctcatggaa…………

…………… cgaa tccgaatgca gatggacagt agacattgca gatacccaga ttagacagggtgtaagcgat ggaaatgaac agattgacag tagacaggat aacaagatac cagctcgataCagataccgc tagacataga caccatgcag atgttcatta gataccagat agggacagatGacagataga ggacatagcg ctgcgtacac agatactcgg ataggacata tatagacagaCagatataga ctcagataga cgctcgacat cgctagacag ctctcgccgt gcatagaccaGatgacagat ggcgtgcgtc gtagtactgc atcgtcatcg aatgccggta ttcgatcgaaCgtgca…………

L’une de ses séquences est artificielle. Laquelle ?

I La bioinformatique : stocker et analyser pour découvrir• La composition des génomes

– Le rapport (G+C)/(A+T) ou le pourcentage de GC• Escherichia coli 51 %

• Plasmodium falciparum 18 %

• Thermus thermophilus 68 %

• Vertébrés 40-45% (et présence d’isochores)

– Le pourcentage de GC varie entre 15 et 75 %.

– L’origine de ces variations est encore mal comprise.


• La composition des protéines– Relativement constante a travers le vivant.

Alanine (A) 83‰ Cysteine (C) 17‰

Méthionine (M) 24‰ Asparagine (N) 44‰

Proline (P) 51‰ Aspartate (D) 53‰

Glutamate (E) 62‰ Glutamine (Q) 40‰

Phénylalanine (F) 39‰ Arginine (R) 57‰

Glycine (G) 72‰ Sérine (S) 69‰

Histidine (H) 22‰ Thréonine (T) 58‰

Isoleucine (I) 52‰ Valine (V) 66‰

Lysine (K) 57% Tryptophane (W) 13‰

Leucine (L) 90‰ Tyrosine (Y) 32‰

Cette distribution moyenne peut être considérée comme une signature


• Etude des fréquences n-uplets– Comparaison de la fréquence d’apparition d’un n-uplet fB1B2…Bn

au produit des fréquences d’apparition des bases individuelles fB1.fB2….fBn

– Si fB1B2…Bn > fB1.fB2….fBn le n-uplet est sur-représenté

– Si fB1B2…Bn < fB1.fB2….fBn le n-uplet est sous-représenté

– Exemple :• Chez E. coli, f CTAG = 3,6 10-4 << fCfTfAfG = 3,9 10-3

– Les palindromes sont en général sous-représentés dans les génomes bactériens, les palindromes sont souvent des sites de restriction.

• Chez les vertébrés, le dinucléotide GC est rare. Il s’agit d’un signal de méthylation de la cytosine. La 5-méthyl-cytosine peut ensuite être transformée en T. Ainsi CG se raréfie au profit de TG.

I La bioinformatique : stocker et analyser pour découvrir• Un n-uplet particulier le codon

– La distribution des codons doit suivre celle des acides aminés qui leurs correspondent dans les protéines ainsi :

fW = fTGG

– Etude de l’usage des codons synonymes

– Il existe donc des codons privilégiés. Ces codons ne sont pas les mêmes d’une espèce à l’autre.

lysine E. Coli H. Sapiens

AAA 60 % 38 %

AAG 40 % 62 %


• En étudiant un grand nombre de gènes on peut construire, pour l’organisme auquel ces gènes appartiennent une table d’usage des codons.

• Cette table diffère de celles construites pour d’autre organismes, mais on observe une conservation évolutive : des espèces proches possèdent des tables d’usage des codons proches.

I La bioinformatique : stocker et analyser pour découvrir• Un n-uplet particulier le codon

Homo sapiens [gbpri]: 50031 CDS's (21930294 codons) --------------------------------------------------------------------------------fields: [triplet] [amino acid] [fraction] [frequency: per thousand] ([number]) --------------------------------------------------------------------------------

UUU F 0.46 17.1 (374332) UCU S 0.18 14.7 (323470) UAU Y 0.44 12.1 (264652) UGU C 0.45 10.1 (221863)UUC F 0.54 20.4 (448127) UCC S 0.22 17.5 (384476) UAC Y 0.56 15.5 (339473) UGC C 0.55 12.4 (271056)UUA L 0.07 7.3 (160731) UCA S 0.15 11.9 (260418) UAA * 0.28 0.8 ( 16884) UGA * 0.50 1.4 ( 30111)UUG L 0.13 12.7 (277774) UCG S 0.06 4.5 ( 98166) UAG * 0.22 0.6 ( 12911) UGG W 1.00 13.0 (284246)

CUU L 0.13 12.9 (283480) CCU P 0.28 17.3 (380219) CAU H 0.41 10.6 (231860) CGU R 0.08 4.7 (102673)CUC L 0.20 19.5 (428574) CCC P 0.33 20.0 (439256) CAC H 0.59 15.0 (329569) CGC R 0.19 10.8 (236986)CUA L 0.07 7.0 (153837) CCA P 0.27 16.7 (367297) CAA Q 0.26 11.9 (261063) CGA R 0.11 6.3 (138297)CUG L 0.40 40.1 (880072) CCG P 0.11 7.0 (154028) CAG Q 0.74 34.4 (755209) CGG R 0.21 11.8 (257761)

AUU I 0.36 15.8 (346233) ACU T 0.24 12.9 (283671) AAU N 0.46 16.7 (365457) AGU S 0.15 12.0 (263279)AUC I 0.48 21.3 (466577) ACC T 0.36 19.1 (419213) AAC N 0.54 19.3 (422697) AGC S 0.24 19.4 (424788)AUA I 0.16 7.2 (157385) ACA T 0.28 14.9 (325763) AAA K 0.42 24.0 (526117) AGA R 0.21 11.7 (255681)AUG M 1.00 22.3 (489160) ACG T 0.12 6.2 (135294) AAG K 0.58 32.5 (713826) AGG R 0.20 11.6 (254743)

GUU V 0.18 10.9 (239795) GCU A 0.26 18.6 (408931) GAU D 0.46 22.1 (484271) GGU G 0.16 10.8 (237026)GUC V 0.24 14.6 (320190) GCC A 0.40 28.4 (622538) GAC D 0.54 25.7 (563848) GGC G 0.34 22.6 (495700)GUA V 0.11 7.0 (154102) GCA A 0.23 16.0 (350382) GAA E 0.42 29.0 (634985) GGA G 0.25 16.4 (358824)GUG V 0.47 28.7 (630151) GCG A 0.11 7.6 (165700) GAG E 0.58 40.3 (884368) GGG G 0.25 16.4 (360728)

--------------------------------------------------------------------------------Coding GC 52.58% 1st letter GC 56.14% 2nd letter GC 42.46% 3rd letter GC 59.13%Genetic code 1: Standard


H.sapiens UGG W 1.00 13.0A thaliana UGG W 1.00 12.5 T aquaticus UGG W 1.00 11.6

H. sapiensGGU G 0.16 10.8GGC G 0.34 22.6 GGA G 0.25 16.4 GGG G 0.25 16.4

A. thalianaGGU G 0.34 22.4GGC G 0.14 9.1GGA G 0.37 24.2GGG G 0.15 10.2

T. AquaticusGGU G 0.04 3.6GGC G 0.48 41.2GGA G 0.06 5.3GGG G 0.42 36.4


• Effet de la composition en base du génome sur l’usage des codons :– Les organismes riches en GC auront une préférence

significative pour les codons possédant un G ou un C comme troisième base.

– C’est l’inverse pour les organismes riches en AT– Pour les autres organismes, le choix de la troisième base reste

fortement biaisé.


• L’effet de contexte :– Si deux codons synonymes ont un usage proche, alors le choix

peut être influencé par le contexte, c’est à dire par les nucléotides présents immédiatement en amont ou en aval du codon.

– Exemple : Chez E. coli, pour la lysine, on trouve plus fréquemment AAA lorsque le codon suivant commence par G et AAG est préféré si un C est le nucléotide en aval.

• L’usage des codons et l’expression des gènes.– Chez la levure (Saccharomyces cerevisiae) et E. coli, la

fréquence d’usage des codons est directement proportionnelle à la concentration cellulaire de l’ARNt correspondant.

– Il s’agit d’une adaptation qui permet d’ajuster la quantité d’ARNt aux besoins de la machinerie de biosynthèse protéique.

– Les gènes le plus exprimés sont ceux qui utilisent le plus de codons privilégiés.

– L’utilisation de codons rares permet d’introduire des poses dans la traduction.


• Ces résultats statistiques peuvent permettre d’analyser les nouvelles séquences pour rechercher les phases codantes, les limites intron/exon, les erreurs de séquençage.

• Tous ces éléments combinés permettent de prédire la position de gènes.

• C’est l’annotation structurale.– Prediction des zones introniques et exoniques au moyen de méthodes

statistiques.– Recherche des motifs accepteurs et donneurs d’épissage– Combinaison des deux infos précédentes pour prédire précisément les limites

des introns/exons– Assemblage des exons prédits et confrontation avec les banques d’EST de

l’organisme considéré– Si échec, confronter les protéines prédites aux protéines existantes dans les

bases de données (pour d’autres organismes)

– Il existe des logiciels qui combinent toutes ces approches tel GenScan qui a été utilisé lors du séquençage du génome humain


II Les banques de données

• L’ensemble des séquences nucléiques ou protéiques connues sont regroupées dans des banques de données– GENBANK au NCBI (National Centre for Biotechnology

Information, USA)– EMBL à l’EBI (European Molecular Biology Laboratory,

European Bioinformatics Institute, UK)– DDBJ au Japon (DNA Data Bank of Japan)

• Certaines banques ne contiennent que des séquences protéiques– UNIPROT (Swissprot) à l’ISB/EBI (Institut Suisse de

bioinformatique)– PIR , Georgetown University, USA (Protein Information

Resource)

II.1 L’organisation de l’information :– Banque de données : l’information est stockée sous la forme

d’une collection de fichiers structurés. Une séquence correspond à un fichier.

– Base de données : l’information est stockée dans les champs d’un SGBD (Système de Gestion de Base de Données). Un langage particulier permet de formuler des requêtes pour interroger la base (SQL, Structured Query Langage)


II.2 Les banques de séquences nucléiques– GENBANK, EMBL et DDBJ sont associées et diffusent les

mêmes informations, mais sous des formats légèrement différents.

– Ces banques sont toutes accessibles via Internet à quiconque et sans restriction

– Elles gèrent les plus de 10 millions de séquences connues à ce jour, quel que soit leur organisme d’origine


II.2.a GENBANK http://www.ncbi.nlm.nih.gov/– Les séquences sont pour une large part obtenues par soumission

directe des chercheurs ou via les grands programmes de séquençage.

– Pour simplifier les recherches des utilisateurs, Genbank, EMBL et DDBJ s’échangent régulièrement leurs données de sorte que les trois banques disposent en permanence des mêmes séquences

– Par commodité les séquences sont classées en divisions selon leur type (EST, séquençage massif,…) ou leur organisme d’origine. Il existe une vingtaine de ces divisions


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

DIVISIONS Utilisées par quelles banques ?

BCT Bacteries DDBJ, GenBankPRO Procaryotes EMBLFUN Champignons EMBLHUMHumain DDBJ, EMBLPRI Primates DDBJ, EMBL, GenBankROD Rongeurs DDBJ, EMBL, GenBankMAMAutre mammifères DDBJ, EMBL, GenBankVRT Autres vertébrés DDBJ, EMBL, GenBankINV Invertébrés DDBJ, EMBL, GenBankPLN Plantes DDBJ, EMBL, GenBankORG Organelles EMBLVRL Virus DDBJ, EMBL, GenBankPHG Phages DDBJ, EMBL, GenBankRNA ARN de tructure DDBJ, EMBL, GenBankSYN Synthétiques et chimériques DDBJ, EMBL, GenBankUNA Non annotées DDBJ, GenBankUNC Non classifiées EMBL

II Les banques de donnéesII.2.a GENBANK

Divisions fonctionnelles Utilisées par quelles banques ?

EST Expressed sequence tags DDBJ, EMBL, GenBankSTS Sequence tagged sites DDBJ, EMBL, GenBankGSS Genome survey sequences DDBJ, EMBL, GenBankHTG High throughput genomic sequences DDBJ, EMBL, GenBankPAT Patent sequences DDBJ, EMBL, GenBankCON* Virtual contigs of segmented sequences DDBJ, EMBL, GenBank


• Chaque séquence possède une « entrée » qui rassemble toute l’information la concernant. Cette information peut-être visualisée sous forme d’une « fiche »

• Exemple : l’ARNm de l’invertase acide de Brassica oleracea


LOCUS AF274299 2251 bp mRNA PLN 26-NOV-2001

DEFINITION Brassica oleracea clone BoINV2 acid invertase mRNA, complete cds.

ACCESSION AF274299

VERSION AF274299.1 GI:11527242

KEYWORDS .

SOURCE Brassica oleracea.

ORGANISM Brassica oleracea

Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta;

Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; core eudicots;

Rosidae; eurosids II; Brassicales; Brassicaceae; Brassica.

REFERENCE 1 (bases 1 to 2251)

AUTHORS Coupe,S.A., Sinclair,B.K., Greer,L. and Hurst,P.L.

TITLE Characterization of acid invertase gene expression during

senescence of broccoli (Brassica oleracea) florets

JOURNAL Unpublished


AUTHORS Coupe,S.A.

TITLE Direct Submission

JOURNAL Submitted (02-JUN-2000) Crop and Food Research, Private Bag 11 600,

Palmerston North, Manawatu 5301, New Zealand




ACCESSION AF274299

VERSION AF274299.1 GI:11527242

KEYWORDS .










JOURNAL Unpublished


AUTHORS Coupe,S.A.




Nom de laséquence taille molécule division




ACCESSION AF274299

VERSION AF274299.1 GI:11527242

KEYWORDS .










JOURNAL Unpublished


AUTHORS Coupe,S.A.




Description de la séquence : origine, type, fonction, … Champ texte libre




ACCESSION AF274299

VERSION AF274299.1 GI:11527242

KEYWORDS .










JOURNAL Unpublished


AUTHORS Coupe,S.A.




Numéro d’accession primaire. Ne change jamais. En cas de fusion ou de scissiond’une entrée, des numéros secondaires peuventapparaître.




ACCESSION AF274299

VERSION AF274299.1 GI:11527242

KEYWORDS .










JOURNAL Unpublished


AUTHORS Coupe,S.A.




Numéro de version. Il est incrémenté à chaque modification.Seule la dernière version est accessible directement.Le deuxième numéro GI permet de satisfaire à des contraintestechniques.




ACCESSION AF274299

VERSION AF274299.1 GI:11527242

KEYWORDS .










JOURNAL Unpublished


AUTHORS Coupe,S.A.




Mots-clés : un mot ou une courte phrase, Les mots-clés sont séparés par une « , »Les mots-clés sont librement choisis par les auteurs.




ACCESSION AF274299

VERSION AF274299.1 GI:11527242

KEYWORDS .










JOURNAL Unpublished


AUTHORS Coupe,S.A.




Organisme et éventuellement type de molécule




ACCESSION AF274299

VERSION AF274299.1 GI:11527242

KEYWORDS .










JOURNAL Unpublished


AUTHORS Coupe,S.A.





FEATURES Location/Qualifiers

source 1..2251

/organism="Brassica oleracea"

/cultivar="Shogun"

/db_xref="taxon:3712"

/clone="BoINV2"

CDS 35..2023

/EC_number="3.2.1.26"

/function="cleaves sucrose into glucose and fructose at acid pH optima"

/note="sucrose hydrolysing enzyme; beta-fructofuranosidase"

/codon_start=1

/product="acid invertase"

/protein_id="AAG36943.1"

/db_xref="GI:11527243"

/translation="MAKSDALLPISAREEDPLLSDGSRSDPNAETHGRRRPVKGLLAV

SFGLFFIAFYVALIATHDGSRSNDVKIESDGTATKASRAHLAGVSEKSNDQLWKLSGD

RNTVAFSWNNSMLSWQRTAFHFQPEQNWMNDPNGPLFYKGWYHFFYQYNPNAAVWGDI

VWGHAVSKDLIHWVHLPLAMAADQWYDANGVWTGSATFLEDGSIVMLYTGSTDKSVQV

QNLAYPEDLNDPLLLKWVKFPGNPVLVPPPGILPKDFRDPTTAWKTSAGKWRITIGSK

INRTGISLVYDTTDFKTYEKLETLLHKVPNTGMWECVDFYPVSKTLVKGLDTSVNGPD

VKHIVKASMDDTRIDHYAIGTYFDSNGTWTPDDPTIDVGISTSLRYDYGKFYASKTFY

DQNKGRRILWGWIGESDSESADVQKGWSSLQGIPRTVVLDTKTGKNLVQWPVEEVKSL

RLSSKKFDMEVGPGSLVHIDVGSAAQLDIEAEFEIKKESLEKILGDASAAAEAEEFSC

QKSGGSTVRGALGPFGFSVLAHESLSEKTPVYFYVAKGKDSKLITFFCTDSSRSSFAN

DVVKPIYGSSVPVLKGEKLTMRILVDHSIVEAFGQGGRTCITSRVYPTKAIYGAAKLF

LFNNAIDATITASFKVWQMNSAFIQPYSEEAVRALSRT"


source 1..2251


/cultivar="Shogun"


/clone="BoINV2"

CDS 35..2023

/EC_number="3.2.1.26"



/codon_start=1



/db_xref="GI:11527243"













Table des « features » :Mis en place par GenBank, EMBL et DDBJContient des informations sur les gènes et leurs produits ainsi que sur les régions d’intérêt biologique des séquences.On y trouve aussi des informations sur les différences entre les versions d’une même séquence. Des liens sur d’autres bases ou banques de données peuvent également être présents.Chaque clé répond à une nomenclature.


source 1..2251


/cultivar="Shogun"


/clone="BoINV2"

CDS 35..2023

/EC_number="3.2.1.26"



/codon_start=1



/db_xref="GI:11527243"













Lien vers la base Taxon du NCBI

Lien vers la base Enzyme

Lien vers la fiche de la protéine dans Genbank

BASE COUNT 632 a 489 c 532 g 598 t

ORIGIN

1 caaaaagaaa gaaactcgaa aacgagaaaa aaccatggcg aagtctgacg ctctcttgcc

61 aatctccgcc agagaagaag atcctctatt atccgacggg tcaagatccg acccaaatgc

121 cgaaacccat ggccgtagaa gacccgtgaa aggtctcctc gccgtctcat ttgggctttt

181 ctttatcgcc ttctacgtcg ctctcatcgc cacacacgac ggatctagat ccaacgacgt

241 taagatcgaa agcgatggaa cagcgaccaa agcgtcacgt gcccatctcg ccggcgtctc

301 ggagaaaagc aatgatcagt tgtggaagct ttccggtgac aggaatacgg tggcgttctc

361 atggaacaac agtatgttgt cgtggcaacg aacggcgttt catttccaac ctgaacagaa

421 ctggatgaac gatcctaatg gtccattgtt ctacaaagga tggtaccatt tcttctacca

481 gtacaaccca aacgcagcag tatggggtga cattgtttgg ggtcatgccg tgtctaagga

/../

1861 aagggtatat ccaacaaagg ccatctatgg agcagcgaag cttttcttgt tcaacaatgc

1921 cattgatgcg actattacgg catcgtttaa ggtgtggcag atgaacagtg cttttattca

1981 gccttactct gaggaggctg ttcgtgctct ctcccgcaca tgattataca cccatctcca

2041 gcaaattctt tttttttttt ttttgtagat ttacttatta aaacttataa atatcgttct

2101 gttattcttc caatttagct cgttcaatta ttctattggg gttcaatttg attcatcata

2161 tgtaagaaaa atgggttact tgagaaattt tttttctcat tatctttaat aaaattttgg

2221 tgaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a

//


0,00E+00

1,00E+06

2,00E+06

3,00E+06

4,00E+06

5,00E+06

6,00E+06

Homo s

apie

ns

Mus

musc

ulus

Droso

phila m

elan

ogaste

r

Rattu

s norv

egic

us

Oryza

sat

iva

Arabid

opsis

thal

iana

Caenorh

abditi

s el

egan

s

Tetra

odon nig

rovi

ridis

Bos ta

urus

Glyci

ne m

ax

Danio

rerio

Lycoper

sico

n esc

ulentu

m

Med

icag

o trunca

tula

Entam

oeba

histo

lytic

a

Xenopus

laev

is

Chlam

ydom

onas re

inhar

dtii

Zea m

ays

Strongyl

ocentro

tus

purpura

tus

Sus sc

rofa

Trypan

osom

a bru

cei

0,00E+00

1,00E+09

2,00E+09

3,00E+09

4,00E+09

5,00E+09

6,00E+09

7,00E+09

8,00E+09

9,00E+09

Entrées

BasesContenu de Genbank


• EMBL et DDBJ stockent les même séquences sous un format très similaire

• Devant la complexité croissante des fiches et notamment avec l’arrivée des tables de « features », de nouveaux outils ont été développés pour visualiser ces fiches.– ARTEMIS est l’un d’entre-eux

• Développé en langage JAVA (multiplateforme)

• Logiciel libre (gratuit)

• Visualise toute fiche GenBank/EMBL

• Permet d’éditer ces fiches et de créer de nouvelles annotations

II Les banques de donnéesII.2.b Visualisation des séquences nucléiques

II.3 Les banques de séquences protéiques– PIR / NRL-3D

• PIR – littérature, soumissions, traductions de Genbank, EMBL et DDBJ

– annotations automatiques, classification en familles (50% d’identité), superfamilles, domaines

– annotations bibliographiques et vérifications (PIR1 et PIR2). 170 000 entrées classifiées mais d’annotation pauvre

• NRL-3D – séquences et annotations issues de la PDB. 23 000 entrées


– II.3.a SWISS-PROT / TREMBL• SWISS-PROT

– Origine des séquences : littérature, soumissions – Annotations manuelles (littérature, experts) 100 000 entrées (10/01)

• TREMBL– Traduction des CDS de EMBL par le programme trembl

ORF (Open Reading Frame) : Phase ouverte de lecture; séquence nucléique comprise entre deux codons stop

CDS (coding sequence) : sequence nucléique codant pour une protéine. Elle est contenue dans une phase ouverte de lecture et débute par un codon start.

– Annotations automatiques SP-TREMBL 300 192 entrées

– Après expertise les fiches TREMBL validée sont transférées dans SWISS-PROT

II Les banques de données II.3 Les banques de séquences protéiques

ID HXK1_ARATH STANDARD; PRT; 496 AA.

AC Q42525; Q42535;

DT 01-NOV-1997 (Rel. 35, Created)

DT 16-OCT-2001 (Rel. 40, Last sequence update)

DT 16-OCT-2001 (Rel. 40, Last annotation update)

DE Hexokinase 1 (EC 2.7.1.1).

GN HXK1 OR AT4G29130 OR F19B15.160.

OS Arabidopsis thaliana (Mouse-ear cress).

OC Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta;

OC Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; core eudicots; Rosidae;

OC eurosids II; Brassicales; Brassicaceae; Arabidopsis.

OX NCBI_TaxID=3702;

ID line : toujours la première ligne, elle contient le nom de la séquence au format X_Y

X = nom de la protéine ( mnémonique de 4 lettres)

Y = code espèce (5 lettres genre (3) espèce (2))Classe :

Standard/preliminary taille

II.3.a SWISS-PROT / TREMBL


AC Q42525; Q42535;










OX NCBI_TaxID=3702;

Numéros d’accession primaire et secondaire(s)



AC Q42525; Q42535;










OX NCBI_TaxID=3702;

Description : champ texte


DE Corticotropin-lipotropin precursor (Pro-opiomelanocortin) (POMC)

DE [Contains: NPP; Melanotropin gamma (Gamma-MSH); Corticotropin

DE (Adrenocorticotropic hormone) (ACTH); Melanotropin alpha (Alpha-MSH);

DE Corticotropin-like intermediary peptide (CLIP); Lipotropin beta (Beta-

DE LPH); Lipotropin gamma (Gamma-LPH); Melanotropin beta (Beta-MSH);

DE Beta-endorphin; Met-enkephalin].

synonyme


DE Corticotropin-lipotropin precursor (Pro-opiomelanocortin) (POMC)

DE [Contains: NPP; Melanotropin gamma (Gamma-MSH); Corticotropin

DE (Adrenocorticotropic hormone) (ACTH); Melanotropin alpha (Alpha-MSH);

DE Corticotropin-like intermediary peptide (CLIP); Lipotropin beta (Beta-

DE LPH); Lipotropin gamma (Gamma-LPH); Melanotropin beta (Beta-MSH);

DE Beta-endorphin; Met-enkephalin].

Liste des peptides produits après clivage de la protéine initiale



AC Q42525; Q42535;










OX NCBI_TaxID=3702;

gènes


RN [1]

RP SEQUENCE FROM N.A.

RC STRAIN=CV. LANDSBERG ERECTA;

RX MEDLINE=95334527; PubMed=7610198;

RA Dai N., Schaffer A.A., Petreikov M., Granot D.;

RT "Arabidopsis thaliana hexokinase cDNA isolated by complementation of

RT yeast cells.";

RL Plant Physiol. 108:879-880(1995).

Travaux pratiqués sur la séquence par les auteurs. Ici, le commentaire indique que seule la séquence nucléique est expérimentalepar conséquent la séquence protéique est

conceptuelle


RN [1]

RP SEQUENCE FROM N.A.

RC STRAIN=CV. LANDSBERG ERECTA;

RX MEDLINE=95334527; PubMed=7610198;

RA Dai N., Schaffer A.A., Petreikov M., Granot D.;

RT "Arabidopsis thaliana hexokinase cDNA isolated by complementation of

RT yeast cells.";

RL Plant Physiol. 108:879-880(1995).

Reference comment : origine biologiquede la séquence (organisme, plasmide, tissu)


CC -!- CATALYTIC ACTIVITY: ATP + D-hexose = ADP + D-hexose 6-phosphate.

CC -!- SUBCELLULAR LOCATION: CHLOROPLAST OUTER ENVELOPE; CYTOPLASMIC SIDE (BY SIMILARITY).

CC -!- SIMILARITY: BELONGS TO THE HEXOKINASE FAMILY.

DR EMBL; U28214; AAB49908.1; -.

DR InterPro; IPR001312; Hexokinase.

DR Pfam; PF00349; hexokinase; 1.

DR PROSITE; PS00378; HEXOKINASES; 1.

KW Transferase; Kinase; Glycolysis; ATP-binding; Transmembrane; Chloroplast.

FT TRANSMEM 4 24 POTENTIAL.

FT NP_BIND 101 106 ATP (POTENTIAL).

FT DOMAIN 171 197 GLUCOSE-BINDING (POTENTIAL).

SQ SEQUENCE 496 AA; 53707 MW; 6DC81CE114E0B52B CRC64;

MGKVAVGATV VCTAAVCAVA VLVVRRRMQS SGKWGRVLAI LKAFEEDCAT PISKLRQVAD

TLDFESLNPG EQILEKIISG MYLGEILRRV/…../ LLKMAEDAAF FGDTVPSKLR IPFIIRTPHM

SAMHNDTSPD LKIVGSKIKD ILEVPTTSLK MRKVVISLCN IIATRGARLS AAGIYGILKK

LGRDTTKDEE VQKSVIAMDG GLFEHYTQFS ECMESSLKEL LGDEASGSVE VTHSNDGSGI

GAALLAASHS LYLEDS

//

Blocs de commentaires


Topic Description ALTERNATIVE PRODUCTS Description of the existence of related protein sequence(s) produced by alternative splicing of the same gene or

by the use of alternative initiation codons

BIOTECHNOLOGY Description of the use of a specific protein in a biotechnological process

CATALYTIC ACTIVITY Description of the reaction(s) catalyzed by an enzyme [1]

CAUTION This topic warns you about possible errors and/or grounds for confusion

COFACTOR Description of an enzyme cofactor

DATABASE Description of a cross-reference to a network database/resource for a specific protein [2]

DEVELOPMENTAL STAGE Description of the developmental specific expression of a protein

DISEASE Description of the disease(s) associated with a deficiency of a protein

DOMAIN Description of the domain structure of a protein

ENZYME REGULATION Description of an enzyme regulatory mechanism

FUNCTION General description of the function(s) of a protein

INDUCTION Description of the compound(s) which stimulate the synthesis of a protein

MASS SPECTROMETRY Reports the exact molecular weight of a protein or part of a protein as determined by mass spectrometric methods [3]

MISCELLANEOUS Any comment which does not belong to any of the other defined topics

PATHWAY Description of the metabolic pathway(s) with which a protein is associated

PHARMACEUTICAL Description of the use of a specific protein as a pharmaceutical drug

POLYMORPHISM Description of polymorphism(s)

PTM Description of a posttranslational modification

SIMILARITY Description of the similaritie(s) (sequence or structural) of a protein with other proteins

SUBCELLULAR LOCATION Description of the subcellular location of the mature protein

SUBUNIT Description of the quaternary structure of a protein

TISSUE SPECIFICITY Description of the tissue specificity of a protein




DR EMBL; U28214; AAB49908.1; -.













GAALLAASHS LYLEDS

//

Data base cross-reference





DR EMBL; U28214; AAB49908.1; -.













GAALLAASHS LYLEDS

//


II.3.b Annotations des séquences de Swiss-Prot– Elles concernent les points suivants :

• Fonction(s) de la protéine• Modifications post-traductionnelles (acétylation, phosphorylation,…)• Domaines et sites (liaison au calcium, à l’ATP, doigts de zinc, …)• Structure secondaire• Structure quaternaire (homodimère, hétérotrimère, …)• Similitudes avec d’autres protéines• Maladies associées à une protéine• Conflits sur la séquence, existence de variants, …

– Sources de l’information• Articles concernant une nouvelle séquence• Article de synthèse sur les familles de protéines• Groupe d’experts

– Les mises à jour sont régulières• La redondance est limitée au mieux

II.3.c Quelques statistiques sur Swiss-Prot


II.4 Les banques d’alignements et de motifs

• Définitions– Domaine : portion d'une protéine supposée avoir un repliement indépendant du

reste de la protéine, et posséder une fonction spécifique. – Motif : segment court et conservé d'une séquence nucléique ou protéique. Les

motifs sont fréquemment des parties hautement conservées des domaines.

• Tout commence par des alignements multiples– Alignement : Processus par lequel deux séquences sont comparées afin

d'obtenir le plus de correspondances (identités ou substitutions ) possibles entre les nucléotides ou acides aminés qui les composent.

• Alignement global : alignement des deux séquences sur toute leur longueur. (Gap)• Alignement local : alignement des deux séquences sur une portion de leur

longueur. (Fasta et Blast) • Alignement optimal : alignement de deux séquences de façon à obtenir le plus haut

score possible. (Needleman et Wunsch) • Alignement multiple : alignement global de trois ou plus de trois séquences.

(ClustalW)


• Il existe de nombreuses banques d’alignements et de motifs

• PROSITE : SIB, Dictionnaire de sites et motifs protéiques (expressions régulières)

• Profiles : ISREC, Lausanne, matrices pondérées (profils)

• PRINTS : UCL London, (Protein Motif Fingerprint Database). Une empreinte (fingerprint) est un groupe conservé de motifs utilisé pour caractériser une famille de protéines

• Pfam : Sanger centre, Collection de familles alignées de protéines, générées automatiquement ou semi-automatiquement par la méthode "Hidden Markov Models" (HMMs).

• BLOCKS : FHCRC Seattle, « blocks », alignements multiples de segments sans insertions, correspondant aux régions les mieux conservées de Prosite

• ProDom : (PROtein DOMain Database) INRA, Toulouse, compilation automatisée des domaines homologues (alignements multiples et consensus) détectés dans Swiss-prot


Alignement multiple de séquences homologues issues de Swiss-Prot

Détermination manuelle d’une expression consensus

Affinage du consensus contre Swiss-Prot :Le consensus doit permettre de récupérer les séquences

qui ont servi à le construire. Il y a des faux positifs ainsi que des faux négatifs.

« pattern / profile »C-x(3)-[LIVMFY]-x(5)-[LIVMFY]-x(3)-[DENQ]-[LIVMFY]-x(10)- C-x(3)-C-T-x(4)-C-x-[LIVMFY]-F-x-[FY]-x(13,14)-C-x-

[LIVMFY]-[RK]-x-[ST]-x(14,15)-S-G-x-[ST]-[LIVMFY]-x(2)-C

Version 16.53, of 06-Dec-2001 (contient 1104 fiches documentation décrivant 1494 « patterns », règles et profils/matrices).

II.4 Les banques d’alignements et de motifs II.4.a PROSITE / PROFILES: SIB, expressions régulières

Alignement local

Identification manuelle d’un « Fingerprint » : ensemble de 1 à n motifs

Affinage contre OWL

« Fingerprint » composé d’un jeu de motifs

Version 32.0 de PRINTS contient 1600 entrées, codant 9800 motifs.

II.4 Les banques d’alignements et de motifs II.4.b PRINTS : UCL London, empreintes (fingerprints)

Alignement multiple édité manuellement

Un profil « HMM » en est dérivéProgression aléatoire estimant la probabilité de transition à chaque étape et utilisant la technique d'apprentissage

Alignement pleine longueur final

Pfam A : Alignements précis vérifiés, annotés (3071 familles, 267598 séquences)Pfam B : Clustering automatique de Swiss Prot / Trembl, non annoté (57477, 126378)

II.4 Les banques d’alignements et de motifs II.4.c Pfam : Sanger centre, HMMs profiles

Transition 1 -> 2Prob(C->G) 2 0.4Prob(C->C) 2 0.4Prob(G->C) 1 0.2Prob(G->G) 0 0

C0.8

G0.2

C0.6

G0.4

début fin

début fin

0.2

0.8 0.4

0.4

0.2

0

P(CG) = 0.8 * 0.8 * 0.4 * 0.4 = 0.102P(GC) = 0.2 * 0.2 * 0.2 * 0.6 = 0.004P(GA) = 0.2 * 0.2 * 0 * 0 = 0

Modèle de Markov

transitionémission

Pfam entry: Glyco_hydro_68Accession number: PF02435 Definition: Levansucrase/Invertase Author: Mian N, Bateman A Alignment method of seed: Clustalw Source of seed members: Pfam-B_2011 (release 5.4) Gathering cutoffs: 25 25 Trusted cutoffs: 825.60 825.60 Noise cutoffs: -256.10 -256.10 HMM build command line: hmmbuild -F HMM SEED HMM build command line: hmmcalibrate --seed 0 HMM Reference Number: [1] Reference Medline: 98394981 Reference Title: Cloning, nucleotide sequence, and expression in Escherichia Reference Title: coli of levansucrase genes from the plant pathogens Reference Title: Pseudomonas syringae pv. glycinea and P. syringae pv. Reference Title: phaseolicola. Reference Author: Hettwer U, Jaeckel FR, Boch J, Meyer M, Rudolph K, Ullrich Reference Author: MS;Reference Location: Appl Environ Microbiol 1998;64:3180-3187. Database Reference INTERPRO; IPR003469; Comment: This Pfam family consists of the glycosyl hydrolase 68 family, Comment: including several bacterial levansucrase enzymes, and invertase from Comment: zymomonas. Number of members: 14

II.4 Les banques d’alignements et de motifs II.4.c Pfam : Sanger centre, HMMs profiles

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/query?uid=98394981&form=6&db=m&Dopt=r

Swiss Prot + Trembl

PSI-BLAST récursifs

Domaines, consensus

•Proteines utilisées pour ProDom 2001.2: (SwissProt /TREMBL – Mai 2001)•domaines avec au moins 2 sequences•domaines

339763101957283772

II.4 Les banques d’alignements et de motifs II.4.d PRODOM

Prosite (4034) ProDom (1066) Pfam(2258) Domo(306)

Groupes de protéines

Alignement local sans gap avec un germe de trois acides aminés

BLOCKS Calibration contre Swiss Prot

Version 13.0 (08/001): 8656 blocks représentant 2101 groupes

II.4 Les banques d’alignements et de motifs II.4.e BLOCKS : FHCRC Seattle, « blocks »

Recherche des membres de super-familles très divergentesProfiles, Pfam

Recherche des membres de sous-famillesPrints

Recherche de motifs courtsProsite, Blocks

II.4 Les banques d’alignements et de motifs II.4.f Quelle banque pour quel résultat ?

INTERPRO : Pfam, Prints, Prosite, Swiss Prot / Trembl sont intégrées dans une hiérarchie formant des familles.

II.4 Les banques d’alignements et de motifs II.4.f INTERPRO la base intégrative

Mots-clés et critères– Numéro d’accession

– Nom de séquence

– Organisme

– Définition

– Taille d’une séquence

Séquence– Recherche de séquences homologues

– Recherche de domaines ou de motifs

II.5 La recherche dans les banques

II.5 La recherche dans les banques II.5.a ENTREZ

II.5 La recherche dans les banques II.5.b SRS (Sequence Retrieval System)

Recherche de similarités entre séquences biologiques

• Objectifs

– Recherche d’informations sur la fonction biologique

– Etude de la structure (motifs, domaines, …)

– Informations sur l’évolution des séquences (phylogénie)

Constitue en générale la première étape

de l’étude d’une séquence nouvelle

La recherche de similarités permet de mettre en évidence les régions proches de deux séquences

Similarité et homologie :

Deux gènes sont homologues s’ils ont un gène ancêtre en commun

On doit donc parler de recherche de similarités.

Si une protéine partage 25 % d’identité sur une longueur de 100 acides aminés avec une autre, on pourra parler d’homologie


• On peut comparer des séquences nucléiques ou des séquences protéiques– La probabilité est plus forte de trouver de la similarité par

hasard dans les comparaisons ADN/ADN car on se restreint à 4 nucléotides contre 20 acides aminés

Séquence de 10 bases -> 410 séquences possibles soit 1 048 576

Les banques publiques contiennent 8.109 nucléotides à partir desquels on peut extraire environ 7.109 séquences de 10 bases. Une séquence particulière de 10 bases peut donc s’y trouver 6600 fois simplement par hasard.

Ainsi obtenir 100 % d’identité sur 10 bases peut ne pas avoir beaucoup de signification biologique et n’être que le fruit du hasard

Séquence de 10 aa -> 2010 séquences possibles soit 10,24.1012


• La recherche de similarités repose sur des processus évolutifs : les mutations


Séq. 2 G T T A G

Séq. 3 G T A G

Séq. 4 G T A T G

substitution

suppression

insertion

Séq. 1 G T C A G

• La mise en évidence de similarités réclame d’aligner des séquences.


Séq. 1 G T C A _ G

Séq. 4 G _ T A T G

Séq. 1 G T C A _ G

Séq. 4 G T _ A T G

3 identités, 1 substitution et 2 indels (INsertion-DELétion)

4 identités et 2 indels

• Comment évaluer un alignement : le score


G T C A G

G T A T G

Appariement = 1, 0 sinon

Score = S(i) = 31 1 0 0 1

1 1 –1/4 1 –1/4 1

G T C A G

G T A T G

Appariement = 1; INDEL = -0,25; 0 sinon

Score = S(i) - P(i) = 3,5


CGCCGGTGTACTGCA-C-TGGCGTG--TCACGCCGG-G-ACCGCAGCATGGCGGGCATCA

Cet alignement nécessite deux insertions (GAP) consécutives.Deux paramètres décrivent un gap

sa créationsa longueur

Il est possible d’imposer une pénalité résumant les deux paramètresP = A + B * L

P pénalité A pénalité d’ouverture de gapB pénalité d’extension de gapL longueur du gap


Si on prend A grand et B petit on favorise des alignements comportantpeu de gaps mais de taille importante.

Si on prend A petit et B grand alors les alignements avec plusieurs gapsmais de courte longueur auront de meilleurs scores que ceux de la situation précédente (moins en accord avec la réalité biologique)

• Les matrices de substitution– Pour les séquences nucléiques : la matrice unitaire


A T G C

A 1 0 0 0

T 0 1 0 0

G 0 0 1 0

C 0 0 0 1

D’autres matrices peuvent être utilisées basées par exemplesur les fréquences de substitution observées sur un jeu de séquences

• Pour les acides aminés on peut également imaginer une matrice unitaire. Mais une telle matrice serait trop sélective.

– En effet, remplacer une leucine par une valine doit avoir moins d’impact sur la structure et la fonction d’une protéine que de la remplacer par une proline.

– Par ailleurs, les séquences protéiques étant soumises à la pression sélective, les mutations que l’on observe entre les séquences d’une même protéine d’organismes différents sont mieux tolérées que les autres.

Ainsi, il faut imaginer d’autre matrices pour que le score associé au remplacement d’un acide aminé par un autre tienne compte des conséquences que cette substitution peut avoir sur la fonction ou la structure de la protéine.


• Les matrices protéiques liées à l’évolution– Elles représentent les échanges possibles ou acceptables d’un

acide aminé par un autre lors de l’évolution des protéines• Les matrices PAM (Point Accepted Mutation)

– Etude de 71 familles de protéines contenant des séquences (1300) très semblables, donc s’alignant facilement

– A partir des alignements, on calcule une matrice de probabilité ou chaque élément désigne la probabilité qu’un acide aminé A soit remplacé par un acide aminé B durant une étape d’évolution

– Cette matrice correspond à un temps d’évolution autorisant 1 mutation pour 100 sites : on parle de 1PAM ou PAM-1 (après un reformatage).

– Si l’on multiplie cette matrice par elle même X fois, on obtient une matrice PAM-X correspondant à un temps d’évolution plus long.

– La matrice PAM-250 semble la plus adaptée pour distinguer des protéines proches de celles similaires par hasard.

– Inconvénient : » tous les sites sont considérés comme équiprobables vis à vis du taux de

mutation => faux


– Les matrices BLOSUM (BLOcks Substitution Matrix)• Les matrices PAM sont construites à partir d’alignements globaux de

protéines très semblables. Les BLOSUM sont élaborées à partir de BLOCKS (séquence issues d’alignements multiples sans insertion délétion de courtes régions conservées)

• Ces blocs permettent de rassembler toutes les séquences ayant un taux d’identité minimum au sein de leur bloc. On en déduit, pour le taux d’identité en question, une matrice de probabilité de substitution d’un acide aminé par un autre.

• A chaque taux d’identité correspond une matrice BLOSUM particulière.– BLOSUM60 : 60 % d’identité

• Non basées sur un modèle évolutif (bien qu’implicite)

• Donnent de meilleurs résultats que PAM– Construites à partir d’un plus grand nombre de séquences

– Basées uniquement sur les régions les plus homologues (blocks)


• Les matrices liées aux propriétés physico-chimiques– Matrice basée sur des mesures d’énergie libre de transfert de

l’eau à l’éthanol des acides aminés (Levitt, 1976)

– Matrice de structure secondaire basée sur la propension d’un acide aminé à se trouver dans une hélice, un feuillet ou un coude (Levin, 1986)

– Matrice basée sur les structure 3D : permet de comparer des protéines assez éloignées ( la structure 3D est plus conservée que la structure primaire => deux protéines peuvent partager la même structure 3D et donc posséder des fonctions biologiques analogues tout en ayant des séquences très différentes => convergence)


• Le choix d’une matrice– BLOSUM élevées (80) et PAM faibles (1) permettent de

comparer des séquences proches et courtes

– BLOSUM faibles (45) et PAM élevées (250) pour les séquences plus divergentes et plus longues

– Pour démarrer une étude il faut utiliser la BLOSUM 62 ou la PAM 120


• Les outils d’alignement– Le « dot plot »


A T G C A A C A T G C

A X X X X

T X X

G X X

C X X

A X X X X

A X X X X

C X X X

A X X X

T X X

G X X

C X X X

• Les outils d’alignement– Le « dot plot »


A T G C A A C A T G C

A X X X X

T X X

G X X

T X X

G X X

A X X X X

C X X X

A X X X

C X X X

G X X

A X X X

• L’alignement optimal– Exemple : deux séquences à comparer

• ATGTAATGCATA

• TATGTGAAT– Scores identité +1

gap -1

extension -1


Alignement optimal par glissement score = 5 A T G T A A T G C A T GT A T G T G A A T

Alignement optimal avec insertion score = 6 A T G T - A A T G C A T GT A T G T G A A T

• L’alignement optimal

– Algorithme de Needleman et Wunsch• Alignement optimal global de deux séquences

– Algorithme de Smith et Waterman• Alignement optimal local de deux séquences

• Ces algorithmes sont les meilleurs mais ils sont très coûteux en temps de calcul. Ils ne sont donc pas utilisés pour la recherche de similarités entre une séquence et une banque de séquences


• La recherche de similarités dans les banques– FASTA

• Identification rapide de zone d’identité entre la séquence requête et les séquences banque.

• Bonne sensibilité car il prend en compte les INDELs

• Les « hits » ou résultats sont fournis avec un Z-score et une E-value– Z-score = (s-m)/e

» S : score observé

» M : moyenne des scores aléatoires

» E : écart type des scores aléatoires

– E-value

» Plus elle est faible et moins on a de chance d’avoir trouver par hasard l’alignement observé

» E-value < 0,01 : séquences homologues

» E-value 1-10 : séquences plus lointaines


• La recherche de similarités dans les banques– BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)

• Développé au NCBI

• Basé sur un modèle statistique

• L’unité de base de l’algorithme est le HSP (High-scoring Segment Pair)– Il s’agit d’une région de similitude la plus longue possible entre deux

séquences ayant un score supérieur ou égal à un score seuil. Il peut y avoir plusieurs HSP issus de la comparaison de deux séquences.

– Un deuxième score MSP (Maximal-scoring Segment Pair) est le meilleur score obtenu parmi tous les couples possibles que peuvent produire deux séquences.

– Les méthodes statistiques sont utilisées pour évaluer la qualité des HSPs et MSPs.



• Il existe cinq programmes– BLASTN (séquence nucléique contre banque nucléique)

– BLASTP (séquence protéique contre banque protéique)

– BLASTX (séquence nucléique traduite en 6 phases contre banque protéique)

– TBLASTN (séquence protéique contre banque nucléique traduite en 6 phases)

– TBLASTX (séquence nucléique traduite dans les 6 phases contre banque traduite dans les 6 phases)

• Les étapes de l’algorithme– Faire une liste de tous les mots de longueur X dans la séquence

» Par défaut X = 3 pour les protéines et 11 pour les acides nucléiques, l’utilisateur peut modifier ces paramètres

– Comparer ces mots avec les séquences de la banques pour identifier les séquences identiques (les « hits »)



– Extension du segment identique lorsque cela est possible, dans les deux directions de manière à ce que le score cumulé puisse être amélioré.

L’extension est stoppée dans trois cas :

» Si le score cumulé descend d’une quantité x donnée par rapport à la valeur maximale qu’il avait atteint

» Si le score cumulé devient inférieur ou égal à zéro

» Si la fin de l’une des deux séquences est atteinte



Séquence requête (query)

Liste des mots de longueur l

Comparaison des mots avec lesséquences de la banque (subject)et identification des « hits » exacts

Extension des HSPs


• L’évaluation du « hit »– Le score S (bits) : Il est dérivé du score brut de l’alignement. Il a été

normalisé dans le but de pouvoir comparer des scores issus de recherches différentes.

– La E-value (Expected) : nombre d’alignements différents que l’on peut espérer trouver dans la banque avec un score supérieur ou égal à S (probabilité d’observer au hasard ce score). Plus la E-value est faible et plus l’alignement est significatif.

» La E-value tient compte de

la taille de la séquence requête

la taille de la banque

la composition de la séquence

la matrice de substitution utilisée

E-value < e-100 => même gène ou allèles ou espèces voisines

E-value e-100 e-80 => gènes très proche



• Paramètres– Taille du mot : plus on l’élève plus la recherche est spécifique et moins elle

est sensible

– Filtres : permet de masquer les régions de faible complexité (séquences répétées, séquences présentes dans de très nombreuses protéines, logiciels SEG et XNU)

– Matrices : choix de la matrice de score (BLOSUM, PAM, …)

– EXPECT : définition du score seuil pour la recherche, seuls les alignements dont le score est inférieur à E seront reportés. Plus E est pris faible et plus les résultats seront fiables.

– GAPS : choix des pénalités d’ouverture et d’extension de gap


ouverture extension

BLASTP -11 -1

BLASTN -5 -2


L < 35 35 < L < 50

50 < L < 85 L > 85

filtre off on on on

matrice PAM35 ou moins

PAM70 BLOSUM80 BLOSUM62

L mot 3 ou 2 3 3 3

Gap (ouv, ext) 9, 1 10, 1 10, 1 11, 1

E-value (seuil)

10000 10-100 10 10

Paramètres recommandés pour une séquence nucléique (infobiogen)

Page d’accueil duserveur BLAST

au NCBI

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

• L’alignement multiple– Détecter des régions conservées dans des familles de

séquences.

– Caractériser de nouvelles familles de protéines.

– Détecter ou démontrer une homologie entre différentes séquences

– Trouver des amorces de PCR pour amplifier une famille de gènes ou un membre d’une famille de gène

– Etablir une phylogénie

– Aider à la modélisation : les algorithmes de prédiction de structure secondaire exploitent très bien les alignements multiples


• L’alignement multiple– Il s’agit d’un processus qui peut être coûteux en temps de calcul

– Ce temps dépend de trois paramètres• Le volume des données à traiter (taille et nombre de séquences)

• La puissance de l’ordinateur utilisé

• La puissance de l’algorithme utilisé

– Il existe deux classes d’algorithme• La première dérive de l’algorithme de Needleman et Wunsch

– On recherche l'alignement multiple qui maximise la somme des scores de chaque alignement pour chaque paire (pour n séquences, il y a n(n-1)/2 paires). Cependant, la taille du problème, en temps et en place mémoire dans l'ordinateur, est proportionnelle au produit des longueurs des séquences : si les N séquences sont de longueur L, la complexité est en LN. Cette complexité croit de façon exponentielle avec le nombre de séquences, elle est donc utilisable avec un petit nombre de séquences mais ne peut répondre à la plupart des besoins.



• L’alignement multiple• La deuxième utilise une méthode heuristique

– Heuristique : méthode donnant rapidement un bon résultat sans que l’on soit assuré que ce soit le meilleur (BLAST en fait partie)

– C'est l'approche la plus commune. Cette méthode est rapide et dans la plupart des cas, donne de bons résultats. Elle est utilisée par le programme Clustalw. Clustalw commence par aligner deux à deux les séquences et construit l'arbre des relations évolutives entre les séquences. Les nœuds entre les branches représentent les alignements deux à deux et la racine représente l'alignement complet. Une fois cet arbre construit, le programme prend les deux séquences les plus proches et commence l'alignement multiple (l'alignement des séquences les plus proches est le plus fiable). Puis il progresse vers les séquences plus distantes, et remonte ainsi l'arbre. Ce programme est rapide pour un nombre raisonnable de séquences longues et plus lent si on aligne un grand nombre de séquences courtes.

Soit 4 séquences s1, s2, s3 et s4

1) Réalisation de l'alignement deux à deux des séquences avec calcul d'un score : on obtient donc une distance pour chaque couple.

2) Construction d'une matrice de distances.

s1 s2 s3 s4

s1

s2 d3

s3 d1 d4

s4 d5 d2 d6

3) Elaboration d'un dendrogramme qui donnera l'ordre de l'alignement multiple On considère que d1 < d2 < d3 < d4 <d5 < d6

S4 S3 / \ S1 / \ / S2 / C1 \ / \ C2 \ / \ / C3

4) Construction successives de consensus permettant de remonter dans l'arbre a. -------------------------- S3 -------------------------- S1 ------------------------- C1 b. -------------------------- S2 -------------------------- S4 ------------------------- C2 c. ------------------------- C1 --------------------- ---- C3 -------------------------- C3

****** MULTIPLE ALIGNMENT MENU ****** 1. Do complete multiple alignment now (Slow/Accurate) On peut utiliser un ancien dendrogramme

pour guider l'alignement initial ou seulement produire ce dendrogramme sans aller jusqu'à l'alignement multiple

2. Produce guide tree file only 3. Do alignment using old guide tree file 4. Toggle Slow/Fast pairwise alignments = SLOW 5. Pairwise alignment parameters contrôle la vitesse et la sensibilité de l'alignement initial 6. Multiple alignment parameters contrôle les gaps dans l'alignement multiple final

Dans ce menu, on peut choisir la vitesse avec laquelle on veut que l'alignement se fasse : - Méthode lente mais précise : cette méthode est très lente pour un grand nombre (> 100) de longues séquences (>1000 résidus). - Méthode rapide mais plus approximative.

7. Reset gaps before alignment? = OFF cela permet d'effacer tous les gaps d'un alignement et de le refaire en modifiant certaines options (ON). Si cette option est OFF, les nouveaux gaps seront conservés si un second alignement est réalisé (Parfois, un deuxième passage voire un troisième améliore la qualité de l'alignement).

8. Toggle screen display = ON Les résultats sont envoyés à la fois à l'écran et dans un fichier de sortie.

********* PAIRWISE ALIGNMENT PARAMETERS ********* Slow/Accurate alignments: Si on augmente les pénalités d'ouverture et d'extension des gaps, ceux-ci seront

moins fréquents (Gap open Penalty) et plus courts (Gap Extension Penalty).

1. Gap Open Penalty :10.00 2. Gap Extension Penalty :0.10 3. Protein weight matrix :Gonnet series matrice de scores donnant la similarité des acides aminés les par

rapport aux autres. On peut choisir entre BLOSUM 30,PAM 35, Gonnet 250, la matrice identité

ou une matrice personnelle. 4. DNA weight matrix :IUB matrice de scores pour les acides nucléiques.

Fast/Approximate alignments: Si on augmente la taille des k-tuples, la vitesse augmente tandis que si on la diminue, c'est la précision qui augmente. [les maximum sont de 2 pour les protéines et 4 pour les

acides nucléiques] 5. Gap penalty :3 cela n'a que peut d'influence sur la rapidité de l'alignement sauf pour des valeurs

extrêmes.

6. K-tuple (word) size :1 7. No. of top diagonals :5 nombre de k-tuples qui matchent sur chaque diagonale (dans un dotplot imaginaire) et seuls les meilleurs sont utilisés pour l'alignement. Une diminution de ce paramètre rend l'alignement plus rapide tandis qu'une augmentation améliore la sensibilité.

8. Window size :5 9. Toggle Slow/Fast pairwise alignments = SLOW

********* MULTIPLE ALIGNMENT PARAMETERS ********* 1. Gap Opening Penalty :10.00 2. Gap Extension Penalty :0.20 3. Delay divergent sequences :30 % donne le seuil au-dessus duquel l'alignement

est retardé : ainsi, si une séquence donnée est plus de 30% différentes des autres, son alignement est remis à plus tard

4. DNA Transitions Weight :0.50 (poids des transitions A <-> G, C <-> T) : Un poids de zéro signifie que les transitions seront considérées comme des mismatches. Pour des séquences éloignées, ce poids doit être proche de zéro tandis qu'il est égal à 1 pour des séquences très proches

5. Protein weight matrix :Gonnet series 6. DNA weight matrix :IUB 7. Use negative matrix :OFF 8. Protein Gap Parameters

********* PROTEIN GAP PARAMETERS ********* 1. Toggle Residue-Specific Penalties :ON Ce sont des pénalités sur certains acides aminés.

Ces pénalités augment ou diminuent la probabilité d'ouverture d'un gap selon la position sur la séquence. Par exemple, les positions riches en glycine seront plussouvent adjacentes à un gap que les positions riches en valine

2. Toggle Hydrophilic Penalties :ON augmente la probabilité d'avoir des gaps dans les régions hydrophiles correspondant souvent à des boucles ou des coils

3. Hydrophilic Residues :GPSNDQEKR 4. Gap Separation Distance :4 ce paramètre tente de diminuer les risques d'avoir des

gaps trop proches les uns des autres. Les gaps qui sont plus proches que cette distance sont plus pénalisés que les autres. Cela n'empêche pas d'avoir des gaps très proches, cela les rend seulement moins fréquents, donnant une apparence de blocs à l'alignement.

5. Toggle End Gap Separation :OFF Si ce paramètre est sur OFF, les gaps en fin de séquences sont ignorés, ce qui est utile lorsque l'on veut aligner des fragments où les gaps terminaux n'ont pas de signification biologique.

****** PROFILE AND STRUCTURE ALIGNMENT MENU ****** 1. Input 1st. profile 2. Input 2nd. profile/sequences 3. Align 2nd. profile to 1st. profile permet d'aligner deux alignements déjà existants

(même si chacun d'eux ne contient qu'une séquence) 4. Align sequences to 1st. profile (Slow/Accurate) permet d'ajouter une (ou une série de )

nouvelle séquence à un alignement déjà existant. L'intérêt de ce choix est double :

- on peut ainsi construire un alignement de façon progressive en ajoutant de nouvelles séquences (souvent, seul un petit nombre de séquences sont à l'origine de nombreux mésappariements : on pourra les ajouter seulement à la fin). - on peut avoir un alignement de référence sur lequel on aligne les nouvelles séquences.

5. Toggle Slow/Fast pairwise alignments = SLOW 6. Pairwise alignment parameters 7. Multiple alignment parameters 8. Toggle screen display = ON 9. Output format options 0. Secondary structure options

********* SECONDARY STRUCTURE OPTIONS ********* 1. Use profile 1 secondary structure / penalty mask = YES 2. Use profile 2 secondary structure / penalty mask = YES 3. Output in alignment = Secondary Structure 4. Helix gap penalty :4 5. Strand gap penalty :4 6. Loop gap penalty :1 7. Secondary structure terminal penalty :2 8. Helix terminal positions within :3 outside :0 9. Strand terminal positions within :1 outside :1

Si une structure secondaire existe elle peut être utiliséePour guider l’alignement

****** PHYLOGENETIC TREE MENU ****** La méthode utilisée est la méthode du Neigbour-Joining (NJ) développée par Saitou et Nei : on calcule d'abord la distance (proportionnelle à la divergence) entre toutes les paires de séquences de l'alignement puis on applique la méthode de NJ sur la matrice de distance.

1. Input an alignment 2. Exclude positions with gaps? = OFF si ce paramètre est sur ON, alors

toutes les positions auxquelles n'importe laquelle des séquences possède ungaps seront ignorées : cela a pour conséquence de perdre une grande quantité d'informations si l'alignement contient de nombreux gaps.

3. Correct for multiple substitutions? = OFF pour des séquences faiblement divergentes (<10%), cette option n'a pas d'intérêt. pour des divergences plusimportante, cela corrige le fait que les distances observées sous-estiment lesdistances évolutives. Cette option à pour effet de raccourcir les longues branches d'un arbre et doit toujours être utilisée mais il faut savoir que pourdes séquences très divergentes, les distances ne peuvent pas être relier de façon convenable

4. Draw tree now 5. Bootstrap tree cette méthode statistique permet d'estimer la confiance que l'on peut

avoir dans l'arbre obtenu. Cette méthode génère un échantillonnage aléatoire à partir des données initiales puis compte combien de fois chaque regroupement de l'arbre initial se retrouve dans l'échantillonnage. 6. Output format options

• Clustalw– La comparaison simultanée de plusieurs séquences est un outil

très utile pour mieux comprendre la structure et l'évolution des protéines et des acides nucléiques mais il faut rester critique au niveau des résultats : l'alignement optimal calculé par ordinateur est rarement le meilleur au sens biologique.

– Il faut toujours vérifier un alignement avant de passer à l'étape suivante (phylogénie par exemple) et il peut être nécessaire de le corriger.

– Il faut également savoir que l'ordre des séquences dans le fichier d'entrée joue un rôle important.


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