Approche de traitement du probleme de la caracterisationdes mouvements des objets microscopiques

Gerard Roblin, Michel Allain et Michel Prevost

In the field of biology there are many problems that call for microscopic image analysis. Prominent amongthese is the study of the change of shape and of the motion of single cells. Such changes are difficult to ana-lyze in real time; taking series of photographs, for example, and evaluating these photographs by microdensi-tometry and subsequent computer analysis are rather time-consuming processes. We present here anothersolution to this problem, using equipment that should be available even in the modestly equipped laborato-ry: a microscope, a scanning system such as a video monitor, and a microcomputer that can be interfacedwith the scanner. The necessary procedures of data acquisition and data processing are discussed in de-tail.

1. Introduction

Les recherches biomedicales ouvrent un large do-maine d'applications aux m6thodes d'analyse d'images.L'int6r~t des experimentateurs porte soit, pour uneimage statique A un instant donne, sur l'analyse desformes, la determination des dimensions, le dosage desconstituants, la numeration des 6l6ments, la statistiquedes anomalies .. ., soit, pour une image dynamique, surl'6volution d'un ph6nomene dans le temps se traduisantpar des variations de forme, des ractions chimiques,des destructions ou multiplications, des d6placements.... Ce dernier probleme de caract6risation du d6-placement d'une cellule biologique trouve notammentson application en lectrophoresel,2 et en chimiotac-tisme.3 ,4

En presence d'un tel dplacement, le biologiste nepeut effectuer qu'une simple observation continue vi-suelle, tlevisuelle ou cinematographique, ce qui l'ameneA une bonne interpretation du phenomene sans pouvoirn6anmoins en chiffrer exactement les parametres.Pour y parvenir, it est ncessaire de traiter une suited'images instantanees du ph6nomene. L'emploi demicroscopes dot6s d'equipements d'analyse d'imagesest peu adapt A ce probleme. Tres performants du faitqu'ils peuvent m6moriser un grand nombre de niveauxpour un grand nombre de points, ils and imposent, par

The authors are with Institut d'Optique, Laboratoire associ auCNRS, Centre Universitaire d'Orsay, B.P. 43, 91406 Orsay CEDEX,France.

Received 15 January 1983.0003-6935/83/142177-05$01.00/0.© 1983 Optical Society of America.

la multiplication du nombre d'images A traiter, d'aug-menter d'autant la capacit6 m6moire. I est encorepossible d'enregistrer des images successives sur unsupport photosensible et d'obtenir les informationsapres densitom6trie des cliches et traitement desdonn6es A l'aide d'outils pouvant tre localis6s A l'ex-t6rieur du laboratoire. Ce procede, qui offre egalementla possibilite de multiples niveaux, conserve la rsolu-tion microscopique plus facilement accessible au sup-port photosensible qu'A un rcepteur video. Par contre,par rapport A l'emploi de microscopes analyseurs, il estplus lent, compte tenu des operations de prise de vue etdes temps de transfert entre les differentes machines.Un autre inconvenient est dui au fait que l'observateur,ne conservant pas la maitrise de l'experience au coursde ses diff6rentes tapes, peut se heurter A un rsultatfinal peu significatif provoquant nouveau retard etsurcout entraine par l'obtention d'une nouvelle prepa-ration microscopique. Aussi, bien souvent, le chercheurse contente-t-il de visualiser l'6cran d'un moniteur etde porter sur un transparent (forme nouvelle de lachambre claire) les contours successifs de la cellulechoisie. La sorte de chaine qu'il obtient ainsi lui rest-itue les deformations de la cellule dans le temps, satrajectoire, ses variations de vitesse suivant que lachaine est plus ou moins serree, l'interet qu'elle porteau message regu suivant qu'elle se dirige vers son butplus ou moins vite, par un trajet plus ou moins long,qu'elle l'atteigne ou s'en desint~resse. Ces informationspeuvent ensuite tre quantifi6es A partir de mesuressimples suffisamment precises.

Le but de notre travail est de faciliter cette proc6dure.Tout en laissant au chercheur sa pleine capacit6 dob-servation et d'interpr6tation, nous avons tente de r-soudre ce probleme de restitution de trajectoire et de

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calcul de ses caracteristiques par l'usage de moyensrestant economiquement accessibles A la plupart desequipes.

II. Position du probleme

L'objet, typiquement de phase, est une cellule biol-ogique vivante (un leucocyte, par exemple) de l'ordred'une dizaine de micrometres de diametre moyen. Sonobservation, necessitant un microscope muni du con-traste interferentiel ou de phase permettant l'obtentiond'un contraste suffisant pour des niveaux lumineuxrestant nanmoins faibles, est possible A l'aided'objectifs 40/0.65 ou 63/0.85 de resolutions respectives0.4 et 0.3 ,um dans des champs de diametre 375 et 250,im. Le rep6rage des cellules exige la connaissance descoordonn6es spatiales d'un certain nombre de points luiappartenant, ce qui n6cessite l'acquisition par balayaged'une trame de points inscrite dans le champ (nouschoisirons une trame telle que son nombre de lignes soitegal aux trois-quarts du nombre de points par ligne).

En fait, la determination de la trajectoire ne nousimpose que la connaissance, A intervalles de tempsegaux, des coordonn6es du centre de gravit6 de la sur-face qu'elle occupe ou, dans une approximation suffi-sante, de son contour. De meme, les informations surl'evolution de sa forme n'imposent de mettre en m6m-oire que les points de ce contour. Eu egard aux aleasde ces phenomenes, il n'est pas necessaire en fait d'an-alyser l'image avec toute la resolution que requiert sonobservation. L'intervalle entre les points de la tramepeut donc tre sup6rieur A la limite de resolution del'objectif. L'6tude des variations du rapport de cetintervalle A cette limite en fonction du nombre de pointspar ligne d'une trame strictement inscrite dans le champ

*des objectifs biologiques classiques (fig. 1) montre qu'iln'est pas necessaire de d6passer 512 points par ligne.Pratiquement, l'analyse suivant 256 points est memesuffisante, car l'intervalle entre les points (47 m dansle plan de l'image interm6diaire) est du meme ordre degrandeur que le diametre du premier anneau de la tachede diffraction de l'objectif, dimension minimale quepeut avoir le point d'analyse.

S'il est besoin d'acqu6rir la position des points ap-partenant ou non A l'objet, il n'est pas utile par contrede prendre en compte leurs differents niveaux pho-tom6triques. Deux seuls niveaux suffisent pour dif-f6rencier les points suivant qu'ils appartiennent au fond(0, par exemple) ou aux cellules (1, par exemple). Ense fixant un seuil, il suffit donc de remplacer (fig. 2) lesignal photom6trique obtenu par balayage (a) par unsignal binaire (b), ce qui peut etre obtenu A l'aide d'uncircuit comparateur. C'est finalement ce signal qui estechantillonn6 en une suite d'impulsions 0 ou 1 suivantque les points n'appartiennent pas ou appartiennent Ala cellule (d). Ceci peut tre obtenu A l'aide d'unehorloge (c) associee A la base de temps pilotant le ba-layage dont la fr6quence f est d6termin6e par le nombreN. de points de la ligne et la vitesse de balayage ou laperiode T, de la base de temps ligne (f = NITx). Lecomptage des periodes de l'horloge pendant le balayage

k

4

10/0,2525 /0,40;40/0,65

2

1

256 512 1024 2048 NXFig. 1. Variations du rapport de l'intervalle entre points d'analyseA la limite de resolution en fonction du nombre de points par ligne

pour les objectifs de microscope les plus classiques.

VA

,~R

VB

VH

1~~~~~~~~~~0 l1l1l1 lIIII1 llII.... IIIIIII d

Fig. 2. Aprbs comparaison A un signal de rference VR, le signalanalogique de balayage VA est transforme en un signal binaire VB.

Son association A un signal horloge VH est equivalente A un signal VE

A l'entrbe de l'ordinateur compose d'une suite de bits 0 et 1.

complet d'une image suffit A determiner les coordonn6esdes points echantillonnes.

Le probleme consiste alors A traiter ces donnees avecdes moyens informatiques l6gers. Travailler en tempsr6el exige une capacit6 m6moire disponible minimalepermettant le traitement d'une image, c'est-a-diresuffisante pour stocker l'ensemble de ses points et poureffectuer le programme de calcul dont la complexited6pendra du nombre de cellules ventuellement enmouvement. S'il en est ainsi, la vitesse d'acquisitionde l'ordinateur fixe la vitesse de balayage maximale, etle temps de calcul d6termine l'intervalle minimal entredeux images. Le probleme peut donc 8tre r6solu si ceslimites sont compatibles avec la vitesse d'evolution duph6nomene que l'on cherche A quantifier, et c'est cettepremiere approche qui sera pr6sent6e dans la suite decet article. Au contraire, si la vitesse de balayage doit8tre augmentee afin de ne pas d6former notablementl'image des cellules, ou si la cadence de prise de vue doit1'tre si leurs d6placements sont rapides, des moyensinformatiques lents ne sont plus adapt6s. I faudra leuradjoindre des memoires plus ou moins rapides, capablesd'accumuler une suite d'images pouvant alors tretrait6es successivement en temps diff6r6 par l'ordina-teur. Dans ces conditions, la vitesse de balayage pou-vant 8tre rapide et les microscopes 6tant de plus en plussouvent munis d'une sortie t6levisuelle, il sera alorspossible d'operer le traitement directement A partir d'unsignal video.

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A ~ ~ ~ ~ ~ ~ A

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Fig. 3. Organigramme de l'experience jusqu'a l'entr6e del'ordinateur.

I11. Elaboration et acquisition des donnees

Afin d'adapter facilement la vitesse de balayage A lavitesse d'acquisition de l'ordinateur, nous avons utilis6pour ces premieres experiences (fig. 3) une methoded'analyse par flying-spot. 5 Le spot du tube analyseur(FS) est projet6 sur l'objet (A) par le microscope (MC).Les dimensions utiles de l'ecran (9 X 11 cm2 ) et celle duspot (0.3 mm) sont parfaitement compatibles avec cellesdu champ de l'instrument et du point d'analyse, legrandissement entre plans de l'image intermediaire etde l'ecran du tube analyseur etant de l'ordre de 8. Leflux lumineux transmis A chaque instant, c'est-A-direen chaque point, par l'objet est recueilli par un pho-tomultiplicateur (PM) dont la surface photosensible estconjuguee de la pupille de l'instrument. Ce rcepteurfournit le signal photometrique analogique transformepar un circuit comparateur (CR) dont la tension deref6rence est ajustee en fonction des caracteristiquesd'eclairement de l'image, en un signal A deux niveauxdisponible A l'entre de l'ordinateur. Ce dernier, detype HP85 poss6dant une mmoire centrale de 32Koctets, est dot6 d'un cran de visualisation dont lad6finition graphique de 192 lignes de 256 points estparfaitement compatible avec les besoins de l'exper-ience, pouvant servir de moniteur auxiliaire. Le tempsd'acquisition d'un bit est de l'ordre de 0.4 msec, soitenviron 20 sec pour l'ensemble de la trame.

Les g6n6rateurs de balayage ligne (X) et image (Y)commandant les dispositifs de deviation des tubes an-alyseur (FS) et moniteur (TM) sont adaptes aux exi-gences de l'exp6rience. D'une part, ils permettentd'obtenir une trame unique (192 X 256) en une vingtainede secondes dclench6e par l'exp6rimentateur ou parle calculateur (Dec.). D'autre part, ils assurent l'affi-chage d'une trame plus serree A la cadence de 25 imagespar seconde pour permettre la mise au point et le ca-drage de l'objet (Rel). De plus, ils dlivrent des signaux

auxiliaires assurant un certain nombre de fonctionstelles l'extinction des spots pendant les retours de ligne,la coincidence du debut de la premiere ligne avec led6but du balayage image, la commande de l'horloge (H).Celle-ci, de frequence reglable, engendre 256 impulsionspar ligne comptees par le compteur (CT) et mises enforme par le circuit (MS). Ces impulsions, associees ausignal video binaire fourni par le comparateur, creentla suite de bits 0 et 1.

L'ordinateur pouvant lire ces informations parpaquets de 8 bits (d6finissant chacun un caractere),6 ilest n6cessaire de transformer cette information srie enune information parallele sur 8 bits par l'interm6diaired'un registre A dcalage commande par le compteur.Ainsi l'image complete formee d'une suite de bits rep-6r6s spatialement par leurs rangs de comptage est-elletransform6e en une suite de 6144 caracteres corres-pondant chacun A 8 points successifs. Ce sont cesdonnees qui sont entres dans le calculateur.

La restitution de l'image binaire acquise est alorspossible [fig. 4(a)]. Ces informations, stockees surbande, peuvent ventuellement tre trait6es ult6r-ieurement en fonction du probleme pose, tel, parexemple, la restitution des contours des zones de niveaudifferent de celui du fond [fig. 4(b)].

IV. Traitement des donnees

Le programme utilise permet l'acquisition, soit di-rectement A partir du signal de balayage, soit A partird'un fichier. Dans le premier cas l'image peut trestockee ou traite suivant le probleme A rsoudre. Sil'image choisie est jug&e inint6ressante, il y a retour auprogramme d'acquisition.

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Fig. 4. Restitution de l'image binaire d'une diatomee (a) et de sescontours (b).

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6 7 8

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4 3 2

Fig. 5. Procedure de restitution d'un c

L'information sur la deformation ou le d6placementde la cellule peut 8tre deduite de la restitution des im-ages successives de son contour ou, avec une approxi-mation suffisante, des positions successives du centrede gravit6 de ce contour. Ces deux rsultats sontfournis par un seul sous-programme. Par balayage del'image, le premier point Mi non nul est recherche; c'estle premier bit non nul du premier caractere non nul. Lepoint suivant M+±1 du contour appartient aux huitvoisins de Mi rep6r6s dans les j(i) directions num6rotees1 A 8 (fig. 5). Il est recherch6 par balayage de ces pointsA partir de la direction n° 1. Le point Mi+l sera quantA lui recherche par balayage des directions autour deMi+1 A partir de la direction suivant imm6diatementcelle de Mi, et ainsi de suite jusqu'A fermeture du con-tour en un point Mi+n confondu avec M,. 7 Les coor-donn6es du centre de gravite sont les moyennes arith-metiques des coordonn6es des points du contour. Ladifference obtenue par rapport au centre de gravit6 dela surface occupee par la cellule est peu significative euegard aux formes relativement simples qu'elle prend.Prendre en compte toute la surface n6cessite de pour-suivre le programme contour sans comparaison descoordonnees de Mi+, A celles de Mi, ce qui a pour effetde decrire l'ensemble des points de la cellule selon unespirale convergente et augmente singulierement letemps de traitement. Par contre le calcul de la surfaceoccupee est obtenue ais6ment par simple comptage deses points. Le p6rimetre, quant A lui, est egal au nom-bre de points constituant le contour affectes de la norme1 ou -\/2 suivant qu'ils sont dans des directions j d'ordreimpair ou pair.

Le temps necessaire a la recherche du contour et aucalcul de son centre de gravit6 est de l'ordre de 20 sec.Compte tenu d'un temps de balayage image du memeordre, cela fixe une cadence minimale d'une imagetoutes les 40 sec, qui convient parfaitement A l'6tude dumouvement d'une cellule se dplacant en moyenned'une longueur de l'ordre de son diametre parminute.

La fig. 6 illustre une simulation macroscopique de laprocedure effectuee A l'aide d'un banc d'analyse declich6s photographiques par flying-spot. 8 La restitu-tion de l'ensemble des images rend compte A la fois dud6placement de la cellule et de l'evolution de sa forme.Ces informations sont plus facilement interpretables

0 0 0Ml

1 M6 it I0* 0 0 0| /M5 _M2/ t010-*

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0 -0 O*separement tant par le trac6 de la trajectoire du centrede gravite, dont il est possible de calculer les parametres,que par la restitution des images binaires indivi-duelles.

V. Conclusions et perspectives

Nous avons presente une approche de resolution d'unprobleme de caract6risation de mouvements d'objetsmicroscopiques. Ce travail n'a d'autre motivation quede mettre au point les techniques de balayage et d'e-chantillonnage d'une image, de mise en forme d'unsignal vid6o utilisable pour le traitement informatique,ainsi que de tester un premier programme de restitutionet de calcul. I n'est pas encore complet, en ce sens qu'ilne permet d'acceder qu'A des ph6nomenes relativementlents et ce d'autant plus qu'il n'a e question que d'uneseule cellule. La prise en charge d'un plus grandnombre de cellules mobiles n6cessite un programmeplus complexe permettant leurs reconnaissances indi-viduelles, une capacit6 m6moire plus gande et un tempsde traitement plus long, ce qui entraine une cadence desaisie d'information plus faible. D'autre part, il est6vident que l'association du syst6me flying-spot fa-vorable A la mise au point des circuits n'est pas conce-vable au plan operationnel par le surcoit d'equipementqu'elle entraine. Il est donc pr6ferable d'appliquer lestraitements de signal tudi6s directement au signalvideo fourni par un circuit tel6vision d6livrant A la foisles voies visualisation et num6risation. On ne peut qu'ygagner en cadence de prise de vue et acceder ainsi A desph6nomenes plus rapides. Dans ce cas, le calculateuretant trop lent et par ailleurs de capacit6 trop faible, ilest n6cessaire d'utiliser des m6moires auxiliaires d'accesplus rapide permettant le stockage de plusieurs imagessuccessives trait6es ulterieurement sparement. Parcontre, dans la mesure o le phenomene reste suffi-samment lent pour que la cadence de saisie d'informa-tion soit faible et ou la capacite du calculateur soit suf-fisante pour traiter un champ ou plusieurs cellules sontmobiles, il pourra aussi etre avantageux d'utiliser unconvertisseur de balayage stockant une image t6l6visionpouvant etre relue lentement. Ces deux possibilit6s encours d'experimentation n'entrainent pas de surcoutprohibitif pour r6soudre le probleme.

Il faut aussi noter que le mode de traitement du signalvideo permet l'acces A d'autres informations que l'an-

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Fig. 6. Exemple de restitution de la trajectoire et de l'evolution de la f

alyse des mouvements et des deformations. En faisantvarier le signal de rf6rence du comparateur, suivant,par exemple, une loi lin6aire ou logarithmique, il estpossible d'analyser en niveaux de transmission ou dedensite les 6lements d'une preparation microscopique.On peut ainsi dlimiter et mesurer les surfaces de zonescomprises entre deux niveaux donn6s, ou de niveau in-ferieur ou sup6rieur A un niveau donn6, et par lA 6valuerdes volumes ou des concentrations de matiere pour desobjets fixes ou mobiles, d'ou les variations de ces gran-deurs tant dans le temps que dans l'espace.

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