UE9 Agent infectieux Lundi 09/03/2020 à 14h00 Ronéotypeuse : Niousha Ronéoficheuse : Marie-Aimée

TP N°2

Observations microscopiques Lecture d’antibiogramme Diagnostic

du paludisme sur frottis

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I. Résultats de l’examen du collet dentaire (sur gélose au sang) II. Résultats de l’ECBUIII. La CMIIV. Le paludismeV. Observation microscopique de 2 champignons unicellulaires à l’encre de Chine

Plan et objectif

– Examen de la gélose ordinaire contaminée par l'air. – Examen de la gélose au sang ensemencée avec le prélèvement de collet dentaire. – Diagnostic d'infection urinaire interprétation : Gélose CLED : lecture de la numération

bactérienne. – Antibiogramme : lecture – Examen microscopique de lames colorées. – Démonstration :

• Galeries d'identification des entérobactéries • Les milieux de culture (gélose au sang, gélose « chocolat », Drigalski, etc.) • Antibiogramme et CMI par E-test • Culture de pneumocoque, streptocoque B, staphylocoque, entérobactéries.

– Lecture de frottis sanguins parasités par Plasmodium sp. – Démonstration du test rapide de détection d’Ag – Observation microscopique du cryptocoque

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I. Résultats de l’examen du collet dentaire (sur gélose au sang)

Flore oro pharyngée

- Dans la flore oro-pharyngée, il y a majoritairement du Streptocoque, Moraxella et Neisseria. Plus rarement, on trouve des Staphylocoques, Haemophylus et Corynebacterium. Des bactéries anaérobies sont parfois présentes : Actinomyces et Fusobacterium.

Les streptocoques

Les streptocoques sont des cocci Gram + en chaînettes retrouvés dans les flores oropharyngée et digestive. Pour être cultivés ils nécessitent une gélose au sang, d’où ils tirent leurs nutriments

Il existe 2 types de streptocoques : Streptocoques α-hémolytiques =commensaux et Streptocoques β-hémolytiques =colonies pathogènes capables d'hémolyser le sang → Lorsque l’on a un streptocoque β, on lance un sérogroupage de Lancefield pour ide ntifie r le streptocoque pathogène (par ex les streptocoques A donnent des angines)

NB : il existe une bactérie streptocoque α hémolytique pathogène : le pneumocoque →pneumonies, otites, méningites. Il existe des streptocoques poussant sur des géloses ordinaires : les entérocoques (streptocoques D), très présents dans le tube digestif.

Observation des lames colorées au

Gram - rappel

• Utilisez l’objectif marqué « 100 »

• Pour obtenir une image nette, il faut déposer une goutte d’huile entre l’objectif et la lame

• Utiliser la roue macrométrique jusqu’à ce que l’objectif touche la goutte d’huile, puis la roue micrométrique jusqu’à obtention d’une image nette

I. Résultats de l’examen du collet dentaire (sur gélose au sang)

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Examen direct - GRAM

• Coloration de Gram: Violet de gentiane -> décoloration (alcool+acétone) -> contre coloration rose

(fuchsine) – Bactéries à Gram positif : colorées en violet – Bactéries à Gram négatif : colorées en rose

. En clinique, ce sont les bacilles Gram qui entraînent le plus de problèmes, les bacilles Gram+ en entraînent moins(ex: lactobacilles dans la flore vaginale) Les Cocci Gram + les plus gênants sont les staphylocoques et les streptocoques.

Les différentes familles

Bactéries invisible au Gram

- Mycobactéries (BAAR: coloration de Ziehl) - Mycoplasmes (absence de paroi) - Spirochètes (très fins, ne poussent pas: vus uniquement en microscope à fond noir) - Chlamydiae (intracellulaires stricts)

Ne pas confondre cellule humaines

et bactérie

I. Résultats de l’examen du collet dentaire (sur gélose au sang) I. Résultats de l’examen du collet dentaire (sur gélose au sang)

II. Résultats de l’ECBU

Objectif Numération des colonies après ensemencement de 10 µL (anse/öse calibrée)

II. Résultats de l’ECBU

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Pour l’infection urinaire, 2 critères très importants : -présence de leucocytes (à l’examen direct) ? -numération des bactéries dans l’urines (après mise en culture) : il y a des seuils (dépendant du sexe du patient et du germe) La quantification est un élément très important du diagnostic d’infection urinaire. Il permet de différencier une infection urinaire basse :cystite (chez la femme essentiellement) ou prostatite d’une pyélonéphrite.

On exprime le résultat en UFC/mL pour Unité s Formant Colonies par mL d'urine. On compte dans la boîte de Petri les colonies formées. Nous avions prélevé un échantillon de 10µL. Pour exprimer le résultat en mL, il suffit alors de multiplier par 100 le nombre de colonies comptées (car il faut multiplier par 100 pour passer de 10 µL à 1 mL). → Donc si on a 10 colonies dans la boîte, on a 103 UFC/mL.

II. Résultats de l’ECBUII. Résultats de l’ECBU

II. La concentration minimale inhibitrice (CMI)

La concentration minimale

inhibitrice (CMI)

La plus faible concentration d’antibiotique capable d’inhiber toute croissance visible de la souche testée après 24h de contact.

Technique de référence en milieu liquide :

On prend différents tubes avec des doses croissantes d'antibiotiques mises en contact avec une suspension de bactéries. On place le tout dans une étuve pendant la nuit. Le lendemain, on regarde le tube avec la concentration la plus faible d'ATB pour laquelle on observe un arrêt de la croissance des bactéries. Limite : c'est difficilement réalisable en milieu hospitalier car cela implique d’utiliser 10 tubes à essai par molécule d’antibiotique. Or, il y a 32 molécules... Il faut donc faire quelque chose de plus facile à interpréter pour le laboratoire, ce qui est permis par l'antibiogramme.

Par contre pour un patient donné qui est atteint d'une maladie grave comme une septicémie que l'on veut traiter par ATB, on peut détermine de manière précise la CMI via l’E-Test.Une bandelette graduée et déposée au contact de la bactérie dans une boîte et elle libère un gradient de concentration d’ATB. On la laisse incuber une nuit puis on lit au niveau de l'ellipse la CMI.

II. La concentration minimale inhibitrice (CMI)

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Exemple

Antibiogramme

! Définition : Système permettant de définir la sensibilité ou la résistance d’une bactérie donnée à plusieurs antibiotiques.

! But : Tester la sensibilité (S) / résistance (R) de la bactérie vis-à-vis de plusieurs antibiotiques.

! Principe : Mesure du diamètre d’inhibition de la culture autour d’un disque imprégné d’antibiotique. Si la bactérie pousse au contact du disque, la bactérie est résistante. Si elle ne pousse pas, on a un diamètre d'inhibition, plus il est grand, plus la bactérie est sensible.

Corrélation entre diamètre et CMI

Il existe des tables de concordance permettant de dire que pour une bactérie donnée, avec un antibiotique donné, on a un diamètre d'inhibition autour de la molécule qui correspond à la CMI. Certains diamètres présentent des problèmes d’interprétation d'où la nécessité de créer de courbes de concordance entre CMI et diamètre. Les sociétés savantes ont créé pour chaque bactérie donnée et chaque antibiotique donné une courbe de concordance avec en ordonnée le diamètre d'inhibition en millimètre et en abscisse, la CMI en mg/L. Plus on s'éloigne du disque, plus la concentration d'antibiotique diminue. Lorsqu'on arrive au diamètre d'inhibition, on obtient la CMI. C'est de cette façon que l'on peut savoir si la bactérie est sensible ou résistante pour un diamètre donné. → On a donc des CMI, des courbes de concordance et des diamètres de concordance

II. La concentration minimale inhibitrice (CMI)II. La concentration minimale inhibitrice (CMI)

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IV. Le paludisme

Diagnostic biologique du paludisme : Devant toute fièvre au retour d’un pays d’endémie→ Premier diagnostic à évoquer=PALUDISME Le résultat doit être récupéré dans les 2 HEURES après la suspicion clinique Prélèvement sanguin veineux sur tube d’EDTA

→préciser les renseignements clinico-épidémiologiques (lieu du séjour, date de retour, signes cliniques, prise de prophylaxie anti-palustre (molécule, observance) ).

Méthode de diagnostic 2 techniques microscopiques de référence :

-frottis sanguin : coloré au MGG → diagnostic de l’espèce de Plasmodium -goutte épaisse : technique de concentration,+ sensible, permet le diagnostic des

faibles parasitémies

Lecture microscopique du frottis coloré au MGG-Vérifier la qualité du frottis et de la coloration : hématies bien séparées au niveau des franges, coloration en violet des noyaux des polynucléaires et des lymphocytes. -Parcourir la lame à l’objectif x10 pour un repérage des franges , là où les hématies sont bien séparées, mettre une goutte d’huile et lire à l’objectif x100 pour confirmer la présence de parasites (trophozoïtes et/ou schizontes et/ou gamétocytes).

Interprétation des résultats En cas d’un frottis positif, on identifie l’espèce de Plasmodium ainsi que le stade parasitaire (trophozoïtes et/ou schizontes et/ou gamétocytes). En présence de Plasmodium falciparum, on détermine la parasitémie (pourcentage d’hématies parasitées).

Caractéristiques d’identification de Plasmodium falciparum →dans cette infection on trouve seulement des trophozoïte s et/ou des gamétocytes ds le sang périphérique o hématie parasitée :taille normale o Monomorphisme : 1 seul stade parasitaire(trophozoïte) +/-gamétocytes o Polyparasitisme fréquent : 2à3parasites/hématie o Trophozoïte jeune en bague à chaton (au fin bleu, noyau petit rouge) o Gamétocyte : en forme de faux ou de banane caractéristique de l’espèce falciparum

Frottis sanguin Plasmodium falciparum

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V. Observation microscopique de 2 champignons unicellulaires à l’encre de Chine

Le prof n’en n’a pas parlé je vous met la

diapo

Explication de l’année dernière

Technique pour la réalisation d’un examen à l’encre de chine à la recherche de cryptocoques dans les liquides biologiques :Pour observer les cryptocoques, des champignons unicellulaires pouvant être responsables de méningites, on peut faire une « encre de chine ». Les étapes sont les suivantes : • Mettre sur une lame une goutte d’encre de Chine préalablement diluée au 1/3 dans de l’eau stérile. • Prendre une pipette plastique graduée stérile. • Ouvrir le bouchon du tube avec la main droite (pour les droitiers) en gardant le bouchon entre la paume et l’auriculaire. • Prélever un petit volume du liquide biologique• En déposer une goutte sur la lame à côté de l’encre de Chine. • Refermer le tube. • Jeter la pipette. • Ajouter une lamelle au-dessus des 2 gouttes présentes sur la lame pour réunir les 2 gouttes uniformément et sans bulle. • Lire au microscope•Décrire les microorganismes présents dans les deux liquides biologiques qui vous sont fournis.

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