dr christian carriere laboratoire de bactériologie hôpital arnaud de villeneuve

Dr Christian CARRIERELaboratoire de bactériologieHôpital Arnaud de Villeneuve

GENETIQUE BACTERIENNE

A - Le chromosome bactérien

ADN double brin

« Gènes de la vie »

•Protéines structurales

•Protéines enzymatiques

Le chromosome bactérien

Le chromosome bactérienApplications pratiques

1 - Epidémiologie moléculaire

?? !

“épidémiologieconventionnelle”

“épidémiologie moléculaire”

Principe de l’épidémiologie moléculaire

But : Comparer des isolats bactériens entre eux

Même espèce bactérienne

Coupure par 1 endonucléase

Migration électrophorétique

Profils de restrictionComparaison des profils

= Technique d’électrophorèse en champ pulsé (ECP)

Variations observées sur les profils d’ECP

Profil de référence

Gain (B) et perte (C) d’un site de restrictionsur le fragment de 400 kpb

A B C D E

Insertion (D) et perte (E)

d’un fragment d’ADN sur le fragment de 400 kpb

400 kpb

500 kpb

200 kpb

50 kpb

Nombre de différences par rapport au profil de référence

3 3 2 2

Interprétation de profils d’ECP

Nombre de modifications génétiques par rapport à la souche épidémique

Nombre de fragments différenciant la souche testée de la souche épidémique

Interprétation microbiologique des profils

Interprétation épidémiologique

0 0 Semblables Souche faisant partie de l’épidémie

1 2 – 3 Très proches Souche faisant probablement partie de l’épidémie

2 4 – 6 Proches Souche faisant possiblement partie de l’épidémie

3 > ou = 7 Différents Souche non reliée à l’épidémie

M 1 2 3 4 5 6

48,5

436,5

194

kb

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

48,5

436,5

194

kb

Isolats de Staphylocoques- service N° 1 (1 à 5) et - service N° 2 (6 à 9)

Isolats de Pseudomonas aeruginosa- 1 à 7 : 7 patients différents- 8 et 9 : fibroscope

Epidémiologie moléculaire

Ancienne dénaturation ou

fusion de l’ADN Tm : température de

fusion G - C %

Notion d’espèceTm et G-C %

proches

2 - Identification : genre et espèce (taxonomie)ex : Escherichia coli

Le chromosome bactérienApplications pratiques

=> Espèces rares ou difficiles à identifier par méthodes commercialisées

Séquençage Comparaison de séquences

banques de séquences

d ’ADN

Nom de l ’espèce

Culture PCR ADN r16S,

Taxonomie bactérienne moderne

Analyse d’une séquence sur Internet

1-Aller surun site spécifique

2- Copierla séquence à analyser

3- Envoyerla recherche

Identification d’une bactérie après séquençage

Si le pourcentage est < à 97 % = nouvelle espèce ou nouveau genre

Pourcentage d’identité entre la séquence analysée et la séquencela plus proche de la banque de données

Alignement des 2 séquences

Si le pourcentage est > à 97 % = même genre et espèce

Les plasmides

Fragments d’ADN double brin Circulaires Intra cytoplasmiques Auto réplicatifs Portent des gènes de « survie »

Adaptation à l’environnement Résistance aux antibiotiques +++

B – Les variations génotypiques

Ce sont des modifications du génome bactérien essentiellement dues à des mutations

Pour le clinicien, les applications : Virulence

Résistance acquise aux antibiotiques

Les variations génotypiques

Que se passe t-il au niveau génomique ? Microinsertions et microdélétions

Mutations faux sens : erreur Mutations non sens : codon stop

Mutations ponctuelles Idem ci-dessus

Macroinsertions et macrodélétions Séquence de type IS (séquences d’insertion) Transposons

Gain ou perte de gènes entiers (Résistance ATB)

La résistance a un support moléculaire(exemple des antituberculeux)

ISONIAZIDE katG, inhA, kasA, aphC

RIFAMPICINE rpoB

PYRAZINAMIDE pncA

ETHAMBUTOL embCAB

STREPTOMYCINE rpsL, rrs

Gènes mutés dans la résistance aux anti-tuberculeux (connus…)

Mode d’action : La rifampicine se fixe à la sous-unité de l’ARN

polymérase Empêche l'initiation de la transcription perturbe la synthèse des ARN messagers

Mécanisme de résistance : 95% des souches portent des mutations ponctuelles

dans le gène rpoB entre les codons 511 et 533 Diminution de l'affinité de l'ARN polymérase pour la

rifampicine

Exemple : Mécanisme de résistance à la rifampicine

rpoB511 533

511 533513 516 526 531

Gln Asp His Ser

LeuPro

TyrVal

TyrAspLeuArg

LeuTrp

Mutations dans le gène rpoB

522

LeuPro

Leu

Ser Leu

Pro

Propriétés des variations génotypiques

1 - Spontanéité le mutant résistant préexiste à

l’utilisation de l’antibiotique qui le sélectionne

ATB

ATB

Bactéries sensibles

Population bactérienne

Population bactériennedevenue résistante

Bactéries résistantes à l’antibiotique

Propriétés des variations génotypiques

2 - Rareté Taux de mutation = probabilité d’avoir un mutant

résistant dans une population bactérienne ex : 10-5

Probabilité d’avoir 2 mutants résistants à 2 ATB = produit des probabilités de chaque mutation

Application : Caverne pulmonaire=108 bacilles Rifampicine : Tx mut. = 10-7

Isoniazide : Tx mut. = 10-5

Mutant isoniazide et rifampicine « spontané » = 10-7 x 10-5 = 10-12

Propriétés des variations génotypiques

3 - Stabilité transmissible à la descendance

4 - Inductibilité U.V., mutagènes…

Résistance naturelle : chromosomique

Résistance acquise :

- chromosomiques, secondaires à une mutation

- extra-chromosomiques par acquisition de gènes ex : plasmides

SUPPORT GENETIQUE DE LA RÉSISTANCE

C - Transferts de matériel génétique

Transformation Conjugaison Transduction

Caractéristiques communes à tous ces mécanismes de transfert

Ces transferts d’ADN doivent être suivis de recombinaison génétique

I – La Transformation

Transfert d’un fragment d’ADN en solution d’une bactérie donatrice à une bactérie réceptrice

Ce modèle avait permis de démontrer que l’ADN était le support de l’hérédité en 1944

Expériences de Griffith

La transformation

Exemple : transformation des pneumocoques par de l’ADN provenant de Streptocoques ORL

Les Streptocoques ORL Sont des commensaux de la gorge,

salive… Peuvent porter des gènes de résistance

aux antibiotiques Sont sélectionnés par l’antibiothérapie Transforment les Pneumocoques

= DANGEREUX car les Pneumocoques deviennent à leur tour résistants

II – Conjugaison Processus sexuel strict Contact et appariement Sexes différents, pili sexuels Pont cytoplasmique Transfert d’ADN

chromosomique à sens unique, en général partiel

La conjugaison

La conjugaison : schéma

La conjugaison bactérienne

Intéresse surtout les bactéries à Gram négatif

N’importe quel gène peut être transféré : résistance, virulence …

Principal facteur d’évolution bactérienne

Intéresse aussi l’ADN plasmidique (plasmides conjugatifs)

Transfert de plasmides de résistance par conjugaison

III - La transduction

Transfert de fragments d’ADN bactérien par l’intermédiaire de vecteurs : bactériophages ou « phages »

Les bactériophages sont des virus infectant de façon spécifique les bactéries

Se répliquent dans la bactérie Utilisent la « machinerie cellulaire » Peuvent lyser la bactérie

La transduction

soit conversion lysogéniqueExpression du gène = prophage

Soit cycle lytiqueRéplication du phage

Exemples de conversion lysogénique

Production de toxines = virulence Corynebacterium diphteriae

Toxine diphtérique : diphtérie

Streptococcus pyogenes (groupe A)

Toxine érythrogène : scarlatine

RESISTANCE BACTERIENNE

NATURELLE ACQUISE

Mutations Extra-Chromosomique

ChromosomiqueFixeConstante1 espèce bactérienne1 ATB ou 1 familleTransm. Verticale

ChromosomiqueRareStableSpontanée1 ATB ou 1 familleTransm. Verticale

Éléments Génétiques Mobiles (Plasm., Tn.)FréquentContagieuxPlusieurs ATB = MultiRTransm. Horizontale

Qq souches d’une espèceTend à se répandre