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Principes d’Immuno-histo-chimie et d’Immunofluorescence :

(P. Levillain)

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Principes généraux

• Mise en évidence d’un constituant cellulaire ou tissulaire par une réaction antigène anticorps

• On utilise un anticorps connu qui est dirigé contre un antigène que l’on recherche sur la préparation histologique ou cytologique

• Puis on met en évidence la fixation éventuelle de l’anticorps sur la lame par un chromogène (IHC) ou un fluorochrome (IF)

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1 - LES ANTICORPS

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Les anticorps primaires(ou spécifiques)

• Ce sont les anticorps utilisés pour mettre en évidence la présence de l’antigène recherché

• Il en existe deux types :– Les AC polyclonaux– Les AC monoclonaux

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Production d’anticorps par des animaux hyper-immunisés

ANTICORPS POLYCLONAUX

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Technique des hybridomes

ANTICORPS MONOCLONAUX

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•Milieu HAT

•Hypoxanthine

•Aminoptérine

•Thymidine

•L’aminoptérine bloque une voie métabolique qui peut être contournée par l’utilisation d’hypoxanthine et de thymidine sauf par les cellules du myélome

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AnticorpsPolyclonaux :

Inconvénients : spécificité relative et variable selon le lot

Avantages :

1) coût généralement moins élevé

2) plusieurs épitopes reconnus => marquage plus intense

Monoclonaux :

- spécificité définie

- cette spécificité peut entraîner une moindre sensibilité en cas d’altération des épitopes

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Antigènes masqués par la fixation

• Restauration antigénique– Chauffage des coupes

histologiques (autocuiseur, bain marie, micro-ondes)

– Dans une solution acide ou alcaline selon l’anticorps utilisé

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2 – LA REVELATION DU COMPLEXE ANTIGENE

- ANTICORPS

Immunofluorescence

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Immunofluorescence directe

fluorochrome

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Immunofluorescence à deux étages

fluorochrome

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Microscope à fluorescence (épi-illumination)

14Différents types de fluororochromes

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Echantillon

Antigène

ETAPES

Anticorps secondaire

Traceur

2

Anticorps primaire 1

Méthode indirecte: utilisation d'un ligand

Sensibilité++

Fluorochrome

Diff érents types de réactions I CC

Méthode directe: le traceur est fixé sur l'extrémitéC-terminale de la molécule d' immunoglobuline utilisée pour détecter l'antigène

I mmunoréaction simple et rapide

Localisation précise

Sensibilité --Fluorochrome

Immunofluorescence : Résumé

CryocutSérums utilisés Dépôts des sérums sur lames

DIRECTEINDIRECTE

Incubation en chambre humide

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Immuno-histo-chimie et Immuno-cyto-chimie

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Anticorps primaire conjugué

péroxydase

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PAP

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Autres techniques de révélation

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Streptavidine biotine

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Polymères (type Envision)

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Application (méthode streptavidine-biotine)

• Prélèvements pour histologie standard + IFD en congélation

• Préparation des Coupes

En congélation: 3 à 4 microns, +/- fixation acétone, séchage, rinçage

En paraffine: lames blanches 4 µm puis déparaffinage manuel

bains d’alcool successifs puis démasquage antigénique (auto-cuiseur)

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Application (méthode streptavidine-biotine)

• Technique de révélation classique « streptavidine-biotine-peroxydase »

ETAPES TEMPS D’INCUBATION

Agent bloquant les enzymes endogènes : H2O2 3%

5 min

Anticorps primaire : 1Variable : de une heure à une

nuit

Réactif secondaire biotinylé (Linker) : 2

15 min

Streptadidine-peroxydaseSubstrat ( DAB) : 3

5min

Hématoxyline 3 min

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Résumé du protocole

Déparaffinage Démasquage Crayon hydrophobe Anticorps primaire puis AC secondaire biotinylé

Streptavidine-peroxydase

Substrat + DAB Hématoxyline Montage des lames

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Polymères

• Technique EnVision : amplification par molécule « porteuse »

ETAPES TEMPS D’INCUBATION

Agent bloquant les enzymes endogènes : H2O2

5 min

Anticorps primaire (souris ou lapin)

Variable : jusqu’à une nuit

Polymère marqué à la HRP (peroxydase de raifort)

30 min

Substrat-Chromogène 3,3’-diaminobenzidine (DAB+)

5 min

Contre-coloration à l’Hématoxyline

3 min

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Résumé polymère (Kit EnVision)

Étape 1 : Blocage des péroxydases endogènes

Étape 2 : Anticorps primaire

Étape 3 : Polymère marqué à la HRP

Étape 4 : Substrat chromogène

Étape 5 : Contre coloration à

l’hématoxyline

Incubation

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Technique du double marquage

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Technique de double marquage en microscopie optique

On doit utiliser deux enzymes différentes

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IM et IHCcomparaison

Difficultés et limites

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IMMUNO-FLUORESCENCE :

Avantage : faible coût et technique facile et rapide

mais - ne permet pas la conservation des lames

- peu informative sur la morphologie

IMMUNO-HISTOCHIMIE :

- permet d’apprécier la morphologie des lésion

- permet la conservation des lames

IF / IHC

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Fixation/Congélation

Type d’antigène Tissu fixé Tissu congelé

Ag extra cellulaire

+/- +

Ag membranaire Svt - +

Ag intra cellulaire + +

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PB = extra cellulaire

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Vascularite

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HMB 45Marqueur des mélanosomes (cytoplasmique)

Chromogène : fast red

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RP et noyaux

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Difficultés liées à la technique

Fluorescence :

- découplage du fluorochrome (bruit de fond)

(=> diminution bruit de fond par Bleu Evans)

- fluorescence spontanée (f. élastiques, glandes sudorales…)

- fixation sur des protéines d’origine sérique (lupus)

- fixation par des protéines électronégatives (donc tamponner en pH alcalin, bloquer les sites)

- « fading » (conservation au froid et obscurité, lecture rapide, montage en milieu alcalin et glycériné)

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Difficultés liées à la technique

IHC :

- peroxydases endogènes

- biotines endogènes

- zones de nécrose

- absorption passive (histiocytes)

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Difficulté non liée à la technique

- un antigène peut posséder un ou plusieurs épitopes en commun avec un autre Ag (réactions croisées)

- CD 10 (cALLA) et cellules du rein

- CD 56 (NCAM) cellules NK et tumeurs neuroendocrines