Vectorologie

Utilisation des systèmes viraux comme vecteurs d’expression de

gènes

Etienne Decroly, CNRSEdecroly@free.fr

Utilisation des systèmes viraux comme vecteurs d’expression de gènes

Les virus constituent des systèmes d’expression spécialisés

Question ?

Peut-on les utiliser pour exprimer selon nos besoins des protéines d’intérêt dans une cellule cible?

Oui, les virus sont à l’origine de plusieurs systèmes d’expression utilisés à ce jour

Thérapies génique biotechnologies

Exemples : phage displayvecteurs d’expression viraux vaccination

Vecteurs viraux courants (eucaryotes)

Vecteurs réplicatifs – Vecteurs se répliquant de manière autonome

• Pas d ’utilisation en thérapie génique• Utilisation en biologie moléculaire, cellulaire, biochimie, biotechnologie

à l ’échelle industrielle, vaccinologie et expression des protéines• Exemples :

Pox Virus (Vaccinia virus) : cellules mammifères, tropisme largeBaculovirus : cellules d ’insectes, expression très élevée ! Vecteurs dérivés non réplicatifs en cellules mammifères

Vecteurs non réplicatifs– Les virus recombinants ne se répliquent que dans des cellules exprimant

les gènes essentiels à la réplication délétés dans la construction du vecteur : « packaging cell lines »

– Utilisation en biologie moléculaire et thérapie génique– Exemples :

Adénoviraux : Ad2 & Ad5Rétroviraux : MLV, lentiviraux( HIV)Adéno associés : famille des parvovirusAlphavirus : SFV

Efficacité Ciblage

Problèmes liés aux ADN nus :

Caractéristiques recherchées pour un vecteur viral (thérapie génique)

Ciblage et

Expression

Sécurité

Production

Tropisme cellulaire adaptable (choix des enveloppes virales)

Régulation de la transcription possible (choix des promoteurs)

Stabilité d’expression (intégration ou épisomes, immunogénicité faible)

Matériel génétique inséré de grande taille (de 3 à 100kb)

Recombinaison faible voir absente

Toxicité faible (immunogénicité faible, intégration dirigée)

Réponse immunitaire faible (expression minimum de gènes viraux)

« Packaging cell lines » aisément cultivables

Production de virus à hauts titres infectieux

Comment construire un virus recombinant réplicatif ?

Identifier un gène non essentiel à la réplication, ou

conditionnellement nécessaire

Remplacer ce gène non essentiel par le « trans gène »

(TG)

Poxvirus : cycle du virus de la vaccine

Cycle entièrement cytoplasmique

Virus ADN double-brin linéaire (200

kb)

Infection de tout type cellulaire mammifère et aviaire (sauf CHO)

10% des protéines totales de la cellule sont des protéines

de la vaccine

Construction de virus recombinants

Le gène codant pour la protéine tymidine Kinase (TK) n’est pas essentiel à l’infection virale dans des cellules en division

Principe : Introduire le TG par recombinaison homologue dans le gène TK

Transfection

Noyau

Cellules Mammifères

Recombinaison homologue0,1 à 0,5%

Virus de la vaccineRecombinant (TK-/TG+)

+virus WT (99,9%)

pro MCS

Transgène

Séquences du gène TK

pro Promoteur Vaccine

5’3’

Choix du promoteur (précoce ou tardif)

Virus de la vaccine

Infection

Sélection et purification des virus recombinants

C’est l’étape limitante : Sélection des virus TK-:

en présence de BrdU (5-bromodéoxyuridine) , la TK phosphoryle le BrdU qui est incorporé dans le génome viral (létal) sélection en incorporant un gène de résistance aux antibiotiques ou le gène lacZ (blanc bleu)

Purification des virus: Par dilution limite (plage de lyse) Plusieurs cycles nécessaires

Contrôle de l’expression des TG PCR Western Blot

Avantages et limitations du système vaccine

Utilisation principale : expression de protéines en cellules mammifères Constructions de virus recombinants :

Construction du plasmide difficile (recombinaison)Choix possible du promoteur (précoce ou tardif, fort ou faible) Sélection des virus recombinants et purification longues Production de stocks de virus recombinants facile

Inconvénients Les virus WT et recombinants sont infectieux et immunogène pour l ’homme (yeux) Ce sont des virus infectieux… (L2 ou L3) utiliser la souche Ankara MVA atténuéeLa vaccine perturbe les métabolismes cellulaires :Expression des protéines endogènes Effet cytopathique : les cellules infectées meurent 48 h après infectionInfecte seulement les cellules en division

AvantagesNiveau d’expression élevéModifications post-traductionnelles ad-hoc (glycosylation, clivages protéolytiques)Taille des inserts > 20kb Production aisée de titres infectieux (1010 PFU/ml)Choix du promoteur (précoce ou tardif)Ancien vecteur de choix pour les vaccinationsTranscription cytoplasmique (pas de problème d ’export des ARNm, pas d ’épissage)

Système vaccine T7 Pol : transfection/infection (1)

Construction d’un virus de la vaccine recombinant exprimant la T7 Pol

Transfection

Noyau

Cellules Mammifères

pro T7pol5’3’

Recombinaison homologue0,1 à 0,5%

Sélection et purificationde virus de la vaccine

recombinant exprimant la T7 Pol

Virus de la Vaccine (WT)

Infection

Système vaccine T7 Pol : transfection/infection (2)

Expression de gènes sous le contrôle de la T7 polymérase :

Avantages/InconvénientsExpression aisée de multiples constructionsLa transfection est une étape limitante pour les productions industriellesTranscription cytoplasmique (pas de problème d ’export des ARNm, pas d ’épissage)

1. Constructiond’un plasmide

T7 polymérase exprimée par le VV

ARNm Protéines

2. TransfectionNoyaupro TG

pro MCS

Transgène

Promoteur T7 Polpro

VV: T7 Pol

3. Infection

pH dépendante

Phases tardives

Phases très tardives

Baculovirus

Virus ADN double-brin circulaire (130Kb)

arthropodes (lépidoptères, SF9)

Polyhédrinenécessaire

pour l’infection

d’un nouvel hôte

Formation de baculovirus recombinants

Particularités de la polyhédrine : •Niveau d ’expression très élevé (jusqu’à 50% du total cellulaire)•Protéines non essentielles à la propagation de l ’infection•Les virus recombinants ∆ polyhédrine ont une morphologie identifiable dans la cellule recombinaison homologue dans le gène de la polyhédrine.

Baculovirus

3. Infection

2. Transfection

Noyau

Cellules SF9, SF 21

Recombinaison homologue0,1 à 0,5%

Baculovirusrecombinant

pro MCS

Transgène

Séquences baculoviralespolyhédrine

pro Promoteur polyhédrine1. clonage

Vecteurs baculoviraux commerciaux

QuickTime™ et undécompresseur TIFF (non compressé)

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99% de recombinants

QuickTime™ et undécompresseur TIFF (non compressé)

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Avantages et limitations des vecteurs baculoviraux

Utilisation principale : expression de protéines en cellules d’insectes, vaccins recombinants, production de protéines insolubles en bactéries.

AvantagesPromoteur très fort, niveau d’expression élevéModifications post-traductionelles proches du système mammifère

Glycosylations : high-mannose mais pas hybride et complexesTransport et processing ad-hoc

Taille des inserts > 50kbProduction aisée de titres infectieux (1010 PFU/ml)Pas d ’infection possible de l ’homme (restriction au niveau de la transcription)

Inconvénients Virus lytique (chez l ’insecte)La formation des virus recombinants est une étape limitante

Vecteurs de deuxième génération pour thérapie génique

Le baculovirus est capable d’infecter des cellules mammifères (récepteur présent)Toutefois ces gènes ne sont pas transcrits

L ’activation des unités transcriptionelles est restreinte aux cellules d’insectes L ’intégration d’un transgène (TG) en aval d’un promoteur eucaryote permet l ’expression du TG

AvantagesProduction aisée de hauts titres infectieuxTropisme large (récepteurs inconnus)Pas de réplication ni de production de protéines virales chez l’hôteSurvie des cellules infectées (virus lytique chez l ’insecte)Insert de grande taille (50 kb) et choix possible des promoteursRisque de recombinaison très faible« Packaging cell lines » : pas de construction complexe (SF9)

InconvénientsPas d ’intégration, persistance limitée

Non déterminéRéponse immunitaire ? Infection des cellules quiescentes?

Song SU, Boyce FM. Exp Mol Med. (2001) Mar 31;33(1):46