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Cours Génotoxixité, Mutagenèse et Réparation de l'ADN -par Dr. Imed MAATOUK

FSB --- A.U. : 2017/2018 -Mastère 2 Sciences Biologiques Animales 1

UNIVERSITE DE CARTHAGE

Faculté des Sciences de BizerteDépartement Sciences de la Vie

Cours Option 1

Génotoxicité, Mutagenèse & Réparation de l’ADN

Mastère Fondamental

Sciences Biologiques Animales

par Dr. Imed MAATOUK

Année Universitaire : 2017/2018

Toxicologie Moléculaire

Première partie : Notions en Toxicologie

FSB - Mastère Sciences Biologiques – Génotoxicité & Réparation de l’ADN - par Dr. Imed MAATOUK

Plan

� Toxicité, Intoxication, Action toxique

� Biotoxification et enzymes impliquées

� Toxicologie, Toxicologie de l’Environnement, Polluant

� Liaisons réversible et irréversible

Deuxième partie : Interaction avec les cibles du tissu

� Porteurs de sites nucléophiles

� Cibles cellulaires et moléculaires

Toxicologie MoléculairePlan

Troisième partie : Génotoxicité et Mutagenèse

� Mécanismes capables d’altérer une molécule d’ADN

� Principales lésions de l’ADN (Événements génotoxiques)

� Signification biologique des dommages à l’ADN

Mutations, Aberration, Réparation de l’ADN, Arrêt du cycle cellulaire, Apoptose

� Cancérogénicité

Cancérogenèse et cancérogènes, Cibles des promoteurs de tumeurs, Oncogènes et suppresseurs de tumeurs, Télomérase, Relation mutagenèse - cancérogenèse

� Tests de génotoxicité / mutagenèse


Notions en ToxicologieToxicologie

La toxicologie se préoccupe des effets nocifs ou indésirables de substances ou de facteurs environnementaux sur les organismes

vivants, en particulier sur l’homme. La toxicologie essaye de caractériser les causes des effets toxiques, d’en concevoir

l’importance et la dangerosité, d’élucider les mécanismes et de développer des mesures de protection rationnelles

La toxicologie est la science qui décrit les risques liés à l’exposition à un toxique

Toxicologie de l’Environnement : Discipline de la descriptionet de l’étude des effets des facteurs environnementaux nocifs

(par ex. produits chimiques, rayonnements, bruit) dans l’air, l’eauet la terre, qui dérangent l’équilibre écologique et menacent des

microorganismes, les animaux et l’homme

1ére partie




Écotoxicologie : Science qui pronostique les effets, les interactions et le devenir des polluants présents dans

l’environnement, dans les écosystèmes existants

Science dont l’objet est l’étude des modalités de contamination de l’environnement par les agents polluants naturels ou artificielsproduits par l’activité humaine (aspect descriptif), ainsi que de leur

mécanismes d’action et de leurs effets sur l’ensemble des êtres vivants qui peuplent la biosphère (aspect causal)

Polluant : Toute substance naturelle ou d’origine anthropique que l’homme introduit dans un biotope donné dont elle était

absente ou encore dont il modifie ou augmente la teneur (dans l’eau, l’air ou les sols selon le biotope)

lorsqu’elle y est spontanément présente


1ére partie


6


1ére partie


Émissions et pollutions importantes vis-à-vis des hommes

7

Polluant toxique

Métabolisme cellulaire

Altérations biochimiques

Altérations physiologiques

Adaptation physiologique

Fixation

Adaptation cellulaire et tissulaire

Adaptation de l’animal

Adaptation biochimiqueMort cellulaire

Mort de l’animalLésions de l’ADN

(mutations)

Néoplasie


Réponse à un toxique

1ére partie


Notions en ToxicologieDifférentes phases lors d’intoxication

Source du toxique Libération du toxique transfert du toxique

Exposition - extérieure - intérieure

Absorption Distribution Biotransformation Excrétion

Effet toxique - aigu - chronique

Phase d’exposition Phase toxicocinétique Phase toxicodynamique

Toxicité, Intoxication, Action toxique� Mise en évidence clinique d’un empoisonnement à la suite de l’absorption

du toxique

� Le potentiel d’une substance à conduire à une intoxication est défini par la somme de toutes les propriétés essentielles pour une intoxication

� La sévérité de l’atteinte (danger) dépend de la capacité toxique (toxicité)du toxique, de sa dose, de son temps d’action (durée) et de la réceptivité des sujets soumis à l’intoxication � Évaluation du risque (Risk Assessment) ou quantification de la dangerosité

1ére partie


Différentes phases lors d’une intoxication



Notions en ToxicologieDifférentes phases lors d’intoxication

Selon la durée de l’application du toxique, on distingue

différentes sortes de toxicité :

Toxicité aiguë : une seule fois, une forte dose (DL50, CL50,…)

Toxicité chronique : Plusieurs fois à petites doses, non létales (alimentation, exposition professionnelle…)

1ére partie


Examen de la Dose Durée Exemple État final

Toxicité aiguë une fois 24 h – 14 j test DL50test Draize

MortÉtats d’irritation

Toxicité subaiguë plusieurs fois < 1 m Dommages aux organes

Toxicité subchronique

plusieurs fois < 10 % ES no observed effect level (NOEL)

Toxicité chronique plusieurs fois > 10 % ES test de pouvoir cancérigène

Néoplasies

ES

: espéran

ce de vie

Notions en Toxicologie1ére partie

composés

peau poumonstractus gastro-intestinal

foie

coeur

reins

cerveauBile

Veine porte

Veine hépatique

Artèrehépatique

Veine cave

fèces urines air expiré

Aorte

Veine pulmonaireArtère pulmonaires.c.→

i.m.→

i.p.→

i.v.

Flux sanguin et distribution de composés administrés à partir des sites d’absorption et des principales voies d’injection

Toxicocinétique


11

substance étrangère substance propres à l’organisme

xénobiotiques, produits pharmaceutiques…

hormones stéroïdes, pigments biliaires…

peu solubles dans l’eau, biologiquement actives et

pour certains toxiques

phase I

produit transformé

réactions de transformation

hydrolyse de liaisons esters et peptidiques oxydo-réductions : hydroxylation, époxydation, formation de sulfoxydes, désalkylation, désamination réduction de liaisons carbonyle azo- et nitro-, déshalogénation méthylation, désulfuration

induction par

le substrat

phase II+

+

induction par

le substrat

formation de conjugués

glucuronisationEsterification par un sulfateamidation par Gly et Glu

méthylation, acétylation

solubles dans l’eau, inactifs, non toxiques

Not

ions

en

Tox

icolog

ie Tox

icoc

inét

ique

1ére

part

ie


conjugué

bile urine Phases de Biotransformation

Notions en ToxicologieAction des toxiques

Toxicodynamique : Description des altérations de l’organisme sous l’influence d’un agent toxique

� Action toxique directe : lésions des tissus et organes

� Effets pharmacologiques, physiologiques et biochimiques

� Tératogénicité

� Immunotoxicité

� Génotoxicité & mutagénicité

� Cancérogénicité

1ére partie

Action des toxiques




� Au niveau moléculaire, les effets toxiques se présentent comme des perturbations de réactions vitales

�� Altération de la prolifération cellulaire

� Points d’attaque préférées des toxiques : enzymes et d’autres protéines fonctionnelles (molécules de transport, récepteurs…)

Cibles cellulaires et moléculaires

2éme partie Interactions avec les cibles du tissu

Interaction avec les cibles du tissu


Points d’attaque biochimiques des composés toxiques

Liaisons réversible et irréversible

Formation de liaison irréversible (covalente)

� Les toxiques, fortement électrophiles, exercent leur action sur les doubles liaisons des lipides et au niveau des sites nucléophiles (–NH2, –SH)

Site nucléophile donneur de doublet d’électrons à un réactif électrophile, accepteur de doublet d’électron

� Les électrophiles forment des liaisons covalentes stables avec les sites d’action, et produisent ainsi leurs effets : nécroses cellulaires (par atteinte des lipides et des protéines), sensibilisation allergique, mutagenèse, cancérogenèse, tératogenèse

O

dérivé possédant des doubles liaisons

époxyde

+ – site nucléophile (molécule)

O

dérivé possédant des doubles liaisons

époxyde

+



Liaisons réversible et irréversible

Formation de liaison réversible (non covalente)

� C’est le cas des toxiques intervenant dans la neurotransmission soit comme antagonistes tels les pesticides organophosphorés, des neurotoxines et les carbamates, soit des composés interférant dans l’action hormonale

� Toxicité aiguë et effets à court terme

� La solidité de ces liaisons irréversibles explique que les dommages persistent après la suppression du toxique

� Un apport complémentaire du toxique peut produire des effets cumulatifs

� L’étude de la toxicité est rendue difficile par la lenteur d’apparition des manifestations pathologiques



Porteurs de sites nucléophiles

Porteurs de sites nucléophiles : Protéines

� Certains acides aminés contenus dans les protéines tels histidine, cystéine, lysine, tyrosine, tryptophane, méthionine… sont riches en doublets électroniques libres et réagissent particulièrement avec les agents chimiques cancérigènes et certains toxiques

Porteurs de sites nucléophiles : Acides nucléiques

� Les acides nucléiques sont porteurs de sites nucléophiles par le biais des bases azotées. Il peut se faire qu’un toxique de structure stéréochimique ou d’une taille proche de la base vienne s’intercaler sur l’acide nucléique dont les fonctions seront altérées

Remarque: Un bon nombre de toxiques doivent avoir subi une activation préalable pour se lier à des sites nucléophilesEx. Époxydation d’hydrocarbures, aflatoxine B1, chlorure de vinyle ; Hydroxylation d’amines aromatiques et dérivés azoïques…





Biotoxification

� On appelle biotoxification la formation de métabolites plus toxiques que la molécule initiale. L’activation métabolique est assurée par des systèmes enzymatiques

� Le cytochrome P450, mono-oxygénase du foie porté par les microsomes du REL, active l’oxygène et catalyse l’oxydation de substrats lipophiles tels que les lipides et les xénobiotiques

� Les mono-oxygénases à cytochrome P450 sont des enzymes d’hdroxylation contenant un groupement hème comme coenzyme des réactions d’oxydoréduction

� Le cytochrome dans sa forme oxydée, se lie au substrat oxydant. Le Fer III dans le cytochrome est réduit en Fer II. Sous forme réduite, l’hème peut lier le monoxyde de carbone (CO) et présenter alors une absorption de la lumière caractéristique, à 450 nm � Nomenclature : Cyt P450

Biotoxification et enzymes impliquées



Biotoxification

� Les mono-oxygénases Cyt P450 catalysent la coupure réductrice de l’oxygène moléculaire (O2). L’un des 2 atomes d’oxygène est transféré sur le substrat et l’autre libéré sous forme d’une molécule H2O

substrat apolaire

produit oxygéné

O= O

2H+

FADH2

FAD

NADP

H

1 Monooxygénase 1.14.n.n. [Hème P450]

NADPH H+

hydroxylation aromatique

hydroxylation aliphatique

formation d’un époxyde

désalkylation

H2O

(H-) O



Monooxygénases dépendant du cytochrome P450 : quelques réactions

Exemples de Biotoxification

� Les réactions catalysées par les mono-oxygénases à Cyt P450 peuvent conduire à une détoxification ou à la formation de métabolites plus toxiques que le substrat (activation toxique)

� Quelques molécules pharmacologiques et des cancérigènes ne deviennent actives qu’après une réaction de biotransformation

� Exemple 1 : Réaction de désulfuration oxydative (cas du parathion)

Parathion Paraoxon


Exemples de biotoxification


Pesticide organophosphoré faiblement inhibiteur de choline-esterase

Composé très fortement inhibiteur de choline-estérase

� Exemple 2 : Réaction d’hydroxylation (cas du paracétamol)

ParacétamolGlucuronide paracétamolSulfate

paracétamol

Cytochrome P-450

N-acétyl-p-benzochinon-imine

Liaison covalente à des protéines du foie

Nécrose

Glutathion

Acide mercapturique

Conjugaison au sulfate

Glucuronidation




Le paracétamol est un analgésique provoquant souvent une nécrose hépatique et parfois des insuffisances rénales après des overdoses chez de nombreuses espèces

Sa toxicité dépend d’une activation métabolique

Protéines cibles : Formyltetrahydrofolate déshydrigénase(protéine cytosolique) , glutamate déshydrogénase et aldéhyde déshydrogénase (enzymes mitochondriales)



� Exemple 3 : Réaction d’époxydation

� Époxydes = intermédiaires produits par oxydation des doubles liaisons insaturées, aromatiques, aliphatiques ou hétérocycliques. Ils sont électrophiles et se lient de façon covalente aux biomolécules (ADN, ARN, protéines) et peuvent être allergènes, cytotoxiques ou cancérigènes

� L’enzyme Époxyde hydrolase (localisée principalement dans le RE du foie, à proximité du cyt P450) joue un rôle dans la détoxification des composés instables et des époxydes intermédiaires toxiques

� L’Epoxyde hydrolase rajoute de H2O à l’époxyde, probablement par attaque nucléophile par OH– sur un des atomes de carbone de l’ "anneau oxygéné", qui peut être considéré comme l’électron déficient, afin de former un dihydrodiol

Benzène-1,2-oxyde Benzène trans-1,2-dihydrodiol




Hydratation par époxyde hydrolase

� Pour certains hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), le dihydrodiol peut être métabolisé en époxydes-diols, ultimes cancérigènes (réactivité forte des époxydes-diols vis-à-vis des acides nucléiques et des groupements thiols des protéines)


2éme partie

Métabolisme des HAP

Interactions avec les cibles du tissu


23

Biotoxification du benzo[a]pyrène

Exe

mpl

es d

e B

ioto

xifi

cati

onIn

tera

ctions

ave

c les

cibles

du

tiss

u2é

mepa

rtie


(Fumée de tabac,

aliments trop grillés ou trop frits) Exemples de Biotoxification

Biotransformation du chlorure de vinyle





25

Exe

mpl

es d

e B

ioto

xifi

cati

on

Nitrates NO3¯Nitrates endogènes

excrétés par la saliveNitrates exogènes par : eau de

boisson, alimentation (légumes, produits de charcuterie et de

salaison, fromages)

Nitrites NO2¯

Flore buccale

dans la bouche et l’intestin

Transformation

par des microorganismes

durant le stockage (ex. Bacillus cereus)

Formation dans le milieu acide stomacal

Acide ascorbique, tocophérol

Absorption dans le jéjunum

Nitrites atmosphériques

& nitrites alimentaires

Ions halogénures (I ¯ , Cl ¯ F ¯ , Br ¯ )

Amines dans l’estomac

& Amines secondaires (aliments)

Acides chlorogéniques (café)

Nitrosaminesex. diméthylnit-

rosamine

Nitrosaminesdans les aliments

Nitrosaminesendogènes (cellules)

3 origines pour les nitrosamines

Absorption

dans le sang transformé en nitrates

NO2¯ NO3

¯

hémoglobine physiologique Fe2+

méthémoglobine Fe3+

+

-

si excès chez le nourrisson :

méthémoglobinémie, empoisonnement

� Exemple 4 : Activation des nitrosamines

2éme

partie

Inte

ract

ions

ave

c les

cibles

du

tiss

u


Provenance, formation et accumulation des nitrates, nitrites et nitrosamines


� Les nitrosamines sont transformés en composés toxiques et cancérigènes par biotransformation. Le radical formé est un radical libre ou un puissant agent d’alkylation RCH3+, très réactif avec l’ADN et les protéines

� Potentiel mutagène et cancérigène des nitrosamines



Biotransformation des nitrosamines


Époxydation de l’Aflatoxine B1 (hépatocancérigène)



Génotoxicité : Interaction toxiques - ADN

� Génotoxicité : Propriété d’un agent toxique de pouvoir endommager le matériel génétique des cellules et l’appareil mitotique

Génotoxicité

�� Altération de la fidélité de la Réplication

� La génotoxicologie (ou toxicologie génétique) s’intéresse à élucider les altérations provoquées sur l’ADN, leur mécanisme de formation et leur signification biologique

� La molécule d’ADN est la cible de nombreuses réactions qui peuvent y induire des dommages primaires (hydrolyse, liaison covalente, attaque électrophile et oxydation)

� Ces réaction peuvent se dérouler sous l’effet d’agents exogènes(chimiques ou physiques) ou de manière spontanée comme conséquence du métabolisme cellulaire normale

3éme partie Génotoxicité & Mutagenèse




� La génotoxicité d’un xénobiotique est une caractéristique chimique intrinsèque dérivée du potentiel électrophile du produit, c a d de son aptitude à se lier aux macromolécules cellulaires, à des sites nucléophiles tels que l’ADN, porteur de l’information génétique

�� La génotoxicité est donc une toxicité qui s’exerce au niveau du matériel génétique

Génotoxicité

� Substance génotoxique = agent altérant la structure, le contenu informationnel ou les processus de séparation de l’ADN et la réplication de l’ADN (Substances génotoxiques et/ou pro-génotoxiques)

3éme partie

� Les génotoxiques regroupent des substances mutagènes (provoquant des mutations) et de substances cancérogènes (ou carcinogènes) (substances mutagènes qui provoquent le cancer).

Ils sont chimiques ou physiques.

Génotoxicité & Mutagenèse


Génotoxicité

3éme partie

� Génotoxiques chimiques :

� Endogènes :

Le métabolisme cellulaire normal ou pathologique (lors d’inflammation chronique par ex.) peut produire des molécules potentiellement génotoxiques, telles que les ROS qui forment des lésions oxydatives des bases.

� Génotoxiques physiques :

� Les radiations ionisantes (rayonnements α, β, γ, X)

� Les rayons ultraviolets UV (soleil)



Génotoxicité

3éme partie

� Exogènes (ou Environnementaux) :

Ils sont actifs soit à l’état natif, soit le plus souvent, après biotransformation.

� Les nitrosamines (dans alcool, dérivés de la nicotine dans fumée de tabac et les agents alkylants ;

� Les dérivés nitrés aromatiques (dans fumée de tabac) et les amines hétérocycliques (dans viandes et poissons grillées) ;

� Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (Ex. benzo[a]pyrènedes goudrons présents dans la fumée du tabac…) ;

� Certaines mycotoxines (Ex. Aflatoxine B1, toxine fongique contaminant des aliments - céréales et arachides – et puissant hépatocancérigène) ;

� Et d’autres : amiante, benzène, chlorure de vinyle…



� La Génotoxicité inclut des effets directs et indirects :

� Induction de mutations (géniques, chromosomiques)

� Événements indirectement associée à la mutagenèse (synthèse non programmée de l’ADN ou échange de chromatides sœurs)

� lésions de l’ADN (directs : adduits par interaction directe toxique-ADN ; ou indirects : lésions par attaque des ROS et des produits de la peroxydation lipidique)

Génotoxicité

� Des mécanismes de réparation performants permettent de déceler les altérations de l’ADN et de remplacer le fragment endommagé par un fragment correct avant la prochaine réplication





Schéma général de l’activation des agents génotoxiques

3éme partie

GENOTOXIQUES

METABOLITES ACTIFS

PRO-GENOTOXIQUES

Fonctionnalisation phase I

CONJUGAISON phase II

Liaison à l’ADN Liaison à site non critique ou Réparation

Élimination

Mutagenèse Cancérogenèse

METABOLITES INACTIFS

Génotoxicité & MutagenèseGénotoxicité


� Les altérations de l’ADN résultent :

� soit de lésions spontanées dues à des erreurs lors de réplication ou à l’instabilité chimique des bases

Mécanismes d’altération de l’ADN

� soit de lésions provoquées par des agents dits mutagènes

� Interaction des agents mutagènes (certains chimiques de l’environnement, rayonnement UV, rayons X, cancérigènes ) avec l’ADN

�� Modifications de l’ADN(cassures, changements de séquences, échanges…)

�� Augmentation de la fréquence des erreurs lors de la réplication�� Mutations

Mécanismes capables d’altérer une molécule d’ADN

3éme partie

� soit de lésions induites par des virus oncogènes




3éme partie

� Microlésions :

� Les microlésions s’étendent sur une ou plusieurs paires de bases.

Spontanées Induites par des génotoxiques

Lors de réplication

Base modifiée par commutation tautomérique

Dérapage réplicatif

Base remplacée par analogue de base

Hors de réplication

Base supprimée : dépurination

Base modifiée : désamination oxydative

Base modifiée : alkylation, oxydation, adduits

Microlésions au niveau des bases

Microlésions au niveau de la double hélice, induites par des génotoxiques hors de la réplication

Pontages intrabrins ou interbrins Cassures simple brin ou double brin




3éme partie

� Macrolésions :

� Les macrolésions s’étendent sur quelques dizaines de paires de bases à des segments chromosomiques, voire à des chromosomes entiers

� Elles sont en général, la conséquence de remaniements chromosomiques :

� accidents de recombinaison méiotique entre chromosomes homologues (dans les cellules germinales),

� ou recombinaisons somatiques entre chromatides sœurs, voire au sein d’une même chromatide,

� insertion d’éléments génétiques mobiles (transposons et rétrotransposons, qui peuvent se déplacer d’une molécule d’ADN à un autre locus de la même molécule ou d’une autre molécule).






Devenir d’une lésion de l’ADN

3éme partie

LESION DE L’ADN(spontanée ou induite)

REPARATION

MORT CELLULAIRE

Silencieuse (région non codante, pas de modification

de la structure protéique)

Exprimée activation ou inactivation

de la protéine

MUTATION



Lésions de l’ADN



Principales lésions de l’ADN


Principales lésions génotoxiques de l’ADN (Schéma 1.)



40

Géno

toxicité

& M

utag

enès

eP

rinc

ipal

es lé

sion

s de

l’A

DN

3éme

part

ie


Principales lésions génotoxiques de l’ADN (Schéma 2.)




� Plusieurs mécanismes sont à l’origine d’induction d’altérations et des lésions de l’ADN :

� Mauvais appariements des bases (Mésappariements ou « mismach »)

� Dépurination et formation de sites abasiques

� Pontages intrabrin et interbrins

� Cassures simple-brin et doubles-brins

� Incorporation d’analogues structuraux

� Pontage ADN-protéine

� Formation d’adduits à l’ADN

� Dommages oxydatifs de l’ADN



� Engendré par une tautomérisation (changement de la complémentarité des bases), un dérapage réplicatif, une alkylation ou une désamination(transformation d’une base dans une autre)

Mauvais appariements des bases


� Tautomérisation (substitution par commutation tautomérique) :

3éme partie

� Cas 1.



La forme céto (ou lactame) est plus présente au pH physiologique que la forme énol (ou lactime)

� Seule la forme céto stable est compatible avec un appariement correcte par liaisons hydrogène entre les bases (A avec T et G avec C).


3éme partie

� Si, exceptionnellement, lors de la réplication, la base est sous forme énol rare, elle peut s’apparier avec une autre base :

T (forme énol) avec G et G (forme énol) avec T



� Ce mésappariement crée une mutation par substitution lors de la réplication suivante.


3éme partie

Le résultat est une mutation par transition GC � AT


1ére réplication 2éme réplication





3éme partie

� Seule la forme aminée est compatible avec un appariement correcte par liaisons hydrogène entre les bases (A avec T et G avec C).

� Cas 2.

� Si, exceptionnellement, lors de la réplication, la base est sous forme iminée rare, elle peut s’apparier avec une autre base :

A (forme iminée) avec C et C (forme iminée) avec A

� Ce mésappariement créera aussi une mutation par transition lors de la réplication suivante.




3éme partie

� Dérapage réplicatif :

� Ces erreurs peuvent se produire lorsque sont repliquées des séquences courtes répétées de une ou plusieurs bases

� Ce « bégaiement » de l’ADN favorise le glissement d’un brin sur l’autre

SSM : Slipped-Strand Mispairing

� Le dérapage réplicatif du brin matrice (de son côté 3’) entraîne une délétion.

Lors de la 2éme réplication, le brin néosynthétisé raccourci (précédent),

devenu brin matrice, donne naissance à un nouveau brin également raccourci.



� Le dérapage réplicatif du brin néosynthétisé (de son côté 5’) entraîne une insertion.

Lors de la 2éme réplication, le brin néosynthétisé allongé (précédent),

devenu brin matrice, donne naissance à un nouveau brin également allongé.

Géno

toxicité

& M

utag

enès

eP

rinc

ipal

es lé

sion

s de

l’A

DN

3éme

part

ie


Dérapage réplicatif


� Désamination : Spontanée ou sous l’action de produits divers

Désamination de base

Mécanisme de désamination (2 étapes d’équilibre).

L’exemple montre une interaction entre l’atome nitrogène d’un groupement

amine et la double liaison C–N de la cytosine






Désamination oxydative de C en U

Désamination Changement d’appariement

Adénine Hypoxanthine A-T → H-C

Cytosine Uracile C-G → U-A

5-méthyl-Cytosine

Guanine

Thymine

Xanthine

C-G → T-A

G-C → X-C

(action de l’acide nitreux) (transition G-C en A-T)





réplication

Désamination oxydative de la 5-méthyl-cytosine



� Alkylation :

Des groupements méthyle ou éthyle peuvent être transférés par des agents alkylants sur des bases ou des phosphates de l’ADN

Alkylation de base

Mécanisme d’alkylation. L’exemple montre une interaction

entre l’atome nitrogène de la cytosine et le carbone d’un composé alkylant




Sites d’alkylation des bases de l’ADN






� Ex. chlorure de vinyle(cancérigène et mutagène) Alkylation de N1-adénineet N3-cytidine

� transitions GC → AT et CG → AT

� Ex. nitrosoguanidine (NG) et éthylméthanesulfonate (EMS) :

Transformation de la guanine en O6-méthylG et O6-éthylG, respectivement

� rupture de liaisons hydrogène entre la guanine et la cytosine

� appariement de la O6-méthylguanine ou la O6-éthylguanine avec la thymine

� transition GC → AT




� La chaleur, les acides et certaines enzymes (uracile N-glycolase, hypoxanthine-N-glycolase…) peuvent entraîner une perte de base par hydrolyse de la liaison N-glycosidique

� création de sites abasiques dits sites AP (apurinique et apyrimidique)

Dépurination et formation de sites abasiques


3éme partie

� La dépyrimidination est moins fréquente



Dépurination


� Lors de la réplication, des analogues structuraux des bases (agents mutagènes) s’incorporent dans la molécule de l’ADN.

Incorporation d’analogues structuraux

T

A

BUcéto

A

BUénol

G

C

G

3éme partie

� Ex. la 2-aminopurine qui se lie aux cytosines

� Ex. le 5-bromouracile (5-BU)qui s’hybride préférentiellement avec les guanines (mutation TA →CG)





1ére réplication

2éme réplication 3éme réplication


Transition TA-CG induite par incorporation du 5-bromouracile




Pontage intrabrin (dimères de pyrimidines)

�� Distorsion locale de l’hélice d’ADN et affaiblissement de l’appariement avec les deux adénines complémentaires sur l’autre brin

� Blocage de la fourche de réplication (La DNA polymérase ne sachant pas recopier ces 2 thymines soudées)

� Mutations en tandem (CC:TT) et en transition (GC:AT)

� Action de l’UV � Établissement de liaisons covalentes entre deux thymines adjacentes dans la séquence d’ADN (dimères de thymine)

�� Raccourcissement de la distance entre les deux bases

� L'absorption d'énergie de radiation par l'ADN se produit essentiellement au niveau des bases, principalement des pyrimidines, provoquant de nombreuses réactions photochimiques

� Formation de dimères de pyrimidines et de photoproduits 6-4



Remarque : Un bain de soleil d’une heure induit jusqu’à 100 000 dimères par cellule

cutanée (soit 1 dimère toutes les 50 000 pb !)


3éme partie

Formation de dimères de thymidine

Dimères de thymine T(6-4)T




Pontages interbrins

� Certains chimiques (médicaments…) établissent des pontages entre :

� Bases puriques (Ex. Mytomycine C)

� Bases pyrimidiques (Ex. Psoralène, associé à une irradiation à 365 nm)

3éme partie

� Le cisplatine (ou cis-diaminedichloroplatine), utilisé dans le traitement de divers cancers, réagit avec l’azote 7 de la guanine, établissant entre deux guanines consécutives ou entre deux guanines sur deux brins différents




Pontages ADN-protéine

� Arrachement d’un électron à la base guanine sous l’action d’une particule

ionisante (par exemple)

� Implication des radicaux

� Implication de certains acides aminés et des bases pyrimidiques

3éme partie

� Ex. Attaque nucléophile de la fonction amine de la lysine sur C8 de la guanine ionisée(liaison covalente irréversible)






Cassures simple-brin (SSB)

� Cassures dues à la rupture des liaisons phosphodiester sous l’action de nombreux agents chimiques (peroxydes, composés à groupement SH comme la cystéine, certains ions métalliques comme le Fe2+ et Cu2+) ou physiques (radiations ionisantes) et aussi des radicaux libres

� Les radiations ionisantes produisent des cassures soit par l’action d’électrons secondaires produits par l’impact de particules β– ou de photons X, soit par l’ionisation de l’eau et la production de radicaux libresqui sont capables d’attaquer les liaisons phosphdiesters

� L’action d’une ADN ligase suffit le plus souvent à réparer les cassures simple-brin




SSB induits par des rayonnements




Cassures double-brins (DSB)

� Cassures localisés en opposition sur chaque brin

�� Rupture de la double hélice(Ex. irradiation de cellules par des rayons gamma)

�� Mort cellulaire (faute de réparation)

� Effet recherché sur les cellules cancéreuses (Radiothérapie), mais pas sur les cellules saines

ROS � SSB,DSB �� translocation, délétion, amplification de gènes

(surexpression des oncogènes) �� progression tumorale




Formation d’adduits à l’ADN (DNA adducts)

� Les électrophiles produits par le métabolisme de nombreuses molécules et de cancérigène chimiques sont capables d’interagir avec les centresnucléophiles des acides nucléiques en formant des liaisons covalentes

� Un nucléotide ayant fixé de manière covalente un xénobiotique (ou une partie de celui-ci) constitue un ajout = ADDUIT

� Selon la nature de la substance initiale et de ses métabolites,

les adduits se forment sur des sites préférentiels de la molécule d’ADN








Sites potentiels de formation d’adduits à l’ADN


� On distingue plusieurs types d’adduits à l’ADN :

� Adduits endogènes (Indigenous-compounds) naturellement présents

� Adduits d’alkylation non enzymatique (de méthylation…)

� Adduits encombrant (aromatiques ou non)

� Adduits d’oxydation

� Éthéno- et Propano-adduits

� Adduits générés sur les groupements Phosphate de l’ADN




� Exemples d’adduits de carcinogènes à l’ADN :

� Amine aromatique :

2-acétylaminofluorène

� Mycotoxine fortement cancérigène :

Aflatoxine B1




� Les HAP sont susceptibles d’induire des adduits à l’ADN via leur biotoxification ( � potentiel cancérigène)

� Source des HAP : Combustion incomplète des matières organiques

� Détection dans tous les compartiments de l’environnement et dans

les aliments (Ex. valeur limite dans l’eau potable : 0,01 µg BaP/l – OMS)



Quelques HAP cancérigènes



69

Géno

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& M

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eP

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es lé

sion

s de

l’A

DN

3éme

part

ie

� Adduit du benzo[a]pyrène à l’ADN


70

Géno

toxicité

& M

utag

enès

eP

rinc

ipal

es lé

sion

s de

l’A

DN

Adduit du Benzo[a]pyrene à l’ADN

3éme

part

ie



5-hydroxy-6-hydro-thymine

Thymine glycol 5,6-dihydrothymine 5-hydroxymethyl-uracil

5-formylyracil 5-hydroxy-5-methylhydantoin

Cytosine glycol 5-hydroxycytosine 5,6-dihydroxy-cytosine

5-hydroxy-6-hydrocytosine

trans-1-carbamoyl-2-oxo-4,5-dihydoxyimidazolidine

Dommages oxydatifs de l’ADN

Uracil glycol 5-hydroxyuracil 5,6-dihydroxy-uracil

5-hydroxy-6-hydro-uracil

5-hydroxy-hydantoin

alloxan 5,6-dihydro-uracil



Lésions oxydatives sur les bases pyrimidiques


8-hydroxyadénine 4,6-diamino-5-formamidopyrimidine

2-hydroxyadénine 8-hydroxyguanine 2,6-Diamino-4-hydroxy-5-formamidopyrimidine

(5'R)-8,5'-cyclo-2'-deoxyguanosine (5'S)-8,5'-cyclo-2'-deoxyguanosine

(5'R)-8,5'-cyclo-2'-deoxyadenosine (5'S)-8,5'-cyclo-2'-deoxyadenosine



Lésions oxydatives sur les bases puriques





� Lésion oxydative modèle : la 8-oxo-7,8-dihydro-2’-désoxyguanosine (8-oxo-dG)


A : Structure des nucléotides dG, 8-oxo-dG et de la forme tautomérique 8-OH-dG (8-hydroxy-2’-désoxyguanosine) ; B : Les appariements de la 8-oxo-dG dans l’ADN

3éme partie Génotoxicité & MutagenèsePrincipales lésions de l’ADN


Mutation par transversion GC–TA en présence de la 8-oxo-dG dans l’ADN


La 8-oxo-dG peut résulter indifféremment d’un effet indirect par addition du radical hydroxyle en position 8 de la guanine ou d’un effet direct de rayonnement

après arrachement d’un électron du noyau purique



Signification biologique des dommages à l’ADN


RAYONNEMENTS IONISANTS

Inductions de lésions

Réparation enzymatique des lésions

• Augmentation de la survie • Augmentation des mutations et de la recombinaison

• Augmentation des transformations malignes

• Effet létal

Réparation fautiveRéparation fidèle Lésion non réparée

• par effet direct : par ionisation ou excitation de la molécule libre

• par effet indirect : par diffusion de OH¯ ,H+ et e–aq. Lésion en un point distant

de celui où l’énergie est déposée

Importance du TLE (Transfert Linéique d’Énergie)


Significations biologiques des lésions induites par les rayonnements ionisants





� Adduits à l’ADN induits par le stress oxydant et la peroxydation lipidique: étheno-adduits (εdA, εdC) et M1dG


3éme partie

Lésions endogènes induites par cellule et par jour

Génotoxicité & MutagenèsePrincipales lésions de l’ADN

T° corporelle (37°C)

Radicaux libres

Métabolismes divers

Source Type de lésion Évaluation du nombre de lésions induites par celles/jour


Remarque : calcul sur la base de 6 x 109 dNps/cellule de mammifère. Nombre total de gènes chez l’homme

: 30 000. (3% du génome est transcrit ; 40% du génome humain constitué de séquences répétitives).



Source Type de lésion Nombre d’adduits/cellule


Lésions exogènes induites par cellule par des agents génotoxiques connus

Signification biologique des dommages à l’ADN



Exposition à un agent toxique (promutagène ou génotoxique procancérigène)

Transformation métabolique

Métabolite électrophilique

Interaction ADN

Adduit à l’ADN

Activation Détoxification

Métabolite inactif

Réparation de l’ADN

Réparation de l’ADN absent ou inefficace

Lésion stable de l’ADN

Mutation de la cellule

Développement tumoral cancer



Mutagénicité

Processus mutagènes

� Mutagénicité : propriété d’une substance de pouvoir provoquer des mutations

� Mutation : modification stable et irréversible du matériel génétique (d’une cellule qui est passé dans les cellules filles) due à des changements ponctuels de l’enchaînement des nucléotides sur les brins d’ADN

� Causes :

� erreurs accidentels, non réparées, au cours de la réplication de l’ADN

� modifications de l’information génétique sous l’effet d’agents mutagènes (physiques ou chimiques)

� mécanismes de transposition



� Une mutation est une lésion structurale non réparée :

3éme partie

� Si les lésions de l’ADN ne sont pas réparées, elles peuvent être fixées en mutation au cours de la division cellulaire

� Une microlésion est, en général, réparable. Si elle n’est pas réparée (ou si le système de réparation est lui-même à l’origine d’une erreur…), elle entraîne une mutation génique dite ponctuelle, car l’altération est localisée en un locus unique d’un même gène d’un même chromosome.

Remarque : Le taux de mutations est la résultante entre le nombre d’événements qui lèsent l’ADN et le nombre de ceux qui réparent ces lésions.

� Une macrolésion est, en général, irréparable. Elle entraîne une mutation chromosomique.

Mutagénicité Génotoxicité & Mutagenèse


� Chez les procaryotes, les mutations sont automatiquement transmisses à la descendance.

� Les mutations germinales, au niveau de l’ADN du spermatozoïde ou de l’ovule, sont transmises aux descendants et peuvent être létales pour l’embryons ou le fœtus

� Les mutations somatiques, au niveau de l’ADN de cellules somatiques, ne sont pas héritables et entraînent la mortalité cellulaire, la transmission de la mutation aux cellules du même tissu ou même la cancérogenèse

3éme partie

� Chez les eucaryotes supérieurs, la mutation n’est transmise aux descendants que si cette mutation a affecté les cellules sexuelles.

Mutagénicité

� mutations allèliques créant un allèle mutant d’un gène en modifiant un ou quelques nucléotides

� mutations chromosomiques affectant soit la structure soit le nombre des chromosomes

� On distingue :



3éme partie

ADN normal

ADN lésé

dom

magesré

para

tion

Lésion non réparée = mutation

Cellule germinaleCellule somatique


atteint la descendance de l’individuatteint la descendance de la cellule


Conséquences des mutations

pas d’effet pathologique

effet pathologique

pas d’effet pathologique

effet pathologique

polymorphisme génétique

maladies héréditaires

dilution de clone

cancer

extinction de clone

prolifération de clone

avantage sélectif

amoindrissement fonctionnel



Mutations allèliques ou géniques

� Une mutation allèlique (ponctuelle) résulte soit du remplacement d’un nucléotide par un autre (substitution), soit de la perte (délétion) ou de l’addition (insertion) d’un ou plusieurs nucléotides, soit encore dudéplacement ou de l’inversion d’une séquence nucléotidique au sein du génome créant un allèle mutant d’un gène

A

G

TC

transition

transversion

Mutation par substitution

� Conséquences sur l’expression génique :mutation muette ou silencieuse, mutation altérant la fonction du polypeptide, mutation létale

3éme partie





Mutagénicité


Transversion GC-TA induite par oxydation de la guanine

Mutations chromosomiques

� mutations chromosomiques affectant soit la structure des chromosome, soit le nombre des chromosomes

� Aberrations numériques (mutations génomiques) :

� Il s’agit de perte et/ou gain d’un ou plusieurs chromosomes sous l’effet de xénobiotiques dits aneugènes ou turbagènes

�� modification de la quantité d'ADN totale de la cellule

� Interférence de l’agent mutagène avec l’appareil fusorial�� non-disjonction des chromosomes (avec par ex. migration de 2 chromosomes homologues vers le même pôle lors de l’anaphase)

� Ces anomalies peuvent concerner soit un seul chromosome (aneuploïdie), soit le lot de chromosomes (polyploïdie)

3éme partie



� Causes d’aneuploïdie

� Effet sur le fuseau (polymérisation des tubulines, formation des microtubules) ex. colchicine, nocodazole, taxol, vincristine, griséofulvine

� Effet sur les centrioles ex. diazépam

� Dommages des kinétochores ex. mitomycine

� Augmentation des dommages ou de la liaison des chromosomes ex. actinomycine D, agents intercalants

� Mauvais alignement des chromosomes sur la plaque métaphasique ex. oxyde d’azote

� Dommage des membranes cellulaire et nucléaire ex. éthanol, sodiumdésoxycholate

3éme partie





� Mitose

3éme partie



� Cycle cellulaire anormal et aneuploïdie

3éme partie



� Aberrations structurales :

� Elles sont la conséquence de cassures chromosomiques suivies ou non d’une association anormale des fragments de chromosomes cassés, et peuvent affecter plus d’un chromosome au niveau d’un même noyau

� Ces anomalies résultent de l’action de substances à effet clastogène, capable de toucher le chromosome ou la chromatide

� Aberrations de type chromosomique(aberrations intrachromosmiques et aberrations interchromosomiques)

� Aberrations de type chromatidique(aberrations intrachromatidiques ou cassures, aberrations interchromatidiques ou échanges entre chromatides)

3éme partie



� Aberrations de type chromosomique :

� Délétion : perte d’un fragment de chromosome (délétion terminale ou interstitielle)

� Inversion péricentrique : lorsque le chromosome se casse de part et d’autre du centromère et se recolle de manière erronée

� Inversion paracentrique : inversion sur un seul bras chromosomique

� Anneau : les 2 extrémités se recollent avec la formation d’un fragment chromosomique suite à une délétion au niveau de l’extrémité du chromosome puis (anneau centrique ou non)

� Isochromosome : bras entier perdu et remplacé par la duplication de l’autre bras

� Duplication : multiplication de segments chromosomiques (une ou plusieurs fois)

3éme partie





� Translocations : échanges de bras chromosomiques

� translocation réciproque : interchanges symétriques résultant de l’échange entre les parties distales de 2 chromosomes

� translocation non symétrique � chromosome dicentrique et fragment acentrique

� translocation robertsonienne : fusion de 2 chromosomes acrocentriques par cassure-racollement à proximité des centromères

� Aberrations de type chromatidiques :

� Aberrations intrachromatidiques : lacunes ou cassures sur une seule chromatide

3éme partie



� Aberrations interchromatidiques : échanges entre chromatides d’un même chromosome ou échanges entre chromatides appartenant à des chromosomes différents

3éme partie



Aberrations chromosomiques et chromatidiques

Réponses cellulaires

� La réponse cellulaire est caractérisée par des modifications de l’expression génique (régulation de la transcription, de la traduction et modifications post-traductionnelles) dans :

� la réparation de l’ADN

� le ralentissement ou même le blocage temporaire du cycle cellulaire(dans le cas de cellules se divisant) permettant aux différents mécanismes de réparation de restaurer avec +/- de fidélité l’intégrité du matériel génétique

� la mort cellulaire par appoptose / nécrose (réparation inefficace face à des lésions trop importantes ou à l’absence d’arrêt du cycle cellulaire)

3éme partie

Réponses cellulaires Génotoxicité & Mutagenèse


� Avant d’adopter la réponse cellulaire appropriée, la cellule doit en premier lieu détecter les altérations produites dans la molécule d’ADN, les membranes cellulaires, et émettre un signal d’alarme

� dans le cas le plus simple : Élimination rapide et correctede la lésion initiale (Ex. lésions radio-induites)

� dans le cas plus complexe d’une population de cellules exposées en activité mitotique, simultanément au processus de la réparation, la cellule active la machinerie de contrôle du cycle cellulaire (arrêt du cycle) et la machinerie qui mène à la mort cellulaire par apoptose

� A la suite de la reconnaissance et la signalisation de la présence de lésions de l’ADN, plusieurs scénarios sont possibles :

3éme partie Génotoxicité & MutagenèseRéponses cellulaires




� Lorsque la réparation est fidèle, la cellule sort de son arrêt transitoire et reprend son rythme habituel de division et réplication

� Lorsque la réparation n’est pas fidèle, soit la cellule n’est pas éliminée (cellule mutante), soit elle est éliminée (en fonction du nombre de lésions résiduelles induites et la fidélité de la réparation)

� L’absence d’élimination d’une cellule exposée n’ayant pas réparé correctement son matériel génétique représente une des étapes fondamentales dans le développement tumoral




� Cas des réponses cellulaires précoces aux rayonnements ionisants

Cellule normale

Radiolyse de l’eau Effet direct ? Effet bystander ?

ERO

Lésions moléculaires(protéines, ADN, lipides

Mort cellulaire

Nécrose ApoptoseMutation

létale

fautive

Mutation non létale

Survie cellulaire

fidèle


Arrêt du cycle cellulaire(stop en G1,S,G2)

Échelle de temps

Milliardième de seconde

Les lésions

Millionième de seconde

Minutes, heures

Réponses précoces

Heures, jour


Anomalies héréditaire Cellule cancéreuse


� Correction d’un mésappariement, c à d d’une absence de complémentarité entre les nucléotides des deux brins d’un fragment d’acide désoxyribonucléique (ADN endommagé ou répliqué de façon incorrecte)

� La réparation vise à remplacer une base azotée, ou un nucléotide ou un fragment d’acide nucléique par des nucléotides complémentaires de la séquence de l’autre brin

� La réplication étant semi-conservatrice, l’un des deux brins est identifié en tant que matrice et c’est l’autre brin qui sera réparé en cas de mésappariement

� Afin d’éviter la transmission d’altérations génétiques, les cellules ont développé des systèmes de réparation de l’ADN qui peuvent se produire à différents points au cours du cycle cellulaire

3éme partie

Réparation d’ADN Génotoxicité & Mutagenèse


3éme partie



Rappel : Schéma général de la fourche de réplication d’ADN



� Plusieurs processus de réparation permettent de détecter et réparer les lésions induites sur l’ADN tels que :

� Réparation par réversion directe (réparation des dimères de pyrimidines induits par les UV, et déalkylation)

� Réparation par excision de base (BER) qui consiste en un retrait des bases modifiées puis son remplacement

(désamination oxydative, sites AP, CSB, bases modifiées…)

� Réparation par excision de nucléotides (NER) (lésions volumineuses : quelques adduits et distorsions)

� Réparation post-réplicative ou Réparation par recombinaison(cassures de brin, pontage interbrin)

� Réparation par le système SOS ou « EPR, Error Prone Repair » (dimère de thymine)

3éme partie

Réparation d’ADN

� Réparation des mésappariements « MMR, MisMatch Repair » (base modifiée par commutation tautomérique)



3éme partie

Réparation d’ADN

� Photoréactivation :

Réparation par réversion directe

� Réparation biochimique simple de lésion

� Élimination directe des lésions

� Inverser la lésion, en régénérant la base d’origine

� Système de réparation rare car la plupart des lésions sont irréversibles.

� Les dimères de thymine peuvent être scindés en les monomères d’origine par des ADN photolyases en présence de lumière visible.

� Les ADN photolyases sont présents chez les bactéries et les plantes, et absents chez l’Homme.



Réparation par photoréactivation

3éme partie

Réparation d’ADN

ADN natif

hν

hν

ADN avec un dimère

de pyrimidine sous l’action

des UV

Enzyme de photo-

réactivation

Reconnaissance du défaut par la photolyase

Coupure du dimère

(absorption de photons > 300 nm)

Brin d’ADN corrigé et enzyme libéré



3éme partie

Réparation d’ADN

� déalkylation :

� Réparation de l’alkylation de la guanine par un enzyme spécifique : la O6-alkylguanine alkyltransférase, qui transfert le groupement alkyle de la base vers un de ses acides aminés, une cystéine.

� L’enzyme de réparation ainsi alkylée est irréversiblement inactivée ; pour chaque réparation, une molécule d’enzyme est sacrifiée.

� Saturation de ce système de réparation si le niveau d’alkylation est trop élevé.

O6-méthylguanine méthyltransférase

Réparation par déalkylation





3éme partie

Réparation d’ADN

Réparation par excision

� Réparation par excision de bases (BER) :

� Les lésions réparées par excision de base (BER, Base Excision Repair) sont :

� Bases éliminées par dépurination,

� Bases endommagées par désamination oxydative,

� Bases endommagées par oxydation,

� Bases endommagées par méthylation.



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Réparation par excision de base (BER)

3éme partie

Réparation d’ADN

� Étape 1.

Hydrolyse de liaison N-glycosidique (dans laquelle est engagée la base endommagée) par une ADN glycolase spécifique.

� Ex. L’Uracile-DNA glycolase corrige la désamination de la cytosine en uracile.



Action de l’ADN glycosylase

3éme partie

Réparation d’ADN

Réparation des cytosines desaminées





3éme partie

Réparation d’ADN

Human DNA glycosylase

Full name Size (aa) AP Lyase Activity

Substrates

UNG Uracil DNA N-Glycosylase 313 No ssU>U:G>U:A, 5-FU

TDG Thymine DNA Glycosylase 410 No U:G>ethenocytosine:G>T:G

UDG2 Uracil DNA N-Glycosylase 2 327 No U:A

SMUG1 Single-strand-selective Monofunctional Uracil-DNA

Glycosylase 1

270 No ssU>U:A, U:G

MBD4 Methyl-CpG-bonding Domain 4 580 ? U or T in U/TpG:5-meCpG

MPG Methyl Purine DNA Glycosylase 293 No 3-meA, 7-meA, 3-meG, 7-meG

MYH MutY Homolog 535 Yes? A:G, A:8-oxoG

OGG1 8-Oxo-Guanine Glycosylase 1 345 Yes 8-oxoG:C

NTH1 Endonuclease Three Homolg 1 312 Yes T-glycol, C-glycol, formamidopyrimidine



3éme partie

Réparation d’ADN

� MYH : homologue du gène Mut Y connu chez E. coli code une glycosylase responsable de l’excision des adénines appariées de façon anormale avec des 8-Oxoguanines lors de la réplication (uniquement sur les brins nouvellement synthétisés)



3éme partie

Réparation d’ADN

� Étape 2.

Coupure du squelette de l’ADN par une endonuclease. La liaison phoisphodiester en 5’du site AP est hydrolysé par une AP-endonuclease, créant une extrémité 3’-OH.

� Étape 3.

Une exonuclease (DNA Phosphodiesterase) enlève un segment d’ADN.

� Étape 4.

Synthèse réparatrice (action de DNA polymerase et DNA ligase) :

� voie de réparation par brèche courte (Short-patch BER) ,

� voie de réparation par brèche longue (Long-patch BER) .



3éme partie

Réparation d’ADN

� Réparation par brèche courte (1 nucléotide), majoritaire

� L’ADN polymérase β ajoute le "bon" nucléotide à l’extrémité 3’-OH de la brèche grâce à son activité polymérase ;

puis, grâce à son activité désoxyribose-phosphodiestérase (dRpase), cet enzyme hydrolyse la liaison phosphodiester en 3’ du site AP, libérant le désoxyribose-phosphate (dRP) ;

enfin, l’ADN ligase III ligature par une liaison phosphodiester le "bon" nucléotide au nucléotide suivant.

Remarque :

Deux autres protéines assistent l’ADN polymérase β : la PARP (poly[ADP-ribose] polymérase),

qui a la fonction de détecter le site AP et de recruter les autres protéines, et la XRCC1

(X-Ray Repair Cross Complementary) qui a la fonction de stabiliser le complexe et d’éviter

la synthèse d’ADN excédentaire par l’ADN polymèrase β .





3éme partie

Réparation d’ADN

� Réparation par brèche longue (1 douzaine de nucléotide), minoritaire

� L’ADN polymérase δ ou l’ADN polymérase ε, assistée du PCNA, allonge l’extrémité 3’-OH de la brèche d’une douzaine de nucléotides, déplaçant le brin après la brèche dans le sens 5’ � 3’

puis, l’ADNase IV (une 5’-3’ exonuclease) "débite« en nucléotides le brin ainsi déplacé ;

enfin, l’ADN ligase I ligature par une liaison phosphodiester le dernier nucléotide mis en place au nucléotide suivant.



3éme partie

Réparation d’ADN

� Réparation par excision de nucléotides (NER) :

� Le système de réparation NER (ou excision-resynthèse) concerne les lésions encombrantes provoquant une distorsion importante de la double hélice :

� Pontages interbrins : dimères de thymine chez l’Homme,

� Adduits formés par des cancérogènes chimiques,

� Les bases endommagées par oxydation peuvent être réparées par le système NER mais de moindre mesure que par le système BER.



3éme partie

Réparation d’ADN

� Le processus de réparation NER, chez l’Homme, comprend différentes étapes assistée par des protéines et des enzymes (reconnaissance de lésion, activité hélicase, endonucléase, polymérase et ligase).

- Après synthèse réparatrice par l’ADN polymérase δ ou ε , l’ADN ligase I ligature par une liaison phosphodiester le dernier nucléotide mis en place au nucléotide suivant

� Chez E. coli, le système NER est le même , impliquant les protéines Uvr qui constituent l’excinuclease :

- UvrA recrute UvrB au niveau de la lésion puis s’en dissocie ;

- UvrC se fixe alors à UvrB, chacune pratiquant une incision ;

- L'oligonucléotide portant la lésion est éliminé sous l'action d'une exonucléase, probablement l'ADN polymérase I et par l’activité de l'hélicase UvrD;

- Ensuite, la brèche ainsi créée est comblée et suturée par l'ADN polymérase I et la ligase.



3éme partie

Réparation d’ADN

Le dimère UvrA forme un complexe avec UvrB (ATP dépendant)

Le complexe reconnaît la lésion de l’ADN qui introduit une distorsion dans la double hélice d'ADN

Le dimère UvrA se dissocie du complexe (ATP dépendant) laissant UvrB sur la déformation de l’ADN



Processus de réparation NER chez E. coli par le système UvrA,B,C (1)



3éme partie

Réparation d’ADN

UvrB recrute UvrC

UvrB active UvrC qui coupe l’ADN 7nt en 5’ du dimère de pyrimidine

On a donc un fragment d’ADN contenant le dimère qui pourra être enlevé

UvrC active UvrB qui coupe l’ADN 4nt en 3’ du dimére de pyrimidine




3éme partie

Réparation d’ADN

Une hélicase, UvrD, déplace le morceau d’ADN endommagé et déplace UvrC

Une ADN ligase ferme l’ADN

La brèche est remplie par l’ADN pol I et uvrB est enlevé




3éme partie

Réparation d’ADN

XP-C reconnaît le dimère de pyrimidine

XP-A/RPA se lie au dimère de pyrimidine et aide à recruter d’autres protéines vers le complexe

XP-B, XP-D et TFIIH (Transcription Factor IIH) sont des hélicases qui séparent et déroulent l’ADN (ouverture de la double hélice). RPA garde les brins séparés

XP-G et XP-F/ERCC1 sont des endonucleases. XPG incise l’ADN à 2-9 nucléotides en 3’ de la lésion et XPF/ERCC1 (Excision Repair Cross Complementary) à 16-25 nucléotides en 5’

Le fragment d’ADN est enlevé et la bréche est remplie par l’ADN Pol δ ou ε, assistée du PCNA et du RF-C



Processus de réparation NER chez l’Homme

3éme partie

Réparation d’ADN

� Maladies liées à des anomalies de la réparation NER chez l’Homme :

� Xeroderma pigmentosum (mutation dans les gènes des protéines XP) :

- sensibilité à la lumière

- défaut de pigmentation

- cancers de la peau précoces (exposition au soleil UV)

- problèmes neurologiques

- gènes XPA à XPG

(Réparatose)





3éme partie

Réparation d’ADN

� Syndrome de Cockayne :

- sensibilité à la lumière

- nanisme

- anomalies des membres et de la face

- anomalies neurologiques

- Mort précoce par neurodégénérescence

- gènes CSA, XPB, XPD, XPG (sous-groupe)

� Anémie de Fanconi, sensibilité aux agents pontants.

� Syndrome de Bloom, sensibilité aux agents alkylants.



122

Géno

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Réparation par excision de base (A) ou de nucléotides (B)

� Lésion principalement réparée par REB et dans un moindre mesure par REN

� Dans les cellules humaines, la REB de la 8-oxo-dG est initiée par une glycosylase (hOGG1 ou human OxoGuanine Glycolase) dotée d’une double activité glycosylase et l’AP lyase (homologue chez E. coli : Fpg ou Formamidopyrimidine DNA N-glycolase) codée par le gène MutM

� Excision de la 8-oxo-dG au sein d’un appariement 8-oxo-dG:dC

� La hMYH (human MutY Homolog, homologue de MutY de E. coli) : ligase qui peut initier la réparation d’un mésappariement 8-oxo-dG:dA

� La 8-oxo-dG pourrait être réparée par réparation couplée à la transcription, puisqu’elle induit un arrêt de la RNA ploymérase II lors de la transcription

3éme partie


� Réparation de la 8-oxo-dG :


Géno

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Réparation par BER des lésions oxydatives de type 8-oxoG



3éme partie

Réparation d’ADN

Réparation des appariements (MMR)� La réparation des mésappariements (MMR, MisMatch Repair) concerne :

� Mésappariement d’un seul nucléotide,

� petites boucles de nucléotides non appariés (jusqu’à 4 nucléotides) --souvent par dérapage réplicatif-- survenant lors de la réplication et

de la recombinaison.

� Acteurs du processus MMR :

� Homme (hMSH2/GTBP, hMLH1/hPMS2, DNase IV/FEN1, ADN polymérase δ ou ε, ADN ligase I) ;

� Procaryotes (protéines Mut : MutS, MutH, Mut L et MutU, exonuclease, ADN polymérase III, ADN ligase)



� Des mutations dans les gènes hMSH2 et hMLH1 sont responsables du syndrome HNPCC, caractérisé par un risque élevé, héréditaire, de développer des tumeurs du côlon (cancer du colon non polyposique).

3éme partie

Réparation d’ADN

L’hétérodimére hMSH2/GTBP (G/T Binding Protein) reconnaît un mésappariement

Le complexe est reconnu à son tour par un autre hétérodimére hMLH1/hPMS2

La DNase IV/FEN1 (5’-Flap Endonuclease I) excise le brin incorrect. Incision en face d’un site méthylé du brin parental à droite ou à gauche du mésappariement

Une exonuclease agit, selon le cas, de 5’ vers 3’ ou de 3’ vers 5’

l’ADN Pol δ ou ε, assistée du PCNA et du RF-C, allonge l’extrémité 3’-OH de la brèche, remplissant la lacune, prenant comme modèle le brin parental intact

l’ADN ligase I ligature par une liaison phosphodiester le dernier nucléotide mis en place du nucléotide suivant


mésappariement


Processus de réparation MMR chez l’Homme

3éme partie



Processus de réparation MMR chez E. coli

3éme partie

Réparation d’ADN

Réparation post-réplicative (Réparation par recombinaison, RR)

� L’ADN lésé peut être répliqué avant même que la lésion (un dimère de thymine, un site AP, etc.) ait été éliminée par excision-resynthèse.

� Arrêt de la réplication du brin lésé et reprise plus loin (à environ 1000 nucléotides) laissant derrière une lacune réplicative

� La molécule fille présente dés lors une lésion double brin (brin parental porteur de la lésion, apparié à un brin néosynthétisé qui présente une brèche

-- un dimère de thymine par ex. et, en regard, la lacune réplicative --

� L’autre molécule fille née de la même fourche de réplication, est intacte (le brin parental et le brin néosynthétisé sont normaux) : elle va servir de matrice à la réparation par recombinaison (RR)



3’5’

3’5’

dimère de thymine



3éme partie

Réparation d’ADN

� Si réparation BER ou NER débordée � Recours à la réparation RR

� La réparation par recombinaison se produit par interaction entre deux doubles hélices. Son résultat est l'incorporation, à la place de la partie lésée, d'un fragment d'ADN identique, présent sur une autre molécule d'ADN homologue.

La réparation par recombinaison est apparentée à la recombinaison génétique qui permet, lors d’un crossing-over au cours de la méïose,

l’échange de segments homologues (chromatides sœurs, c.a.d les deux molécules filles nées de la même fourche de réplication)



Principe générale de la réparation par recombinaison

3éme partie

Réparation d’ADN

� Chez E. coli la protéine qui assure la réparation par recombinaison s'appelle RecA (Rec comme Recombinaison). Elle hybride des séquences situées de part et d'autre d'une lésion avec des séquences complémentaires de molécules d'ADN non altérées.

� Les mutants recA¯ sont presque complètements déficients à la fois dans la recombinaison génétique et dans la réponse réparatrice.

En effet la protéine RecA joue un rôle essentiel dans ces deux mécanismes, où elle assure la fonction de :

� L'échange de brins entre molécules d'ADN, une activité centrale dans la recombinaison,

� L'échange simple-brin entre molécules néosynthétisées, impliqué

dans la réparation par recombinaison.

� Chez les eucaryotes, les protéines Rad (pour Radiation) sont homologues aux protéines Rec.



3éme partie



Rôle de la protéine RecA

3éme partie



Réparation post-réplicative par recombinaison (schéma 1.)



133

Géno

toxicité

& M

utag

enès

e

Si REB ou REN débordés �

Recombinaison par recA

3éme

part

ieE

E

E

E

E

E

coupuresprotéine recA

protéine recA

protéine recARép

arat

ion

d’A

DN


Réparation post-réplicative par recombinaison (schéma 2.)

3éme partie

Réparation d’ADN

Réparation par le système SOS

� Lorsque la réparation constitutive ou par recombinaison d’une lésion est débordée

� Alternative = Réparation du dernier recours = Réparation translésionnelle par le système SOS (ou SOS Repair ou EPR, Error-Prone Repair)

-- Système sollicité en réponse à ce que l’on assimile à un appel à l’aidede la cellule devant les dommages causés à son ADN --

� Pas d’arrêt de réplication au prix d’erreurs réplicatives (Introduction de mauvais nucléotides en face de la lésion illisible)

-- La réparation SOS est fautive (imparfaite), donc mutagène --

� Le système SOS met en jeu des mécanismes de réparation de l’ADN qui en font la cause des mutations induites par les mutagènes qui produisent des lésions non codantes (rayons UV, aflatoxine B1, benzo-pyrène et la plupart des cancérigènes).



3éme partie


� Si erreurs suffisamment graves pour arrêter la synthèse d’ADN

� Induction de gènes SOS

� Déclenchement du système SOS :

� L’arrêt de la réplication provoque l’apparition d’ADN monocaténaire. Celui-ci est reconnu par l’enzyme de réparation RecA.

� L’enzyme RecA est bifonctionnelle et agit :

� en assurant des recombinaisons (activité d’échange de brins d’ADN),

� en détruisant, par son activité protéolytique, la protéine LexA, le répresseur des gènes SOS


3éme partie



Répression de l’expression des gènes SOS par LexA



Répression de la synthèse de protéine RecA par la protéine LexA

3éme partie




Activation du Rec A

3éme partie

Réparation d’ADN

Propriétés de Rec A : recombinaison et coprotéase (si activée par dimère de thymine ou DNA 1brin) → autoprotéolyse de son répresseur (LexA)

→ � RecA → Recombinaisons


Si Réparation constitutive débordée → déclenchement du système SOS

→ Survie de cellule (pas de blocage de la synthèse d’ADN au prix d’erreurs réplicatives)

3éme partie



Fonctionnement de la réponse SOS (système inductible)

3éme partie


- RecA, présente en petite quantité, s’associe à l’ADN sb au niveau de la lésion.

- RecA forme un filament hélicoïdal autour du brin d’ADN.

- LexA s’attache au complexe ADN sb-RecA sur lequel il est clivé par une activité protéase de RecA.

- L’inactivation du répresseur LexA constitue le signal SOS.

- La vingtaine des gènes SOS, impliquées dans les divers processus de réparation, sont alors exprimés.

- Activation du gène uvrA, dont le produit est impliqué dans la réparation par excision

- Augmentation de la synthèse de RecA (la synthèse de RecA induit sa propre activation)

- Synthèse des protéines mutagènes UmuC et UmuD (rôle important dans SOS Repair)

�

� Séquences du système SOS :




3éme partie


Induction du système SOS


3éme partie

Réparation d’ADN

- Activation de UmuD en UmuD’ grâce à l’activité protéase de RecA

- Association de 2 molécules d’UmuD’ à UmuC pour former UmuD’2C

- Insertion du complexe UmuD’2C en amont de Rec A sur la molécule de l’ADN , se substituant à l’ADN polymérase III, et poursuit la réplication

- Incorporation, par cette polymerase, n’importe quel nucléotide en face de la lésion (comme la matrice est illisible) � Réplication fautive

- Une fois la lésion franchie, l’ADN pol III reprend sa place

- Arrêt du système SOS lorsque la réparation a restauré la structure de double hélice

- Disparition du signal SOS : libération du Rec A et répression des génes SOS par LexA

Remarque : Le processus SOS de franchissement de lésion existe aussi chez les eucaryotes supérieurs



3éme partie


UvrA UmuC UmuDRecA


séquences du système SOS Mutations et réparation : récapitulatif

Géno

toxicité

& M

utag

enès

e3é

mepart

ie

Rép

arat

ion

d’A

DN




Arrêt du cycle cellulaire

Arrêt du cycle cellulaire

Génotoxicité & Mutagenèse3éme partie

� A la suite de la reconnaissance et la signalisation de la présence de lésions de l’ADN, la cellule pourrait activer la machinerie de contrôle du cycle cellulaire

� Arrêt momentané du cycle cellulaire pour réparation des lésions

� Le cycle cellulaire des cellules de mammifères comprend quatre phases : G1, S ,G2 (= interphase) et M mitose (= processus de division cellulaire).

Chaque phase ne pouvant débuter que si la précédente est totalement terminée.

� Le point de restriction R et les principales transitions G1 � S, G2 � M et métaphase � anaphase sont sous le contrôle de complexes protéiques : protéines kinases cycline-dépendantes (CDK) - cyclines (Cyc)


Arrêt du cycle cellulaireGénotoxicité & Mutagenèse3éme partie


Étapes du cycle cellulaire


� Des mécanismes de contrôles (contrôle de la synthèse d’ADN, contrôle de l’assemblage correct du fuseau mitotique…) opèrent et empêchent la progression dans le cycle si les étapes précédentes n’ont pas été complètes ou si l’ADN est lésé.

� Des mécanismes « DNA damage checkpoint » détectent une altération de l’ADN et génèrent un signal qui arrête les cellules dans la phase du cycle où elles se trouvent, et induit la transcription de gènes réparateurs ou de mort cellulaire.

� Les mécanismes moléculaires des checkpoints sont complexes.

� Le point de restriction est contrôlé par la voie pRb-E2F.

Dans les cellules au repos, en G0 ou G1, la protéine pRb du rétinoblastome est liée au facteur de transcription nucléaire appelé E2F, nécessaire à

l'initiation de la phase S.



� Au début du cycle cellulaire (passage G0-G1), pRb hypophosphoryléeséquestre le facteur E2F.

� Brusquement, lors du passage G1-S, sous l'effet des complexes cycline–CDK, pRb devient hyperphosphorylée et libère le facteur E2F permettant les transcriptions d’un grand nombre de gènes.

� L’activation de la protéine p53 sous l’effet d’une altération du DNA entraîne une activation de la transcription de la protéine p21 qui inactive la liaison cycline E–CDK2 et ainsi empêche la libération de la protéine chapeau pRb du facteur de transcription E2F.

�� Arrêt de la phase G1/S dépendant du p53

� p21 inhibe aussi le complexe cycline B–CDK1 �� Arrêt du cycle en G2





� Lésions induisant une augmentation du taux de p53 ( = un gène suppresseur de tumeurs et facteur de transcription de gènes codant pour p21, des gènes pro-apoptotiques Bax et Fas et pour plus d’une centaine de protéines impliquées dans l’arrêt du cycle cellulaire, la réparation de l’ADN et l’apoptose) :

� simple cassure double brin,

� trou d’environ 30 à 40 bases dans la traduction du DNA sur un simple brin

� mésappariement de bases ou une insertion délétion de bases.

� A la suite de lésions d’ADN, les protéines kinases ATM (Ataxia-Telangiectasia

Mutated, qui répond aux cassures double brin de l’ADN), ATR (ATM- and Rad3-

related, qui répond au blocage de la fourche de réplication) ou DNA-PK (DNA

dependent Protein Kinase, qui répond aux CDB) phosphorylent p53 pour l’activer.

� D’autres mécanismes d’arrêt du cycle semblent exister, impliquant le PCNA, la cycline D1, le facteur de croissance TGFβ, le gène GADD45 (retrouvé dans les irradiations par les ultraviolets), etc..



Mécanisme d’arrêt en G1

*


* WAF1 / CIP, (pour Wild Type p53-activated fragment et cdk2 inhibiting protein)



Apoptose

Mort cellulaire / Apoptose


� Apoptose = mort cellulaire physiologique par suicide provoqué par la mise en marche d’un programme génétique en réponse à des signaux extra- ou intracellulaires.

� L’apoptose, contrebalançant la prolifération cellulaire, régule la taille des organes

� L’apoptose élimine des cellules devenues inutiles ou dangereuses :

� cellules avec ADN lésé, non ou mal réparé

� cellules de système immunitaire après mission

� cellules potentiellement cancéreuses

3éme partie


� cellules infectés par des virus (apoptose induite par lymphocytes T cytotoxiques)



Génotoxicité & MutagenèseApoptose

Control cells without cyanobacterial extract

Cells with cyanobacterial extract, apoptotic buds, and highly condensed chromatin are visible

3éme partie


Microscopic analysis. Rat hepatocytes incubated with cyanobacterial extract (Microcystin-LR = 1000 nM) for 120 min

� Inducteurs négatifs = suppresseurs de facteurs de survie (facteurs de croissance, cytokines, certaines hormones…)

� Inducteurs d’apoptose :

� Inducteurs positifs = ajouts de facteurs de mort

� des lésions d’ADN (stress génotoxique) par oxydants, rayons X, rayons UV, cancérigènes, agents chimiothérapeutiques

� des molécules, qui par contact intercellulaires, en se liant à leurs récepteurs membranaires, déclenchent l’apoptose :

� des cytokines, le TNFα, ligand du TNFR (TNF Receptor), et la lymphtoxine (TNFβ), ligand du même récepteur,

� le Fas ligand (FasL), ligand du récepteur Fas.


3éme partie



Inducteurs positifs

Inducteurs négatifs

TNFαFasL

lésions d’ADN

privation en facteurs de croissance

Apoptose

Caspases

Voie extrinsèque Voie intrinsèque

3éme partie


� L’apoptose est commandée par divers signaux : les signaux de suicide et les facteurs de survie


� Les facteurs intervenant pour susciter l’apoptose aboutissent à une voie commune passant par la mitochondrie, la protéine Bcl-2 et les caspases.

3éme partie


Signaux régulant l’apoptose




� Les atteintes aboutissent au niveau de la mitochondrie à la fermeture ou l’ouverture de pores de transition de perméabilité mitochondriale (MPT ou Mitochondrial Permeability Transition), sous l’effet de protéines de la famille Bcl-2 (B Cell leukemia/lymhoma-2)

.

� Rôle de mitochondrie :

� L’ouverture de ces pores est responsable de la libération dans le cytoplasme :

� de libérer des substances (cytochrome C notamment) qui activent des enzymes ayant une activité de protéase à cystéine, qui atteint les protéines spécifiquement au niveau d’un aspartate (caspases)

� de libérer d’autres facteurs, à destination nucléaire, comme l’AIF(Apoptosis Inducing Factor)

� Protéine Bcl-2 (anti-apoptotique) � Fermeture des pores , Protéines Bax et Bad (pro-apoptotiques) � Ouverture des pores

3éme partie


� Le processus d’apoptose peut être amplifiée par la libération de radicaux libres et du Ca++, et par l’inhibition de la chaîne respiratoire mitochondriale

� Les caspases :


� Caspases = Protéases à action hydrolytique permettant essentiellement la perte de fonction de protéines nécessaires :

� au maintien de l’intégrité cellulaire :

� la dégradation de l’actine lève son action inhibitrice sur la DNAse I

� la dégradation des lamines nucléaires rend l’ADN accessible aux endonucléases

� la dégradation de l’IACD (inhibiteur de la "Caspase Activated Dexoxyribonuclease")

�� au maintien de l’intégrité génomique :

� la dégradation de la PARP (poly(ADP-ribose)polymérase) entraîne un défaut de réparation de l’ADN

� la dégradation de la DNA-PK (DNA-dependent Protein Kinase) entraîne un défaut de réparation des cassures double brin de l’ADN

3éme partie


�� au contrôle du cycle cellulaire (protéine pRb)


� Les signaux de survie déclenchent la fabrication ou l’activation de la protéine Bcl-2, tandis que les signaux de suicide déclenchent celle de la protéine Bax.

� La balance Bcl-2/Bax :Un des modules de contrôle de la survie ou du suicide

� Les protéines Bcl-2 et Bax, aux fonctionnement antagonistes, se lient et se neutralisent. L’excès de Bcl-2 détermine la survie, l’excès de Bax, la mort.

� Le complexe Bcl-2/Apaf-1 (Apoptotic Protease Activating Factor-1)/caspace empêche la mort.

� Bax entraîne la libération, par la mitochondrie:

� soit du cytochrome C qui, avec Apaf-1et la procaspase-9 forment un complexe, l’apoptosome activant les caspases effectrices,

� soit d’autres protéines qui déclenchent un phénomène de mort indépendant des caspases.

3éme partie



3éme partie


Balance Bcl-2/Bax




� Rôle du p53 :

� La voie d’apoptose peut être activée par le gène p53 (exprimé) en réponse à une lésion d’ADN.

� A la suite de lésions de l’ADN, p53 est phosphorylé par une protéine kinase (ATM , ATR, ou DNA-PK) ayant pour effets :

� le p53 n’induit plus la transcription de MDM2 � pas de dégradation du p53

� p53 est facteur de transcription, entre autres gènes, de ceux codant pour p21,

une CK1 qui entraîne l’arrêt du cycle cellulaire et la réparation de l’ADN,

et pour la protéine Bax

� p53 pourrait séquestrer des membres anti-apoptotiques de la famille Bcl-2.

3éme partie


� Un défaut d’apoptose entraîne une prolifération cellulaire incontrôlée(les cellules génétiquement lésées se multiplient à l’excès et subissent des altération chromosomiques qui ne sont pas éliminées) :

� surexpression de la protéine anti-apoptotique Bcl2

� mutation de la protéine pro-apoptotique p53 (inactivation)


Apoptose


Le gène p53


(Din

g &

Ong,

2003)

3éme partie


Les différents mécanismes possibles de l’induction de l’apoptose par les cyanotoxines de type microcystine


� On peut trouver des foyers d'apoptose près des foyers de nécrose, mais aussi après irradiation, chimiothérapie, une hyperthermie modérée, la suppression hormonale (cancer de la prostate) ou au contraire la surcharge en corticoïdes (leucémies et lymphomes).

� Les lymphocytes cytotoxiques sont tueurs par induction de l'apoptose de la cellule cible.

3éme partie

� Rôle de l’apoptose dans le cancer :

� Au cours du processus de cancérisation, il existe probablement des défautsde mise en route de l’apoptose lorsque surviennent des anomalies de l’ADN qui devraient mettre en route l’apoptose.

� Des mutations des gènes pro-apoptotiques (p53…) interdisent l’arrêt du cycle et n’orientent pas la cellule vers l’apoptose ; la division cellulaire se poursuit accumulant des mutations




Présence d’ADN endommagé � Stimulation de la protéine anti-oncogène p53

�Arrêt momentané du cycle cellulaire pour réparation des lésions.

(en stimulant la synthèse de p21 qui inhibe CDK-2 et ainsi le passage G1 � S)

Trop de mutations et réparation insuffisante � apoptose orientée par p53. (solution préférentielle pour l’organisme)

Mutation de p53 � ni blocage de cycle cellulaire, ni orientation vers

l’apoptose � Réplication de l’ADN endommagé � Développement tumoral.

3éme partie

Réponse cellulaire Génotoxicité & Mutagenèse


CancérogénicitéGénotoxicité & Mutagenèse

� Cancer = prolifération anarchique de cellules anormales, les tumeursqui en résultent sont dites malignes quand ces cellules peuventessaimer dans l'organisme.

Cancérogénicité

� Processus multi-étapes

� Initiation (modification irréversible)

� Promotion (progression vers le cancer)

� Une substance chimique peut-être:

� initiatrice (action sur l’ADN)

� Promotrice (sans action directe sur l’ADN)

� Un produit cancérogène est une substance chimique qui peut causerle cancer ou en augmenter la fréquence dans une population.Cancérogénicité veut dire "capacité de causer le cancer"

3éme partie


167

Géno

toxicité

& M

utag

enès

e3é

mepart

ie

Can

céro

géni

cité

Étapes de la cancérogenèse



Classification des substances cancérogènes

� Selon le CIRC (Centre International de Recherche sur leCancer, Lyon), on distingue :

� catégorie 1 : substance cancérogène pour l’homme

� catégorie 2A : substance probablement cancérogène pour l’homme

� catégorie 3 : substances ne peut être classée du point de vue de sa cancérogénicité pour l’homme

� catégorie 4 : substances probablement non cancérogène pour l’homme

3éme partie

Cancérogénicité





� Selon la CEE, on distingue :

� catégorie 1 : cancérogène pour l’homme (études épidémiologiques)R45 "peut causer la cancer"

� pas de classement : données insuffisantes pour classer ! # non cancérigène !

� Les cancérigènes peuvent être des substances génotoxiques, épigénitiques ou même des proliférateurs de peroxysomes

3éme partie

Cancérogénicité

� catégorie 2 : assimilés à un cancérogène pour l’homme R49 (études animales positives)

� catégorie 3 : substances préoccupantesR40 "effets irreversibles"(études animales suggestives)



Cancérogènes Génotoxiques

Type Mode of action Example

Genotoxic

1) Direct-acting or primary carcinogen

Electrophile, organic compound, genotoxic, interacts with DNA

Azirdine, bis(chloromethyl)-ether

2) Procarcinogen or secondary carcinogen

Requires conversion through metabolic activation by host or in vitro to type I

Vinyl chloride, benzo[a]pyrene, 2-naphthylamine, dimethylnitrosamine, Hydrazines

3) Inorganic carcinogen Not directly genotoxic, leads to changes in DNA by selective alteration in fidelity of DNA replication

Nickel, chromium

3éme partie

Cancérogénicité



Type Mode of action Example

Epigenetic

4) Solid-state carcinogen

Exact mechanism unkown ; usually affects only mesenchhymal cells and tissues; physical form vital

Polymer or metal foils, asbestos

5) Hormone Mainly alters endocrine system balance and differenciation ; often acts as promoter

Estradiol, diethylstilbestrol

6) Immuno-suppressor

Mainly stimulates ‘virally induced’, transplanted or metastatic neoplasms

Azathioprine, antilymphocytic serum

7) Cocarcinogen Not genotoxic or carcinogenic, but enhances effect of type-1 or type-2 agent when given at the same time. May modify conversion of type 2 to type 1

Phorbol esters, carbon tetrachloride, catechol, ethanol, n-dodecane, SO2

8) Promoter Not genotoxic or carcinogenic, but enhances effect of type-1 or type-2 agent when given subsequently

Phorbol esters, phenol, dithranol, bile acids, tryptophan metabolites, saccharin

3éme partie

Cancérogénicité


Cancérogènes Epigénétiques


Cancérogènes non génotoxiques� Promoteurs : Agents très variés accélérant la formation de tumeurs paracroissement de l’expansion clonale dans les cellules néoplasiques ouprénéoplasiques. Ex : TPA, TCDD, microcystine-LR…

� Carcinogènes peroxisomiaux : Provoquant la libération d’enzymescontenues dans les peroxisomes et accélérent la prolifération cellulaire.Ex : méthylclofenapate, ciprofibrate…

� Carcinogènes cytotoxiques : agents produisant cytotoxicité et nécrose,spécificité d’organe. Ex : CCl4, furane (foie), chloroforme, nitrilotriacétate(rein), hydroxyanisole (estomac)…

� Hormones : Régulatrices de la prolifération cellulaire, forte spécificitéd’organe. Ex : DES, TSH, thiocarbonyls…

3éme partie

Cancérogénicité


� Carcinogènes « solides » : agents irritants inflammatoires.Ex : fibres minérales (amiante), métaux à certaines concentrations…



CancérogénicitéGénotoxicité & Mutagenèse3éme partie


Mécanismes d’induction de la cancérogenèse par des agents génotoxiques directs et indirects et/ou par d’autres substances non-génotoxiques


Cibles multiples des promoteurs de tumeurs� Transduction des signaux contrôlant la croissance et la différenciation :Proto-oncogènes, gènes suppresseurs de tumeur

� État de phosphorylation de protéines cellulaires ; Régulation de leuractivation / inactivation : Activation de protéines kinases (par TPA) ; Inhibitionde protéines phosphatases (par AO et microcystine-LR)

� Production de radicaux libres ; Altération de la balance oxydo-réductrice et agression des biomolécules

� Biosynthèse de phospholipides ; Production de médiateurs del’inflammation

� Altération des systèmes de réplication ou de réparation de l’ADN ;Activité télomèrase

3éme partie

Cancérogénicité


� Altération de la structure et de la fonction de la membranecytoplasmique ; jonctions communicantes, cytosquelette


Certains gènes associés au cancer chez l’homme : Proto-oncogènes / Oncogènes

� Les proto-oncogènes codent des protéines qui stimulent la division cellulaire ; certaines formes mutées de ces gènes, les oncogènes, codent des formes hyperactives des protèines de stimulation, entraînant la prolifération excessive des cellules.

� Oncogènes :

� Gènes codant des facteurs de croissance ou leurs récepteurs(PDGF, erb-B, erb-B2, RET)

� Gènes codant des relis cytoplasmiques dans les voies de stimulation(Ki-ras, N-ras)

� Gènes codant des facteurs de transcription qui activent les gènes favorisant la croissance (c-myc, N-myc, L-myc, c-fos, c-jun)

� Gènes codant d’autres molécules (Bcl-2, Bcl-1, MDM2)

3éme partie

Cancérogénicité



Certains gènes associés au cancer chez l’homme : Gènes suppresseurs de tumeurs

� Les gènes suppresseurs de tumeurs codent des protéines qui inhibent la division cellulaire. Des mutations peuvent inactiver ces protéines, et contrer les freins limitant la prolifération cellulaire.

� Gènes suppresseurs de tumeurs (anti-oncogènes) :

� Gènes codant des protéines de cytoplasme (APC, DPC4, NF-1, NF-2)

� Gènes codant des protéines de noyau (MTS1, pRb, p53, WT1)

� Gènes codant d’autres protéines (ATM, BRCA-1, BRCA-2, VHL)

3éme partie

Cancérogénicité




177

Géno

toxicité

& M

utag

enès

e

Oncogènes Gènes suppresseurs de tumeurs

3éme

part

ie



Importance de l’instabilité génomique induite par les substances génotoxiques dans la cancérogenèse

Mutations dans des gènes de stabilité du génome

Mutations dans des gènes associées au cancer

Substances chimiques

Radiations ionisantes

Processus endogènes

Réparation de l’ADN Réparation de mésappariements Réplication de l’ADN Ségrégation des chromosomes Longueur des télomères

Phénotype

mutateur

ras

Rb

p53

CANCER




Réplication des extrémités



Rôle de la Télomèrase




Tests de cancérogenèse:

3éme partie

Cancérogénicité

� rat, souris

� Tests de cancérogenèse chez l’animal / méthodes expérimentales

� 18-24 mois

� 2 sexes

� différentes doses (environ 4 dont dose témoin 0)

� Voies d’administration : per os +++ , inhalation + , peau, injection ?

� Limitations


doses, saturation, réparation, détoxification, épigénitiques >, pas information mécanisme, extrapolation homme, durée, coût


Cancérogénicité

� Initiation tumorale / Exemple Bio-essais d’hépatocancérogenèse / RatsOhta et al. (1994)

0 10

stopMCYST-LR

(25 µg/kg) saline

12S

sacrifice

-1i.p. (20 x)

10

NOD (25 µg/kg) saline

12S

0 10

NOD (25 µg/kg) saline

12S

sacrifice

-1

i.p. (20 x)

stop

i.p. (20 x)3

DENi.p.

(200 mg/kg)

sacrificestop

0-1

Absence de nodules néoplasiques

Foyers GST-P+ (106 no/cm2)

Foyers GST-P+400X DEN

(diéthylnitrosamine)



Relation Mutagenèse – Cancérogenèse� Dépassement des processus de réparation de l’ADN� Fixation des altérations de l’ADN � Apparition des mutations

� Stabilisation des mutations après processus de la cancérogenèse (promotion et progression) � Installation d’une tumeur

� Arguments directs et indirects soutenant la relation mutagenèse -cancérogenèse :

� ADN = principale cible moléculaire des cancérogènes

� Activation des proto-oncogènes en oncogènes par mutation

� Inactivation des gènes suppresseurs de tumeurs par mutation

3éme partie

Mutagenèse - Cancérogenèse


� Relation entre formation d’adduits à l’ADN par des intermédiaires électrophiles générés par des cancérigènes, formation de mutations (par transversions GC:AT ou AT:TA) et apparition de cancers


� Corrélation entre génotoxicité, mutagénicité et cancérogenèse� Utilisation des biomarqueurs biologiques de génotoxicité

�� Évaluation du risque cancérigène

� Toutes les mutations n’entraînent pas systématiquement l’initiation d’un processus de cancérogenèse. Les mutations dangereuses portent en général sur les gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire, dans l’embryogenèse ou dans la différenciation cellulaire

� Les cancérogènes environnementaux ne procèdent pas tous par la voie de la génotoxicité

Exposition

Métabolisme

Réactifs intermédiaires

Adduits à l’ADN cancérigènes

Cancer

Mutation

3éme partie



� Il existe des mutagènes non cancérogènes et des cancérogènes non mutagènes




Soussi et al. (2000)

3éme partie






Soussi et al. (2000)

Tests de génotoxicité / mutagenèseGénotoxicité & Mutagenèse

Tests de génotoxicité / mutagenèse� Les tests sont nombreux � tests in vitro (sur bactéries ou cellules en cultures) effectués en premier et complétés par des tests in vivo (sur l’animal)

� Les résultats positifs des tests de génotoxicité sont considérés comme une alerte pour un éventuel potentiel cancérigène ou tératogène

� Les résultats des tests in vivo sont pris en compte de façon prioritaire pour la classification des agents mutagènes

� Selon les effets recherchés, on distingue (tests rapides / prédictifs) :

� tests de mutations géniques (ex. test d’Ames)

� tests de mutations génomiques (dommages chromosomiques)

� autres indicateurs de dommages génétiques

3éme partie


� Détection des cancérogènes non génotoxiques et promoteurs de tumeurs


� Test d’Ames (détection sur bactérie de mutants reverses en présence de l’agent toxique)

� Test HG-PRT ou test de mutation ponctuelle au locus de l’hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl transférase (sur cellules en culture)

Tests de génotoxicité / mutagenèse

� Test de dominance létale chez le rongeur ; Test sur souris transgénique ; Spot test (exposition des embryons de souris dans des souris gestantes à l’agent toxique)

� Mesure des mutations

� Mesure des cassures chromosomiques

� Test d’échange chromatides soeurs (visualisation sur cellules en culture des échanges de bras chromatidiens appartenant à un même chromosome)

� Test d’aberrations chromosomiques au niveau des plaques métaphasiques (sur cellules en culture ou sur animal)

� Test du micronoyau (mise en évidence d’effet aneugène et clastogéne, sur cellules en culture ou sur animal)

3éme partie




Génotoxicité & MutagenèseTests de génotoxicité / mutagenèse

� Mesure de l’exposition

� Détection des adduits à l’ADN et des dommages oxydatifs de l’ADN

� Test d’élution alcaline et le test de comètes (évaluation de la présence de cassures d’ADN

� Mesure de la réparation

� SOS chromotest (Mesure sur bactérie de la réparation mutagène de type SOS)

� Test de synthèse non programmée de l’ADN UDS (détection de l’ADN néoformé sur cellules en culture ou sur animal)

� Test 3D (sur bactérie ou sur cellules en culture)

3éme partie



� Test d’Ames (ou Mutatest) (Salomonella typhimurium His-)

� But : Étude de potentiel mutagène d’un composé chimque � mise en

évidence de mutations géniques par des substitutions de paires de bases et

par décalage du cadre de lecture � test de révélation sur procaryotes

� Estimation du potentiel cancérigène d’une substance


Mesures des mutations géniques

3éme partie

� Le principe de ce test repose sur différentes souches bactériennes de

Salmonella typhimurium (TA 1535, TA 1537, TA 98, TA 100 et TA 102) portant des mutations dans les gènes nécessaire à la synthèse de l'histidine

� Ces bactéries modifiées sont donc auxotrophes pour l'histidine et requièrent

par conséquent un apport d'histidine pour se développer. Elles ne se

développent que sur des milieux spéciaux (Agar-His+)



� Le test permet donc d'évaluer la facilité que possède une substance à induire

une réversion de la souche auxotrophe.

Dans le cas d'une substance mutagène, on observe ainsi l'apparition de

souche prototrophes, ne nécessitant plus d'histidine pour croître mais

d'un milieu minimum seulement.

� Dénombrement de colonies de bactéries réversibles (mutation reverse),

se développant sur un milieux Agar-His¯ , après l’action de mutagène

avec et sans activation métabolique (S9-Mix : microsomes de foies de rats,

ajoutée afin de siuler l’effet du métabolisme)


3éme partie

� Comme Salmonella est un organisme procaryote, il ne représente pas

un modèle parfait pour l'Homme.



Révertants His+

3éme partie


Test d’Ames avec de l’ α-naphtylamine




� Test HG-PRT

� But : Dépistage, par analyse du gène sur des eucaryotes, de mutations de paires de bases, de mutations frameshift et de petites délétions

� Incubation de cellules de mammifères (ex. V79 fibroblastes de hamster) modifiées dans la zone du gène hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transférase (HG-PRT),et donc résistantes à la thioguanine (6TG), avec des cellules de type naturel

HG-PRT-

(survie en présence de TG) V79 fibroblastes de hamster

contrôle + TG

culture mixte

HG-PRT+

(survie sans présence de TG)

le métabolite TG est transmis par des gap junctions sur la mutante

HG-PRT à travers la signalisation intracellulaire : les 2 cellules meurent

le DDT et d’autres promoteursbloquent la signalisation cellulaire :

les cellules résistantes survivent

+ DDT


3éme partie


Test HG-PRT


3éme partie


Test HG-PRT


Tests des dommages chromosomique


� But : Test cytogénétique mettant en évidence les produits clastogènes

capables d’induire des aberrations de structure aussi bien du type

chromosomique que de type chromatidique

� Analyse de métaphases

� Test d’aberrations chromosomiques sur culture de cellules de hamster

chinois en lignée continue (CHO, V79 ou CHL) ou sur lymphocytes

humains en primo-cultures (� Extrapolation plus pertinente à l’homme)

� Test d’aberrations chromosomiques

3éme partie


196

Géno

toxicité

& M

utag

enès

eT

ests

de

géno

toxi

cité

/ m

utag

enès

e

3éme

part

ie


Test d’analyse de métaphase in vivo chez le rongeur




3éme partie

Aberrations chromosomiquesFSB - Mastère Sciences Biologiques – Génotoxicité & Réparation de l’ADN - par Dr. Imed MAATOUK


� Test d’échanges des chromatides sœurs (SCE)

� But : Dépistage d’anomalie structurale de chromosomes� Test sur cell. V79 ou CHO ou lymphocytes humains

� L’échange se manifeste spontanément lors de la mitose, en particulier sous l’effet de clastogènes. Dans une première mitose, le marquage du brin de l’ADN nouvellement formé se fait par la bromodésoxyuridine (BrdUrd). Après lamitose suivante, le marquage ne devrait alors apparaître que sur le brin marqué

SCE initié avec des clastogènes � Distribution anormale de marquage

contrôle

1. Mitose + BrdUrd

2. Mitose sans BrdUrd

+ clastogènes


3éme partie


Échange des chromatides sœurs (SCE)




3éme partie



3éme partie






� test d’évaluation du nombre de cellules à génome altéré

dans une population de cellules par le biais de micronoyaux

� test de mise en évidence d’aneuploïdie

(recherche de perte de chromosome entier)

� Test du micronoyau (micronucleus)

� But : Mise en évidence de l’effet clastogène et aneugène sous l’effet

d’une substance génotoxique en utilisant des cellules cultivées ou de la

matière obtenue par biopsie

� Des micronoyaux se forment à la suite d’une division cellulaire erronée,

les chromosomes n’étant pas correctement répartis dans les cellules filles

� Observation du matériel extranucléaire

3éme partie



Test micronucleus


3éme partie



3éme partie


Test micronucleus


Test du micronoyau : aneuploïdie ou clasogénèse ?

Noyau contenant un chromosome marqué par une sonde centromérique : 2 spots

Noyau

Micronoyau contenant un fragment chromosomique, pas

de marquage du centromère

Clastogénèse

Noyau

Micronoyau contenant un chromosome entier,

marquage du centromère

Aneuploïdie

3éme partie





� But : Remplacer un test de mutation génique (test d’Ames)

� chercher si un effet positif ou douteux mis en évidence

dans un des tests de base de la batterie, résulte bien

d’une altération primaire de l’ADN

� Application aussi sur des hépatocytes après traitement in vivo de l’animal

� Test de synthèse non programmée de l’ADN (UDS) sur primo-culture d’hépatocytes de rat


Tests basés sur la réparation de l’ADN

3éme partie


206

Géno

toxicité

& M

utag

enès

eT

ests

de

géno

toxi

cité

/ m

utag

enès

e

3éme

part

ie

� SOS Chromotest(activation de recA et protéolyse de LexA, réparation par recombinaisons)


SOS Chromotest


Tests de mesure d’exposition

� Test de comètes (Single cell gel electrophoresis)

� But : Détection en milieu alcalin des cassures simple (et doubles)

brins d’ADN, des bases oxydées d’ADN, les sites alcali-labiles, les pontages ADN-protéines et des sites incomplets de réparation dans des cellules isolées exposées à des génotoxiques

� La digestion des bases oxydées de l’ADN par des endonucléase III et des

formamido pyrimidine glycolase (fpg) transforme ces cassures en simple brin de l’ADN

� Queues de comètes = fragments d’ADN migrés à l’extérieur du noyau

3éme partie


� Fragmentation d’ADN résultant de l’apoptose

�� Sur-estimation de la génotoxicité révélée par le test de comètes !!!


control cell

control+ Fpg

treated cell

treated cell + Fpg

3éme partie


Test de comètes en milieu alcalin




� Detection des adduits à l'ADN (comme biomarqueurs d'exposition aux cancérogènes de l'environnement)

� Les adduits à l’ADN sont promutagèniques et ont le potentiel de produire

des effets biologiques néfastes (s’ils ne sont pas réparés), lors de la réplication du matériel génétique et ultérieurement au cours de sa traduction

� La détection et la quantification des adduits à l’ADN nécessitent des

méthodes très sensibles capables de détecter un adduit pour 107 à 1010

nucléotides, soit pour l'homme environ un adduit par génome

� Le niveau mesuré d’adduits à l’ADN est le résultat de la balance entre la

formation/persistance, l’élimination par la réparation, la prolifération cellulaire et la dilution par la réplication (l’ADN nouvellement synthétisé ne contient pas d’adduit)


3éme partie



� Plusieurs techniques de détection des adduits à l’ADN ont été mises au point ces dernières années :

� les méthodes immunologiques

� les méthodes fluorimétriques

� la chromatographie liquide haute performance (CLHP)

� l’électrophorèse capillaire (EC)

� la chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CG/SM)

� le post-marquage au radio phosphore (32P)


3éme partie



3éme partie


Techniques Avantages Inconvénients Sensibilité

Méthodes immunologiques

- Rapide, sensible, très spécifique et reproductible- Nombreux échantillons par jour

- Connaître les adduits- Quantité d'ADN assez élevée (20 µg)- Surestimation des niveaux mesurés- Spécificité non absolue (réactions croisées

1 adduit / 106 à 108

nucléotides

Chromatographie gazeuse + spectrométrie de masse

- Sensibilité de la mesure- Reconnaissance d'un grand nombre d'adduits spécifiques

- Surestimation du taux d'adduits- Appareillage et mise en route onéreux- Quantité d'ADN (>10 µg)- oxydation des bases normales d'ADN lors de leur dérivatisation

1 adduit / 108 nucléotides

CLHP - Sensible et spécifique- relativement facile à mettre en oeuvre- Nombreux échantillons par jour

- Surestimation possible en raison de la préparation d'échantillons- Artéfacts liés au protocole d'extraction de l'ADN- Quantité d'ADN assez élevée (20 µg)

1 adduit / 106 nucléotides

Post-marquage au radiophosphore

- assez sensible- Grand nombre d'adduits reconnues - très appliquée dans les analyses in vitro

- Faible quantité d'ADN (1-10 µg)

- technique lourde- oxydation des bases non modifiées lors de l'extraction d'ADN ou par radiolyse du 32P- Surestimation des niveaux mesurés- Pas spécifique d'un type d'adduit- Utilisation d'éléments radioactifs

1 adduit / 108 à 1010

nucléotides

Electrophorèse capillaire

- technique très sensible, sélective, reproductible et simple- Faible quantité d'ADN- nombreux échantillons par jour

- Entretien du capillaire et de l'appareillage- Mauvaise estimation des niveaux mesurés en cas d'altération de la séparation

1 adduit / 106 à 108

nucléotides


3éme partie


Post-marquage au 32P : Autoradiographies des profils d’adduits à l’ADN obtenus après traitement de cellules épithéliales bronchiques WI 26 à l’acide okadaique (OA)

pendant 4h aux doses 1, 10 et 100 nM.



213

Géno

toxicité

& M

utag

enès

eT

ests

de

géno

toxi

cité

/ m

utag

enès

e

(in Esaka et al. 2003)

Analyse par HPLC et MS


214

Géno

toxicité

& M

utag

enès

e

Analyse par ECZ

Tes

ts d

e gé

noto

xici

té /

mut

agen

èse

3éme

part

ie


(Tamisier-Karolak et al. 2001)


� Detection des dommages oxydatifs de l’ADN(Étude d’une lésion oxydative modèle: La 8-oxo-dG)

� La 8-oxo-dG (8-oxo-7,8-dihydro-2’-désoxyguanosine) est très stable, fréquente, possède des effets biologiques et facile à identifier ce qui en fait un excellent modèle d’étude

� La 8-oxo-dG possède une électronégativité différente de la guanine et un potentiel redox particulièrement bas, ce qui reflète qu’elle est encore plus

sensible à l’oxydation que la guanine

� Sachant que le cycle imidazole des purines est plus sensible aux oxydations que le cycle pyrimidine, on dénombre entre 104 et 105

résidus de 8-oxo-dG produits par cellule et par jour chez les mammifères

� Un niveau basal a été estimé dans le foie de rat à 500 pour 109 nucléotides pour la 8-oxo-dG indiquant la formation continue de cette lésion dans l’organisme


3éme partie



� Détection par des techniques directes :

� les méthodes immunochimiques

� la chromatographie liquide haute performance avec détection électrochimique (CLHP/DE) � très utilisée en raison de sa grande sensibilité et de sa simplicité

� l’électrophorèse capillaire (EC)

� la chromatographie gazeuse / Spectrométrie de masse (CG/SM)

� le post-marquage au radio phosphore (32P)

� Détection par des techniques indirectes :

� techniques utilisant les endonucléases de réparation (Fpg…)

� test de comètes ou l’élution alcaline


3éme partie




217

Géno

toxicité

& M

utag

enès

eT

ests

de

géno

toxi

cité

/ m

utag

enès

e

3éme

part

ie


218

Géno

toxicité

& M

utag

enès

e

(Maatouk et al. 2004)

Tes

ts d

e gé

noto

xici

té /

mut

agen

èse



Détection des cancérogènes non génotoxiques et des promoteurs tumoraux

� Test d’inhibition de la communication cellulaire utilisant des colorants

ou des anticorps spécifiques

� Test de transformation basée sur l’incorporation de cellules exposées

à l’agent toxique et transfert à des souris nudes afin de voir si ces cellules évoluent en cancer ou non (nécessaire comme 20-40 % des cancérigènes chimiques exercent un mécanisme non génotoxique)

� Systèmes de métabolisation exogènes (in vitro) complémentaires

si l’agent chimique inefficace par lui-même, devient génotoxique après métabolisation (fraction S9)


3éme partie



3éme partie




Conclusion Générale


Exposition à un agent toxique (promutagène ou génotoxique procancérigène)

Transformation métabolique

Métabolite électrophilique

Interaction ADN

Lésion de l’ADN

Activation Détoxification

Métabolite inactif


Réparation de l’ADN absent ou inefficace

Lésion stable de l’ADN

Mutation de la cellule

Développement tumoral cancer







Réponses cellulaires aux radiations ionisantes




Exemple : Réponses cellulaires aux radiations ionisantesLa réponse cellulaire aux rayonnements ionisants est fonction de la dose, du débit de dose, du type de rayonnement, du type cellulaire et de son micro/ macro environnement. La cellule réagit immédiatement à l’atteinte de son ADN dans les minutes, les heures, les jours qui suivent l’agression



RAYONNEMENTS IONISANTS

Inductions de lésions

Réparation enzymatique des lésions

• Augmentation de la survie • Augmentation des mutations et de la recombinaison

• Augmentation des transformations malignes

• Effet létal

Réparation fautiveRéparation fidèle Lésion non réparée

• par effet direct : par ionisation ou excitation de la molécule libre

• par effet indirect : par diffusion de OH¯ ,H+ et e–aq. Lésion en un point distant

de celui où l’énergie est déposée

Importance du TLE (Transfert Linéique d’Énergie)


Significations biologiques des lésions induites par les rayonnements ionisants

227

Conc

lusion

Gén

érale


Biomarqueurs d’exposition aux génotoxiques et cancérigènes de l’environnement



Position des tests de génotoxicité au niveau des différentes étapes conduisant de l’induction d’une lésion par une substance génotoxique à la fixation de la mutation

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