identification des cellules responsables des effets du récepteur des glucocorticoïdes sur la...
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Identification des cellules responsables des effets du récepteur des glucocorticoïdes sur la
vulnérabilité à la cocaïne
Mutagenèse conditionnelle chez la souris
Marc Turiault, UMR7148, Collège de France
Réponse au stress et glucocorticoïdes
Glande surrénale
Hypophyse
+CRH
Hypothalamus
Glucocorticoïdes
Gluconéogénèse
Réponse immunitaireRéparation tissulaire
Lipolyse
ACTH+
Rétrocontrôle négatifModulation des comportements
Glucocorticoïdes et psychostimulants
Injection GC/stress : réponse aux psychostimulants
Adrénalectomie : réponse aux psychostimulants
Vulnérabilité accrue aux drogues chez des animaux stressés
MR GR
Mécanisme d’action du récepteur des glucocorticoïdes
transcription transcriptionAP1 NFkB
transcription transcriptionStat5
GRE
nGRE
Glucocorticoides
hsp
GR
hsp
ARMR
PI3KAkt
Mutation du GR
Allèle sauvage
Domaine de liaison au ligand
Domaine de liaison à l’ADN
1a 1b 1c 2 3 4 5 6 7 8 9
Allèle null
Pas de protéine produite
Mort des nouveaux nés
Mutagénèse conditionnelle du GR
hGH
polyA
Nestine-Cre
CreRégion Nestine 5’ Nestine enh II
Cre
Inactivation de GR dans le système nerveux : souris GRNesCre
GRloxP
loxPloxP
Tronche et al, Nature Genetics, 1999
ComportementCollaboration
Sensibilisation comportementale après injections chroniques
Auto-administration
Etude comportementale de la réponse à la cocaïne des souris
GRNesCre
L’absence de GR dans le cerveau bloque la sensibilisation comportementale
9 injections (intervalle:2 jours)
Groupe 3 (chronique) Cocaïne Cocaïne
Groupe 2 (aiguë) Saline Cocaïne
Groupe 1 (contrôle) Saline Saline
30 joursTest
(15mg/kg) (7,5mg/kg)
(7,5mg/kg)
Acti
vit
é locom
otr
ice
0
50
100
150
200
250
300
350
Contrôles
a *
*
§
0
50
100
150
200
250
300
350
GRNesC
re
*
*
b salineacute cocainechronic cocaine
Deroche-Gamonet et al, Journal of Neuroscience,2003
Acti
vit
é locom
otr
ice
Diminution des propriétés motivationnelles de la cocaïne en absence
de GR dans le cerveau
Cage d’auto-administration
Days
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Nose-P
okes
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50a
FR1 FR2 FR3 FR5
Acquisition
Trou inactif -GRNesCre
Trou actif- GRNesCre Trou actif -GRloxP
Trou inactif -GRloxP
Deroche-Gamonet et al, Journal of Neuroscience, 2003
Cocaine doses (mg/kg/inj)
0.03 0.06 0.12 0.25 0.5 1.0 2.00
20
40
60
80
100
120
140b
*
**
*
*
**
Dose réponse
Nose-P
okes
Quelles cellules sont responsables des effets du GR sur la vulnérabilité à la
cocaïne ?
Marc Turiault Frederic Ambroggi
Paris Bordeaux
Drogues transmission dopaminergique
Glucocorticoïdes l’activité électrique des neurones dopaminergiques
Quelles cellules sont responsables des effets du GR sur la vulnérabilité à la
cocaïne ?
Les neurones dopaminergiques ont-ils une activité différente en absence de GR ?
Système méso-cortico-limbique
Cortex préfrontal
Noyau accumbens
ATV
GR est impliqué dans le contrôle de l’activité des neurones dopaminergiques
Neurone de l’AVT
AmplificateurO
rdin
ate
ur
Au
dio
mon
Oscillo
scop
e
µ manipulateur
Fréquence d’occurrence des
bouffées (Hz)
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
01Cont GRNesCre
1
2
3
4
0Cont GRNesCre
Fréquence de décharge (Hz)
1.8 Hz
2.4 Hz
4.4 Hz
4.6 Hz
1 sec
Contrôles GRNesCre
Hz Hz
Système méso-cortico-limbique
Quelles cellules sont responsables des effets du GR sur l’activité dopaminergique
et la vulnérabilité à la cocaïne ?
Cortex préfrontal
Noyau accumbensATV NO GR
NO GR
NO GR
Inactivation du GR dans les neurones dopaminergiques
Cre
GRlox
PloxPloxP
GRnull
Gène DAT
CreHomologie 5’ Homologie 3’
BAC DAT210kb
NO GR
NO GR
NO GR
Recombinaison spécifique des neurones DA
TH Cre TH X-gal
Cre
loxPloxP
STOP LacZ
Souris DATiCre Souris DATiCre – R26R
Recombinaison dans les neurones dopaminergiques de l’ATV
GRloxp/loxp
GRDAT-Cre
Souris GRDATiCre
THGR Ov
Souris DATiCre – R26R
β-Gal DAT OvTH
Souris DATiCre
iCre
TH iCre
DATiCre
L’inactivation de GR dans les neurones dopaminergiques n’a
aucun effet sur l’autoadministration de cocaine
Poin
t d
e r
up
ture
Ratio progressifAcquisition
Trou inactif- GRDATCre
Trou actif- GRDATCre
Trou actif -Contrôles
Trou inactif -Contrôles
Noses p
okes
Dose réponse
GRDATCre
Contrôles
Inje
cti
on
s
Cocaïne (mg/kg/inj)
Pas d’effet de l’absence de GR dans les neurones dopaminergiques
4.4 Hz, 7% Bursts 4.6 Hz 7% Burst
GRloxP GRDATCre
WT
KO
Fir
ing
Rate
(H
z)
0
1
2
3
4
0
2
4
6
8
Bu
rst
Ev
en
t fr
eq
ue
nc
y (
Hz)
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Fréquence d’occurrence des bouffées (Hz)Fréquence de décharge
(Hz)
Cortex préfrontal
Noyau accumbensATV ?NO GR
NO GR
NO GR
Inactivation du GR dans les neurones post-dopaminergiques
TrpUra
YAC D1A140 kb
CEN4 Gene D1
CreHomologie 5’
Homologie 3’
loxPGRnull
Cre
GRlox
PloxPloxP
NO GR
NO GR
NO GR
Inactivation du GR dans les structures post-synaptiques du système dopaminergique
Cre
striatum
n. acc.
olf. tub.
V et VI
GRGR
VTA
TH GR GR - TH
GRloxP/loxP GRD1Cre
Striatum
Hippocampe
GR
Forte baisse de la motivation pour la cocaïne en absence de GR dans les neurones
dopaminoceptifs
Ratio progressifDose response
Injections
Cocaïne (mg/kg/inj)
GRD1Cre
Contrôles
Acquisition
Jours
Nose-P
okes
Trou inactif- GRD1Cre
Trou actif -Contrôles
Trou inactif -Contrôles
Trou actif- GRD1Cre
L’absence de GR dans les neurones dopaminoceptifs
suffit à bloquer la sensibilisation comportementale
9 injections (intervalle:2 jours)30 jours
Test
Groupe 3 (chronique) Cocaïne Cocaïne
Groupe 2 (aiguë) Saline Cocaïne
Groupe 1 (contrôle) Saline Saline
(15mg/kg) (7,5mg/kg)
(7,5mg/kg)
GRD1Cre
Activité locom
otrice
Contrôles A
ctivité locomotrice
Réponse au stress
Temps (min)
Activité locomotrice
Jour Nuit
Coordination motrice
Jours
Piscine de Morris
Jour 1Jour 2Jour 3
Champ ouvertLabyrinthe en croix surélevé
Matin Soir
Rythme circadien
Contrôles GRD1Cre
Corticostéronémie et comportement des souris GRD1Cre
L’absence de GR dans les seuls neurones post-dopaminergiques modifier l’activité des
neurones dopaminergiques
Fréquence de décharge (Hz)
GRloxP GRD1Cre0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
Fréquence d’occurrence des bouffées (Hz)
00,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
GRloxP GRD1Cre
3.6 Hz, 20% Bursts 2.4 Hz, 0% Bursts
1 sec
GRloxP GRD1Cre
Cortex préfrontal
Noyau accumbensATVNO GR
NO GR
NO GR
Par quel mécanisme le GR influence l’activité dopaminergique ?
Quelles afférences de l’ATV sont invalidées en GR chez les souris GRD1Cre ?
Dans le cortex préfrontal ?
Dans le noyau accumbens ?
Voie directe
Voie indirecte
Cortex préfrontal
Noyau accumbens
Pallidum ventral
ATV
??
La majorite des neurones D1 qui projettent à l’ATV expriment le GR
Fluorogold Cre
GRD1Cr
e
%
FG
+/C
re+
0
20
40
60
80
100
GRD1Cre
ContrôlesGRD1Cr
e
Fluorogold GR
%
FG
+/G
R+
0
20
40
60
80
100
Invalidation dans le cortex préfrontal ?
Cortex préfrontal
Noyau accumbens
Pallidum ventral
ATV
FluoroGold
?
Fluorogold Cre
GRD1Cr
e
%
FG
+/C
re+
0
20
40
60
80
100
GRD1Cre
ContrôlesGRD1Cr
e
%
FG
+/G
R+
Fluorogold GR
*
0
20
40
60
80
100
La majorité des neurones du NAc qui projettent directement à l’ATV
n’expriment plus le GR
Cortex préfrontal
Noyau accumbens
Pallidum ventral
ATV
Invalidation dans les neurones de la voie directe NAc-ATV ?
FluoroGold
?
Les neurones de la voie indirecte NAc-PV-ATV présentent un faible taux
d’invalidation du GR
GRD1Cre
ContrôlesGRD1Cr
e
Fluorogold GR
%
FG
+/G
R+
0
20
40
60
80
100
Fluorogold Cre
GRD1Cr
e
%
FG
+/C
re+
0
20
40
60
80
100
Cortex préfrontal
Noyau accumbens
Pallidum ventral
ATV
FluoroGold
?
Invalidation dans les neurones de la voie indirecte NAc-PV-ATV ?
Quel est l’effet de la mutation du GR sur la réactivité au glutamate des
neurones épineux du NAc ?
ATV Noyau accumbens
-1nA
-2nA
-4nA
-8nA…128
L’invalidation du GR induit une hyporéactivité au glutamate dans le
NAc
GRD1Cr
e
Contrôles
ContrôlesGRD1Cr
e
L’invalidation du GR bloque le contrôle du noyau accumbens sur les neurones
DA de l’ATV
ATV
Noyau accumbens
Kynurénate
Conclusion
Nous avons identifié les cellules responsable des effets du GR sur
Le GR participe au contrôle de la réactivité au glutamate des neurones épineux du NAc
la réponse à la cocaïne
L’activité dopaminergique
Le GR contrôle indirectement l’activité dopaminergique
Dissociation cellulaire des effets du GR pour l ’anxiété et l’addiction
Perspectives
Déterminer les gènes différentiellement exprimés : ARNm, protéines (voies de signalisation…)
Etude électrophysiologique pour déterminer le mécanisme impliqué dans l’altération de la réponse au glutamate des neurones épineux du NAc
• INSERM, BordeauxFrédéric AmbroggiVéronique DerocheـGamonetPier Vincenzo Piazza
• CNRS, Collège de FranceSébastien ParnaudeauAude MiletDominique LazarHélène CambierJeanـDenis RouzeauFrançois Tronche
DKFZ, HeidelbergThomas Lemberger
Céline Diaz