1

Transduction cellulairePrincipes généraux de transductionSurvol:

– Signalisation– Récepteurs– Transducteurs– Cibles (targets)

Principaux types of recepteurs cellulaires desurface

- signalisation par RTK (récepteurs Tyrosine-kinase)

- signalisation par protéines-G

TransductionTerminologie:Enzyme-linked receptor (Receptor-tyrosine kinase) G-protein linked receptor nuclear hormone receptor G-protein Second messenger: cAMP, IP3+DAG, Ca2+

adaptor protein protein kinase scaffolding protein SH2 domain MAPK Ras phosphodiesterase phospholipase protein phosphatase crosstalk

Principes Généraux de Transduction1. Communication implique

généralement(i) une molecule de signalisation,(ii) un recepteur,(iii) transducteurs intracellulairedu signal et(iv) des cibles (targets)

Principes Généraux de Transduction2. chaque cellule respond à un profile complexe demolecules de signalisation (crosstalk)

2

Principes Généraux de Transduction3. Differentes cellules respondent differemment à

une molecule signalisation particulière

Principes Généraux de Transduction4. Les Cellules peuvent se rappeler les effects de

certains signaux5. Les Cellules peuvent ajuster leur sensibilités à un

signal

Principes Généraux de Transduction4. Les Cellules peuvent se rappeler les effects de

certains signaux5. Les Cellules peuvent ajuster leur sensibilités à un

signal

Molécules de Signalisation

signaux de sécrétion:• Autocrine-signal affecte la même cellule ou

des cellules de même type• Paracrine-signal affecte des cellulaes voisines

Endocrine-signal affecte des cellules à longuedistance

signaux contact-dépendants :-les signaux ne sont pas libérés mais affectent

d’autres cellules en contact avec l’une d’ellespar interactions proteine-proteine

3

Signalisation Autocrine

Signaux libérés par une cellule affectentd’autres cellules dans l’entourage immediat

Amplifie une response en induisant denombreuses “cellules semblables” à respondrede la même manière

Permet aux cellules une réponse coordonnée(effet de communauté)

Signalisation Autocrine

Signalisation Paracrine

Signaux libérés par une cellule agissent surdifférentes cellules immédiatement voisines

La transmission synaptique ressemble à unestimulation paracrine mais la réponse est limitéeaux cellules en très proche proximité

La propagation du signal est limitée par -capture cellulaire,

-degradation extracellulaire-& liaison

Signalisation Endocrine

Signaux libérés par une cellule affectentdifferentes cellules très éloignées

La signalisation endocrine exerce souvent demultiple effets sur l’organisme en affectant denombreux tissus differents

4

Récepteurs= Proteines qui lient unemolécule signal et initient unecascade de signalisation

Récepteurs de surface-proteines membranairesintegrales qui lient un signalextracellulaire etprovoquent une cascade designalisation

Récepteurs intracellulaires-recepteurs nucleaires

Transduction intracellulaire du SignalLes recepteurs membranaires activés peuventmodifier l’activité des enzymes intracellulairessurtout:

–des enzymes modifiant des Protéines•Kinases (PKA, PKC, PKG)/ phosphatases•acetylases/ deacetylases

–des enzymes modifiant des Lipides•Phospholipases (PLCβ ou γ)•Phosphotidyl inositol kinase (PI3K)

–des enzymes modifiant des Nucleotides•cyclases/ phosphodiesterases

5

3 classes principales recepteurs cellulaires de surface :

I. Recepteurs couplés à un canal ionique

II. Recepteurs à activité enzymatique associéepeuvent possèder une activité enzymatique intrinsèqueou bien

lorsqu’ils lient un ligand, développent une activitéenzymatique

III. Recepteurs couplés aux protéines-Gsont monomeriques (7TM)et activent une proteine-G trimèrique(proteine liant GTP) qui régule des

proteines downstream

Recepteurs Cellulaires de surface Recepteurs à activité enzymatique associée5 classes principales selon :•type d’effecteur (p.ex. kinase vs. phosphatase)•cible (serine/threonine, tyrosine, histidine)•type de relation entre recepteur et enzyme

1. Recepteurs tyrosine kinase (RTK)2. recepteurs associés à Tyrosine kinase3. Recepteurs serine/threonine kinase

(PKA, PKC, PKG, PK-Ca2+-CAM)4. Recepteurs guanylyl cyclase5. recepteurs à activité Histidine-kinaseassociée

Recepteurs tyrosine kinasesType de recepteurs très fréquents pour lesprincipales hormones peptidiques, p.ex. EGF, PDGF,FGF, HGF, IGF-1, VEGF, NGF.

3 classes principales recepteurs cellulaires de surface :

I. Recepteurs couplés à un canal ionique

II. Recepteurs à activité enzymatique associéepeuvent possèder une activité enzymatique intrinsèqueou bien

lorsqu’ils lient un ligand, développent une activitéenzymatique

III. Recepteurs couplés aux protéines-Gsont monomeriques (7TM)et activent une proteine-G trimèrique(proteine liant GTP) qui régule des

proteines downstream

Recepteurs Cellulaires de surface

6

III. Recepteurs couplés aux Protéines-Get protéines-G

Receptor

G-protein

Recepteurs couplésaux protéines-G

Recepteurs couplés aux Protéines-GLigand: Divers ligands, p.ex. epinephrine

Recepteur: proteine intégrale membranaire avec7TM (7 domaines transmembrane)

Protein-G: protéine trimerique (α, β, γ) attachée àla membrane par un ancre lipidique

Effecteurs: proteines cibles qui présente uneactivité alterée lorsqu’elle interagit avec des sous-unités activatées de protéines-G (α, or βγ)

Rhodopsin PDB 1F88

Cascade de Signalisation parProtein-G

Une hormone (p.ex. epinephrineou glucagon) qui active laformation de cAMP ou IP3, se lieà la surface de la cellule sur unrecepteur (à 7 ségments enhélice-α transmembranaires).Rhodopsine: premier membre de lafamille de recepteurs à 7-helices-α, dont la structure a été déterminéepar crystallographie aux rayons-X.

7

Dissociation des protéines-G L’hydrolyse de GTP termine la signalisationet induit la trimerisation

Cycle d’activation/déactivation de protéines-G

B.- Protéines-G trimériques

Varietés de protéines-G

• Gs sont stimulantes• Gi/0 sont inhibitrices• Gq agit sur PLC• G12/13 agit sur canaux ioniques

– 22 α subunits– 5 β subunits– 12 γ subunits

8

Voie ADENYLATE CYCLASE :Gs & Gi Voies Gs & Gi

Gs proteins sont stimulantesLors de la dissociation, une proteine Gs stimule unenzyme effecteur, comme

-adenylate cyclase,-phospholipase Cβ

or-canal ionique (K+ or Ca2+)

Adenylate cyclase convertit ATP en cAMP

L’augmentation de cAMP stimule les protein kinasecAMP-dependantes (PKA), en provoquant lalibération des sous-unités régulatrices(inhibitrices)

VARIETES de G-PROTEINS:Gα, -β, -γ

9

La toxine de Cholera catalyse une modification covalentede Gsα. ADP-ribose est transferré du NAD+ sur uneresidue sur le site actif GTPase de Gsα.

Cette ADP-ribosylation empêche Gsα hydrolyser GTP.Ainsi Gsα devient activé de façon permanente.

La toxine de Pertussis (coqueluche=whooping coughdisease) catalyse l’ADP-ribosylation sur une cysteine de Giα, ceci rend la Gα (inhibitrice) incapable d’exchanger GDPcontre GTP. Ainsi la voie inhibitrice est blocquée.

ADP-ribosylation est un mechanisme general pour régulerl’activité de nombreuses proteines, dans les eukaryotes etprokaryotes.

ADP-Ribosylation

Figure 19-19 Mechanism d’action de la toxine de cholera.Toxine de Choleracomposition = AB5 B:103AA / A: 240AA

Activation: clivage en A1 (195AA) + A2(45AA) reliés par -S-S-

A pénètre dans cellule (endocytose) / dirigé dans ER: liaison par séquence KDEL de A2

Effet: ADP-ribosylation de Arg de Gsα

Adenylate Cyclasecatalyse: ATP cAMP + PPi

Liaison de certaines hormones (p.ex.,epinephrine) à la surface de la cellule activeAdenylate Cyclase qui forme du cAMP dansla cellule.

Cyclic AMP est donc un second messager.

NNNNNH2OOHOHHHH2CHOPOO-1'3'5'4'2'

cAMP

C

P

N

N

N

N

NH2

O

OO

OO

10

Protein Kinase A (cAMP-Dependent Protein Kinase)transfert Pi de ATP sur OH de Ser ou Thr sur uneséquence particulière de 5-résidus d’aminoacides.Protein Kinase A: au repos (inactif) = complexe :• 2 sous-unités catalytiques (C)• 2 sous-unités regulatrices (R) :

R2C2

activation de PKA par cAMP

PKA active l’expression de gènesCASCADE de PHOSPHORYLATION

11

EXEMPLE: Mètabolisme du Glycogène CREB =cAMP responsiveElements Binding

Protein

Inactivation de la voie PKA

La voie protéine-G - PKA est inactivèe par:–desensitisation du Recepteur (phophorylation parPKA)–hydrolyse du GTP de la proteine-G (GTPase de lasous-unité alpha)–hydrolyse de cAMP par phosphodiesterase–inhibition de PKA–action de Phosphatases sur les targets de PKA–Activation d’une voie antagoniste (Gi)

PHOSPHODIESTERASE

12

PLCβ & PKC

Proteines-G et phospholipases

Certaines protéines-G activentPLCβ (phospholipase Cβ),enclanchant la formation

d’inositol triphosphate (IP3) etdiacylglycerol (DAG)

DAG, IP3, Ca2+ et transduction de signalDAG:•substrat pour la production d’eicosanoids,(=puissants médiateurs de signalisation,notamment acide arachadonique)•active PKC

IP3:Induit la libération de Ca2+ à partir des réservesdu RE via canaux Ca-IP3-sensibles

Ca2+:Une élévation de Ca2+ peut activer PKC et CamK. Formule moleculaire des

phosphatidylinositides.

Pag

e 70

7

IP3 : second messager - Phosphatidylinositides

13

Une phospholipase est appelée selon laliaison clivée sur un glycerophospholipide

Pag

e 70

9

KINASES: RESUME

A/Ser-Thr kinases–PKA: cAMP dépendantes RRXSX–PKCα,β,γ XRXXSSRS–PK-Ca-CAM-I NYLRRLSDSNF–PK-Ca-CAM-II XRXXSX–PK-Ca-CAM-III RAGETRFTDTRK–PKG: cGMP dépendantes RXXSRX

B/ Tyr Kinases-PKY

Ca2+

croissance

secretion

differentiationproliferation

contraction/mobilité

fertilisationapoptosis

métabolisme

14

Ca2+

La concentration cellulaire de Calcium est maintainue faible pardes pompes qui transporte le calcium à travers la membraneplasmique et du cytosol à l’intérieur du reticulumendoplasmique (ER). De hautes concentrations de calciumactivent diverses proteines (protéines kinase, phosphatases,etc).

De nombreux effets du calcium sont réalisés par liaison à desprotéines liant Ca++, surtout calmodulin, qui est activée lorsquela concentration de calcium cytosolique augmente de 0.1 à 0.5micromolar.

La Calmoduline, ensuite, lie diverses protéines cibles, p.ex.Ca-calmoduline kinases (CaMK). Une des proteines activée par Ca/calmodulin est une

kinase appelée CaMK

Ca2+

Target

Transduction de Signal par CalciumTransduction de Signal par Calcium

mM

µM

0.1→10 µM

1 slide

Régulation Régulation de de Activité ProteineActivité ProteineKinase Kinase par Capar Ca2+2+-Calmoduline-Calmoduline

signalsignal Ca Ca2+2+

Activation Activation KinaseKinase

15

Structure de Protein Structure de Protein Kinases Ca-Kinases Ca-DependantesDependantes::

Activation de Activation de Kinase intra-moleculaireKinase intra-moleculaire

Activation de Activation de ProteinesProteinesKinases Calmoduline-Kinases Calmoduline-

dépendantesdépendantes

Myosin lightchain kinase

InsP3AA

Ca

Ca

PLCR

Ca2+

PLA2G

Ca2+ active PLA2qui déclanche le Metabolisme de l’Acide Arachidonique

(20:4 Δ5, Δ8, Δ11, Δ14)

Linoleic Acid

16

Biosynthese de Prostagandines Prostaglandines et Leukotrienes Grande famille de lipides bioactifs.

= hormones paracrines/autocrinesTrès faible durée de demi-vie

En general: regulent localement une inflammation, mais chaquemolecule a des effets specifiques:

eg. Prostaglandin E2 - vasodilatation Prostaglandin F2 - vasoconstriction Prostacyclin (PGI2) - vasodilatation / inhibe aggregation de plaquettes Thromboxane A2 - vasoconstriction / stimule aggregation de plaquettes

Differentes prostaglandines sont fabriquées par des types de cellulesdifferentes.

eg. Thromboxane A2 fabriqués par plaquettes Prostacycline produite par cellules vasculaires endotheliales

L’inhibition de generation d’AA empêche l’entréede Ca2+ par de faibles concentrations d’agonists.

Acid Arachidonique (AA) comme second-messager pour l’entrée de Ca2+

administration exogene de faibles concentrationsd’AA (3-8 µM) induit une entrée de Ca2+ sansdepletion detectable des réserves intracellulaires.

Les enzymes de production d’AA (p.ex. cPLA2) sontactivés à faibles concentrations d’agonistes appropriés.

17

Canaux à Ca2+ régulés parAc.Arachidonique

Arachidonate-Regulated Calcium channels

HEK-293 cellsCHO cells (Yoo et al., 2000)Parotid acinar cells (mouse & human)HeLa cellsCOS cellsRBL cellsDT40 cells

= “ARC” channels

3 classes principales recepteurs cellulaires de surface :

I. Recepteurs couplés à un canal ionique

II. Recepteurs à activité enzymatique associéepeuvent possèder une activité enzymatique intrinsèqueou bien

lorsqu’ils lient un ligand, développent une activitéenzymatique

III. Recepteurs couplés aux protéines-Gsont monomeriques (7TM)et activent une proteine-G trimèrique(proteine liant GTP) qui régule des

proteines downstream

Recepteurs Cellulaires de surface

CANAUX IONIQUES COUPLES A UNLIGAND

ION GATED CHANNELSTRANSDUCTION RAPIDE (msec)

FAST TRANSDUCTION

•ligand-gated ion channel• 5 subunits, each subunits has 4TM• very fast membranedepolarization (msec)

SLOW TRANSDUCTION

•G-protein coupled receptor• monomeric Receptor with 7TM• activation of second messengers• Long term changes (minutes todays) & plasticity changes

18

Canaux ioniques couplés à un ligandION-GATED CHANNELS

(TRANSDUCTION RAPIDE, msec)

Ion Channel Clustering

ION-GATED RECEPTORS IONOTROPIC GLU-RECEPTORS

Recepteurs Cellulaires de surface3 classes principales recepteurs cellulaires de surface :

I. Recepteurs couplés à un canal ioniqueII. Recepteurs à activité enzymatique associée

peuvent possèder une activité enzymatique intrinsèqueou bien

lorsqu’ils lient un ligand, développent une activitéenzymatique

III. Recepteurs couplés aux protéines-Gsont monomeriques (7TM)et activent une proteine-G trimerique(proteine liant GTP) qui régule des

proteines downstream

Recepteurs à activité enzymatique associée5 classes principales selon :•type d’effecteur (p.ex. kinase vs. phosphatase)•cible (serine/threonine, tyrosine, histidine)•type de relation entre recepteur et enzyme

1. Recepteurs tyrosine kinase (RTK)2. recepteurs associés à Tyrosine kinase3. Recepteurs serine/threonine kinase

(PKA, PKC, PKG, PK-Ca2+-CAM)4. Recepteurs guanylyl cyclase5. recepteurs à activité Histidine-kinaseassociée

19

Recepteurs tyrosine kinasesType de recepteurs très fréquents pour lesprincipales hormones peptidiques, p.ex. EGF, PDGF,FGF, HGF, IGF-1, VEGF, NGF.

Ligand-dependent autophosphorylation anddocking

Autophosphorylation Ligand-dépendente etdocking Recepteurs Tyrosine kinase

Recepteur possède une activitè intrinsèquetyrosine kinase

Lorsque le ligand se lie, le recepteur peut sedimeriser et devient une tyrosine kinase active

Il se phosphoryle lui-même (autophosphorylation),conséquences:

1. activité kinase augmentée2. affinité élevée pour d’autres proteins

Une fois liées, ces “docking proteins” peuvent êtrephosphorylées

20

Autophosphorylation Ligand-dépendente etdocking

Recepteurs Tyrosine Kinase

Pag

e 68

6

Activation de Ras

Ras-GTP

Ras-GDP

Ras GTPase Cycle

GTP

GDP

H2O

Pi

Exchange Hydrolysis

21

Ras GTPase Cycle

Ras-GTP

Ras-GDP

GTP

GDP

H2O

Pi

Guanine NucleotideExchange Factors (GEFs)

GTPase Activating Proteins (GAPs)

Superfamille Ras Ras Rho Rab Arf Ran

H-RasN-RasK-Ras

TC21

Rap1Rap2

R-Ras

RalARalB

RhoARhoBRhoC RhoGRhoE

CDC42

Rac1Rac2

Rab1-N Arf1-6 Ran

Croissance/ Cytosquelette Traffic VesiculaireDifferentiation Translocation Nucleaire

Fonctions des Proteines Ras

1) Stimule la Proliferation Cellulaire-fibroblastes, cellules epitheliales, lymphocytes-favorise les actions de facteurs de croissance

2) Stimule la Differentiation Cellulaire- progenitrices cellules neuronales (PC12)- favorise l’action de neurotrophines

3) Contribue aux Fonctions de Cellules differentiées-neurones SNC-module les effets de signalisation du calcium

Ras

SOS

Tyrosine Kinases

GRB2 Ras-GRP DAG

Phospholipase C

Ras-GRFCalmodulin

Ca2+

Chaque GEF a un motif qui le connecte à un signal signals upstream différentmais un domaine catalytique similaire qui active Ras

Fonction de RasEffecteurs Multiples

22

Ras

Raf

Ral-GEF

RalPI3Kinase

Fonction de RasEffecteurs Multiples

PDK1

AktMek

Erk Src

Exocyst RalBP

Voie MAP kinase

Activation de cascade MAPK

cascade MAP kinase- activée par Ras

Pag

e 69

6

23

Scaffolding proteins: assistent pourorganiser MAPKs

Scaffold proteins: modulation de cascades MAPkinase. (a) JIP-1(JNK-interacting protein).

Pag

e 69

9

Scaffold proteins: modulattion de cascadesMAP kinase. (b) MEKK1.

Pag

e 69

9

Signalisation de Insuline• 2 chaînes alpha extracellulaires• Chacune avec un site de liaison pour Insuline• liés à 2 chaînes beta transmembranaires, avec

chacune un domaine cytosolique tyrosine kinase• L’insuline lie les chaines alpha, -> le domaine

tyrosine kinase de chaque chaine beta catalysel’autophosphorylation de residus tyrosine sur ledomain kinase adjacent.

• Les domaines tyrosine kinase catalysent aussi laphosphorylation de protéines appelées  « insulin-receptor substrates » (IRSs).

• Certains effets de la liaison de l’insuline passent parle systeme second messager de PIP3 (qui regulatedivreses serine-threonine protein kinases.

• La liaison de insuline dans certaines cellules (p.ex.muscle) provoque une stimulation of cascadesphoshatase entraînant l’inactivation de glycogènephoshorylase dans la voie de degradation duglycogène

24

Recepteurs Non-TyrosineKinases

Voie JAK-STAT de transmissionintracellulaire de signaux de cytokines

Pag

e 70

2

JAK-STAT JAK-STAT

25

Recepteurs intracellulaires

–Steroides–Vit. D–Hormones Thyroidiennes T3/T4–Acide Retinoique

Recepteurs= Proteines qui lient un signalet initient une cascade designalisation

recepteurs membranaires- proteines membranairesintegrales qui lient un signalextracellulaire et initientune cascade de signalisation

Recepteurs intracellulaires-recepteurs d’hormonenucleaires

HORMONES STEROIDESCes molecules diffusent à travers la membraneplasmique et se lient sur des Recepteurs dans lecytoplasme ou le noyau.Dérivés du cholesterol.

steroides sexuels (oestrogène, progesterone,testosterone)corticosteroids (glucocorticoides etmineralcorticoides)

-Hormone thyroidiennes-Vitamin D3-acide retinoique structures et fonctions differentes mais même mechanisme d’action

Superfamille de Recepteurs Steroides: facteurs detranscription - fonctionnent soit comme activateurs ourepresseurs de la transcription.

GR Glucocorticoides PR Progesterone

AR Androgene ER Oestrogene

VDR, PPAR TR, FXR RXR, LXR RAR, PXR

Recepteurs Steroides Recepteurs Class ll Recepteurs orphelins

NGFI-B SF-I ERR

ReVERB

Palindrome HREs Halfsite HREsDirect Repeat HREsAGAACA-N3-TGTTCT GRE/PREAGGTCA-N3-TGACCT ERE ACGGTCA-N1-5-AGGTCA AAA-ACGGTCA NBRE

TCA-AGGTCA SFRE

SR SR NR RXR NR

Recepteurs Nucleaires

26

Action des Recepteurs deSteroides : liaison directe sur ADN

Cytoplasm

HRE

Nucleus

Ligand

SR

SR SR

SR SR

mRNA

Protein

Cell specificResponse

1

1. Liaison directesur ADN

Action des Recepteurs de Steroides :Proteine/Proteine

Cytoplasm

HRE

TFTF

Nucleus

Ligand

SR

SR SR

SR SRSR

mRNA

Protein

Cell specificResponse

12

1. Interactions directes

2. interactions proteine-proteine indirectes

Recepteur de SteroidesCoregulators

• Proteines qui interagissent avecreceptors steroides non-liguandés ouliguandés et modulent leur action– Coactivateurs– Corepresseurs

RNAPol.

TBP

TFII-B

Remodellage de chromosomeacetylation d’histoneTranscription

pCAF

SRC

SRSR

α

SRC

CBP

mRPD3

NCoR/SMRT

SR SR

Sin3

ACTIVATION

REPRESSION

condensation de chromosome deacetylation d’histone PAS de transcription

Activation/Repression

mRPD3

NCoR/SMRT

Sin3

27

Role des Coactivateurs and Corepresseurs en pathologie

Tamoxifen: antagoniste d’oestrogènes enpresence de corepresseurs in vitro

Une baisse de N-CoR detectée dans lescellules tumorales Tamoxifen-resistantesMCF-7 (cancer du sein)

Suggère que le niveau de coactivateurs oucorepresseurs peut moduler le phenotype

Quelques données cliniques vont dans cesens